JP2000295999A - １α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ３の生物学的製造方法 - Google Patents
１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ３の生物学的製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 １α−ヒドロキシビタミンＤ3の２４位に水
酸基を導入する１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3
の生物学的製造方法の提供。 【構成】 ビタミンＤ類を水酸化する微生物菌体または
その産生する酵素を含有する溶液中に、１α−ヒドロキ
シビタミンＤ3とシクロデキストリン類とを共存させ、
２４位の水素原子を水酸基に変換することを特徴とする
１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3の生物学的製造
方法。
酸基を導入する１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3
の生物学的製造方法の提供。 【構成】 ビタミンＤ類を水酸化する微生物菌体または
その産生する酵素を含有する溶液中に、１α−ヒドロキ
シビタミンＤ3とシクロデキストリン類とを共存させ、
２４位の水素原子を水酸基に変換することを特徴とする
１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3の生物学的製造
方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は１α−ヒドロキシビ
タミンＤ3の２４位に水酸基を導入して１α，２４−ジ
ヒドロキシビタミンＤ3を得る生物学的な製造方法に関
する。
タミンＤ3の２４位に水酸基を導入して１α，２４−ジ
ヒドロキシビタミンＤ3を得る生物学的な製造方法に関
する。
【０００２】
【発明の背景】ビタミンＤ誘導体は体内でのカルシウム
の吸収、骨のカルシウム代謝促進または表皮ケラチン細
胞の分化等に関係する重要なビタミンであり、その活性
は肝臓で２５位、腎臓で１α位に水酸化を受けて発揮さ
れることが知られている［エイチ・エフ・デルーカおよ
びエイチ・ケー・ジョーンズ：アニュアル・レビュー・
オブ・バイオケミストリー（Ann. Rev. Biochem.），第
５２巻，４１１頁(1983年)］。ところが、肝機能障害を
持つ患者では、２５−ヒドロキシビタミンＤ3の生体内
における生成量が不足していることが知られている。従
って、この様な患者に対する２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ3の投与は、生体内での不足分を補うという観点から
有効である。特に腎不全（腎不全性くる病等）や骨粗鬆
症患者等には１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3が
著効を表わす。
の吸収、骨のカルシウム代謝促進または表皮ケラチン細
胞の分化等に関係する重要なビタミンであり、その活性
は肝臓で２５位、腎臓で１α位に水酸化を受けて発揮さ
れることが知られている［エイチ・エフ・デルーカおよ
びエイチ・ケー・ジョーンズ：アニュアル・レビュー・
オブ・バイオケミストリー（Ann. Rev. Biochem.），第
５２巻，４１１頁(1983年)］。ところが、肝機能障害を
持つ患者では、２５−ヒドロキシビタミンＤ3の生体内
における生成量が不足していることが知られている。従
って、この様な患者に対する２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ3の投与は、生体内での不足分を補うという観点から
有効である。特に腎不全（腎不全性くる病等）や骨粗鬆
症患者等には１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3が
著効を表わす。
【０００３】近年、１αおよび２４位をヒドロキシル化
した合成ビタミンＤ誘導体（１α，２４−ジヒドロキシ
ビタミンＤ3）が１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3
の特異的レセプターに結合し、１α，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ3と同様な活性を示すことが報告されてい
る［ジャーナル・オブ・デルマトロジー(The Journalof
Dermatology)，第１７巻，１３５頁(1990年)］。従っ
て、１αおよび２４位をヒドロキシル化したジヒドロキ
シビタミンＤ3を安価でしかも大量に製造する方法の提
供は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3の生産と
同様、医療上および工業上極めて有益である。
した合成ビタミンＤ誘導体（１α，２４−ジヒドロキシ
ビタミンＤ3）が１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3
の特異的レセプターに結合し、１α，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ3と同様な活性を示すことが報告されてい
る［ジャーナル・オブ・デルマトロジー(The Journalof
Dermatology)，第１７巻，１３５頁(1990年)］。従っ
て、１αおよび２４位をヒドロキシル化したジヒドロキ
シビタミンＤ3を安価でしかも大量に製造する方法の提
供は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3の生産と
同様、医療上および工業上極めて有益である。
【０００４】１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3は
２５−ヒドロキシビタミンＤ3を原料として微生物を用
いて酵素化学的に変換生成されることが知られている
が、その変換効率は十分ではなかった（特開平2-469号
および特開平2-231089号）。本発明者らは微生物を用い
るビタミンＤ誘導体からの２５−ヒドロキシビタミンＤ
誘導体、あるいは１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
誘導体への変換において、シクロデキストリン類を反応
液中に共存させることによりその変換効率を増大する方
法を先に提案した（特開平4-166090号）。
２５−ヒドロキシビタミンＤ3を原料として微生物を用
いて酵素化学的に変換生成されることが知られている
が、その変換効率は十分ではなかった（特開平2-469号
および特開平2-231089号）。本発明者らは微生物を用い
るビタミンＤ誘導体からの２５−ヒドロキシビタミンＤ
誘導体、あるいは１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
誘導体への変換において、シクロデキストリン類を反応
液中に共存させることによりその変換効率を増大する方
法を先に提案した（特開平4-166090号）。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは先に提案し
た生物学的方法（特開平4-166090号）による１α−ビタ
ミンＤ3の２５位を水酸化したビタミン類の製造方法に
ついて検討した結果、２５位だけでなく、２４位に水酸
基が導入された１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3
が生成することを確認し、本発明を完成するに至った。
た生物学的方法（特開平4-166090号）による１α−ビタ
ミンＤ3の２５位を水酸化したビタミン類の製造方法に
ついて検討した結果、２５位だけでなく、２４位に水酸
基が導入された１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3
が生成することを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明はビタミンＤ類を水酸化
する微生物菌体またはその産生する酵素を含有する溶液
中に、１α−ヒドロキシビタミンＤ3、シクロデキスト
リン類及び／または界面活性剤とを共存させ、その１α
−ヒドロキシビタミンＤ3の２４位の水素原子を水酸基
に変換することを特徴とする１α，２４−ジヒドロキシ
ビタミンＤ3の生物学的製造方法を提供する。
する微生物菌体またはその産生する酵素を含有する溶液
中に、１α−ヒドロキシビタミンＤ3、シクロデキスト
リン類及び／または界面活性剤とを共存させ、その１α
−ヒドロキシビタミンＤ3の２４位の水素原子を水酸基
に変換することを特徴とする１α，２４−ジヒドロキシ
ビタミンＤ3の生物学的製造方法を提供する。
【０００７】本発明に用いられるビタミンＤ類の水酸化
能を有する微生物とは、ノカルディア属、ストレプトマ
イセス属、スフィンゴモナス属またはアミコラータ属に
属するものである。ノカルディア属に属するものとして
は、例えばノカルディア・オウトトロフィカ（Nocardia
autotrophica）N-102（生命研条寄第1573号(FERM BP-1
573)）などが挙げられる。ストレプトマイセス属に属す
るものとしては、例えばストレプトマイセス・ロゼオス
ポラス（Streptomyces roseosporus）A-5797（生命研条
寄第1574号(FERMBP-1574)）、ストレプトマイセス・ス
クレロチアラス（Streptomyces sclerotialus）T-JSI
（生命研条寄第1370号(FERM BP-1370)）などが挙げられ
る。スフィンゴモナス属に属するものとしては、例えば
スフィンゴモナス・マリー（Sphingomonas mali）IFO15
500、スフィンゴモナス・パウチモビリス（Sphingomona
s paucimobilis）IFO13935、スフィンゴモナス・パラパ
ウチモビリス（Sphingomonas parapaucimobilis）IFO15
100、スフィンゴモナス・ヤノイクヤエ（Sphingomonas
yanoikuyae）IFO15102、スフィンゴモナス・アドハエシ
バ（Sphingomonas adhaesiva）IFO15099、スフィンゴモ
ナス・カプスラータ（Sphingomonas capsulata）IFO125
33、スフィンゴモナス・サンギス（Sphingomonas sangu
is）IFO13937、スフィンゴモナス・マクロゴルタビダス
（Sphingomonas macrogoltabidus）IFO15033、スフィン
ゴモナス・テラーエ（Sphingomonas terrae）IFO15098
などが挙げられる。
能を有する微生物とは、ノカルディア属、ストレプトマ
イセス属、スフィンゴモナス属またはアミコラータ属に
属するものである。ノカルディア属に属するものとして
は、例えばノカルディア・オウトトロフィカ（Nocardia
autotrophica）N-102（生命研条寄第1573号(FERM BP-1
573)）などが挙げられる。ストレプトマイセス属に属す
るものとしては、例えばストレプトマイセス・ロゼオス
ポラス（Streptomyces roseosporus）A-5797（生命研条
寄第1574号(FERMBP-1574)）、ストレプトマイセス・ス
クレロチアラス（Streptomyces sclerotialus）T-JSI
（生命研条寄第1370号(FERM BP-1370)）などが挙げられ
る。スフィンゴモナス属に属するものとしては、例えば
スフィンゴモナス・マリー（Sphingomonas mali）IFO15
500、スフィンゴモナス・パウチモビリス（Sphingomona
s paucimobilis）IFO13935、スフィンゴモナス・パラパ
ウチモビリス（Sphingomonas parapaucimobilis）IFO15
100、スフィンゴモナス・ヤノイクヤエ（Sphingomonas
yanoikuyae）IFO15102、スフィンゴモナス・アドハエシ
バ（Sphingomonas adhaesiva）IFO15099、スフィンゴモ
ナス・カプスラータ（Sphingomonas capsulata）IFO125
33、スフィンゴモナス・サンギス（Sphingomonas sangu
is）IFO13937、スフィンゴモナス・マクロゴルタビダス
（Sphingomonas macrogoltabidus）IFO15033、スフィン
ゴモナス・テラーエ（Sphingomonas terrae）IFO15098
などが挙げられる。
【０００８】アミコラータ属に属するものとしては、例
えばアミコラータ・サツルネア（Amycolata saturnea）
A-7983（生命研条寄第2307号(FERM BP-2307)）、アミコ
ラータ・サツルネア（Amycolata saturnea）A-1246（生
命研条寄第5544号(FERM BP-5544)）のほか、アミコラー
タ・サツルネア（Amycolata saturnea）IFO14499、アミ
コラータ・オウトトロフィカ（Amycolata autotrophic
a）ATCC19727、アミコラータ・オウトトロフィカ（Amyc
olata autotrophica）ATCC13181、アミコラータ・オウ
トトロフィカ（Amycolata autotrophica）ATCC33794、
アミコラータ・オウトトロフィカ（Amycolata autotrop
hica）ATCC33795、アミコラータ・オウトトロフィカ（A
mycolata autotrophica）ATCC33796、アミコラータ・オ
ウトトロフィカ（Amycolata autotrophica）ATCC3379
7、アミコラータ・オウトトロフィカ（Amycolata autot
rophica）JCM4010、アミコラータ・ヒドロカルボンオキ
シダンス（Amycolata hydrocarbonoxidans）IFO14498な
どが挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種
以上を混合して用いてもよい。
えばアミコラータ・サツルネア（Amycolata saturnea）
A-7983（生命研条寄第2307号(FERM BP-2307)）、アミコ
ラータ・サツルネア（Amycolata saturnea）A-1246（生
命研条寄第5544号(FERM BP-5544)）のほか、アミコラー
タ・サツルネア（Amycolata saturnea）IFO14499、アミ
コラータ・オウトトロフィカ（Amycolata autotrophic
a）ATCC19727、アミコラータ・オウトトロフィカ（Amyc
olata autotrophica）ATCC13181、アミコラータ・オウ
トトロフィカ（Amycolata autotrophica）ATCC33794、
アミコラータ・オウトトロフィカ（Amycolata autotrop
hica）ATCC33795、アミコラータ・オウトトロフィカ（A
mycolata autotrophica）ATCC33796、アミコラータ・オ
ウトトロフィカ（Amycolata autotrophica）ATCC3379
7、アミコラータ・オウトトロフィカ（Amycolata autot
rophica）JCM4010、アミコラータ・ヒドロカルボンオキ
シダンス（Amycolata hydrocarbonoxidans）IFO14498な
どが挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種
以上を混合して用いてもよい。
【０００９】本発明では、シクロデキストリン類を添加
しなくても水酸化反応は進行するが、好ましくはシクロ
デキストリン類を添加することが有効な手段である。本
発明で用いられるシクロデキストリン類には、α−シク
ロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロ
デキストリン、β−ジメチルシクロデキストリン、β−
トリメチルシクロデキストリン、部分メチル化シクロデ
キストリン（以下、ＰＭＣＤと略記することがあ
る。）、分枝シクロデキストリンなどがある。これらの
シクロデキストリン類は単独で用いてもよいし、あるい
は２種以上を混合したものを用いてもよい。
しなくても水酸化反応は進行するが、好ましくはシクロ
デキストリン類を添加することが有効な手段である。本
発明で用いられるシクロデキストリン類には、α−シク
ロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロ
デキストリン、β−ジメチルシクロデキストリン、β−
トリメチルシクロデキストリン、部分メチル化シクロデ
キストリン（以下、ＰＭＣＤと略記することがあ
る。）、分枝シクロデキストリンなどがある。これらの
シクロデキストリン類は単独で用いてもよいし、あるい
は２種以上を混合したものを用いてもよい。
【００１０】本発明では、シクロデキストリン類と同時
に界面活性剤を共存させることが有効な手段である。界
面活性剤としては、非イオン性界面活性剤としてポリオ
キシエチレン・ソルビタン脂肪酸エステル［例えばTwee
n ８０（シグマ社製）］、ソルビタン脂肪酸エステル
［例えばSpan ８５（シグマ社製）］、ポリオキシエチ
レンエーテル［例えばBrij９６（シグマ社製）］やTrit
on Ｘ−１００（シグマ社製）、ノニルフェノール｛例
えばノニポール４５［三洋化成工業（株）］製｝、酸化
エチレン−酸化プロピレンのブロック共重合物｛例えば
Pluronic Ｌ−６１［旭電化工業（株）］製｝、および
陰イオン性界面活性剤としてダイレックス［日本油脂
（株）製］、トラックス［日本油脂（株）製］などを用
いることができる。
に界面活性剤を共存させることが有効な手段である。界
面活性剤としては、非イオン性界面活性剤としてポリオ
キシエチレン・ソルビタン脂肪酸エステル［例えばTwee
n ８０（シグマ社製）］、ソルビタン脂肪酸エステル
［例えばSpan ８５（シグマ社製）］、ポリオキシエチ
レンエーテル［例えばBrij９６（シグマ社製）］やTrit
on Ｘ−１００（シグマ社製）、ノニルフェノール｛例
えばノニポール４５［三洋化成工業（株）］製｝、酸化
エチレン−酸化プロピレンのブロック共重合物｛例えば
Pluronic Ｌ−６１［旭電化工業（株）］製｝、および
陰イオン性界面活性剤としてダイレックス［日本油脂
（株）製］、トラックス［日本油脂（株）製］などを用
いることができる。
【００１１】本発明の方法では微生物の菌体または酵素
を含有する溶液中でシクロデキストリン類またはシクロ
デキストリン類と界面活性剤を共存させることによりそ
の反応速度、反応効率を上げることができる。微生物を
培養する培地は主として液体培地を用い、炭素源として
グルコース、マルトース、シュークロース、デキストリ
ン、澱粉、アラビノース、キシロース、グリセリド、植
物油脂、動物油脂を単独もしくは混合して用いる。窒素
源としては大豆粉、綿実粕、グルテンミール、カゼイ
ン、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、コ
ーンスチープリカー等を単独または混合して用いる。そ
の他生育に必要な、あるいは２４位水酸化酵素の生産を
促進する有機物及び無機物を必要に応じて添加すること
ができる。
を含有する溶液中でシクロデキストリン類またはシクロ
デキストリン類と界面活性剤を共存させることによりそ
の反応速度、反応効率を上げることができる。微生物を
培養する培地は主として液体培地を用い、炭素源として
グルコース、マルトース、シュークロース、デキストリ
ン、澱粉、アラビノース、キシロース、グリセリド、植
物油脂、動物油脂を単独もしくは混合して用いる。窒素
源としては大豆粉、綿実粕、グルテンミール、カゼイ
ン、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、コ
ーンスチープリカー等を単独または混合して用いる。そ
の他生育に必要な、あるいは２４位水酸化酵素の生産を
促進する有機物及び無機物を必要に応じて添加すること
ができる。
【００１２】培養方法は振盪培養、通気撹拌培養などの
好気培養が適している。培養温度は２０〜３３℃、好ま
しくは２５〜３０℃で行ない、培養１２〜９６時間後、
好ましくは２４〜４８時間後に基質となる１α−ヒドロ
キシビタミンＤ 3とシクロデキストリン類、および所望
により界面活性剤を添加する。１α−ヒドロキシビタミ
ンＤ3の添加量は培地中１０〜1000μｇ／ｍｌ、好まし
くは５０〜５００μｇ／ｍｌが好適であり、シクロデキ
ストリン類の添加量は0.1〜１５重量％、好ましくは0.1
〜２重量％が好適である。培養のｐＨは５〜９、好まし
くは６〜８が好適である。界面活性剤の添加量は、培地
中0.01〜５重量％、好ましくは0.05〜0.5重量％が好適
である。
好気培養が適している。培養温度は２０〜３３℃、好ま
しくは２５〜３０℃で行ない、培養１２〜９６時間後、
好ましくは２４〜４８時間後に基質となる１α−ヒドロ
キシビタミンＤ 3とシクロデキストリン類、および所望
により界面活性剤を添加する。１α−ヒドロキシビタミ
ンＤ3の添加量は培地中１０〜1000μｇ／ｍｌ、好まし
くは５０〜５００μｇ／ｍｌが好適であり、シクロデキ
ストリン類の添加量は0.1〜１５重量％、好ましくは0.1
〜２重量％が好適である。培養のｐＨは５〜９、好まし
くは６〜８が好適である。界面活性剤の添加量は、培地
中0.01〜５重量％、好ましくは0.05〜0.5重量％が好適
である。
【００１３】本発明の製造方法では、培養液中あるいは
培養菌体あるいは酵素を含有する溶液中で振盪あるいは
通気撹拌することが適しており、基質である１α−ヒド
ロキシビタミンＤ3、シクロデキストリン類、および所
望により界面活性剤を添加後１〜１３０時間好気的に撹
拌を行う。好気的条件を得るために培養器内の圧力を上
げたり酸素気流下で反応を行うことも有効である。シク
ロデキストリン類および界面活性剤の添加方法は、基質
である１α−ヒドロキシビタミンＤ3と予め混合してお
く方法、１α−ヒドロキシビタミンＤ3を先に添加し、
つづいてシクロデキストリン類と界面活性剤を添加する
方法、シクロデキストリン類と界面活性剤を先に添加し
ておき、後から１α−ヒドロキシビタミンＤ3を添加す
る方法のいずれでも可能である。
培養菌体あるいは酵素を含有する溶液中で振盪あるいは
通気撹拌することが適しており、基質である１α−ヒド
ロキシビタミンＤ3、シクロデキストリン類、および所
望により界面活性剤を添加後１〜１３０時間好気的に撹
拌を行う。好気的条件を得るために培養器内の圧力を上
げたり酸素気流下で反応を行うことも有効である。シク
ロデキストリン類および界面活性剤の添加方法は、基質
である１α−ヒドロキシビタミンＤ3と予め混合してお
く方法、１α−ヒドロキシビタミンＤ3を先に添加し、
つづいてシクロデキストリン類と界面活性剤を添加する
方法、シクロデキストリン類と界面活性剤を先に添加し
ておき、後から１α−ヒドロキシビタミンＤ3を添加す
る方法のいずれでも可能である。
【００１４】これらの反応により製造された１α，２４
−ジヒドロキシビタミンＤ3を単離するには有機溶剤に
よる抽出、カラムクロマトグラフィー等の方法が採られ
る。例えば反応終了後、反応液を塩化メチレンにより抽
出し濃縮、乾固する。これを２−プロパノール、ｎ−ヘ
キサン等の適当な溶媒に溶解し、ろ過、遠心分離などに
より不溶物を除いた後シリカゲルカラム、例えばゾルバ
ックスＳＩＬ（米国デュポン社製）、シムパックＯＤＳ
（島津製作所製）、ハイバーＲＴ２５０−１０リクロソ
ルブＳｉ６０（シカ・メルク社製）等を用いた高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により１α，２４−ジ
ヒドロキシビタミンＤ3の単離を行なうことができる。
−ジヒドロキシビタミンＤ3を単離するには有機溶剤に
よる抽出、カラムクロマトグラフィー等の方法が採られ
る。例えば反応終了後、反応液を塩化メチレンにより抽
出し濃縮、乾固する。これを２−プロパノール、ｎ−ヘ
キサン等の適当な溶媒に溶解し、ろ過、遠心分離などに
より不溶物を除いた後シリカゲルカラム、例えばゾルバ
ックスＳＩＬ（米国デュポン社製）、シムパックＯＤＳ
（島津製作所製）、ハイバーＲＴ２５０−１０リクロソ
ルブＳｉ６０（シカ・メルク社製）等を用いた高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により１α，２４−ジ
ヒドロキシビタミンＤ3の単離を行なうことができる。
【００１５】
【発明の効果】本発明の方法により微生物菌体またはそ
の生産する酵素を用いて、ビタミンＤ誘導体の活性型で
ある１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3と同様の活
性を有する１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3を効
率よく製造することができる。
の生産する酵素を用いて、ビタミンＤ誘導体の活性型で
ある１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3と同様の活
性を有する１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3を効
率よく製造することができる。
【００１６】
【実施例】以下実施例により本発明を詳細に説明する
が、これによって本発明が限定されるものではない。な
お、下記の例中の％は特にことわらないかぎり重量基準
による。実施例中、各試料の機器分析には以下の方法を
用いた。微生物変換後の試料は日本分光製ＭＤ−９１０
型マルチ検出器を装備したＨＰＬＣシステムを用いて分
離、精製し、以下の分析を行なった。1Ｈ−ＮＭＲおよ
び19Ｆ−ＮＭＲはブルカー製ＡＲＸ−４００型により測
定した。1Ｈ−ＮＭＲの場合はテトラメチルシラン（tet
rametylsilane；ＴＭＳ）を内部標準として、また19Ｆ
−ＮＭＲの場合はトリフルオロトルエン（trifluorotol
uene）を外部標準（δ＝−６３ｐｐｍ）として、化学シ
フトをδ値で示した。ＮＭＲの記載は次の略号によっ
た。ｓ＝singlet、ｄ＝doublet、ｔ＝triplet、ｍ＝mul
tiplet、ｂｒ＝broad signal。ＭＳスペクトルは日本電
子製ＪＭＳ−ＡＸ５０５ＨＡ型を用い電子衝撃法（Ｅ
Ｉ）により測定した。ＵＶスペクトルは日立製Ｕ−3200
型により測定した。
が、これによって本発明が限定されるものではない。な
お、下記の例中の％は特にことわらないかぎり重量基準
による。実施例中、各試料の機器分析には以下の方法を
用いた。微生物変換後の試料は日本分光製ＭＤ−９１０
型マルチ検出器を装備したＨＰＬＣシステムを用いて分
離、精製し、以下の分析を行なった。1Ｈ−ＮＭＲおよ
び19Ｆ−ＮＭＲはブルカー製ＡＲＸ−４００型により測
定した。1Ｈ−ＮＭＲの場合はテトラメチルシラン（tet
rametylsilane；ＴＭＳ）を内部標準として、また19Ｆ
−ＮＭＲの場合はトリフルオロトルエン（trifluorotol
uene）を外部標準（δ＝−６３ｐｐｍ）として、化学シ
フトをδ値で示した。ＮＭＲの記載は次の略号によっ
た。ｓ＝singlet、ｄ＝doublet、ｔ＝triplet、ｍ＝mul
tiplet、ｂｒ＝broad signal。ＭＳスペクトルは日本電
子製ＪＭＳ−ＡＸ５０５ＨＡ型を用い電子衝撃法（Ｅ
Ｉ）により測定した。ＵＶスペクトルは日立製Ｕ−3200
型により測定した。
【００１７】実施例１ バクトソイトン（ディフコ社製）1.5％、コーンスチー
プリカー 0.5％、グルコース 1.5％、ＮａＣｌ 0.5％、
ＣａＣＯ3 0.2％（ｐＨ7.2)からなる培地（ＢＧ培地）
１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れ１２１
℃、２０分間加熱滅菌した。これに、アミコラータ・オ
ウトトロフィカ ＡＴＣＣ３３７９６（Amycolata autot
rophica ATCC33796）を一白金耳接種し２８℃、２２０
ｒｐｍで４８時間培養した。
プリカー 0.5％、グルコース 1.5％、ＮａＣｌ 0.5％、
ＣａＣＯ3 0.2％（ｐＨ7.2)からなる培地（ＢＧ培地）
１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れ１２１
℃、２０分間加熱滅菌した。これに、アミコラータ・オ
ウトトロフィカ ＡＴＣＣ３３７９６（Amycolata autot
rophica ATCC33796）を一白金耳接種し２８℃、２２０
ｒｐｍで４８時間培養した。
【００１８】ＢＧ培地に部分メチル化β−シクロデキス
トリン（メルシャン社製）を１％（または部分メチル化
β−シクロデキストリン 0.05％とγ−シクロデキスト
リン0.5％）添加した培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容三角
フラスコに入れ、１２１℃、２０分間加熱殺菌を行なっ
た。これに、先に培養した培養液１ｍｌを無菌的に移
し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８時間培養した。この培
養液に0.5ｍｌのエタノールに溶解した１α−ヒドロキ
シビタミンＤ3１０ｍｇを添加し、さらに２４〜１２０
時間培養を行なった。
トリン（メルシャン社製）を１％（または部分メチル化
β−シクロデキストリン 0.05％とγ−シクロデキスト
リン0.5％）添加した培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容三角
フラスコに入れ、１２１℃、２０分間加熱殺菌を行なっ
た。これに、先に培養した培養液１ｍｌを無菌的に移
し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８時間培養した。この培
養液に0.5ｍｌのエタノールに溶解した１α−ヒドロキ
シビタミンＤ3１０ｍｇを添加し、さらに２４〜１２０
時間培養を行なった。
【００１９】培養終了後、培養液と等量のメタノールを
添加混合し、3000ｒｐｍ、１０分間の遠心分離（島津製
作所製、ＣＳＴ０６０ＬＦ型）を行ない、上清を回収し
た。回収した上清をダイアイオンＨＰ２０ＳＳ（三菱化
成社製）を充填したカラム（内径１ｃｍ×長さ１５ｃ
ｍ）に流速0.5ｍｌ／ｍｉｎで通液し、５０−１００％
メタノール濃度勾配溶出でピーク画分を得た。このピー
ク画分を濃縮乾固し、２−プロパノール：ｎ−ヘキサン
（１：９）の混合溶媒３ｍｌに溶解し、−２０℃で２時
間放置し、生じた不溶成分を遠心分離によって除去し
た。この上清液を減圧濃縮しＨＰＬＣを行ない、ピーク
画分を集めた。これを４０℃以下で窒素ガス置換しなが
ら減圧濃縮乾固した。これを以下の条件でセミ分取用Ｈ
ＰＬＣにて精製し、１α，２４−ジヒドロキシビタミン
Ｄ3を８０８μｇ得た。
添加混合し、3000ｒｐｍ、１０分間の遠心分離（島津製
作所製、ＣＳＴ０６０ＬＦ型）を行ない、上清を回収し
た。回収した上清をダイアイオンＨＰ２０ＳＳ（三菱化
成社製）を充填したカラム（内径１ｃｍ×長さ１５ｃ
ｍ）に流速0.5ｍｌ／ｍｉｎで通液し、５０−１００％
メタノール濃度勾配溶出でピーク画分を得た。このピー
ク画分を濃縮乾固し、２−プロパノール：ｎ−ヘキサン
（１：９）の混合溶媒３ｍｌに溶解し、−２０℃で２時
間放置し、生じた不溶成分を遠心分離によって除去し
た。この上清液を減圧濃縮しＨＰＬＣを行ない、ピーク
画分を集めた。これを４０℃以下で窒素ガス置換しなが
ら減圧濃縮乾固した。これを以下の条件でセミ分取用Ｈ
ＰＬＣにて精製し、１α，２４−ジヒドロキシビタミン
Ｄ3を８０８μｇ得た。
【００２０】ＨＰＬＣ条件： カラム：Hibar RT 250-10LiChrosorb Si60（７μｍ）、 溶出液：１５％イソプロパノール／ヘキサン、 流速 ：７ｍｌ／ｍｉｎ、 温度 ：室温、 検出光：２６５ｎｍ。
【００２１】スペクトルデータ：１α，２４−ジヒドロ
キシビタミンＤ3 1 Ｈ―ＮＭＲ（CDCl3）：δ 0.55(3H,s,18-H), 0.91 and
0.92(each 3H,d,J=6.8 Hz,26,27-H), 0.94(3H,d,J=6.3
Hz,21-H), 2.32(1H,dd,J=13.2,6.6 Hz,4-H),2.60(1H,d
d,J=13.2,3.3 Hz,4-H), 2.82(1H,m,9-H), 3.32(1H,m,24
-H), 4.22(H,m,3-H), 4.43(1H,m,1-H), 5.01 and 5.33
(each 1H,s,19-H), 6.01(1H,d,J=11.2 Hz,7-H), 6.38(1
H,d,J=11.2 Hz,6-H）； ＭＳ ｍ／ｚ（％）：416（Ｍ+,38), 398（58), 380（4
8), 365（5）287（9),251（16), 152（50), 134（10
0）； ＵＶ λmax(EtOH）：２６４ｎｍ。
キシビタミンＤ3 1 Ｈ―ＮＭＲ（CDCl3）：δ 0.55(3H,s,18-H), 0.91 and
0.92(each 3H,d,J=6.8 Hz,26,27-H), 0.94(3H,d,J=6.3
Hz,21-H), 2.32(1H,dd,J=13.2,6.6 Hz,4-H),2.60(1H,d
d,J=13.2,3.3 Hz,4-H), 2.82(1H,m,9-H), 3.32(1H,m,24
-H), 4.22(H,m,3-H), 4.43(1H,m,1-H), 5.01 and 5.33
(each 1H,s,19-H), 6.01(1H,d,J=11.2 Hz,7-H), 6.38(1
H,d,J=11.2 Hz,6-H）； ＭＳ ｍ／ｚ（％）：416（Ｍ+,38), 398（58), 380（4
8), 365（5）287（9),251（16), 152（50), 134（10
0）； ＵＶ λmax(EtOH）：２６４ｎｍ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 熊澤 雅輝 静岡県磐田市中泉1797メルシャンアパート 224 (72)発明者 清水 正人 東京都品川区大井１−34−４ (72)発明者 山田 幸子 東京都八王子市初沢町1227−４ Ｆターム(参考） 4B064 AH07 BA05 BH04 BH06 BH07 CA04 CB12 CC03 CD06 DA01
Claims (4)
- 【請求項１】 ビタミンＤ類を水酸化する微生物菌体ま
たはその産生する酵素を含有する溶液中に、１α−ヒド
ロキシビタミンＤ3を共存させ、その１α−ヒドロキシ
ビタミンＤ3の２４位の水素原子を水酸基に変換するこ
とを特徴とする１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3
の生物学的製造方法。 - 【請求項２】 ビタミンＤ類を水酸化する微生物菌体が
ノカルディア属、ストレプトマイセス属、アミコラータ
属に属する微生物の菌体である請求項１に記載の１α，
２４−ジヒドロキシビタミンＤ3の生物学的製造方法。 - 【請求項３】 ビタミンＤ類を水酸化する微生物菌体ま
たはその産生する酵素を含有する溶液中に、１α−ヒド
ロキシビタミンＤ3とシクロデキストリン類とを共存さ
せ、その１α−ヒドロキシビタミンＤ3の２４位の水素
原子を水酸基に変換することを特徴とする１α，２４−
ジヒドロキシビタミンＤ3の生物学的製造方法。 - 【請求項４】 ビタミンＤ類を水酸化する微生物菌体ま
たはその産生する酵素を含有する溶液中に、１α−ヒド
ロキシビタミンＤ3、シクロデキストリン類及び界面活
性剤とを共存させ、その１α−ヒドロキシビタミンＤ3
の２４位の水素原子を水酸基に変換することを特徴とす
る１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ3の生物学的製
造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10662399A JP2000295999A (ja) | 1999-04-14 | 1999-04-14 | １α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ３の生物学的製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10662399A JP2000295999A (ja) | 1999-04-14 | 1999-04-14 | １α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ３の生物学的製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000295999A true JP2000295999A (ja) | 2000-10-24 |
Family
ID=14438247
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10662399A Pending JP2000295999A (ja) | 1999-04-14 | 1999-04-14 | １α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ３の生物学的製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000295999A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012512648A (ja) * | 2008-12-19 | 2012-06-07 | イルドン ファーマ カンパニー リミテッド | カルシトリオール又はカルシフェジオールの生産促進用バッファ組成物及びこれを利用したカルシトリオール又はカルシフェジオール製産方法 |
| CN102660618A (zh) * | 2012-04-17 | 2012-09-12 | 四川汪氏动物保健有限责任公司 | 一种微生物转化制造25-羟基维生素d的方法 |
-
1999
- 1999-04-14 JP JP10662399A patent/JP2000295999A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012512648A (ja) * | 2008-12-19 | 2012-06-07 | イルドン ファーマ カンパニー リミテッド | カルシトリオール又はカルシフェジオールの生産促進用バッファ組成物及びこれを利用したカルシトリオール又はカルシフェジオール製産方法 |
| CN102660618A (zh) * | 2012-04-17 | 2012-09-12 | 四川汪氏动物保健有限责任公司 | 一种微生物转化制造25-羟基维生素d的方法 |
| CN102660618B (zh) * | 2012-04-17 | 2013-12-11 | 四川汪氏动物保健有限责任公司 | 一种微生物转化制造25-羟基维生素d的方法 |
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