JP2000166578A

JP2000166578A - Ｄ―パントテン酸の製造方法及びＥ．ｃｏｌｉ属の微生物

Info

Publication number: JP2000166578A
Application number: JP11340841A
Authority: JP
Inventors: Mechthild Dr Rieping; リーピングメヒトヒルト; Georg Thierbach; ティールバッハゲオルク; Walter Dr Pfefferle; プフェッファーレヴァルター; Dusch Nicole; ドゥッシュニコーレ; Joern Kalinowski; カリノヴスキーイェルン; Alfred Puehler; ピューラーアルフレート
Original assignee: Degussa GmbH; Degussa Huels AG
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 1998-12-01
Filing date: 1999-11-30
Publication date: 2000-06-20
Also published as: HU9904446D0; BR9905785A; IL133215A0; ID25769A; ZA997405B; CN1259576A; EP1006193A3; YU61899A; DE19855314A1; CN1128882C; HUP9904446A2; KR20000047840A; SK163999A3; EP1006193A2; US6184006B1

Abstract

(57)【要約】【課題】腸内細菌科のパントテン酸−形成−株をさら
に改善すること【解決手段】腸内細菌類のＤ−パントテン酸を産生す
る微生物の発酵によりＤ−パントテン酸を製造する方法
において、ａ）プラスミドｐＦＶ３１及び／又はｐＦＶ２０２を
含有する株を使用し、この微生物中で、ｂ）ｐａｎＤ−遺伝子及び場合によりさらにアスパル
テート−１−デカルボキシラーゼをコードするヌクレオ
チド配列を強化、特に過剰発現し、ｃ）パントテン酸を培地中又は微生物の細胞中に富化
させ、及びｄ）生じたパントテン酸を分離する、ことを特徴とする、Ｄ−パントテン酸の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】パントテン酸は化粧品、医薬
品、栄養食品及び動物飼料中に使用される商業的に重要
なビタミンである。

【０００２】

【従来の技術】パントテン酸は化学合成又は適当な培養
液中での適当な微生物の発酵により生物工学的に製造す
ることができる。化学合成の場合にはＤＬ−パントラク
トンが重要な中間体である。これはホルムアルデヒド、
イソブチルアルデヒド及びシアニドから多工程法で製造
される。他の方法工程においてラセミ混合物を分離し、
Ｄ−パントラクトンをβ−アラニンで縮合し、Ｄ−パン
トテン酸が得られる。

【０００３】微生物による発酵製造の利点は、Ｌ−パン
トテン酸不含のパントテン酸の所望のＤ−形の直接形成
にある。

【０００４】バクテリア、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｕｒｅａｆ
ａｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｒ
ｙｔｈｒｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ及び酵母、例えばＤｅｂａ
ｒｏｍｙｃｅｓｃａｓｔｅｌｌｉｉの多様な種類は、
欧州特許出願公開第０４９３０６０号明細書に示された
ように、グルコース、ＤＬ−パントイン酸及びβ−アラ
ニンを含有する培養液中でＤ−パントテン酸を産生する
ことができる。欧州特許出願公開第０４９３０６０号明
細書は、さらに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉに
おいて、プラスミドｐＦＶ３及びｐＦＶ５上に含まれる
パントテン酸−生合成遺伝子の増幅により、グルコー
ス、ＤＬ−パントイン酸及びβ−アラニンを含有する培
養液中で、Ｄ−パントテン酸の生成が改善されることが
示されている。

【０００５】欧州特許出願公開第０５９０８５７号明細
書及び米国特許５５１８９０６号明細書は、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株ＩＦＯ３５４７から誘導され
た突然変異種、例えばＦＶ５７１４、ＦＶ５２５、ＦＶ
８１４、ＦＶ５２１、ＦＶ２２１、ＦＶ６０５１及びＦ
Ｖ５０６９を記載しており、これらは多様な代謝拮抗
物、例えばサリチル酸、α−ケト酪酸、β−ヒドロキシ
アスパラギン酸、Ｏ−メチルトレオニン及びα−ケトイ
ソ吉草酸に対して耐性を有し、グルコース含有培養液中
でパントイン酸を及びグルコース及びβ−アラニンを含
有する培養液中でＤ−パントテン酸を産生する。

【０００６】欧州特許出願公開０５９０８５７号明細書
中では、さらに、プラスミドｐＦＶ３１上に含まれる正
確には特定されていないパントテン酸−生合成遺伝子の
増幅により、上記の株中で、グルコース含有培養液中で
Ｄ−パントイン酸の産生が、及びグルコース及びβ−ア
ラニンを含有する培養液中でＤ−パントテン酸の産生が
改善されることが示されている。

【０００７】ＷＯ９７／１０３４０中では、さらに、プ
ラスミドｐＦＶ２０２を用いた、バリン生合成の酵素、
ｉｌｖＧＭ−遺伝子の増幅による酵素アセトヒドロキシ
酸−シンターゼＩＩの活性の向上により、グルコース含
有培養液中でＤ−パントテン酸の産生を、及びグルコー
ス及びβ−アラニンを含有する培養液中でＤ−パントテ
ン酸の産生を改善する。

【０００８】前記の文献からは、前記の株が単にグルコ
ース又は単にサッカロースを基質として含有する培養液
中でパントテン酸をどの程度まで産生するかは推知でき
ない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、腸内細菌科
の、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属のパントテン酸−形
成−株をさらに改善するという課題が生じた。

【００１０】

【課題を解決するための手段】ビタミンのパントテン酸
は、化粧品、医薬品、栄養食品及び動物飼料中に使用さ
れる商業的に重要な生成物である。従って、パントテン
酸の改善された製造方法を提供するという一般的興味が
生じる。

【００１１】以後、Ｄ−パントテン酸又はパントテン酸
又はパントテネートに言及する場合、遊離酸だけでなく
Ｄ−パントテン酸の塩、例えばカルシウム塩、ナトリウ
ム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩を意味するものと
する。

【００１２】本発明の対象は、腸内細菌科、特にＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ属のＤ−パントテン酸産生微生物の発
酵によりＤ−パントテン酸を製造する方法において、こ
の微生物がａ）プラスミド、ｐＦＶ３１及び／又はｐＦＶ２０
２、特にｐＦＶ３１を含有し、その微生物中で、ｂ）ｐａｎＤ−遺伝子及び場合によりさらにアスパル
テート−１−デカルボキシラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．
１．１１）をコードするヌクレオチド配列を強化、有利
に過剰発現させることを特徴とする。

【００１３】ヌクレオチド配列が、特にコリネ型バクテ
リアのＥ．ｃｏｌｉから由来するｐａｎＤをコードする
ＤＮＡを有する微生物を使用するのが有利である。有利
に複製可能なＤＮＡは、（ｉ）配列番号１で示され
た、ｐａｎＤをコードするヌクレオチド配列、又は（ｉ
ｉ）遺伝子コードの同義性（Degeneration）の範囲内
で配列（ｉ）に相当する配列、又は（ｉｉｉ）配列
（ｉ）又は（ｉｉ）に対する相補的配列とハイブリダイ
ズする配列、及び場合により（ｉｉｉｉ）（ｉ）にお
いて機能的に中立なセンス突然変異（sense mutations;
Sinnmutationen）により特徴付けられる。

【００１４】この発酵は、有利にもっぱらグルコース又
はサッカロースを基質として含有し、かつβ−アラニン
及びパントイン酸は含有しない培養液中で行われる。

【００１５】パントテン酸の産生は本発明により改善さ
れる。アスパルテート、β−アラニン、ケトイソバレレ
ート、ケトパントイン酸又はパントイン酸及び／又はこ
れらの塩の添加は場合により望ましい。

【００１６】「強化」の概念は、本願明細書において、
例えば遺伝子のコピー数を高めるか、強いプロモータを
使用するか又は高い活性を有する相当する酵素をコード
する遺伝子を使用することにより、及び場合によりこれ
らの手法を組み合わせることにより、微生物中で相当す
るＤＮＡによりコードされる１種以上の酵素の細胞内活
性を高めることを意味する。

【００１７】本発明の対象である微生物は、グルコー
ス、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルト
ース、糖蜜、デンプン、セルロースから又はグリセリン
とエタノールとからパントテン酸を製造できる。有利に
グルコース又はサッカロースが使用される。特にこれは
グラム陰性バクテリア、例えば腸内細菌科である。腸内
細菌科において、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉの種類のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属が挙げられる。こ
の種のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉの中で、いわ
ゆるＫ−１２株、例えばＭＧ１６５５又はＷ３１１０
（Neidhard et al.:Escherichia coli and Salmonella.
Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washin
gton D.C.)）又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ野
生型ＩＦＯ３５４７（Institut fuer Fermentation, Os
aka, Japan）及びこれらから誘導された突然変異種が挙
げられ、これらはパントテン酸を産生する能力を有す
る。この場合、特に株３５４７／ｐＦＶ３１、５７１４
／ｐＦＶ３１、５２５／ｐＦＶ３１、８１４／ｐＦＶ３
１、５２１／ｐＦＶ３１、ＦＶ２２１／ｐＦＶ３１、Ｆ
Ｖ６０５１／ｐＦＶ３１、ＦＶ５０６９／ｐＦＶ３１、
ＦＶ５０６９／ｐＦＶ２０２及び通常の突然変異誘発、
例えば代謝拮抗物質耐性、例えばアジドチミジン耐性、
チアイソロイシン耐性による選択、及びスクリーニング
により得られたものが挙げられる。特に、株ＦＶ５０６
９／ｐＦＶ３１及びＦＶ５０６９／ｐＦＶ２０２が適し
ており、これらはブタペスト条約によりＦＥＲＭＢＰ
４３９５及びＦＥＲＭＢＰ５２２７として寄託さ
れている（ＥＰ−Ａ−０５９０８５７及び９７／１０３
４０参照）。

【００１８】強化、特に過剰発現の達成のために、例え
ば相応する遺伝子のコピー数を高めるか、又は構造遺伝
子の上流に存在するプロモーター部位及びレギュレーシ
ョン部位を突然変異させる。同様に、構造遺伝子の上流
に組み込まれた発現カセットが作用する。誘導可能なプ
ロモーターにより、付加的に発酵によるＤ−パントテネ
ート形成の過程において発現を向上させることができ
る。ｍ−ＲＮＡの寿命を延長させる手段によっても同様
に発現を改善できる。さらに酵素タンパク質の分解を阻
害することによっても同様に酵素活性が強化される。遺
伝子又は遺伝子構造体は異なるコピー数を有するプラス
ミド中に存在するか又は染色体中に組み込まれ、増幅さ
せることができる。また、さらに該当する遺伝子の過剰
発現は、培地組成の変更及び培養操作の変更により達成
することができる。

【００１９】これについての手引は、当業者には特にCh
ang and Cohen (Journal of Bacteriology 134:1141-11
56 (1978)), Hartley and Gregori (Gene 13:347-353
(1981)), Amann and Brosius (Gene 40:183-190 (198
5)), Broer et al. (Proceedings of the National of
Sciences of the United States of America 80:21-25
(1983)), LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-1
93 (1993)), PCT/US97/13359, Llosa et al. (Plasmid
26:222-224 (1991)), Quandt and Klipp (Gene 80:161-
169 (1989)), Hamilton (Journal of Bacteriology 17
1:4617-4622 (1989), Jensen and Hammer (Biotechnolo
gy and Bioengineering 58, 191-195 (1998)及び遺伝学
及び分子生物学の公知の教書に見ることができる。

【００２０】Ｅ．ｃｏｌｉのｐａｎＤ−遺伝子は公知で
ある。このヌクレオチド配列は Merkels and Nichols
(FEMS Microbiology Letters 143, 247-252 (1996))に
公開されている。Ｅ．ｃｏｌｉのｐａｎＤ−遺伝子の単
離もしくは製造のために、一般的に公知のＰＣＲ（ポリ
メラーゼ連結反応）法又は以下に記載する方法を使用す
ることができる。

【００２１】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｐａｎＤ−遺
伝子の単離のために、まずＥ．ｃｏｌｉ中の微生物の遺
伝子ライブラリーを作成する。遺伝子ライブラリーの作
成は一般に公知の教書及びハンドブックにおいて記載さ
れている。例として、Winnackerの教書：Gene und Klon
e, Eine Einfuehrung in die Gentechnologie (Verlag
Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990)又はSambrook e
t al.の教書：Molecular Cloning, A Laboratory Manua
l (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)が挙
げられる。公知の遺伝子ライブラリーは、Kohara et a
l. (Cell 50, 495-508 (1987))によるλ−ベクター中に
作成されたＥ．ｃｏｌｉＫ−１２株Ｗ３１１０の遺伝
子ライブラリーである。Bathe et al. (Molecular and
General Genetics, 252:255-265, 1996)はＣ．ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリ
を記載しており、この遺伝子ライブラリーはコスミドベ
クターＳｕｐｅｒＣｏｓＩ(Wahl et al., 1987, 84:2
160-2164)を用いてＥ．ｃｏｌｉ株Ｋ−１２ＮＭ５５
４（Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research1
6:1563-1575）中で作成された。Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣ．
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの遺伝子ライブラリーの製造は、
ｐＢＲ３２２（Bolivar, Life Sciences, 25,807-818
(1979)）又はｐＵＣ９（Vieria et al., 1982, Gene, 1
9:259-268）のようなプラスミドも使用することができ
る。宿主として特に制限欠失（restriktionsdefekt）及
び組換え欠失（rekombinationsdefekt）であるような
Ｅ．ｃｏｌｉ株が適している。これについての例は、Gr
ant et al. (Proceedings of the National Academy of
Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)に記載されてた
株ＤＨ５αＭＣＲである。この遺伝子ライブラリーは引
き続き指示株中へ形質転換（Hanahan, Journal of Mole
cular Biology 166, 577-580, 1983）又はエレクトロポ
レーション（Tauch et. al., 1994, FEMS Microbiologi
cal Letters, 123:343-347）によって導入することがで
きる。この指示株は、検出可能な表現型、例えば栄養要
求性を生じさせる重要な遺伝子中に突然変異を有するこ
とにおいて優れている。本発明の範囲内で、ｐａｎＤ遺
伝子中に突然変異を有するＥ．ｃｏｌｉ突然変異体ＤＶ
９（Vallari and Rock, Journal of Bacteriology 198
5, 164:136-142）が特に重要である。指示株、例えばｐ
ａｎＤ−突然変異体ＤＶ９を、重要な遺伝子、例えばｐ
ａｎＤ−遺伝子を有する組換えプラスミドで形質転換
し、それを発現させた後で、この指示株は相応する特
性、例えばパントテン酸−要求性に関して原栄養体とな
る。

【００２２】このように単離された遺伝子もしくはＤＮ
Ａ−フラグメントは、例えばSangeret al. (Proceeding
s of the National of Sciences of the United States
ofAmerica USA, 74:5463-5467, 1977)に記載されたよ
うに配列決定により特性決定されることができる。

【００２３】このようにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの遺
伝子ｐａｎＤをコードする新規のＤＮＡ−配列が得ら
れ、この配列は配列番号１として本発明の構成要素であ
る。さらに、本発明のＤＮＡ−配列から上記記載の方法
を用いて相応する酵素のアミノ酸配列が誘導された。配
列番号２中ではｐａｎＤ−遺伝子産物の得られたアミノ
酸配列、つまりＬ−アスパルテート−１−デカルボキシ
ラーゼが示されている。

【００２４】配列番号１から遺伝子コードの同義性（De
generiertheit）により生じたコードするＤＮＡ−配列
も同様に本発明の構成要素である。同様に、配列番号１
とハイブリダイズするＤＮＡ−配列も本発明の構成要素
である。この専門分野において、さらにタンパク質中で
の同類アミノ酸置換（konservative Aminosaeureaustau
sch）、例えばグリシンのアラニンによる置換又はアス
パラギン酸のグルタミン酸による置換は「センス突然変
異」（sense mutations; Sinnmutationen）として公知
であり、このセンス突然変異はタンパク質の活性の根本
的な変更を引き起こさない、つまり機能的に中立であ
る。さらに、タンパク質のＮ−及び／又はＣ−末端での
変更はその機能に本質的に影響を及ぼさないか、それど
ころか安定化することもできることは公知である。

【００２５】これについての情報は、当業者は特にBen-
Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757
(1987)), O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)),
Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (19
88)) 及び遺伝学及び分子生物学の公知の教書に見るこ
とができる。

【００２６】このように単離されかつ特性決定された遺
伝子は、引き続き個々に又は場合により他のものと組み
合わせてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉの適当な株
中で発現させることができる。遺伝子を発現させるも特
は過剰発現させる公知の方法は、さらに発現シグナルを
設置することができるプラスミドベクターを用いて増幅
することである。プラスミドベクターとして、相応する
微生物中で増幅可能なものが挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ
用に例えばベクターｐＳＣ１０１（Vocke andBastia, P
roceedings of the National Academy of Sciences USA
80 (21), 6557-6561 (1983)）又はｐＫＫ２２３−３
（Brosius and Holy, Proceedings of the National Ac
ademy of Sciences USA 81, 6929 (1984)）又はＣｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ／Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉシャトルベクターｐＺ
８−１（欧州特許第０３７５８８９号明細書）が本発明
のために挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉのこの種の株の例
は、ＦＶ５０６９／ｐＦＶ３１／ｐＮＤ−Ｄ１及びＦＶ
５０６９／ｐＦＶ３１／ｐＮＤ−Ｄ２であり、これらは
プラスミドｐＮＤ−Ｄ１及びｐＮＤ−Ｄ２を含有する。
プラスミドｐＮＤ−Ｄ１はプラスミドｐＺ８−１ベース
のＥ．ｃｏｌｉ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトルベ
クターであり、このシャトルベクターはＥ．ｃｏｌｉの
ｐａｎＤ−遺伝子を有する。プラスミドｐＮＤ−Ｄ２は
プラスミドｐＺ８−１ベースのＥ．ｃｏｌｉ−Ｃ．ｇｌ
ｕｔａｍｉｃｕｍシャトルベクターであり、このシャト
ルベクターはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｐａｎＤ−遺
伝子を有する。

【００２７】染色体突然変異、代謝物質及び代謝拮抗物
質に対する耐性を引き起こすか又はパントテン酸の前駆
体の流出を阻止する染色体突然変異は、個々に又は一緒
に、本発明の対象である手段を用いて有利に組み合わせ
ることができることは当業者には明らかである。

【００２８】本発明により製造された微生物は、連続的
に又は不連続的に、バッチ法（Satzkultivierung）又は
フィードバッチ法（fed batch; Zulaufverfahren）又は
繰り返しフィードバッチ法（repeated fed batch;repet
itives Zulaufverfahren）でパントテン酸−産生の目的
で培養することができる。公知の培養法に関する概要は
Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bi
overfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttga
rt, 1991))の教書又はStorhas (Bioreaktorenund perip
here Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wi
esbaden, 1994))の教書に記載されている。

【００２９】使用すべき培養基は適当な手法でそれぞれ
の微生物の要求を満たさなければならない。多様な微生
物の培養基の記載は、ハンドブック"Manual of Methods
forGeneral Bacteriology", American Society for Ba
cteriology (Washington D.C., USA, 1981)になされて
いる。炭素源として、糖及び炭水化物、例えばグルコー
ス、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルト
ース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油及び脂肪、例
えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ脂
肪、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリ
ノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノー
ル及び有機酸、例えば酢酸が使用される。この材料は単
独で又は混合物として使用することができる。窒素源と
して、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母抽出
物、肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ膨潤水、ダイ
ズ粉及び尿素又は無機化合物、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム
及び硝酸アンモニウムが使用される。この窒素源は個々
に又は混合物として使用することができる。リン源とし
て、リン酸、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カ
リウム又は相応するナトリウム含有塩を使用することが
できる。この培養基は、さらに成長に必要な金属塩、例
えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有しなければなら
ない。最後に、必須の成長物質、例えばアミノ酸及びビ
タミンを前記の物質に対して付加的に使用することがで
きる。この培養基に所望の場合にさらにパントテン酸の
前駆体、例えばアスパルテート、β−アラニン、ケトイ
ソバレレート又はケトパントイン酸又はパントイン酸及
び場合によりこれらの塩を添加することができる。前記
の添加物質は培養へ１回のバッチの形で添加するか、又
は適当な手法で培養の間に供給することができる。

【００３０】培地のｐＨ−コントロールのために、塩基
性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
アンモニア、又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸が
適当な手法で使用される。泡形成を制御するために、消
泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用する
ことができる。プラスミドの安定を維持するために、培
地に適当な選択作用する物質、例えば抗生物質を添加す
ることができる。好気性条件を維持するために、酸素又
は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培地中へ導入す
る。培地の温度は通常２５℃〜４５℃、有利に３０℃〜
３７℃である。パントテン酸の最大量が生成されるまで
培養は継続される。この目的は通常１０時間〜１６０時
間の間に達成される。

【００３１】酵素Ｌ−アスパルテート１−デカルボキ
シラーゼの高い活性を有する株は、Ｌ−アスパルテート
からβ−アラニンを製造するために使用できることは当
業者には明らかである。このため、公知の発酵による方
法、酵素による変換反応又はこの両方の組合せが使用さ
れる。

【００３２】生成されたパントテン酸の濃度は、公知の
方法（Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560
(1992)）で測定することができる。

【００３３】次の微生物をブタペスト条約に従ってDeut
sche Sammlung fuer Mikrorganismen und Zellkulturen
(DSMZ, Braunschweig, Deutschland)に寄託した：Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−Ｄ２をＤＳＭ１２４３８
として。

【００３４】

【実施例】本発明を次に実施例につき詳説する。

【００３５】例１Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｐａｎＤ−遺伝子のクロー
ニング及び配列決定１．ｐａｎＤ−遺伝子のクローニングＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２から
の染色体ＤＮＡを、Tauch et al. (1995, Plasmid, 33:
168-179)に記載されたように単離し、制限酵素Ｓａｕ３
Ａ（Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland),製品
表示Ｓａｕ３Ａ、Code no. 27-0913-02）を用いて部分
的に分解した。７〜９ｋｂのサイズ領域のＤＮＡ−フラ
グメントを"Nucleotrap Extraction Kit for Nucleic A
cids" (Machery und Nagel, Duersen, Deutschland; Ca
t. No. 740584)を用いて単離し、MBI Fermentas社（Vil
nius, Litauen）のベクターｐＵＣ１９（Norrander et
al., 1982, Gene, 26:101-106）の脱リン酸化されたＢ
ａｍＨＩ−切断部位へ連結した。この連結はSambrook e
t al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor)に記載されたように実施し、そ
の際、ＤＮＡ−混合物はＴ４−リガーゼ（Pharmacia Bi
otech, Freiburg, Deutschland）と一緒に一晩中インキ
ュベートした。この連結混合物を引き続きＥ．ｃｏｌｉ
株ＤＨ５αＭＣＲ（Grant, 1990, Proceedings of the
National Acadimies of Sciences USA, 87:4645-4649）
中へエレクトロポレーション（Tauch, 1994, FEMS Micr
obiological Letters, 123:343-347）し、ＬＢ−寒天
（Lennox, 1955, Virology, 1:190）＋アンピシリン１
００μｇ／ｍｌ上で平板培養した。３７℃で２４時間の
インキュベーションの後に、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
遺伝子ライブラリーを、"Alkalischen-Lyse-Methode" B
irnboim and Doly (Nucleic Acids Research, 7:1513-1
523, 1997)によるプラスミド−ＤＮＡの再単離によって
形質転換体から得た。この遺伝子ライブラリーを用い
て、ｐａｎＤ−遺伝子中に突然変異を有するＥ．ｃｏｌ
ｉ株ＤＶ９（Vallari and Rock, 1985, Journal of Bac
teriology, 164:136-142）のコンピテント細胞をエレク
トロポレーションした。このエレクトロポレーション処
理物を再生期間（Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol
ogical Letters, 123: 343-347）に引き続き培地Ｅ（Vo
gel and Bonner, 1956, Journalof Biological Chemist
ry, 218:97-106）を用いて２回培養した。培地Ｅの組成
を表１に示した。この細胞を２５０ｍｌのエルレンマイ
ヤーフラスコ中に装入した培地Ｅ５０ｍｌ＋アンピシ
リン１００μｇ／ｍｌに接種し、エアシェーカー中で２
５０ｒｐｍで３９℃でインキュベーションした。２日間
のインキュベーションの後に、バクテリア懸濁液を希釈
し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを補充したＬＢ−寒
天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上に塗り付け
た。

【００３６】

【表１】

【００３７】ＤＶ９−形質転換体のプラスミド−ＤＮＡ
を単離し、これをｐＮＩＣ−１．３とし、アガロースゲ
ル電気泳動（Sambrook et al., Molecular cloning. A
laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Labor
atory Press）及び公知の長さの標準−ＤＮＡ−フラグ
メントとの比較により特性決定した。プラスミドｐＮＩ
Ｃ−１．３は７ｋｂｐの長さの挿入物を有する。ｐＮＩ
Ｃ−１．３の相補能力をｐａｎＤ突然変異体ＤＶ９の新
たな形質転換により調査した。得られた形質転換体は再
び、β−アラニン不含培地Ｅ中で上記の条件下で成長す
ることができた。

【００３８】７ｋｂのインサートのサブクローニング
は、プラスミドｐＮＩＣ−１．３を制限酵素ＢａｍＨＩ
（Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland),製品表
示ＢａｍＨＩ、Code no. 27-0868-03）、ＥｃｏＲＩ（P
harmacia Biotech (Freiburg,Deutschland),製品表示Ｅ
ｃｏＲＩ、Code no. 27-0884-03）及びＢｇｌＩＩ（Pha
rmacia Biotech (Freiburg, Deutschland),製品表示Ｂ
ｇｌＩＩ、Code no. 27-0946-02）を用いて分解し及び
引き続き相応して制限消化したベクターｐＫ１８ｍｏｂ
（Schaefer, 1994, Gene, 145:69-73）中へ連結した。
得られた連結物をＥ．ｃｏｌｉｐａｎＤ突然変異体Ｄ
Ｖ９中へエレクトロポレーションし；相補的形質転換体
に関して上記のように選択を行った（この場合、寒天プ
レートはカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有）。相補的
な単一クローンのプラスミドを単離し、制限分析により
特性決定した。約３ｋｂのサイズのＤＮＡ−インサート
を有するＥｃｏＲＩ−サブクローン（以後ｐＮＩＣ−１
０とする）を次の配列分析のために選択した。

【００３９】２．ｐａｎＤ−遺伝子の配列決定ｐＮＩＣ−１０の３ｋｂ断片の二本鎖の配列決定のため
に、この断片を多様な制限酵素で分解し、この断片をプ
ラスミドｐＵＣ１９又はｐＫ１８ｍｏｂ中へサブクロー
ニングした。配列決定のために使用したプラスミド−Ｄ
ＮＡは、"QIAGEN Plasmid Mini kit" (Qiagen, Inc., C
hatsworth, Ca., USA)を用いて製造元の指示により単離
し、プラスミドサイズの決定をアガロースゲル電気泳動
を用いて実施した。

【００４０】配列決定は、Zimmermann et al. (Nucleic
Acids Research, 18:1067, 1990)により改良したSange
r et al. (Proceedings of the National Academies of
Sciences USA, 74:5463-5467, 1977)のジデオキシ−鎖
中断−法により行った。Pharmacia (Product No. 27-26
90-02, Freiburg, Germany)の"Cy5-AutoRead Sequencin
g kit"を使用した。ゲル電気泳動による分離及び配列反
応の分析を、Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, S
chweden)社の"automatischen Laser-Fluoreszenz (A.L.
F.) Express DNA Sequenziergeraet"を備えた"Long Ran
ger Gel Solution"-Polyacrylamidgel (FMC BioProduct
s, Rockland, Me., USA)中で行った。得られた粗−配列
データを引き続きStaden-Programpakets（Nucleic Acid
s Research, 14:217-231, 1986）Version 97-0を使用し
て処理した。ｐＮＩＣ−１０サブクローンの全体の単一
配列は関連する３０６０ｂｐの長さのＣｏｎｔｉｇに組
み立て、これをＣｏｎｔｉｇ１３とした。全体のＤＮＡ
−フラグメントのプログラム XNIP (Staden, 1986, Nuc
leic Acids Research, 14:217-231)を用いたコンピュー
タによるコード領域分析は５つのオープンリードフレー
ム（ＯＲＦｓ）の同定が明らかになった。図１におい
て、Ｃｏｎｔｉｎｇ１３の制限マップ及びｏｒｆ−１〜
ｏｒｆ−５として示されるＯＲＦｓの長さが示されてい
る。相同性分析は、"National Library of Medicine"
(Bethesda, MD, USA)のＮＣＢＩ−サービスのオンライ
ンサービスを介して供給された"BLAST search program
s" (Gishand States, 1993, Nature of Genetics, 3:26
6-272; Altschul et al., 1990,Journal of Molecular
Biology, 215:403-410)を用いて実施した。Ｃｏｎｔｉ
ｇ１３の分析によりｏｒｆ−３がｐａｎＤ−遺伝子であ
ることを明らかになった。以後、ｏｒｆ−３をｐａｎＤ
とした。ｐａｎＤ−遺伝子を有するＤＮＡ−フラグメン
トのヌクレオチド配列を配列番号１として記載した。上
記方法で生じたｐａｎＤ−遺伝子産物のアミノ酸配列を
配列番号２として記載した。

【００４１】例２ｐａｎＤ−遺伝子の発現のためのベクターの構成パントテネート生合成−遺伝子であるＣ．ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍからのｐａｎＤ及びＥ．ｃｏｌｉからのｐａｎ
Ｄをポリメラーゼ連結反応（ＰＣＲ）並びに合成オリゴ
ヌクレオチドの適用下に増幅した。ＰＣＲ−実験はGibc
o-BRL (Eggestein, Deutschland社）のＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて"PCT-100 Thermocycler" (MJ Res
earch Inc., Watertown, Mass., USA)中で実施した。９
４℃で２分間の１回の変性工程に続き９４℃で９０秒の
変性工程、Ｔ＝（２ＡＴ＋４ＧＣ）−５℃（Suggs, et
al., 1981, p. 638-693, In: D.D. Brown, and C.F. Fo
x(eds.), Developmental biology using purified gene
s. Academic Press, NewYork, USA）のプライマー依存
性温度で９０秒のアニーリング工程並びに７２℃で９０
秒間の延長工程を続けた。後の３工程を３５回のサイク
ルで繰り返し、この反応は７２℃で１０分の最後の延長
工程で完了した。こうして増幅した産物を、アガロース
ゲル中で電気泳動により試験した後、製造元の指示に応
じて、ベクターｐＣＲ^(R) ２．１（Original TA Cloni
ng Kit, Invitrogene (Leek, Niederlande),製品表示Or
iginal TA Cloning ^(R) Kit, Cat. no. KNM2030-01）中
に連結し、引き続きＥ．ｃｏｌｉ株ＴＯＰ１０Ｆ′中へ
形質転換した。形質転換体に関する選択は、アンピシリ
ン１００μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０
μｇ／ｍｌを有するＬＢ−寒天プレート上で２４時間３
７℃でインキュベーションすることによって行った。

【００４２】このパントテネート生合成−遺伝子のＣ．
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２（図２）の
ｐａｎＤ及びＥ．ｃｏｌｉＫ１２（W.K. Merkel and
B.P. Nichols, 1993, GenBank: L17086）のｐａｎＤの
ヌクレオチド配列から出発し、ＰＣＲ−プライマーを合
成した（MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland）。こ
のプライマーは、増幅されたフラグメントが前記遺伝子
並びにそのネガティブなリボソーム−結合部位を有する
が、可能なプロモータ−部位は有していないように選択
された。さらに、目的ベクター中へのクローニングを可
能にするように適当な制限切断部位を挿入した。ＰＣＲ
−プライマーの配列、挿入された切断部位（下線の配
列）並びに増幅された遺伝子（フラグメントのサイズを
括弧中にｂｐで記載）を次の表２に記載した。

【００４３】

【表２】

【００４４】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ並びにＥ．ｃｏ
ｌｉ中での発現のための基本ベクターは、図２に示した
Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトル−発
現ベクターｐＺ８−１（欧州特許第０３７５８８９号明
細書）を使用した。予めベクターｐＣＲ^(R)２．１中に
クローニングされたｐａｎＤ_C.g.増幅物を、プライマー
が挿入された制限切断部位を用いて同様に処理された発
現ベクターｐＺ８−１中へ連結し、それによりこのプラ
スミド上に含まれるｔａｃ−プロモータの制御下におか
れる。この増幅物のｐａｎＤ_E.c.はＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ
ＩＩ−フラグメントとしてベクターｐＺ８−１の適合す
るＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−制限末端中へクローニング
された。こうして構成された発現プラスミドについての
それぞれプラスミドの表示を表２に記載した。遺伝子ｐ
ａｎＤ_E.c.及びｐａｎＤ_C.g.についてのクローニングス
トラテジーを図２に示した。発現プラスミドの正確なク
ローニングはそれぞれのインサートの配列決定により調
査された。

【００４５】このプラスミドｐＮＤ−Ｄ１及びｐＮＤ−
Ｄ２はＥ．ｃｏｌｉ株ＦＶ５０６９／ｐＦＶ３１中に形
質転換され、形質転換体はＬＢ−寒天（Lennox, 1955,
Virology, 1:190)＋カナマイシン５０μｇ／ｍｌ上で選
択した。得られた株をＦＶ５０６９／ｐＦＶ３１／ｐＮ
Ｄ−Ｄ１及びＦＶ５０６９／ｐＦＶ３１／ｐＮＤ−Ｄ２
とした。

【００４６】例３Ｅ．ｃｏｌｉＦＶ５０６９／ｐＦＶ３１から誘導され
た多様な株によるパントテネートの形成Ｄ−パントテネートの定量的測定は、Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍパントテネート−アッ
セイ（試験株：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔ
ａｒｕｍＡＴＣＣ８０１４，Cat. No. 3211-30-3；
培養基：Bacto Pantotenate Assay Medium (DIFCO Labo
ratories, Michigan, USA), Cat. No.0604-15-3）を用
いて行った。この指示株はパントテネートの存在の場合
にだけ前記の培養基中で成長し、この成長は、測光によ
り測定可能に、培養基のパントテネート濃度に直線的に
依存することが示された。校正のためにパントテネート
のヘミカルシウム塩を使用した（Sigma,製品表示Ｐ
２２５０）。光学密度はLKB Biochrom Photometer, Pha
rmacia Biotech社(Freiburg, Deutschland)で、５８０
ｎｍの測定波長（ｏ．Ｄ．₅₈₀）で決定した。

【００４７】基質としてグルコース又はサッカロースを
用いたＥ．ｃｏｌｉ株ＦＶ５０６９／ｐＦＶ３１／ｐＺ
８−１、ＦＶ５０６９／ｐＦＶ３１／ｐＮＤ−Ｄ１及び
ＦＶ５０６９／ｐＦＶ３１／ｐＮＤーＤ２のパントテネ
ート−産生を測定した。グルコース４ｇ／ｌ又はサッカ
ロース４ｇ／ｌが基質として補充され、株ＦＶ５０６９
／ｐＦＶ３１／ｐＮＤ−Ｄ１及びＦＶ５０６９／ｐＦＶ
３１／ｐＮＤ−Ｄ２の場合にカナマイシン５０μｇ／ｍ
ｌを有する培地Ｅを試験培地として使用した。５００ｍ
ｌのエルレンマイヤーフラスコ中に装入した試験培地５
０ｍｌを同じ培地の１６時間後の培養から出発して、
ｏ．Ｄ．₅₈₀が０．１になる程度に増幅した。この培養
を３７℃で２５０ｒｐｍで７２時間インキュベーション
した後、この細胞を５０００×ｇで１０分間遠心分離す
ることでペレット化した。得られた細胞不含の上澄液を
滅菌濾過し、パントテネート−定量化のために４℃で貯
蔵した。

【００４８】培養上澄液のＤ−パントテネートの定量化
は、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＡＴＣＣ８０１４を
用いてDIFCO (DIFCO Manual, 10th Edition, p. 1100-1
102;Michigan, USA)社のハンドブックの記載により行っ
た。この測定結果を表３及び表４に記載した。

【００４９】表３基質としてグルコースを用いたパントテネート−蓄積

【００５０】

【表３】

【００５１】表４基質としてサッカロースを用いたパントテネート−蓄積

【００５２】

【表４】

【００５３】配列表（１）書誌的事項（ｉ）出願人（Ａ）名称：Degussa Aktiengesellschaft （Ｂ）番地：Weissfrauenstr. 9 （Ｃ）都市：Frankfurt am Main （Ｄ）州：Hessen （Ｅ）国：Deutschland （Ｆ）郵便番号：D-60311 （ｉｉ）発明の名称：Ｄ−パントテン酸の製造方法及びＥ．ｃｏｌｉ属の微生物（ｉｉｉ）配列の数：２（ｉｖ）コンピュータ記録方式：（Ａ）記録媒体：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：IBM PC互換（Ｃ）オペレーションシステム：PC-DOS/MS-DOS （Ｄ）ソフトウェアー：PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA) （２）配列番号１に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：５４０塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ゲノム−ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし（ｉｖ）アンチセンス：なし（ｖｉ）起源（Ａ）生物名：Corynebacterium glutamicum （Ｂ）株名：ATCC13032 （ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：７７．．４８４（Ｄ）他の情報：/codon_start=77 /EC_number=4.1.1.11 /product="Ｌ−アスパルテート−１−デカルボキシラーゼ" /gene="ｐａｎＤ" （ｘｉ）配列番号１：

【００５４】

【外１】

【００５５】（２）配列番号２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１３６アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：タンパク質（ｘｉ）配列番号２：

【００５６】

【外２】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｏｒｆ１〜ｏｒｆ５を有するＣｏｎｔｉｇ１３
のマップを示す図。

【図２】プラスミドｐＺ８−１のプラスミドマップ及び
プラスミドｐＮＤ−Ｄ１及びｐＮＤ−Ｄ２のクローニン
グストラテジーを示す図。

【符号の説明】

ＴＩＴ２ｒｒｎＢ−遺伝子のトランスクリプション−
ターミネータＰｔａｃｔａｃプロモータｐａｎＤｐａｎＤ遺伝子のコード領域ｒｅｐ−Ｃ．ｇ．Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の複製
のためのＤＮＡ−領域ｏｒｉＶ−Ｅ．ｃ．Ｅ．ｃｏｌｉ中の栄養成長のトラ
ンスファー用の起源ｋａｎカナマイシン耐性ＥｃｏＲＩ制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位Ｅ制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位ＢａｍＨＩ制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位Ｂ制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位ＢｇｌＩＩ制限酵素ＢｇｌＩＩの切断部位ＣｌａＩ制限酵素ＣｌａＩの切断部位Ｈ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位Ｐ制限酵素ＰｓｔＩの切断部位ＰｓｔＩ制限酵素ＰｓｔＩの切断部位ＳａｌＩ制限酵素ＳａｌＩの切断部位ＳｃａＩ制限酵素ＳｃａＩの切断部位ＳｐｈＩ制限酵素ＳｐｈＩの切断部位Ｘ制限酵素ＸｂａＩの切断部位ＸｈｏＩ制限酵素ＸｈｏＩの切断部位

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ゲオルクティールバッハドイツ連邦共和国ビーレフェルトグンストシュトラーセ 21 (72)発明者ヴァルタープフェッファーレドイツ連邦共和国ハレヤーンシュトラーセ 33 (72)発明者ニコーレドゥッシュドイツ連邦共和国ビーレフェルトアムポッゲンポール 38 (72)発明者イェルンカリノヴスキードイツ連邦共和国ビーレフェルトレンバッハシュトラーセ 19 (72)発明者アルフレートピューラードイツ連邦共和国ビーレフェルトアムヴァルトシュレスヒェン２

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】腸内細菌類のＤ−パントテン酸を産生す
る微生物の発酵によりＤ−パントテン酸を製造する方法
において、ａ）プラスミドｐＦＶ３１及び／又はｐＦＶ２０２を
含有する株を使用し、この微生物中で、ｂ）ｐａｎＤ−遺伝子及び場合によりさらにアスパル
テート−１−デカルボキシラーゼをコードするヌクレオ
チド配列を強化し、特に過剰発現させ、ｃ）パントテン酸を培地中又は微生物の細胞中に富化
させ、及びｄ）生じたパントテン酸を分離する、ことを特徴とする、Ｄ−パントテン酸の製造方法。
【請求項２】複製可能なＤＮＡを有する微生物を使用
し、このヌクレオチド配列はコリネバクテリウム由来の
ｐａｎＤをコードする、請求項１記載の方法。
【請求項３】複製可能なＤＮＡが、（ｉ）配列番号
１で示された、ｐａｎＤをコードするヌクレオチド配
列、又は（ｉｉ）遺伝子コードの同義性の範囲内で配
列（ｉ）に相当する配列、又は（ｉｉｉ）配列（ｉ）
又は（ｉｉ）に対する相補的配列とハイブリダイズする
配列、及び場合により（ｉｉｉｉ）（ｉ）において機
能的に中立なセンス突然変異により特徴付けられる、請
求項２記載の方法。
【請求項４】微生物を使用し、前記微生物中で、遺伝
子もしくはヌクレオチド配列の強化（過剰発現）の達成
のためにそのコピー数を遺伝子もしくはヌクレオチド配
列を有するプラスミドベクターを用いて高める、請求項
１記載の方法。
【請求項５】微生物を使用し、前記微生物中で、過剰
発現の達成のために、構造遺伝子の上流に存在するプロ
モータ部位及びレギュレーション部位を突然変異させ
る、請求項１記載の方法。
【請求項６】微生物を使用し、前記微生物中で、過剰
発現の達成のために、構造遺伝子の上流に発現カセット
を組み込む、請求項１記載の方法。
【請求項７】強化の達成のために、上記の配列からマ
トリックスとして読み取られるｍＲＮＡの寿命を延長す
る及び／又は相応する酵素タンパク質の分解を阻害す
る、請求項１記載の方法。
【請求項８】さらに、代謝物質−もしくは代謝拮抗物
質−耐性突然変異を個々に又は一緒に有する微生物を使
用する、請求項１から７までのいずれか１項記載の方
法。
【請求項９】過剰発現の達成のために、微生物を相応
する変更した培養基中で発酵させるか又は発酵操作を変
更する、請求項１から８までのいずれか１項記載の方
法。
【請求項１０】パントテネート−（パントテン酸）−
形成を低下させる物質代謝経路が少なくとも一部遮断さ
れている微生物を使用する、請求項１から９までのいず
れか１項記載の方法。
【請求項１１】微生物を使用し、前記微生物中で、ｐ
ａｎＤ−遺伝子に対して付加的に、パントテン酸形成の
物質代謝経路の残りの、特にコリネバクテリウム由来の
遺伝子を個々に又は一緒に過剰発現させる、請求項１か
ら１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】ケトパントエート−ヒドロキシメチル
トランスフェラーゼ（ＥＣ４．１．２．１２）及びパ
ントテネート−シンテターゼ（ＥＣ６．３．２．１）
の酵素をコードする１種以上の遺伝子を、特にコリネバ
クテリウム由来のｐａｎＤ−遺伝子に対して付加的に過
剰発現させる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】前記の遺伝子を個々に含有する多様な
適合性のプラスミドベクターを用いて形質転換した微生
物を使用する、請求項１１及び１２記載の方法。
【請求項１４】プラスミドベクターを用いて形質転換
したＥ．ｃｏｌｉ種の微生物を使用し、前記プラスミド
ベクターはｐａｎＤ−遺伝子を含んだ前記遺伝子の１種
以上を有し、前記ベクター中で前記遺伝子は連続して配
置されておりかつ共通のプロモータの制御下にあるか、
又は相互に別々に配置されており、異なるプロモータの
制御下にある、請求項１１及び１２記載の方法。
【請求項１５】コリネバクテリウム・グルタミクムＡ
ＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−Ｄ２としてＤＳＭ１２４
３８の名称で寄託された、図２に記載された制限マップ
により特徴付けられるプラスミドベクターｐＮＤ−Ｄ２
を含有する微生物を使用する、請求項１から１４までの
いずれか１項記載の方法。
【請求項１６】次の工程：ａ）少なくともｐａｎＤ−遺伝子が強化（過剰発現）
され、場合によりｐａｎＢ−遺伝子及び／又はｐａｎＣ
−遺伝子と組み合わせた、Ｅ．ｃｏｌｉ種の微生物の発
酵、ｂ）培地中又は微生物の細胞中でのパントテン酸の富
化、ｃ）パントテン酸の単離を実施する、請求項１から１５までのいずれか１項記載
のパントテン酸の製造方法。
【請求項１７】過剰発現された遺伝子がコリネバクテ
リウム属の微生物から由来する、請求項１６記載の方
法。
【請求項１８】工程ａ）において、アスパルテート、
β−アラニン、ケトパントエート、ケトイソバレレート
又はパントエートのグループから選択されるパントテン
酸の前駆体を添加する、請求項１６又は１７記載の方
法。
【請求項１９】プラスミドｐＦＶ３１及び／又はｐＦ
Ｖ２０２を含有し、（ｉ）ｐａｎＤをコードする、配
列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は（ｉｉ）
遺伝子コードの同義性の範囲内で配列（ｉ）に相当する
配列、又は（ｉｉｉ）配列（ｉ）又は（ｉｉ）に対す
る相補的配列とハイブリダイズする配列、及び場合によ
り（ｉｉｉｉ）（ｉ）において機能的に中立なセンス
突然変異により特徴付けられる複製可能なＤＮＡの導入
により形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ属の微生物。