JP2000060547A

JP2000060547A - 新規アルカリプロテア―ゼおよびその製造法

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Publication number: JP2000060547A
Application number: JP11165534A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Moriyama; 康司森山; Shinji Mansei; 慎二満生; Yasuhiro Shimizu; 保広清水; Atsushi Sugiyama; 敦史杉山; Akiyo Kamiyama; 明代上山
Original assignee: Toto Ltd
Current assignee: Toto Ltd
Priority date: 1998-06-11
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2000-02-29
Anticipated expiration: 2019-06-11
Also published as: JP3889524B2

Abstract

(57)【要約】【課題】より分子量が小さくて、優れた蛋白分
解活性と高い温度での安定性とを有する新規なアルカリ
プロテアーゼを提供すること。【解決手段】（ａ）作用および基質特異性：タン
パク質およびペプチドに特異的に作用し、そのペプチド
結合をエンド型の機作により切断して、低分子量のオリ
ゴペプチドおよびアミノ酸を生成する、（ｂ）安定温
度：ｐＨ７．０、１０分間の処理条件において、カルシ
ウムの添加、無添加にかかわらず７０℃まで安定であ
る、（ｃ）分子量：約20,000（ＳＤＳ電気泳動法）であ
る、（ｄ）等電点：９．３以上（等電点電気泳動法）で
ある、（ｅ）比活性：カゼインを基質とした場合は約15
2,000（U/mg蛋白）、ケラチンを基質とした場合は54,60
0（U/mg蛋白）である、との理化学的性質を有するアル
カリプロテアーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なアルカリプ
ロテアーゼ、その製造法及び該アルカリプロテアーゼ産
生能を有する新規な好アルカリ性放線菌に関する。

【従来の技術】アルカリプロテアーゼはタンパク質のペ
プチド結合をアルカリ領域において特異的に加水分解す
る酵素であり、食品、繊維、皮革、洗剤等の工業におい
て広く利用されている。このようなアルカリプロテアー
ゼは糸状菌、酵母、細菌等の微生物により広く生産され
ることが知られており、またいわゆる好アルカリ性微生
物と呼ばれる一群の微生物によっても生産される。前述
された好アルカリ性微生物から生産されるアルカリプロ
テアーゼとしては、いわゆる好アルカリ性バチルス属菌
から得られる酵素（例えば、特公平7-63366 、特公平7-
63367 、特公平7-63368 等）が多数既に知られており、
主に洗剤用として開発が進められている。また、同様な
好アルカリ性バチルス属菌から得られる耐熱性酵素とし
て、AH-101株の生産するアルカリプロテアーゼ（特開平
2-255087）およびB18-1 株の生産するアルカリプロテア
ーゼ（特公平7-63368 ）等が知られている。しかしなが
ら、同じ好アルカリ性微生物である好アルカリ性放線菌
の産生するプロテアーゼについてはあまり知られておら
ず、わずかに好アルカリ性ストレプトマイセス属菌由来
の酵素（Agr.Biol.Chem.,38 (1)37-44,1974）ならびに
好アルカリ性サーモアクチノマイセス属HS682 株のアル
カリプロテアーゼ（Biosci.Biotech.Biochem.,56(2),24
6-250,1992）等が報告されているにすぎない。

【０００２】一方、洗剤用にプロテアーゼを応用する場
合、ケラチン等の不溶性タンパク質に対しても良好に作
用する酵素が望ましいことが指摘されている（皆川基：
繊消誌、第26巻,322頁,(1985) ）。また、浴槽、風呂
釜、浴床排水溝、循環浴槽の配管、便器あるいは洗面化
粧台ドレインの洗浄剤にプロテアーゼを応用する場合で
は、30℃前後の中温で充分な活性を保持し、かつ毛髪、
垢あるいは汚れなどのケラチンを代表とする不溶性タン
パク質を強力に分解する能力が要求される。加えて、現
状の洗剤および洗浄剤は、配合組成の関係からそのpHが
アルカリ領域にあることから、これらに配合する酵素は
アルカリプロテアーゼが最適である。さらに、ケラチン
を主要タンパク質とする毛髪、羽毛等は化学合成が不可
能なアミノ酸であるシステインの製造原料として重要で
ある。しかし、現状では過激な反応条件のため著量のシ
ステインが分解されてしまい収量が極めて悪いため、プ
ロテアーゼ処理等の温和な加水分解方法が望まれてい
た。さらに、発展途上国で未利用資源として大量に廃棄
される牛、水牛の角および羽毛等は有用なアミノ酸で構
成されており、穏和な加水分解でペプチド液、アミノ酸
液が製造できれば、輸液等の医薬品あるいは栄養補助剤
として、これらの国々にとって極めて有用である。これ
らの場合においても、ケラチンが高アルカリ領域におい
て膨潤し酵素の作用を受けやすくなるという性質から、
加水分解剤としての酵素はアルカリプロテアーゼが最適
である。

【０００３】これらの用途以外にも、台所洗剤や食器洗
浄器用洗剤および住宅洗剤等の洗剤、あるいは絹や羊毛
および皮革等の精錬（風合いの向上）、脱毛クリームや
入浴剤およびコンタクトレンズ洗浄剤等の医薬部外品、
さらに肉質軟化剤等の食品加工や医薬、試薬等の用途
に、不溶性タンパク質の分解力に優れたアルカリプロテ
アーゼは極めて有用である。このような用途に対して、
特にケラチン等の不溶性タンパク質の分解力において従
来のアルカリプロテアーゼは不充分であり、さらに強力
なケラチン分解力を有する新規なアルカリプロテアーゼ
の開発が望まれていた。このような状況において、本発
明者らは、すでに新規なアルカリプロテアーゼを見いだ
し、特許出願している（特開平９−１２１８５８号公
報）。このアルカリプロテアーゼは、優れた蛋白分解活
性を有するものの、分子量が大きく、かつカルシウム無
添加の時の安定性が５５℃と低いとの問題点があり、よ
り分子量が小さくて、優れた蛋白分解活性と高い温度で
の安定性とを有する新規なアルカリプロテアーゼの開発
が望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、より分子量
が小さくて、優れた蛋白分解活性と高い温度での安定性
とを有する新規なアルカリプロテアーゼを提供すること
を目的とする。また本発明は、上記アルカリプロテアー
ゼを生産する新規微生物およびその微生物を利用した上
記アルカリプロテアーゼの製造法を提供することを目的
する。本発明は、また、上記アルカリプロテアーゼを含
有する各種組成物を提供することを目的する。

【課題を解決するための手段】本発明者らは、特開平９
−１２１８５８号公報に記載の新規微生物であるＴＯＴ
Ｏ−９３０５株を継代培養していたところ、驚くべきこ
とに、上記課題を解決しえるアルカリプロテアーゼを産
生する変異株を見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、下記の理化学的性質
を有するアルカリプロテアーゼを提供する。 (a) 作用および基質特異性：タンパク質およびペプチド
に特異的に作用し、そのペプチド結合をエンド型の機作
により切断して、低分子量のオリゴペプチドおよびアミ
ノ酸を生成する。 (b) 安定温度：pH7.０、10分間の処理条件において、カ
ルシウムの添加、無添加にかかわらず70℃まで安定であ
る。 (c) 分子量：約20,000（ＳＤＳ電気泳動法）である。 (d) 等電点：9.３以上（等電点電気泳動法）である。 (e) 比活性：カゼインを基質とした場合は約152,000(U/
mg蛋白）、ケラチンを基質とした場合は54,600(U/mg 蛋
白）である。本発明は、又、ストレプトマイセス属に属し、上記アル
カリプロテアーゼ産生能を有する微生物を培養する工程
と、該工程で得られる培養物より該新規アルカリプロテ
アーゼを分離する工程を含んでなる、アルカリプロテア
ーゼの製造法及び上記新規アルカリプロテアーゼ産生能
を有する新規菌株、特にストレプトマイセスエスピー
TOTO- 9805株（FERM BP-6359)を提供する。本発明
は、又、上記プロテアーゼを含有する洗浄剤組成物をも
提供する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明で用いるアルカリプロテア
ーゼとしては、上記(a) 〜(e) の理化学的性質に加え
て、下記の理化学的性質を有するものが好ましい。 (f) 最適pH：最適pHはカゼインを基質とした場合、10.5
〜11.5である。 (g) 安定pH：30℃、24時間の処理条件において、pH1.５
〜10.0で安定である。 (h) 最適温度：最適作用温度は60℃である。 (i) 阻害：ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）では活
性は阻害されないが、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフ
ォニルフルオライド）及びＳＳＩ（ストレプトマイセス
サブチリシンインヒビター）では阻害される。 (j) ケラチンなどの不溶性タンパク質についても高い分
解活性を示す。

【０００７】本発明によるアルカリプロテアーゼはカゼ
イン等の可溶性タンパク質だけでなく、特に従来のプロ
テアーゼでは分解されにくかったケラチン等の不溶性タ
ンパク質をも、強力に加水分解する。したがって、衣料
用洗剤や柔軟剤および各種洗浄剤に洗浄効果を高める目
的で配合されたり、浴槽、風呂釜、浴室排水溝、循環浴
槽の配管、便器、洗面化粧台ドレインなどの配管洗浄剤
（閉塞除去剤ともいう）に添加されれば、極めて効果的
である。さらに、ケラチンを主要タンパク質とする毛
髪、羽毛、牛角等からのペプチドおよびシステイン等の
アミノ酸製造にも応用が可能である。また、脱毛クリー
ム、入浴剤等の化成品や食肉軟化剤あるいは医薬、試薬
等、極めて広範囲の工業分野で利用され得る。また、本
発明による菌株は、上記アルカリプロテアーゼを効率良
く菌体外に分泌するので、簡便な工程で高効率にその生
産を行うことができる点で有利である。

【０００８】上記洗浄剤組成物としては、上記アルカリ
プロテアーゼ単独、又は公知の洗浄剤成分、例えば、各
種界面活性剤、各種ビルダー（キレート剤、アルカリ剤
など）、再汚染防止剤、漂白剤、上記アルカリプロテア
ーゼ以外の酵素（他のプロテアーゼ、セルラーゼな
ど）、香料、色素などの一種又は２種以上を併用するこ
とができる。又、閉塞除去剤としては、上記アルカリプ
ロテアーゼ単独、又はチオグリコール酸塩との併用が好
ましい。洗浄剤組成物や閉塞除去剤などの形態は、液
状、スラリー状、粉状、粒状、錠剤状など任意の形態と
することができる。本発明による新規アルカリプロテア
ーゼは、微生物を用いて生産することができる。特に好
ましくは、本発明によるアルカリプロテアーゼは、好ア
ルカリ性ストレプトマイセス属、特にストレプトマイセ
スエスピー（Streptomyces sp.）TOTO- 9805株によ
り生産される。この菌株は、TOTO- 9305株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３６４０）の継代培養により得られた変異株であ
る。この菌株は好アルカリ性放線菌であり、次の第１表
及び第２表に示すように親株であるTOTO- 9305株と全く
同様の菌学的性質を有する。なお、本菌株は好アルカリ
微生物であり、通常の中性培地では生育しないか、ある
いは生育が極めて不良であるため、第１表及び第２表の
菌学的性質の検討に際しては0.5%Na2CO3添加のアルカリ
性培地を用い。

【０００９】本菌株TOTO-9805 株は第１表の結果より、
形態学的に放線菌、ストレプトマイセス属の特徴を有す
る。また、細胞壁にL-L-ジアミノピメリン酸を含有する
等のことから、本菌株はストレプトマイセス属に属する
一菌種と分類される。TOTO-9805 株は、各種寒天培地上
での気菌糸と胞子の色調から白色シリーズに属するこ
と、胞子表面は平滑であること、胞子の連鎖はおおむね
直状であること、メラニン色素は生成しないこと等の性
質を有する。これらの性質と各種炭素源の同化性試験の
結果をもとに、既知菌種の中から本菌株の類似種をバー
ジェーズマニュアルの最新版である第４巻（Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology Vol.4 1989 ）に従
って検索を行った。

【００１０】

【表１】第１表 TOTO-9805 株の菌学的諸性質形態生理的性質各炭素源の同化性

【００１１】

【表２】第２表各培地における生育状況＊１メラニンなし

【００１２】同マニュアルに記載されているストレプト
マイセス属の種のうち、本発明の菌株と同様な白色の胞
子塊（コロニーの色調）を形成する種は21種であった。
本菌株とこれら21種の性質を詳細に比較したところ、本
菌株とこれらは、胞子鎖の性状、胞子の形状と大きさ、
拡散色素の生産性、メラニン色素の生産性、各種糖類の
同化性などの点で異なっていた。特に各種糖類の同化性
において、類似の性質を示す種として、ストレプトマイ
セスボビリ（Streptomyces bobili ）、ストレプトマ
イセスシュードエチノスポレウス（Streptomyces pse
udoechinosporeus）の２種が記載されていたが、本菌株
ととは胞子鎖の性状とメラニン色素の生産性で異なり、
又胞子の性状と大きさにおいて異なっていた。また、本
株と同様に好アルカリ性を示し、アルカリ性セルラー
ゼ、もしくはアミラーゼを生産する放線菌として、スト
レプトマイセスエスピー KSM-２およびKSM-９（特公
平4-64675 、FERM P-7620 、FERM P-7621 ）が知られて
いる。しかしながら、本株とこれらは集落の色調で類似
するものの、各種糖類の同化性は全く異なるものであっ
た。これらの結果より、本菌株と類似の性質を示す既知
菌種は見いだせず、一方、上述したように、本菌株は親
株であるTOTO- 9305株と全く同様の菌学的性質を有す
る。しかしながら、本菌株は、親株であるTOTO- 9305株
とは全く異なるプロテアーゼを産生する点で異なってい
る。従って、本菌株TOTO-9805 株は親株TOTO-9305株の
変異株と判断し、ストレプトマイセスエスピー TOTO
-9805 （Streptomyces sp. TOTO-9805）と命名した。

【００１３】なお、本菌株は工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託番号第号（FERM BP-6359)のもと寄託さ
れている。培養条件上記菌株は好アルカリ性放線菌であるため、その培養は
アルカリ領域で行う必要がある。培地をアルカリ性にす
るための方法としては格別である必要はなく、通常の培
地中に例えば炭酸ナトリウムあるいは炭酸水素ナトリウ
ムを添加するだけで良い。炭素源としてはグルコース、
可溶性デンプン、セルロース等の単糖、多糖などを用い
ることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウ
ム塩などの無機物をはじめ、尿素、ペプトン、乾燥酵
母、酵母エキス、ダイズ粉、コーンスチープリカー、カ
ゼイン、肉エキス、アミノ酸などが用いられる。これら
の炭素源や窒素源の他に各種無機塩、例えばマグネシウ
ム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩などを必要
に応じて添加しても良い。培地に加えるアルカリ源とし
ては、0.５〜2.０％程度の炭酸ナトリウム、炭酸水素ナ
トリウム等の炭酸塩あるいは水酸化ナトリウム、アンモ
ニアなどが使用でき、培地のpHは8.０〜11.0程度が望ま
しい。培養は、このような培地中で培養温度20〜40℃、
好ましくは27〜38℃で２日〜５日間好気的に撹袢または
振とうしながら行う。本発明による新規なアルカリプロ
テアーゼは、上記のような培養条件のもとで、主として
培養液中に分泌され、蓄積される。

【００１４】酵素の採取上記培養液から本発明による酵素を採取、精製するため
には、既知の精製法を単独もしくは併用して利用するこ
とができる。本酵素は主として菌体外（培養液中）に分
泌されるため、例えば濾過あるいは遠心分離で菌体を除
去することにより容易に粗酵素液を得ることができる。
この粗酵素は、さらに既知の精製法、例えば硫安などに
よる塩析；メタノール、エタノール、アセトンなどの有
機溶媒による沈殿法；ケラチン等による吸着法；限外濾
過；ゲル濾過クロマトグラフィー；イオン交換クロマト
グラフィー；疎水クロマトグラフィー、その他の各種ク
ロマトグラフィーを、単独もしくは併用して、精製する
ことができる。好ましい精製法を示せば以下の通りであ
る。まず、培養濾液に８０％飽和硫安を添加して塩析を
行い、得られた沈殿を緩衝液に溶解する。次いでCM-Toy
opearl650M（東ソー社製）、DEAE-Toyopearl 650M（同
社製）によるイオン交換クロマトグラフィーを行うこと
により、ＳＤＳ電気泳動的に均一な精製酵素を得ること
ができる。

【００１５】酵素の性質本発明によるアルカリプロテアーゼの性質は以下に示さ
れる通りである。なお、以下において活性測定法とは次
の方法をいうものとする。（活性測定法)カゼイン0.6%またはケラチン2%を含む50m
Mホウ素/Na₂CO₃ 緩衝液（pH11.0）9mlを0.1ml の酵素溶
液と混合し、30℃、10分間（ケラチンを基質とした場合
は振とうしながら20分間）反応させた後、2 mlのトリク
ロロ酢酸混合液（0.11M トリクロロ酢酸、0.22M 酢酸ナ
トリウム、0.33M 酢酸）を加えて30℃で30分間静置した
後、アドバンテック社製濾紙N0.5C で濾過する。次い
で、この濾液の0.5ml を2.5ml の0.5M炭酸ナトリウム溶
液に加え、さらに３倍希釈したフェノール試薬を0.5ml
添加撹袢後、さらに室温にて30分間放置し、660nm の吸
光度を測定する。上記の測定条件下で１分間に１マイク
ログラムのチロシンに相当する吸光度を増加させる酵素
量を、酵素活性１単位（1U）と定義する。

【００１６】（１）作用および基質特異性カゼイン、ゼラチン、グルテン、ヘモグロビン、インシ
ュリンなどのタンパク質に作用し、そのペプチド結合を
エンド的に加水分解することによりオリゴペプチドおよ
びアミノ酸を生成する。また、特に従来の酵素では分解
の困難であったケラチンなどの不溶性タンパク質をも強
力に加水分解する。（２）最適pHおよび安定pH 上記の活性測定法にもとづき、本酵素に及ぼすpHの影響
を調べた。なお、緩衝液として酢酸ナトリウム/HCl(pH
1.0-2.5) 、Britton-Robinson広域緩衝液（pH3.0-11.
5）、KCl/NaOH(pH12.0-12.5) を使用した。第１図に活
性の最大値を100 とした場合の各pHにおける相対活性を
示した。第１図により本酵素の最適pHは30℃において1
0.5〜11.5であることが分かる。同様に本酵素のpH安定
性について第２図に示した。本酵素を各pHの緩衝液中に
30℃で24時間保持した後、その残存活性を未処理の酵素
活性を100 とした相対活性として示した。第２図から、
本酵素は上記処理条件下においてpH1.５〜10.0までの極
めて広範囲のpH域で安定であることが分かる。

【００１７】（３）最適温度および安定温度上記活性測定法に準じて、本酵素に及ぼす温度の影響を
調べた。第３図に最大活性を100 とした場合の各温度に
おける相対活性を示した。第３図から、本酵素の最適温
度は60℃であることが分かる。また、本酵素を100 mMト
リス塩酸緩衝液（pH7.0)に添加し、40〜80℃の範囲の各
条件下で10分間保持した後、その残存活性を測定した。
なお、温度処理は10mMの塩化カルシウムを添加した場合
と、しない場合の二通りについて行った。その結果を第
４図に示した。第４図により、カルシウムの添加、無添
加にかかわらず70℃まで安定であることがわかる。（４）分子量本酵素の分子量をＳＤＳ電気泳動法により測定したとこ
ろ、分子量は約20,000であった。（５）等電点本酵素の等電点を等電点電気泳動法により測定したとこ
ろ、等電点は9.3 以上であった。

【００１８】（６）比活性本酵素の比活性を活性測定法に準じて測定した。なお、
タンパク質濃度はバイオラッド社製のプロテインアッセ
イキットを使用して測定し、酵素は電気泳動的に均一な
精製標品を使用した。その結果、本酵素の比活性は、カ
ゼインを基質とした場合は152,000(U/mgタンパク) 、ケ
ラチンに対しては54,600(U/mg タンパク) であり、本酵
素は極めて強力なタンパク質加水分解活性を有すること
が判明した。（７）阻害一般的な酵素阻害剤であるＰＭＳＦ（フェニルメタンス
ルフォニルフルオライド）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミ
ン四酢酸）及びＳＳＩ（ストレプトマイセスサブチリシ
ンインヒビター）について、これらが本酵素の活性に及
ぼす影響を調べた。各阻害剤を所定濃度となるように50
mMトリス塩酸緩衝液(pH9.0) に溶解し、本酵素を添加後
30℃で30分間処理を行った。次いで処理溶液より一定量
を分取して活性測定法に準じて、その残存活性を測定し
た。本酵素はＰＭＳＦ及びＳＳＩにより阻害され、ＥＤ
ＴＡによる阻害を受けなかったことより、本アルカリプ
ロテアーゼはセリンプロテアーゼであることがわかる。
上記各特性を示す本酵素と、従来公知の細菌、放線菌由
来のアルカリプロテアーゼとの比較を第３表に示した。

【００１９】

【表３】第３表各種アルカリプロテアーゼの比較空欄は該当データなし（以下、同じ）

【００２０】

【表４】第３表各種アルカリプロテアーゼの比較
（続き）

【００２１】文献：１；Agr. Biol. Chem., 38, (1) 37-44, 1974. ２；エンザイムデータシートライブラリー（生化学工業株式会社）３；バイオサイエンスとインダストリー 48, (7) 33-36, 1990. 第３表に示した諸性質の比較より、本酵素が分子量が小
さく、かつ極めて高い比活性を有する新規なアルカリプ
ロテアーゼであることが分かる。

【００２２】

【実施例】次に本発明を以下の実施例により更に詳細に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。実施例１粗酵素の調製ストレプトマイセスエスピー TOTO-9805 株の前培養
液50ml（35℃、４日間振とう培養）を、可溶性デンプン
1.5%、スキムミルク1.5%、K₂HPO₄ 0.3%、エキス 0.1%
、MgSO₄ ・7H₂O 0.05%および、別殺菌して添加したNaH
CO₃1.0%有する培地（pH9.０）4500 ml を入れた小型ジ
ャーファーメンターに植菌し、35℃で４日間、通気量1
v/v/min 、回転数200rpmで培養を行った。培養終了後、
培養液を8000 rpmで10分間遠心分離して菌体を除去し
た。これにより、16.9U/mlの粗酵素液約4,050 mlを得
た。実施例２精製酵素の調製実施例１と同様の培地8000 ml を入れた小型ジャーファ
ーメンターに、ストレプトマイセスエスピー TOTO-9
805 株の前培養液100 mlを植菌した。これを実施例１と
同様に培養した後、遠心分離により培養上清7,600 mlを
得た。この上清液のpH10.5におけるプロテアーゼ活性は
17.0 U/ml であった。

【００２３】次いで、この上清液に硫安粉末を80% 飽和
になるまで加え、１昼夜５℃で暗所に静置後8000 rpmで
遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿を10 mM リ
ン酸緩衝液（pH7.０）に溶解し、セルロースチューブを
用いて同緩衝液に対し透析を行った。透析後、その透析
内液を1 mM CaCl₂添加の10 mM MOPS緩衝液（pH7.５で平
衡化したCM-Toyopearl 650M カラムに通じて酵素を吸着
させ、０〜0.5 M のNaCl濃度勾配で溶出させた。活性画
分を透析後、1 mM CaCl₂を含む10 mM トリス塩酸緩衝液
（pH9.０）で平衡化したDEAE-Toyopearl 650M カラムに
通じて活性画分を通過させ、不純タンパク質を吸着させ
た。上記一連の精製により、約433 U/mlのアルカリプロ
テアーゼを27.5 ml 得た。本画分はＳＤＳ電気泳動的に
もゲル濾過的にもそれぞれ単一バンドおよび単一ピーク
を示し、酵素タンパク質として均一であることが確認さ
れた。

【００２４】実施例３実施例１で得た粗酵素液を３倍量のエチルアルコールで
沈殿させ、沈殿物を室温で乾燥して得た粗酵素粉末（１
0,０００Ｕ／ｇ）１〜５重量部を、硫酸ナトリウム１０
０重量部、アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、
ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（ＡＥＳ）
及びポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＡＥ）から
なる群から選ばれる界面活性剤１０〜５０重量部と混合
し、常法により造粒機を用いて粒状洗剤組成物を調製し
た。この洗剤組成物は、衣料用洗浄剤として、特に衣料
の襟や袖などの垢汚れに対して優れた洗浄力を発揮し
た。

【００２５】実施例４硫酸ナトリウム５重量部と界面活性剤であるポリオキシ
エチレンアルキルエーテル（ＡＥ）１重量部とを十分に
混合したものに、チオグリコール酸塩２重量部及び実施
例３で用いたのと同じ粗酵素粉末（１0,０００Ｕ／ｇ）
１重量部を加えて混練し、粉状の配管洗浄剤を調製し
た。洗面化粧台（トラップ容量２００ｍｌ）の排水溝に
人の毛髪３ｇ（２０〜３０ｃｍ）を流し入れてわざと排
水溝を閉塞させた。この状態の排水溝に上記配管洗浄剤
を入れ、室温にて８時間（一夜）放置した後、通水した
ところ、閉塞は完全に解消されており通水がスムーズと
なった。この際、ドレーンから閉塞物を採取したとこ
ろ、毛髪は数ｍｍ程度に切断されていた。

【００２６】実施例５ストレプトマイセスエスピー TOTO-9805 株を用い、
Y. Moriyama らのJ. Antibact. Antifung. Agents 24,
No. 6, pp. 407-413, 1996に記載の方法に準拠して、フ
ロテアーゼ以外の酵素の産生状況を確認した。すなわ
ち、Czapek寒天培地の基本塩類に、デンプン（アミラー
ゼ）、ツィーン８０（リパーゼ）、カルボキシメチルセ
ルロース（セルラーゼ）、キチン（キチナーゼ）、ペク
チン（ペクチナーゼ）、キシラン（キシナラーゼ）又は
プルラン（プルラナーゼ）などの基質を唯一の炭素源と
なるようにそれぞれ１％加え、別途炭酸ナトリウム溶液
でｐＨを１0.５に調整した各種寒天培地に、本発明のTO
TO-9805 株を接種して３０℃で３日間培養した。判定は
培地上のTOTO-9805 株の生育状況を下記の基準により目
視で、又酵素活性は上記文献記載の方法等により下記の
基準で行った。結果をまとめて表−４に示す。生育状況 ◎ TOTO-9805 株の生育良好 ○ TOTO-9805 株の生育普通 △ TOTO-9805 株の生育不良 × TOTO-9805 株生育せず酵素活性 ◎ 高活性 ○ 活性有り △ 活性不明瞭 × 活性なし

【００２７】

【表５】表−４

【表６】表−４（続き）

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるアルカリプロテアーゼの最適pH
を示すグラフである。

【図２】本発明によるアルカリプロテアーゼの安定pH
を示すグラフである。

【図３】本発明によるアルカリプロテアーゼの最適温
度を示すグラフである。

【図４】本発明によるアルカリプロテアーゼの安定温
度を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者清水保広滋賀県甲賀郡甲西町日枝町４番19号大和化成株式会社内 (72)発明者杉山敦史滋賀県甲賀郡甲西町日枝町４番19号大和化成株式会社内 (72)発明者上山明代滋賀県甲賀郡甲西町日枝町４番19号大和化成株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の理化学的性質を有するアルカリプ
ロテアーゼ。 (a) 作用および基質特異性：タンパク質およびペプチド
に特異的に作用し、そのペプチド結合をエンド型の機作
により切断して、低分子量のオリゴペプチドおよびアミ
ノ酸を生成する。 (b) 安定温度：pH7.０、10分間の処理条件において、カ
ルシウムの添加、無添加にかかわらず70℃まで安定であ
る。 (c) 分子量：約20,000（ＳＤＳ電気泳動法）である。 (d) 等電点：9.３以上（等電点電気泳動法）である。 (e) 比活性：カゼインを基質とした場合は約152,000(U/
mg蛋白）、ケラチンを基質とした場合は54,600(U/mg 蛋
白）である。
【請求項２】さらに、下記の理化学的性質を有する請
求項１記載のプロテアーゼ。 (f) 最適pH：最適pHはカゼインを基質とした場合、10.5
〜11.5である。 (g) 安定pH：30℃、24時間の処理条件において、pH1.５
〜10.0で安定である。 (h) 最適温度：最適作用温度は60℃である。 (i) 阻害：ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）では活
性は阻害されないが、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフ
ォニルフルオライド）及びＳＳＩ（ストレプトマイセス
サブチリシンインヒビター）では阻害される。
【請求項３】好アルカリ性放線菌ストレプトマイセス
（Streptomyces）属菌から得られる請求項１又は２記載
のプロテアーゼ。
【請求項４】ストレプトマイセスエスピー（Strept
omyces sp. ）TOTO-9805 株から得られる請求項１又は
２記載のプロテアーゼ。
【請求項５】好アルカリ性ストレプトマイセス属に属
し、請求項１〜４のいずれか１項記載のアルカリプロテ
アーゼ産生能を有する微生物を培養する工程と、該工程
で得られた培養物より該アルカリプロテアーゼを分離す
る工程とを含んでなる、アルカリプロテアーゼの製造
法。
【請求項６】前記微生物の培養がpH8.０〜13.0のアル
カリ性で行われる、請求項５記載の製造法。
【請求項７】前記微生物がストレプトマイセスエス
ピー TOTO-9805 株である請求項５記載のプロテアーゼ
製造法。
【請求項８】好アルカリ性ストレプトマイセス属に属
し、請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼ産生能
を有するストレプトマイセスエスピー。
【請求項９】ストレプトマイセスエスピーが、スト
レプトマイセスエスピー TOTO-9805 株（FERM BP-6
359)である請求項８記載のストレプトマイセスエスピ
ー。
【請求項１０】請求項１〜４のいずれか１項記載のプ
ロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。
【請求項１１】請求項１〜４のいずれか１項記載のプ
ロテアーゼ及び界面活性剤を含有する衣料用洗浄剤組成
物。
【請求項１２】請求項１〜４のいずれか１項記載のプ
ロテアーゼを含有する配管洗浄剤組成物。