ITUB20154036A1

ITUB20154036A1 - Biosensore per il rilevamento di analiti nel sudore, e metodo di fabbricazione del biosensore

Info

Publication number: ITUB20154036A1
Application number: ITUB2015A004036A
Authority: IT
Inventors: Helena Iuele; Palma Vincenza Di
Original assignee: St Microelectronics Srl
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2017-03-30
Also published as: CN106556635B; CN205879857U; EP3150714B1; EP3150714A1; CN106556635A; US20170086715A1; US11116428B2

Description

DESCRIZIONE

''BIOSENSORE PER IL RILEVAMENTO DI ANALITI NEL SUDORE, E METODO DI FABBRICAZIONE DEL BIOSENSORE"

La presente invenzione è relativa ad un biosensore per il rilevamento di analiti in un fluido e ad un metodo di fabbricazione dello stesso; in particolare il biosensore è utilizzabile per rilevare glucosio e lattato nel sudore.

Nella diagnostica medica, biosensori indossabili rivestono una notevole importanza per fornire informazioni relative allo stato di salute corrente di un paziente.

Un biosensore è un dispositivo per la rilevazione di un analita. Un biosensore comprende un elemento di bioriconoscimento (elemento biologico sensibile) ed un elemento rilevatore che trasforma il segnale risultante dall'interazione dell'analita con l'elemento biologico in un ulteriore segnale che può essere facilmente misurato e quantificato.

L'analisi del sudore, in particolare, sta ricevendo particolare attenzione per l'analisi del glucosio e del lattato in quanto, a differenza delle analisi basate su campioni di sangue, esso non necessita di pratiche invasive per l'acquisizione del campione da analizzare.

Gli elettroliti sono i componenti del sudore più facilmente analizzabili. I metaboliti, quali ad esempio lattato e glucosio, sono più difficili da misurare. Tuttavia, esiste grande interesse nel monitoraggio di questi metaboliti, per il loro fondamentale ruolo diagnostico. Il lattato, ad esempio, è un indicatore di deficienza di ossigeno; un incremento eccessivo del lattato è sintomo di ischemia ed è un indicatore di alcune tipologie di cancro. Il monitoraggio del glucosio, invece, è di importanza fondamentale nella gestione del diabete. Esiste una correlazione diretta tra le concentrazioni di glucosio e lattato nel sangue e quelle presenti nel sudore.

I metodi attualmente utilizzati per il monitoraggio dei metaboliti attraverso l'analisi del sudore prevedono il ricorso ad una tecnica nota come ionoforesi inversa. Dispositivi basati su ionoforesi inversa sono provvisti di terminali elettrici (catodo e anodo), disposti a contatto con la cute del paziente, tra i quali può scorrere una corrente elettrica. La somministrazione tra il catodo e l'anodo del dispositivo di una bassa corrente elettrica, attraverso la cute del paziente, causa una migrazione osmotica degli ioni sodio e cloruro che trasportano le molecole di glucosio e lattato presenti nel sudore verso il catodo e l'anodo, rispettivamente. Su uno di essi è disposto l'enzima specifico per l'analita, cosicché dall'interazione enzima-analita è possibile misurare la concentrazione di analita. Tuttavia, i dispositivi basati su questa tecnologia possono causare fastidi o irritazioni alla cute di pazienti sensibili, a causa della presenza della corrente elettrica che fluisce attraverso la cute stessa.

Scopo dell'invenzione è quindi mettere a disposizione un biosensore e un metodo di fabbricazione dello stesso, che superino gli svantaggi delle soluzioni note.

Secondo la presente invenzione vengono realizzati un biosensore e un metodo di fabbricazione dello stesso, come definiti nelle rivendicazioni allegate.

Per la comprensione della presente invenzione ne vengono ora descritte forme di realizzazione preferite, a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento ai disegni allegati, nei quali:

- la figura 1 mostra un biosensore secondo una forma di realizzazione della presente divulgazione;

- le figure 2-11 mostrano fasi di fabbricazione del biosensore di figura 1;

- le figure 12-18 mostrano fasi di fabbricazione alternative a quelle delle figure 2-11; e

- la figura 19 mostra un biosensore secondo una ulteriore forma di realizzazione della presente divulgazione, fabbricato secondo le fasi delle figure 12-18.

La figura 1 mostra, in un sistema triassiale X, Y, Z, un biosensore 1 secondo un aspetto della presente divulgazione. Il biosensore 1 comprende; un primo strato strutturale 2, di idrogel fotosensibile; un secondo strato strutturale 4, di idrogel fotosensibile, estendentesi sopra il primo strato strutturale 2; una regione di rilevamento 6, includente una matrice di idrogel fotosensibile in cui sono dispersi elementi di bio-riconoscimento, in particolare enzimi quali GOx (glucosio ossidasi) e LOx (lattato ossidasi). Il secondo strato strutturale 4 presenta una apertura passante 8 in corrispondenza della regione di rilevamento 6, tale per cui la regione di rilevamento 6 è, almeno parzialmente, esposta verso l'ambiente esterno attraverso l'apertura passante 8.

Un terminale elettrico di lavoro 10 è disposto in contatto elettrico con la regione di rilevamento 6, mentre un terminale elettrico di controelettrodo 12 è disposto sul primo strato 2 (o, in parte, nel primo strato 2), lateralmente rispetto alla regione di rilevamento 6, e non in contatto elettrico diretto con la regione di rilevamento 6. Un terminale elettrico di riferimento 14 si estende sul primo strato 2 (o, in parte, nel primo strato 2), lateralmente alla regione di rilevamento 6, e non in contatto elettrico diretto con la regione di rilevamento 6. In particolare, la regione di rilevamento 6 si estende, in vista superiore sul piano XY, tra il terminale elettrico di controelettrodo 12 e il terminale elettrico di riferimento 14.

I terminali elettrici di lavoro 10, di controelettrodo 12 e di riferimento 14 sono di materiale conduttivo, quale ad esempio di un metallo inerte scelto tra oro, argento, platino, polimeri conduttivi e carbonio. L'elettrodo di riferimento 14 può altresì essere di cloruro di argento, AgCl.

II biosensore 1 realizza, in pratica, una cella elettrochimica a tre elettrodi.

Gli idrogel, noti nello stato della tecnica, sono particolarmente attraenti per la fabbricazione di sensori biochimici poiché costituiti da catene polimeriche di molecole idrofile che formano una eccellente matrice di incapsulamento di enzimi funzionali, cellule e altro materiale biologico. In particolare, le condizioni ambientali all'interno dell'idrogel sono ideali per minimizzare la denaturazione degli elementi biologici dispersi in esso, favorendone le funzionalità.

1/ idrogel fotosensibile utilizzato per la formazione del primo strato strutturale 2, del secondo strato strutturale 4, e della regione di rilevamento 6 include polimeri idrofili che comprendono catene polimeriche reticolate l'una con l'altra con legami sia covalenti che non covalenti. I loro monomeri o prepolimeri sono solubili in acqua, mentre i polimeri sono insolubili in acqua a temperatura, pH e forza ionica fisiologici. Il contenuto di acqua (% H20) è definito come % H20=100·(peso polimero gonfio-peso polimero secco)/(peso polimero gonfio). I polimeri possono avere peso molecolare nell'intervallo 500-200000 dalton, e le cui proprietà incluse viscosità, punto di rammollimento e temperatura di degradazione sono ottimizzate secondo l'applicazione specifica.

Il primo strato strutturale 2, il secondo strato strutturale 4 e la regione di rilevamento 6 possono comprendere: monomeri, oligomeri o prepolimeri (il peso molecolare dei prepolimeri controlla le proprietà meccaniche e la viscosità), o leganti che regolano le proprietà meccaniche della miscela (adesione, ecc.); uno o più solventi che controllano ulteriori proprietà meccaniche, quali ad esempio la viscosità della miscela; e materiali foto attivi (PAC) o foto inibitori (PhI).

Secondo una forma di realizzazione della presente divulgazione, 1'idrogel del primo strato strutturale 2, del secondo strato strutturale 4 e della regione di rilevamento 6 funziona alla stregua di un fotoresist negativo utilizzato nei processi fotolitografici, cosicché 1'irradiazione UV controllata di una porzione del secondo strato strutturale 4 e della regione di rilevamento 6 causa la polimerizzazione delle sole regioni irradiate, consentendo la rimozione delle regioni non irradiate mediante uno sviluppo in acqua. In questo caso, dunque, 1'idrogel contiene monomeri o oligomeri o prepolimeri precursori per l'esposizione alla radiazione UV incidente, ad esempio, è soggetto ad una reazione di fotopolimerizzazione e/o foto-reticolazione. La foto reticolazione degli strati coinvolti determina un aumento del loro peso molecolare, che causa una vantaggiosa diminuzione della solubilità di tali strati in acqua.

Esempi di idrogel composti da semplici monomeri o miscele di differenti monomeri, utilizzabili secondo la presente divulgazione, sono:

0 0

C3⁄4=CH— CIl— 0— fCH2C3⁄40->^CII — CH=CH2

Glicole polietilenico diacrilato, noto come PEG-DA,

CH3O O CH3

CH2=C C — 0— bCH2CH203⁄4— C — C=C3⁄4

PEG dimetacrilato,

α1⁄2 0

HO—fCH— C3⁄4 — 0— C— CH=CH— C— 0-^— hCH^CHiQ-)^— OH 0

Polipropilene fumarato-co-etilene glicole,

Destrano modificato con metacrilato

OIIH

rkki

Acido ialuronico commutato,

Alcol polivinilico, noto come PVA

- cimai -cimai— amai CH2CH-CH2CH

i

oli o OH 0 0

\

CH

ai2ai2oii

C3⁄4

CTT2

NH

0

C=0 c=o

CH CIT CH,

c3⁄4

PVA modificato con acrilato

OCH2CH2OCH2CH2OCH3

<■>N=

OCH,CH?OC3⁄4CH2OC3⁄4

Poli [bis (metossi-etossi-etossi)fosfazene] , noto come MEEP

0CH2CH20CH2C3⁄40CH3

N= P-

OIC3⁄4CH= CH

/ N

Poliiosfazene

OH

Poli-idrossietil-metacrilato, noto come PHEMA

Nel seguito della descrizione si farà esplicito riferimento al PEG-DA senza per questo perdere di genericità.

Le figure 2-11 mostrano, in vista laterale sul piano XZ, fasi successive di fabbricazione del biosensore 1 di figura 1, secondo un aspetto della presente divulgazione.

Si dispone innanzitutto, figura 2, un substrato 20, ad esempio di vetro, o silicio, o materiale plastico (es., polietilene tereftalato PET, polietilene naftalato o PEN, polietere eter chetone o P oEEK).

Quindi, figura 3, si forma sul substrato 20 un primo strato foto-definibile di idrogel 22, nel modo seguente. Viene preparata una miscela prepolimerica aggiungendo un fotoiniziatore a del PEG-DA, in una percentuale del 2-3 % v/v. Un qualsiasi fotoiniziatore, con la capacità di assorbire una radiazione UV e subire una fotoreazione, producendo specie reattive, radicali che polimerizzano, costituenti della miscela prepolimerica è atto allo scopo. In particolare, si utilizza come fotoiniziatore il 2-idrossi-2-metil-l-fenil-propan-l-one, anche noto commercialmente come Darocur™. La soluzione prepolimerica così formata è depositata mediante tecnica di spin-coating sul substrato 20 (a 700-1000 rpm, per 8-15 secondi, in particolare 800 rpm per 10 secondi).

Il primo strato foto-definibile di idrogel 22 presenta uno spessore compreso tra 100 nm e 1000 nm, ad esempio pari a 200 nm. I parametri di deposizione possono essere regolati in funzione della viscosità della soluzione a base di idrogel utilizzata, in modo tale da ottenere uno strato 22 avente lo spessore desiderato.

Quindi, figura 4, si procede con la disposizione di filamenti conduttivi (commercialmente disponibili) che formano i terminali elettrici di lavoro 10, controelettrodo 12 e di riferimento 14. Tali filamenti hanno, ad esempio, diametro compreso tra 50 nm e 200 nm, e sono di un materiale scelto tra oro, argento, platino, polimeri conduttivi e carbonio.

I filamenti vengono disposti sullo strato 22 prima della fase di reticolazione. I filamenti penetrano solo in parte all'interno dello strato 22. In questo modo essi (ed in particolare il terminale elettrico di lavoro 10) sono elettricamente accessibili superiormente..

Quindi, figura 5, si procede con una fase di reticolazione, mediante lampada UV 23 generante una radiazione UV 25, di porzioni selettive del primo strato foto-definibile di idrogel 22. In particolare, al fine di ottenere una polimerizzazione selettiva del primo strato foto-definibile di idrogel 22, si utilizza una maschera 24 provvista di regioni opache 24a, atte a bloccare la radiazione UV 25 incidente, e regioni trasparenti 24b, che sono trasparenti alla radiazione UV 25 incidente. In questo modo, solo le porzioni del primo strato foto-definibile di idrogel 22 estendentisi in corrispondenza delle regioni trasparenti 24b subiscono un processo di reticolazione poiché 1'idrogel si comporta come un fotoresist negativo.

Secondo un aspetto della presente divulgazione, i filamenti - che formano i terminali elettrici di lavoro 10, controelettrodo 12 e di riferimento 14 si estendono in parte all'interno delle regioni del primo strato fotodefinibile di idrogel 22 che vengono polimerizzate ed in parte al di fuori di esse in modo che, come mostrato in figura 6, dopo la fase di polimerizzazione tali filamenti siano elettricamente accessibili dall'esterno del primo strato strutturale 2 formato.

La fase di polimerizzazione è eseguita utilizzando i seguenti parametri di esposizione: lunghezza d'onda della radiazione UV scelta in funzione del fotoiniziatore utilizzato, ad esempio (nel caso di utilizzo di Darocur™) pari a 365 nm; potenza di esposizione compresa nell'intervallo tra 12 mW/cm<2>e 20 mW/cm<2>, in particolare pari a 18 mW/cm<2>; tempo di esposizione compreso tra 5s e 20 s, in particolare pari a 7s.

Una successiva fase di bagno in acqua deionizzata consente di rimuovere in pochi minuti le porzioni del primo strato foto-definibile di idrogel 22 non polimerizzate, formando il primo strato strutturale 2 come mostrato in figura 6.

Quindi, figura 7, si procede con la formazione di un secondo strato foto-definibile di idrogel 26 (provvisto di elementi di bio-riconoscimento, ad esempio enzimi) al di sopra del substrato 20 e del primo strato strutturale 2, Il secondo strato foto-definibile di idrogel 26 forma, in fasi successive di fabbricazione, la regione di rilevamento 6.

In dettaglio, il secondo strato foto-definibile di idrogel 26 viene formato a partire da una soluzione prepolimerica di idrogel (es., PEG-DA), un fotoiniziatore (es,, Darocur™) al 3% v/v, ed un mediatore di ossidoriduzione (redox) al 1% v/v. Il mediatore redox è una molecola in grado di mediare una reazione di ossidoriduzione o, in altre parole, in grado di facilitare il flusso di elettroni, generati dalla reazione di ossidoriduzione, attraverso la matrice di idrogel. Il mediatore redox è, ad esempio, un derivato del ferrocene, quale il vinilferrocene.

Una soluzione enzimatica viene preparata dissolvendo opportuni enzimi in un buffer fosfato, PBS, con pH variabile in un intervallo tra 6 e 6.5, e glutaraldeide quale agente per migliorare la ritenzione dell'enzima nella matrice. Gli enzimi sono scelti, secondo una forma di realizzazione, tra glucosio ossidasi (GOx) e lattato ossidasi (LOx). La concentrazione degli enzimi in PBS è, ad esempio, pari a 20 mg/mL.

La soluzione prepolimerica e la soluzione enzimatica così preparate vengono miscelate tra loro per un tempo compreso tra 4 e 5 ore ad una temperatura compresa tra4 e 5 °C (es., 4°C). Il rapporto tra la soluzione prepolimerica e la soluzione enzimatica è di 10:1 v/v, ma può essere variato secondo necessità. La miscela così ottenuta (nota come "matrice di rilevamento" - "sensing matrix") forma il secondo strato foto-definibile di idrogel 26 che viene depositato sul substrato 20 e sul primo strato strutturale 2 mediante tecnica di spin coating, in modo analogo a quanto già descritto con riferimento al primo strato fotodefinibile di idrogel 22. Il secondo strato foto-definibile di idrogel 26 ha uno spessore compreso tra 100 nm e 1000 nm, ad esempio pari a 200 nm. Anche in questo caso, i parametri di deposizione possono essere regolati in funzione della viscosità della soluzione utilizzata per il secondo strato foto-definibile di idrogel 26, in modo tale da ottenere uno strato 26 (e, quindi, la regione di rilevamento 6) avente lo spessore desiderato.

Quindi, figura 8, si procede con una fase di esposizione a radiazione UV per favorire la reticolazione di porzioni selettive del secondo strato foto-definibile di idrogel 26, utilizzando una opportuna maschera 28. L'esposizione avviene, ad esempio, mediante la stessa lampada UV 23 precedentemente utilizzata, generante la radiazione UV 25. Al fine di ottenere una polimerizzazione selettiva del secondo strato foto-definibile di idrogel 26, si utilizza la maschera 28 provvista di regioni opache 28a, atte a bloccare la radiazione UV 25 incidente e regioni trasparenti 28b, che sono trasparenti alla radiazione UV 25 incidente. In questo modo, solo le porzioni del secondo strato foto-definibile di idrogel 26 estendentisi in corrispondenza delle regioni trasparenti 28b sono soggette ad un processo di reticolazione.

Secondo un aspetto della presente divulgazione, il filamento metallico che forma il terminale elettrico di lavoro 10 si estende in parte all'interno della regioni del secondo strato foto-definibile di idrogel 26 che viene polimerizzata ed in parte al di fuori di essa in modo che, dopo la fase di polimerizzazione, tale filamento sia elettricamente accessibile dall'esterno della regione di rilevamento 6 così formata.

La fase di polimerizzazione è eseguita utilizzando i seguenti parametri di esposizione: lunghezza d'onda della radiazione UV scelta in funzione del fotoiniziatore utilizzato, ad esempio (nel caso di utilizzo di Darocur™) pari a 365 nm; potenza di esposizione compresa nell'intervallo tra 12 mW/cm<2>e 20 mW/cm<2>, in particolare pari a 18 mW/Cm<2>; tempo di esposizione compreso tra 5s e 20s, in particolare pari a 7s.

Quindi, figura 9, una successiva fase di bagno in acqua deionizzata consente di rimuovere in pochi minuti le porzioni del secondo strato foto-definibile di idrogel 26 non polimerizzato, formando la regione di rilevamento 6 in corrispondenza dell'elettrodo di lavoro 10 ed in contatto elettrico con esso.

Quindi, figura 10, si procede con la formazione del secondo strato strutturale 4. A tal fine si forma, sul substrato 20, sul primo strato strutturale 2 e sulla regione di rilevamento 6, un terzo strato foto-definibile di idrogel 34.

A tal fine, viene preparata una miscela prepolimerica aggiungendo a del glicole polietilenico diacrilato (nel seguito, PEG-DA) un fotoiniziatore, in una percentuale del 2-3 % v/v, analogamente a quanto descritto con riferimento al primo strato foto-definibile di idrogel 22. In particolare, si utilizza come fotoiniziatore il 2-idrossi-2-metil-l-fenil-propan-l-one, anche noto commercialmente come Darocur™. La soluzione prepolimerica così formata è depositata mediante tecnica di spin-coating sul substrato 20, sul primo strato strutturale 2 e sulla regione di rilevamento 6. Lo spin-coating è eseguito tra i 700 e i 1000 rpm, per 8-15 secondi, in particolare 800 rpm per 10 secondi.

Il terzo strato foto-definibile di idrogel 34 così formato ha uno spessore compreso tra 100 nm e 1000 nm, ad esempio pari a 200 nm. I parametri di deposizione possono essere regolati in funzione della viscosità della soluzione a base di idrogel utilizzata, in modo tale da ottenere uno strato 34 avente lo spessore desiderato.

Sempre con riferimento alla figura 10, si procede con una fase di esposizione a radiazione UV per favorire la reticolazione di porzioni selettive del terzo strato fotodefinibile di idrogel 34, utilizzando una opportuna maschera 36. L'esposizione avviene, ad esempio, mediante la stessa lampada UV 23 precedentemente utilizzata, generante la radiazione UV 25. Al fine di ottenere una polimerizzazione selettiva del terzo strato foto-definibile di idrogel 34, la maschera 36 è provvista di regioni opache 36a, atte a bloccare la radiazione UV 25 incidente, e regioni trasparenti 36b, trasparenti alla radiazione UV 25 incidente. In questo modo, solo le porzioni del terzo strato foto-definibile di idrogel 34 estendentisi in corrispondenza delle regioni trasparenti 36b sono soggette ad un processo di reticolazione.

La fase di polimerizzazione del terzo strato fotodefinibile di idrogel 34 è eseguita utilizzando i seguenti parametri di esposizione: lunghezza d'onda della radiazione UV scelta in funzione del fotoiniziatore utilizzato, ad esempio (nel caso di utilizzo di Darocur™) pari a 365nm; potenza di esposizione compresa nell' intervallo tra 12 mW/cm<2>e 20 mW/cm<2>, in particolare pari a 18mW/cm<2>,- tempo di esposizione compreso tra 5s e 20s, in particolare pari a 7s .

Una successiva fase di sviluppo in acqua deionizzata consente di rimuovere le porzioni del terzo strato fotodefinibile di idrogel 34 non polimerizzate, formando il secondo strato strutturale 4, come mostrato in figura 11.

Secondo la presente divulgazione, la maschera 36 è provvista di una regione opaca che copre, durante l'uso (ossia quando la maschera 36 è disposta allineata al terzo strato foto-definibile di idrogel 34), la porzione del terzo strato foto-definibile di idrogel 34 che si estende al di sopra della regione di rilevamento 6. In questo modo, la porzione del terzo strato foto-definibile di idrogel 34 al di sopra della regione di rilevamento 6 non subisce il processo di reticolazione ed è rimossa durante la fase di sviluppo in acqua deionizzata. Si forma così l'apertura passante 8, attraverso la quale viene esposta, almeno in parte, la regione di rilevamento 6. Si forma così il biosensore 1 di figura 1.

Infine, mediante una fase di peeling, si rimuove il substrato 20, ottenendo il biosensore 1 di figura 1. La fase di rimozione del substrato 20 è opzionale.

Le figure 12-19 mostrano fasi di fabbricazione di un biosensore 1' secondo una ulteriore forma di realizzazione.

Con riferimento alla figura 12, si dispone innanzitutto un substrato 40, ad esempio di vetro, o silicio, o materiale plastico (es., PET, PEN, PEEK), Quindi, si forma sul substrato 40 un primo strato foto-definibile di idrogel 42, in modo analogo a quanto descritto con riferimento allo strato 22 di figura 3, e qui non ulteriormente riportato.

Quindi, figura 13, si esegue una fase di reticolazione, mediante lampada UV 23 generante una radiazione UV 25, di porzioni selettive del primo strato foto-definibile di idrogel 42. In particolare, al fine di ottenere una polimerizzazione selettiva del primo strato foto-definibile di idrogel 42, si utilizza una maschera 44 provvista di regioni opache 44a, atte a bloccare la radiazione UV 25 incidente, e regioni trasparenti 44b, che sono trasparenti alla radiazione UV 25 incidente. In questo modo, solo le porzioni del primo strato foto-definibile di idrogel 42 estendentisi in corrispondenza delle regioni trasparenti 44b subiscono un processo di reticolazione.

In particolare, il primo strato foto-definibile di idrogel 42 non viene illuminato in corrispondenza di una regione dello stesso che si estende sopra una porzione 40' del substrato 40 che, in fasi di fabbricazione successive, alloggerà terminali elettrici di lavoro 10', di controelettrodo 12' e di riferimento 14'. La porzione 40' del substrato 40 può essere scelta liberamente in funzione della forma geometrica che si vuole conferire al primo strato strutturale 2 (dopo la fase di polimerizzazione); ad esempio, la porzione 40' del substrato 40 si estende lungo la periferia del substrato 40.

Quindi, figura 14, un bagno in acqua deionizzata consente di rimuovere in pochi minuti le porzioni del primo strato foto-definibile di idrogel 42 non polimerizzate, formando un primo strato strutturale 2'.

In seguito, figura ISA, si procede con una fase di deposito, mediante sputtering, di materiale metallico quale ad esempio oro; il deposito mediante sputtering è assistito da una maschera (non mostrata) atta a consentire il deposito del materiale metallico in regioni specifiche del substrato 40 e del primo strato strutturale 2'. Si formano così strisce metalliche che si estendono dalla superficie del primo strato strutturale 2 verso la porzione 40' del substrato 40.

La figura 15B mostra, in vista superiore sul piano XY, il substrato 40 provvisto del primo strato strutturale 2 e dei terminali elettrici di lavoro 10', di controelettrodo 12' e di riferimento 14' così formati. Essi possono essere realizzati anche con metalli quali argento, platino o con polimeri conduttivi o carbonio.

Si procede quindi, figura 16, con la fabbricazione di una regione di rilevamento 6', analoga alla regione di rilevamento 6 del biosensore 1.

A questo fine si forma un secondo strato fotodefinibile di idrogel 46 (provvisto di elementi di bioriconoscimento, ad esempio enzimi) al di sopra del substrato 40, del primo strato strutturale 2' e dei terminali elettrici di lavoro 10', di controelettrodo 12' e di riferimento 14'. Il secondo strato foto-definibile di idrogel 46 forma, in fasi successive di fabbricazione, la regione di rilevamento β'.

Il secondo strato foto-definibile di idrogel 46 viene formato analogamente a quanto descritto precedentemente con riferimento al secondo strato foto-definibile di idrogel 26, a partire da una soluzione prepolimerica di idrogel (es., PEG-DA), un fotoiniziatore (es., 2-idrossi-2-metil-lfenil-propan-l-one) al 3% v/v, ed un mediatore redox (es,, un derivato del ferro cene, quale il vinilferrocene) al 1% v/v. Una soluzione enzimatica viene preparata dissolvendo opportuni enzimi in un buffer fosfato PBS con pH variabili in un intervallo tra 6 e 6.5 e glutaraldeide quale agente per migliorare la ritenzione dell'enzima nella matrice. Gli enzimi sono scelti, secondo una forma di realizzazione, tra glucosio ossidasi (GOx) e lattato ossidasi (LOx). La concentrazione degli enzimi in PBS è, ad esempio, pari a 20 mg/mL.

La soluzione prepolimerica e la soluzione enzimatica così preparate vengono miscelate tra loro per un tempo compreso tra 4 e 5 ore ad una temperatura compresa tra 4 e 5 °C (es,, 4°C). Il rapporto tra la soluzione prepolimerica e la soluzione enzimatica è di 10:1 v/v, ma può essere variato secondo necesità. La miscela così ottenuta (nota come ''matrice di rilevamento" - "sensing matrix") viene deposta mediante tecnica di spin coating e forma il secondo strato foto-definibile di idrogel 46, in modo analogo a quanto già descritto con riferimento al secondo strato foto-definibile di idrogel 26. Il secondo strato fotodefinibile di idrogel 46 ha uno spessore compreso tra 100 nm e 1000 nm, ad esempio pari a 200 nm. Anche in questo caso, i parametri di deposizione possono essere regolati in funzione della viscosità della soluzione utilizzata per il secondo strato foto-definibile di idrogel 46, in modo tale da ottenere uno strato 46 (e, quindi, la regione di rilevamento 6') avente lo spessore desiderato.

Quindi, figura 17, si procede con una fase di esposizione a radiazione UV per favorire la reticolazione di porzioni selettive del secondo strato foto-definibile di idrogel 46, utilizzando una opportuna maschera (non mostrata). L'esposizione avviene, ad esempio, mediante la stessa lampada UV 23 precedentemente utilizzata, generante la radiazione UV 25. Al fine di ottenere una polimerizzazione selettiva del secondo strato fotodefinibile di idrogel 46, si utilizza una maschera provvista di regioni opache atte a bloccare la radiazione UV 25 incidente e regioni trasparenti alla radiazione UV 25 incidente. In questo modo, solo le porzioni del secondo strato foto-definibile di idrogel 46 allineate, lungo Z, alle regioni trasparenti sono soggette ad un processo di reticolazione poiché 1' idrogel si comporta come un fotoresist negativo.

La fase di polimerizzazione è eseguita utilizzando i seguenti parametri di esposizione già precedentemente indicati per la polimerizzazione del secondo strato fotodefinibile di idrogel 26. Una successiva fase di bagno in acqua deionizzata consente di rimuovere in pochi minuti le porzioni del secondo strato foto-definibile di idrogel 46 non polimerizzato, formando la regione di rilevamento 6', come mostrato in figura 17.

Dopo la fase di rimozione dell'idrogel non polimerizzato, solo la pista metallica che forma il terminale elettrico di lavoro 10' si estende in contatto diretto con la regione di rilevamento 6'. Le piste metalliche che formano i terminali elettrici di controelettrodo e di riferimento 12', 14' non sono in contatto diretto con la regione di rilevamento 6', ma si estendono lateralmente ad essa.

Quindi, figura 18, si procede con la formazione di un secondo strato strutturale 4', analogo al secondo strato strutturale 4 del biosensore 1. Le fasi di fabbricazione del secondo strato strutturale 4' sono analoghe a quelle precedentemente descritte per il secondo strato strutturale 4 (si veda la descrizione delle figure 10 e 11, e non sono qui ulteriormente riportate.

In particolare, il processo di fabbricazione del secondo strato strutturale 4' prevede la formazione di una apertura passante 8' in corrispondenza della regione di rilevamento 6'. Attraverso l'apertura passante 8' viene esposta, almeno in parte, la regione di rilevamento 6'.

La figura 19 mostra, in vista prospettica, il biosensore 1' fabbricato secondo le fasi delle figure 12-18.

Come si nota dalla figura 19, in questa forma di realizzazione il substrato 40 non viene rimosso, in quanto esso funge da supporto per i terminali elettrici di lavoro 10', di controelettrodo 12' e di riferimento 14'. Per favorire l'aderenza del substrato 40 al primo strato strutturale 2', è possibile inserire uno strato adesivo, ad esempio a base di organosilano, tra il substrato 40 e il primo strato strutturale 2', prima della fase di deposizione del primo strato di idrogel 42 di figura 12.

La funzionalizzazione del substrato 40 con molecole di silano avviene secondo una procedura di per sé nota, ad esempio descritta in US 2014/0017772. In particolare, il substrato è trattato mediante un trattamento al plasma in ossigeno (si utilizza a questo fine un comune sistema di plasma etching). Viene altresì preparata una soluzione di silano (2% v/v) con 3-(Trimetossisilil)propil metacrilato in alcol isopropilico, correggendo il pH con acido acetico, per portarlo ad un valore di 4.5-5. La soluzione è quindi posta sotto leggera agitazione e si attendono alcuni minuti (in particolare, almeno 30 minuti) prima di utilizzarla; questo consente di far avvenire 1'idrolisi dei gruppi silossanici.

Si immerge quindi il substrato 40 nella soluzione di silano, lo si lava in alcol isopropilico e quindi lo si scalda a 120°C per 60 minuti. Il substrato 40 è così funzionalizzato con molecole di silano che espongono gruppi metacrilici ai quali successivamente si legherà 1'idrogel 42 durante la sua polimerizzazione, formando lo stato 2'. I silani sono scelti in funzione della tipologia di idrogel che si deposita sul substrato. Nel caso di idrogelo a base di PEG-DA, i silani possono essere scelti nella famiglia di silani acrilati o metacrilati, azosilani ciclici, silani con terminazioni amminiche, dipodali, e carbossilati.

Il biosensore 1, 1' può essere utilizzato disponendolo direttamente sulla cute del paziente da monitorare, in modo tale che la regione di rilevamento 6, 6' sia affacciata alla cute attraverso l'apertura passante 8, 8'. L'apertura passante 8, 8' formata attraverso il secondo strato strutturale 4, 4' di idrogel realizza, in uso, una camera chiusa che non impedisce la naturale traspirazione della cute, ma limita considerevolmente lo scambio di aria con l'ambiente esterno, causando un rapido aumento della temperatura locale della cute fino a valori di circa 35-40 °C. Il vapore che si genera all'interno dell'apertura passante 8, 8' satura l'ambiente e favorisce la formazione di sudore che, entrando in contatto con la regione di rilevamento 6, 6', consente l'esecuzione dell'analisi biologica. Dal sudore prodotto possono infatti essere monitorati glucosio o lattato, grazie agli enzimi GOx o LOx presenti nella matrice di rilevamento ("sensing matrix'').

Il monitoraggio della corrente presente tra i terminali elettrici di lavoro 10, 10' e di controelettrodo 12, 12' consente di ottenere, in modo di per sé noto, informazioni circa la concentrazione di analita monitorato.

La Richiedente ha verificato che la matrice di idrogel utilizzata secondo la presente divulgazione per la realizzazione della regione di rilevamento 6, 6' fornisce una risposta lineare nell'intervallo di concentrazioni da ΙΟμΜ a 4mM per il glucosio, e da ΙμΜ a 4mM per il lattato, ossia in intervalli compatibili con le concentrazioni tipicamente presenti nel sudore umano.

In uso, il biosensore 1 funziona come sensore amperometrico . Come noto, un sensore amperometrico si basa sulla misura della corrente tra il terminale elettrico di lavoro 10 e il terminale di controelettrodo 12, corrente che è indotta dalla reazione redox tra analita ed enzima che avviene al terminale elettrico di lavoro 10. La corrente è proporzionale alla concentrazione dell'analita da monitorare. A questo fine, un potenziale costante (determinato dal potenziale redox del mediatore, precedentemente valutato tramite misure di voltammetria ciclica) è applicato alla cella elettrochimica e la risposta della corrente viene monitorata. Questo potenziale consente di operare nelle condizioni ottimali per il monitoraggio della corrente. In particolare, l'elettrodo di lavoro 10 è fissato ad un potenziale, ad esempio di 0.25V, rispetto al terminale elettrico di riferimento 14. Il valore di 0.25 V è il potenziale di picco anodico, misurato dalla Richiedente, del mediatore in vinilferrocene immobilizzato nella matrice di idrogel. Il terminale di controelettrodo è un elettrodo ausiliario e funziona come collettore della corrente ("current drain") generata durante la reazione redox al terminale elettrico di lavoro 10 (il controelettrodo 12 ''raccoglie" gli elettroni generati dalla reazione enzima-analita).

La configurazione a tre elettrodi garantisce la presenza di un potenziale stabile tra il terminale elettrico di lavoro 10 e il terminale elettrico di riferimento 14, Tuttavia, altre configurazioni, in particolare una configurazione a due elettrodi (in cui il riferimento coincide con il controelettrodo) è altresì utilizzabile secondo un ulteriore aspetto della presente divulgazione.

Un potenziostato (non mostrato in figura) è operativamente accoppiabile al terminale elettrico di lavoro 10, al terminale di controelettrodo 12 e al terminale elettrico di riferimento 14, ed è configurato per controllare il voltaggio attraverso la coppia terminale elettrico di lavoro-controelettrodo e di aggiustarlo per mantenere la differenza di potenziale imposta tra il terminale elettrico di lavoro 10 e il terminale elettrico di riferimento 14, Il terminale elettrico di riferimento misura e controlla il potenziale del terminale elettrico di lavoro 10 mentre il terminale di controelettrodo 12 fa passare tutte le altre correnti in maniera tale da bilanciare quella che si osserva ancora al terminale elettrico di lavoro 10. Con questo arrangiamento la corrente generata per reazione redox viene fatta passare tra il terminale elettrico di lavoro 10 e il terminale di controelettrodo 12. Questa corrente, misurabile, è indicativa di una concentrazione di specie elettroattive presenti nell'analita.

Il biosensore 1' funziona in modo analogo al biosensore 1, secondo quanto sopra descritto.

I vantaggi ottenibili con il trovato descritto sono evidenti dalla descrizione precedente.

In particolare, il primo strato strutturale 2 ed il secondo strato strutturale 4 operano come capsule di supporto, protezione e contenimento della regione di rilevamento 6 e, allo stesso tempo fungono da strato isolante tra gli elettrodi. Dunque, non sono necessari ulteriori strati di supporto e contenimento, rendendo il biosensore 1 di semplice costruzione ed economico.

Il processo di fabbricazione prevede l'utilizzo di dispositivi e tecnologie ampiamente utilizzate nell'ambito della microfabbricazione di dispositivi microelettromeccanici, ed in particolare la forma degli strati 2, 2', 4, 4' viene definita attraverso semplici fasi fotolitografiche. Il biosensore 1, 1' può dunque essere integrato all'interno di dispositivi elettronici o MEMS più complessi, sfruttando la stessa tecnologia di fabbricazione .

L'utilizzo dell'idrogel consente di fabbricare un biosensore che non causa fastidi durante l'uso (essendo di materiale flessibile) ed avente l'aspetto, ad esempio, di un piccolo cerotto. È dunque di semplice utilizzo, autoconsistente ed esteticamente poco appariscente. Il biosensore in oggetto, inoltre lavora a potenziali bassi. Si può inoltre integrare in dispositivi medici o in altri dispositivi indossabili, come un bracciale, in modo discreto.

Poiché l'analisi è effettuata sulla base del sudore del paziente, l'utilizzo del biosensore 1, 1' non causa dolore.

Risulta infine chiaro che a quanto qui descritto ed illustrato possono essere apportate numerose modifiche e varianti, tutte rientranti nell'ambito del concetto inventivo, come definito nelle rivendicazioni allegate.

Ad esempio, i terminali elettrici 10, 10', 12, 12', 14, 14' possono essere fabbricati mediante altre tecnologie, ad esempio depositati mediante ink-jet.

Inoltre gli elementi di bio-riconoscimento intrappolati nella regione bioattiva 6 possono essere diversi dagli enzimi GOx e LOx, ad esempio possono essere scelti tra enzimi di altro tipo, oppure tra: anticorpi, acidi nucleici, recettori di cellule (''celi receptors").

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Biosensore (1; 1') per il rilevamento di analiti in un fluido, comprendente: - un primo strato strutturale (2; 2'), di idrogel fotodefinibile; - un secondo strato strutturale (4; 4'), di idrogel fotodefinibile; - una regione bioattiva (6; 6'), estendentesi tra il primo strato strutturale (2; 2') ed il secondo strato strutturale (4; 4'), di idrogel fotodefinibile includente elementi di bio-riconoscimento e un mediatore di ossidoriduzione; - un elettrodo di lavoro (10; 10'), estendentesi in contatto diretto con la regione bioattiva (6; 6'); - un controelettrodo (12; 12'), estendentesi in contatto diretto con il primo strato strutturale (2; 2') a distanza dalla regione bioattiva (6; 6'), in cui il secondo strato strutturale (4; 4') presenta una apertura passante (8; 8') in corrispondenza della regione bioattiva (6; 6'), cosicché la regione bioattiva (6; β') è in collegamento fluidico diretto con un ambiente esterno al biosensore per ricevere detto fluido comprendente detti analiti atti a reagire con gli elementi di bio-riconoscimento e con il mediatore di ossidoriduzione 2. Biosensore secondo la rivendicazione 1, in cui la regione bioattiva (6; β') si estende in contatto diretto con il primo strato strutturale (2; 2') e con il secondo strato strutturale (4; 4'), 3. Biosensore secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il primo strato strutturale (2; 2’) delimita inferiormente la regione bioattiva (6; 6' ) ed il secondo strato strutturale (4; 4' ) circonda lateralmente la regione bioattiva (6; 6'). 4. Biosensore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui gli elementi di bioriconoscimento sono enzimi. 5. Biosensore secondo la rivendicazione 4, in cui detti enzimi sono scelti tra glucosio ossidasi e lattato ossidasi . 6. Biosensore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui regione bioattiva (6; 6'), il primo strato strutturale (2; 2') e il secondo strato strutturale (4; 4') comprendono ciascuno almeno un monomero o prepolimero. 7. Biosensore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui regione bioattiva (6; 6'), il primo strato strutturale (2; 2’) e il secondo strato strutturale (4; 4') comprendono ciascuno almeno uno tra: oligomeri e prepolimeri . 8. Biosensore secondo la rivendicazione 7 in cui detto almeno uno tra detti oligomeri e prepolimeri è scelto nel gruppo comprendente: 0 0 CH2=CH— CIl — O→-CH2CH2O-÷^CII — CH=CH2Glicolo polietilenico diacrilato, o PEG-DA, C1I3o o Cll3 CH cI—cII__0CH2CH20-V-c- O= OH2 PEG di metacrilato, CIT30 HO— f-CH— CH2— 0 — C — CH=CH— C — 0-^ — ί-Ο3⁄40Η20-)^— OH 0 Polipropilene fumarato-co-et ilene glicole, Destrano modificato con metacrilato, OCH2CH2OCH2CH2OCH3 OCH^CH^OCHICHOOCHÌ MEEP COOII C IIH r i Acido ialuronico commutato, -CHiCH" -CH,CH— - CHJCH- -CIHCII-CIHCH OH 0 OH 0 J.Ò TH C 1H:C3⁄4OH CH, NH 0 c=o C— 0 CII CH C II C IIH, H, PVA modificato con acrilato PVA οαι2α1⁄4οαι2αΐ2θα1⁄2 OCII3CII / S Poliiosfazene CH3 PHEMA 9. Biosensore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente inoltre un elettrodo di riferimento (14; 14') estendentesi in contatto diretto con il primo strato strutturale (2; 2') a distanza dalla regione bioattiva (6; 6'). 10. Biosensore secondo la rivendicazione 9, comprendente inoltre un potenziostato, operativamente accoppiato all'elettrodo di lavoro (10; 10'), al controelettrodo (12; 12') e all'elettrodo di riferimento (14; 14') e configurato per mantenere l'elettrodo di lavoro ad un potenziale costante rispetto all'elettrodo di riferimento, cosicché una corrente elettrica circoli tra l'elettrodo di lavoro e il controelettrodo, detta corrente elettrica essendo indicativa di una concentrazione di specie elettroattive presenti nell'analita. 11. Metodo di fabbricazione di un biosensore (1; 1') per il rilevamento di analiti in un fluido, comprendente le fasi di; - formare un primo strato strutturale (2; 2'), depositando un idrogel fotodefinibile; - formare un secondo strato strutturale (4; 4'), depositando un idrogel fotodefinibile; - formare una regione bioattiva (6; 6') tra il primo strato strutturale (2; 2') ed il secondo strato strutturale (4; 4'), depositando un idrogel fotodefinibile includente elementi di bio-riconoscimento e un mediatore di ossidoriduzione, ; - formare un elettrodo di lavoro (10; 10') in contatto diretto con la regione bioattiva (6; 6'); formare un controelettrodo (12; 12') in contatto diretto con il primo strato strutturale (2; 2'); e - formare una apertura passante (8; 8') attraverso il secondo strato strutturale (4; 4')/in corrispondenza della regione bioattiva (6; 6')/collegando fluidicamente la regione bioattiva (6; 6') con un ambiente esterno al biosensore per ricevere detto fluido comprendente detti analiti atti a reagire con gli elementi di bioriconoscimento e con il mediatore di ossidoriduzione. 12. Metodo secondo la rivendicazione 11, in cui la fase di formare la regione bioattiva (6; 6') comprende formare la regione bioattiva (6; 6') in contatto diretto con il primo strato strutturale (2; 2’) e con il secondo strato strutturale (4; 4')