ITTO960496A1 - Modificatione di farmaci polipeptidici per accrescere il flusso per e- lettrotrasporto. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Modificazione di farmaci polipeptidici per accrescere il flusso per elettrotrasporto",

DESCRIZIONE

CAMPO TECNICO

L'invenzione si riferisce in generale alla somministrazione di farmaco per elettrotrasporto, e più particolarmente alla somministrazione di farmaco per elettrotrasporto transdermico. Specificamente, l'invenzione si riferisce ad un procedimento per migliorare il flusso di elettrotrasporto di farmaci polipeptidici sostituendo certi amminoacidi nel polipeptide.

SFONDO DELL'INVENZIONE

La somministrazione transdermica (cioè attraverso la pelle) di agenti terapeutici (per esempio farmaci) è una via di somministrazione importante per medicinali. La somministrazione transdermica di farmaco aggira la degradazione gastrointestinale ed il metabolismo epatico. La maggior parte dei sistemi commerciali di somministrazione transdermica di farmaco (per esempio cerotti epidermici di nitroglicerina, scopolammina, estradiolo, testosterone) somministra il farmaco mediante diffusione passiva. Il farmaco si diffonde da un serbatoio nel cerotto nella pelle del paziente per mezzo del gradiente di concentrazione esistente, cioè il farmaco si diffonde dall'elevata concentrazione nel serbatoio del cerotto alla bassa concentrazione nel corpo del paziente. Il flusso di farmaco attraverso la pelle del paziente viene determinato da numerosi fattori comprendenti il coefficiente di ripartizione del farmaco e le caratteristiche di solubilità. Questo tipo di sistema di somministrazione (cioè un cerotto) fornisce somministrazione bassa, ma controllata, del farmaco al flusso sanguigno del paziente. La somministrazione transdermica di farmaco è una via di somministrazione particolarmente attraente per farmaci con un ristretto indice terapeutico, breve semi-vita e potente attività.

Sfortunatamente, molti farmaci presentano flussi di diffusione transdermica che sono troppo bassi per essere terapeuticamente efficaci. Questo è specialmente vero per farmaci ad alto peso molecolare come polipeptidi e proteine. Per aumentare il flusso transdermico di farmaco, è stata usata una tecnica che prevede l'applicazione di bassi valori di corrente elettrica applicati attraverso un serbatoio di farmaco a contatto con una superficie del corpo del paziente (per esempio la pelle). Questa tecnica è stata chiamata con diversi nomi comprendenti iontoforesi e, più recentemente, elettrotrasporto.

L'elettrotrasporto è un procedimento mediante il quale il trasporto transdermico di agenti o speci terapeutiche viene ottenuto usando corrente elettrica come forza di azionamento, cioè applicando corrente elettrica al paziente attraverso un serbatoio che contiene l'agente. Come tale, 1'elettrotrasporto è un procedimento più controllabile rispetto alla somministrazione transdermica passiva di farmaco, poiché l'ampiezza, la durata e la polarità della corrente elettrica applicata vengono regolati facilmente usando componenti elettrici standard. In generale, il flusso di farmaco per elettrotrasporto può essere dal 50% fino a diversi ordini di grandezza maggiore rispetto al flusso transdermico passivo dello stesso farmaco .

Nei dispositivi per esempio elettrotrasporto attualmente noti, vengono usati almeno due elettrodi.

Entrambi questi elettrodi vengono posizionati in contatto elettrico intimo con la stessa parte della superficie del corpo del paziente (per esempio la pelle). Un elettrodo, chiamato elettrodo attivo o donatore, è l'elettrodo dal quale l'agente terapeutico (per esempio ionico o ionizzabile), precursore del farmaco oppure il farmaco viene distribuito nel corpo per elettrotrasporto. L'altro elettrodo, chiamato controelettrodo o elettrodo di ritorno, serve a chiudere il circuito elettrico attraverso il corpo. Insieme con la superficie del corpo del paziente contattata dagli elettrodi, il circuito viene completato collegando gli elettrodi ad una fonte di energia elettrica, per esempio una batteria.

In base alla carica elettrica delle speci da somministrare transdermicamente, sia l'anodo che il catodo possono essere l'elettrodo "attivo" o donatore. Se, per esempio, la sostanza ionica da somministrare nel corpo è caricata positivamente (cioè un catione), l'anodo sarà quindi l'elettrodo attivo e il catodo servirà per completare il circuito. D'altra parte, se la sostanza ionica da distribuire è caricata in modo relativamente negativo (cioè un anione), il catodo sarà quindi l'elettrodo attivo e l'elettrodo anodico sarà il controelettrodo.

In alternativa, sia l'anodo che il catodo possono venire usati per somministrare nel corpo farmaci con carica appropriata. In tale caso, entrambi gli elettrodi vengono considerati elettrodi attivi o donatori. Vale a dire, che l'elettrodo anodico può somministrare nel corpo agenti caricati positivamente mentre l'elettrodo catodico può somministrare nel corpo agenti caricati negativamente.

I dispositivi per elettrotrasporto esistenti richiedono generalmente un serbatoio o fonte di agente terapeutico da somministrare nel corpo mediante elettrotrasporto; l'agente è tipicamente in forma di soluzione liquida di speci ionizzate o ionizzabili, oppure un precursore di tali speci. Esempi di tali serbatoio o fonti comprendono una sacca come descritta in Jacobsen, Brevetto U.S. 4.250.878; un corpo di gel preformato come descritto in Webster, Brevetto U.S.

4.382.529; e un contenitore di vetro o plastica che contiene una soluzione liquida del farmaco come descritto nelle figure di Sanderson et al., Brevetto U.S. 4.722.726. Tali serbatoio di farmaco sono collegati elettricamente all'anodo oppure àl catodo del dispositivo di elettrotrasporto per provvedere una fonte fissa o rinnovabile di una o più speci o agenti desiderati .

II-termine "elettrotrasporto" come usato in questa sede, si riferisce in generale alla somministrazione assistita elettricamente di un agente terapeutico, sia che l'agente venga somministrato compietamente caricato (cioè ionizzato al 100%), completamente non caricato, oppure parzialmente caricato e parzialmente non caricato. L'agente o speci terapeutiche possono venire somministrate mediante elettromigrazione, elettroosmosi, elettroporazione oppure qualsiasi loro combinazione. L'elettroosmosi, in generale, deriva dalla migrazione di solvente liquido, in cui sono contenute le speci, come risultato dell'applicazione di forza elettromotrice al serbatoio di speci terapeutiche. L'elettroporazione prevede la formazione di pori temporanei che si verifica in seguito ad applicazione di corrente elettrica alla pelle .

Di interesse particolare è la somministrazione per elettrotrasporto transdermico di peptidi, polipeptidi e proteine, a causa dei problemi incontrati con le vie di somministrazione del farmaco più comuni come la somministrazione orale. Le molecola di polipeptide e proteina sono altamente sensibili alla degradazione da parte di enzimi proteolitici nel tratto gastrointestinale e vengono sottoposte ad un elevato metabolismo a livello epatico quando assunte oralmente. I polipeptidi e le proteine richiedono normalmente somministrazione parenterale per ottenere livelli terapeutici nel sangue del paziente. Le tecniche di somministrazione parenterale più convenzionali sono iniezione ipodermiche e somministrazione intravenosa. I polipeptidi e le proteine hanno, tuttavia, una azione inerentemente breve nella loro attività biologica, richiedendo frequenti iniezioni, diverse volte al giorno, per mantenere le quantità terapeuticamente efficaci richieste. I pazienti trovano frequentemente questo regime di trattamento fastidioso, doloroso e con un rischio collegato, per esempio infezione.

Sono stati fatti molti sforzi per trovare altre vie (diverse dalle iniezioni parenterali) per la somministrazione efficace di farmaci polipeptidi e proteici. Le vie di somministrazione con meno effetti secondari come pure con migliore soddisfazione del paziente sono state di interesse particolare. Tali vie alternative comprendono generalmente la somministrazione orale "schermata" in cui il polipeptide/proteina viene rilasciata da una capsula o altro contenitore dopo passaggio nell'ambiente a basso pH dello stomaco, distribuiti attraverso i tessuti mucosi, per esempio i tessuti mucosa del polmone con inalatori oppure i tessuti della mucosa nasale con spray nasali, e pompe impiantabili. Sfortunatamente, fino ad ora, queste vie alternative di somministrazione di polipeptide/proteina hanno incontrato solo un successo limitato.

La somministrazione per elettrotrasporto di polipeptidi e proteine ha anche incontrato difficoltà tecniche. Per esempio, l'acqua è il solvente liquido preferito per formare la soluzione del farmaco da distribuire mediante elettrotrasporto, per la sua eccellente biocompatibilità. Sfortunatamente, molti polipeptidi e proteine sono instabili (cioè si idrolizzano, ossidano, denaturano o si degradano altrimenti) in presenza di acqua. La pelle contiene anche enzimi proteolitici che possono degradare il polipeptide/proteina quando vengono somministrati transdermicamente. Inoltre, certi polipeptidi/proteine, in particolare quelli che non sono nativi dell'animale da trattare, possono causare reazioni della pelle, per esempio sensibilizzazione o irritazione.

Numerosi studiosi hanno descritto la somministrazione per elettrotrasporto di polipeptidi e proteine. Uno studio recente di R. Burnette et al., J. Pharm. Sci., voi. 75 (1986) 738, prevede permeazione in vitro nella pelle di ormone che rilascia tirotropina, una piccola molecola di tripeptide. È stato trovato che il flusso di elettrotrasporto è maggiore rispetto al flusso di diffusione passivo. Chien et al., J. Pharm. Sci., voi. 78 (1988) 376, sia in studi in vitro che in vivo, hanno dimostrato che è possibile la somministrazione transdermica di vasopressina e insulina mediante elettrotrasporto. Vedi anche Maulding et al., U.S. Statutory Invention Registration n. H1160, che descrive la somministrazione per elettrotrasporto di calcitonina in cavie.

Numerosi approcci (diversi dal semplice aumento delle quantità di corrente di elettrotrasporto applicata) sono stati usati per aumentare il flusso di elettrotrasporto transdermico di farmaci polipeptidici e proteici. Un approccio prevede l'uso di aumentatori di flusso come tensioattivi ionici. Vedi, per esempio Sanderson et al., Brevetto U.S. 4.722.726. Un altro approccio utilizza cosolventi diversi dalla sola acqua per aumentare il flusso di elettrotrasporto. Vedi, per esempio, la Domanda di Brevetto Europeo 0 278 473. Ancora un altro approccio prevede la disgregazione meccanica dello strato esterno (cioè lo strato corneo) della pelle prima della somministrazione per elettrotrasporto attraverso di essa. Vedi, per esempio, Lee et al·., Brevetto U.S. 5.250.023.

Ulteriori approcci per aumentare il flusso di farmaco per elettrotrasporto transdermico prevedono la creazione di un profarmaco oppure un analogo del farmaco di interesse e 1'elettrotrasporto del profarmaco o dell'analogo modificato. Per esempio, WO 92/12999 descrive la somministrazione di insulina come analogo dell'insulina avente una ridotta tendenza ad auto-associarsi (forme apparentemente associate di insulina presenti in composizioni farmaceutiche convenzionali riducono la somministrazione transdermica dell'insulina). Gli analoghi vengono creati sostituendo acido aspartico (Asp) o acido glutammico (Giu) con altri residui di amminoacidi in posizioni scelte lungo la catena del polipeptide insulina. WO 93/25197 descrive la somministrazione di farmaci peptidici e non peptidici come complessi modificatori dell'agente farmaceutico o profarmaci in cui un modificatore chimico (per esempio una parte caricata) è legato covalentemente all'agente farmaceutico progenitore. Il legame covalente viene rotto dopo che l'agente è stato somministrato nel corpo, rilasciando così l'agente progenitore .

Mentre i problemi associati con la somministrazione per elettrotrasporto di proteine e polipeptidi sono stati individuati, e sono stati proposti tentativi per migliorare il flusso di elettrotrasporto di farmaci polipeptidici e proteici, esiste ancora la necessità di provvede un procedimento per ottenere un flusso di elettrotrasporto transdermico maggiore di polipeptidi e proteine.

DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE

Un aspetto della presente invenzione consiste nel provvedere un procedimento per aumentare il flusso di elettrotrasporto di farmaci e, più specificamente, farmaci polipeptidici e proteici.

Un altro aspetto della presente invenzione consiste nel provvedere un procedimento per aumentare il flusso di elettrotrasporto transdermico di farmaci polipeptidici e proteici. Come tale, il procedimento della presente invenzione permette la somministrazione per elettrotrasporto di molti polipeptidi e proteine che altrimenti non potrebbero venire trasportati transdermicamente mediante elettrotrasporto a velocità terapeuticamente efficaci.

Questi ed altri aspetti saranno evidenti a persone esperte nel campo della somministrazione per elettrotrasporto dalla seguente descrizione dettagliata della presente invenzione. La presente invenzione si riferisce a procedimenti per derivatizzare farmaci polipeptidici e proteici in modo da migliorare o aumentare il flusso di elettrotrasporto del farmaco. Il procedimento della presente invenzione è caratterizzato dal provvedere il polipeptide o proteina di interesse come analogo sintetico che ha proprietà di flusso per elettrotrasporto migliorate, come carica positiva aumentata al pH al quale si verifica 1'elettrotrasporto, mobilità iontoforetica aumentata e/oppure idrofilicità aumentata.

L'analogo preferibilmente ha almeno la stessa bioattività del polipeptide o proteina progenitore, e più preferibilmente ha bioattività maggiore del progenitore. L'analogo differisce dal progenitore per la sostituzione con residui di istidina di uno o più residui di amminoacidi che hanno una catena laterale polare, ma non caricata. I residui di istidina presentano una carica positiva ai campi di pH che tipicamente si incontrano durante la somministrazione per elettrotrasporto anodico. I residui di amminoacidi sostituibili preferiti comprendono glutammina, asparagina e treonina. Fra questi, viene più preferibilmente sostituita la glutammina.

In un altro aspetto, l'invenzione è un analogo sintetico avente flusso di elettrotrasporto aumentato rispetto al suo farmaco polipeptidico o proteico progenitore. Il farmaco polipeptidico o proteico progenitore ha almeno un residuo di amminoacido a catena laterale polare ma non caricata, e l'analogo ha almeno uno di questi residui sostituito con un residuo di istidina. L'analogo presenta preferibilmente almeno circa la stessa attività biologica del farmaco polipeptidico o proteico progenitore e preferibilmente ha la stessa distribuzione della carica globale del progenitore a pH fisiologico.

Altri vantaggi e un apprezzamento di adattamenti specifici, variazioni della composizioni e attributi fisici della presente invenzione sarà evidente dai seguenti disegni e descrizione dettagliata.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI

Nel disegno, in cui numeri di riferimento uguali si riferiscono a elementi uguali,

la Figura 1 è una vista schematica di un dispositivo per la somministrazione di farmaco mediante elettrotrasporto secondo la presente invenzione.

MODI PER REALIZZARE L'INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce in generale ad un procedimento per aumentare il flusso di elettrotrasporto di agenti terapeutici e in particolare il flusso di elettrotrasporto transdermico di polipeptidi e proteine. La presente invenzione si riferisce anche a formulazioni di agente terapeutico ed a sistemi di somministrazione per elettrotrasporto per realizzare i procedimenti descritti in questa sede.

La presente invenzione è caratterizzata dalla capacità di migliorare il flusso di elettrotrasporto di farmaci polipeptidici e proteici per la somministrazione per elettrotrasporto, aumentando 1'idrofilicità e la mobilità elettroforetica al pH di elettrotrasporto, mantenendo la distribuzione della carica globale approssimativamente ad un pH fisiologico, e preferibilmente mantenendo almeno circa la stessa attività biologica del farmaco polipeptidico o proteico.

In un aspetto, la presente invenzione provvede un analogo sintetico di un farmaco polipeptidico biologicamente attivo avente caratteristiche di elettrotrasporto migliorate rispetto al farmaco. Come usato in questa sede, il termine "polipeptide" deve essere considerato in generale come comprensivo di qualsiasi dei residui di amminoacido legati mediante legami peptidici; vale a dire peptidi, polipeptidi e proteine. Come usato in questa sede, il termine "analogo" è inteso in generale come riferito a muteina, un derivato strutturale di un farmaco polipeptidico progenitore, oppure un polipeptide modificato in cui almeno un residuo di amminoacido nel farmaco polipeptidico progenitore è stato sostituito con un residuo di amminoacido differente. Il farmaco progenitore può derivare da fonti naturali oppure essere stato completamente sintetizzato mediante procedimenti chimici o biochimici. Si comprende che il farmaco progenitore può essere una sequenza polipeptidica naturale oppure può esso stesso avere differenze strutturali da un polipeptide naturale. I termini "farmaco polipeptidico", "agente polipeptidico" oppure "polipeptide farmaceutico" si intendono riferiti a qualsiasi polipeptide, quando il termine viene usato in questa sede, che ha attività fisiologica, cioè bioattività.

Secondo questo aspetto dell'invenzione, come farmaci polipeptidici vengono preferiti quelli che contengono almeno un residuo di amminoacido avente una catena laterale polare, ma non caricata. L'analogo secondo la presente invenzione viene sintetizzato sostituendo uno di questi residui con un residuo di istidina (His). Specificamente preferiti come farmaci polipeptidici sono quelli che contengono almeno un residuo di glutammina (Gin), treonina (Thr) oppure asparagina (Asn). Uno o più di questi residui vengono sostituiti con un residuo di istidina (His) nell'analogo della presente invenzione. Molto preferita è la sostituzione del residuo(i) di glutammina sul farmaco polipeptidico con residui di istidina. L'analogo secondo la presente invenzione presenta preferibilmente attività biologica almeno circa uguale a quella del farmaco polipeptidico di interesse non modificato, e più preferibilmente ha bioattività maggiore rispetto al farmaco, ma ha idrofilicità e mobilità elettroforetica aumentate rispetto al farmaco progenitore. Come tale, l'analogo secondo la presente invenzione presenta flusso di elettrotrasporto transdermico aumentato rispetto al farmaco progenitore, cioè il polipeptide non modificato.

La presente invenzione è utile per aumentare la carica positiva utile su un polipeptide che viene somministrato da un serbatoio anodico di un dispositivo per la somministrazione mediante elettrotrasporto. In generale, il campo di pH di una formulazione di serbatoio donatore anodico contenente l'analogo di polipeptide è nel campo di pH da circa 3,5 a circa 8, e preferibilmente da circa 5 a 6. In questi campi di pH, la sostituzione con His di Gin, Asn oppure Thr porta ad un aumento di idrofilicità dell'analogo rispetto al farmaco progenitore oppure al polipeptide non modificato a causa della carica positiva sull'anello imidazolico e ad una mobilità elettroforetica aumentata a causa della maggiore carica positiva utile. Il risultato è che l'analogo presenta flusso di elettrotrasporto transdermico aumentato rispetto al farmaco progenitore. Contemporaneamente, a pH fisiologico, cioè pH 7,4, l'analogo mantiene la carica, legame idrogeno e caratteristiche di idrofobicità del farmaco polipeptidico progenitore. A pH neutro, la catena laterale imidazolica di His non viene caricata, e quindi la sostituzione con His di Gin, Asn oppure Thr non diminuisce apprezzabilmente l'attività biologica dell'analogo, cioè la sostituzione non altera l'affinità dell'analogo per il suo recettore previsto.

È ulteriormente previsto che il numero di sostituzioni con His di Gin, Asn oppure Thr sia limitato solo dalla carica utile desiderata al pH utilizzato nel sistema di elettrotrasporto. Tuttavia, il numero di sostituzioni non dovrebbe essere così elevato da fare in modo che l'analogo venga individuato come proteina estranea dal sistema immunitario del paziente. Mentre non vi sono regole assolute per determinare il numero di sostituzioni prima che un polipeptide o una proteina venga visto come "estraneo", più l'analogo è simile come struttura/sequenza di amminoacidi al progenitore (cioè minori sono le sostituzioni), meno il polipeptide/proteina verrà visto come estraneo dal sistema immunitario del corpo.

Tipicamente, i polipeptidi e le proteine, compresi i loro analoghi, entro lo scopo della presente invenzione, hanno pesi molecolari nel campo da circa poche centinaia di dalton (per esempio per un tripeptide) a circa 30.000 dalton. Esempi specifici di farmaci polipeptidici, proteici e macromolecolari in questo campo comprendono, senza limitazione, CSF, GHRH, insulina, calcitonina, endorfine, eritropoietina, ormone paratiroideo e agonista, GHRF, insulotropina, octreotide, ormoni della ghiandola pituitaria (per esempio HGH, HMG, desmopressina acetato, ecc.), luteoidi follicolari, otANF, fattori di crescita come fattore di rilascio del fattore di crescita (GFRF), somatostatina, peptide natriuretico atriale, somatotropina, fattore di crescita di derivazione piastrinica, asparaginasi, chimopapaina, colecistochinina, gonadotropina corionica, corticotropina (ACTH), fattore di crescita epidermica, eritropoietina, glucagone, analogo dell'irudina, ialuronidasi, interferoni, fattori di crescita simili all ' insulina (per esempio IGF-1), interleuchine, menotropine (urofollitropina (FSH) e LH), ossitocina, streptochinasi, attivatore del plasminogeno tissutale, urochinasi, vasopressina, desmopressina, analoghi di ACTH, ANP, inibitori dell'eliminazione di ANP, antagonisti dell'angiotensina II, agonisti dell'ormone antidiuretico, antagonisti dell'ormone antidiuretico, CD4, ceredasi, frammenti FAB, soppressori del peptide IgE, neuropeptide Y, fattori neutrofici, peptidi oppiacei, antagonisti dell'ormone paratiroideo, proteina C, proteina S, inibitori della renina, α-1-timosina, trombolitici, TNF, vaccini, analoghi di antagonisti della vasopressina, α-l anti-tripsina (ricombinante) e β-TGF.

Esempi illustrativi di farmaci polipeptidici che sono particolarmente adatti per la modificazione secondo la presente invenzione sono fattore di stimolazione della colonia di granulociti (G-CSF), un fattore che stimola la produzione di granulociti, in particolare neutrofili; ormone paratiroideo (PTH), un fattore di regolazione nel controllo omeostatico del metabolismo del calcio e del fosfato, e usato per trattare 1'osteoporosi; ormone di rilascio dell'ormone luteinizzante (LHRH) e suoi analoghi, e ormone di rilascio dell'ormone della crescita (GHRH) e suoi analoghi, con il loro flusso transdermico aumentato .

La sostituzione con His di Gin, Asn oppure Thr secondo la presente invenzione, viene considerata una modificazione o derivatizzazione "conservativa" di un polipeptide o una proteina. Con questo si intende che 1'idrofobicità/ la carica utile a pH fisiologico, volume e capacità di legame idrogeno del polipeptide o della proteina progenitore vengono conservate nell'analogo. La sostituzione preferita con His di Gin è la più conservativa delle tre sostituzioni possibili, poiché le capacità di legame idrogeno, le cariche a pH 7 e le dimensioni della catena laterale dell'analogo così sintetizzato sono virtualmente identiche al composto progenitore.

Le strutture della catena laterale dei residui di Gin e His sono mostrate in seguito:

Le catene laterali dei residui di Gin e His rivelano una considerevole analogia nelle forme della capacità di legame idrogeno, cioè la sostituzione di Gin con His non altera in modo apprezzabile la capacità di legame idrogeno della catena laterale. In base agli angoli di legame fra il gruppo ammidico planare, il βΟΗ2 e OCCH2, i legami idrogeno coinvolgono la catena laterale di Gin che può anche essere costituita da una catena laterale di His.

Inoltre, le idrofobicità dei residui di His (stato non caricato) e Gin sono molto simili. Vedi Tanford et al., J. Biol. Chem., voi. 246 (1971) 2211-2217, in cui vengono misurate le idrofobicità delle catene laterali di amminoacidi sia in acqua che vari alcoli, e sono state trovate energie di trasferimento libere molto simili per His e Gin in concentrazioni di diossano moderate.

Gli analoghi secondo la presente invenzione possono venire sintetizzati in numerosi modi noti e convenzionali nella tecnica, e quindi non descritti dettagliatamente in questa sede. Tali procedimenti comprendono di nuovo sintesi in fase solida dei polipeptidi, procedimenti chimici ad umido e procedimenti biotecnologici .

La sintesi della proteina in fase solida utilizza il legame del primo amminoacido della sequenza desiderata mediante il suo gruppo carbossilico ad una resina insolubile. Quando il prodotto desiderato è stato ottenuto la sequenza peptidica viene scissa dalla resina. Vedi, per esempio, R. B. Merrifield et al., Biochemistry, voi. 21 (1981) 5020; M. Bodanszky "Principles of Peptide Synthesis", Akad.-Verlag (1984); J. M. Stewart et al. "Solid Phase Peptide Synthesis", Freeman (1969), le descrizioni dei quali sono incorporate in questa sede per riferimento. Sono anche noti altri procedimenti di sintesi. Per esempio, gli analoghi descritti in questa sede possono venire preparati mediante il procedimento di sintesi del peptide multipla simultanea. Vedi, per esempio, Houghten, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., voi. 82 (1985} 5131-5135; Houghten et al., Peptide Chemistry (1987) 295-298; Brevetto U.S. 4.631.211, le descrizioni dei quali vengono incorporate in questa sede per riferimento.

Gli analoghi possono anche venire sintetizzati programmando un apparecchio commerciale sintetizzatore di peptide in modo che da alcuni a tutti i residui di glutammina nella sequenza di amminoacidi di un farmaco polipeptidico o proteico di interesse, vengano sostituiti con residui di istidina.

Gli analoghi della presente invenzione possono anche venire sintetizzati con tecniche note di ingegneria genetica, come sistemi di espressione ricombinante. La mutagenesi in vitro può venire utilizzata per alterare il gene del polipeptide progenitore mediante sostituzione delle basi appropriate nel gene nel sito appropriato con altre che codificano il sostituto del residuo di amminoacido desiderato. Per esempio, la sostituzione di alcuni fino a tutti i codoni per Gin con il codone per His, richiede solo la sostituzione di una singola base di A oppure G nell'ultima posizione del codone Gin con U oppure C. Il gene che codifica l'analogo desiderato viene quindi inserito in un vettore di espressione adatto che quando transfettato in un organismo ospite adatto, per esempio E. coli, Bacillus oppure lievito, genera l'analogo desiderato. L'analogo espresso viene quindi isolato dalle cellule oppure dal brodo di coltura, in base al fatto se l'analogo espresso viene secreto dalla cellule o meno. Nell'analogo espresso, da alcuni a tutti i residui di glutammina non sono presenti nella sequenza polipeptidica, ma sostituiti in quelle posizioni nella sequenza vi sono residui di istidina. Procedimenti per identificare e isolare geni che codificano peptidi e proteine analoghi di interesse, oppure per costruire tali geni, ed esprimerli in sistemi ospiti sono ben noti e sviluppati. Questi procedimenti sono descritti in brevetti ed altre pubblicazioni. Vedi, per esempio, Brevetti U.S. 4.431.739 e 5.013.653; e Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", II ed., Cold Spring Harbor (1989); "ACS Symposium Serie, 477: Expression Systems and Processes of rDNA Products", R. T. Batch et al., American Chemical Society (1991); R. Seetharam et al., "Purification and Analysis of Recombinant Proteins" in "Bioprocess Technology" voi. 12, Marcel Dekker (1991), le descrizioni dei quali vengono incorporate in questa sede per riferimento.

La struttura del gene alterato può anche venire costruita mediante tecniche di sintesi automatica mediante, per esempio, il procedimento con fosforammide di sintesi in fase solida di oligonucleotidi. Vedi, per esempio, S. L. Beaucage et al., Tetrahedron Lett., voi. 22 (1981) 1859-1862; M. D. Matteneci et al., J. Am. Chem. Soc., voi. 103 (1981) 3185-3191, le descrizioni dei quali vengono incorporate in questa sede per riferimento.

Mentre in seguito vengono dati esempi illustrativi degli analoghi compresi dalla presente invenzione per G-CSF, ormone paratiroideo e ormone di rilascio dell'ormone della crescita umano, gli insegnamenti seguenti si applicano a qualsiasi altro polipeptide o proteina biologicamente attivi che contengono residui sostituibili.

G-CSF (un polipeptide con 174 residui di amminoacidi) è noto per avere 12 residui di Gin che sono nelle posizioni 11, 20, 25 e 32 nell'elica A; 107, 119 e 120 nell'elica C; 145, 158 e 173 nell'elica D; e 131 e 134 nella regione ad ansa. La sostituzione di uno o più fino a tutti i Gin di G-CSF con residui di His produce un analogo che presenta una attività specifica a quella del G-CSF non modificato o progenitore. Esempi di analoghi di G-CSF secondo la presente invenzione comprendono: His (11)G-CSF; His (11), His (20)G-CSF; vedi SEQ. ID. N. 1 e 2.

L'ormone paratiroideo (PTH), una proteina avente un peso molecolare di circa 9.500 dalton, ha una sequenza polipeptidica di circa 34 residui di amminoacido dal terminale N che presenta attività biologica completa. È indicato che sequenza di 34 amminoacidi ha due residui di glutammina alle posizioni 5 e 29 della catena polipeptidica. Come nel caso di G-CSF, è possibile usare la presente invenzione per creare mutazioni ai codini 5 e 29 del gene dell'ormone paratiroideo che portano alla sostituzione di uno o entrambi i residui di Gin con residui di His. Tali analoghi secondo la presente invenzione comprendono:

His (5) PTH; His (5), His(29) PTH, vedi SEQ. ID. N. 3 e 4.

L'ormone di rilascio dell'ormone della crescita umano (h-GHRH) è un polipeptide con 44 amminoacidi contenente residui di glutammina alle posizioni 16, 24, 30, 31 e 36. Come nel caso di G-CSF, un gene di h-GHRH modificato può venire preparato inducendo mutagenesi sito-specifiche nel gene di h-GHRH alle posizioni specifiche dei codoni 16, 24, 30, 31, 36, oppure qualsiasi combinazione di 2 o più posizioni che conservano o aumentano l'attività biologica. Preferibilmente, possono venire impiegate mutagenesi dirette all'oligonucleotide per ottenere un gene di h-GHRH analogo che codifica un analogo avente attività di h-GHRH, ma avente la Gin 31 e 36 cambiata in His 31 e 36, vale a dire His(31), His(36) h-GHRH, vedi SEQ. ID. N. 5.

Gli analoghi della presente invenzione sono particolarmente adatti per la somministrazione mediante elettrotrasporto attraverso una superficie o membrana del corpo (per esempio la pelle) di un animale (per esempio un uomo o altri mammiferi come bestiame, cavalli, maiali, ecc.). quindi, la presente invenzione provvede un procedimento per la somministrazione di un analogo ad un paziente mediante elettrotrasporto, comprendente le fasi di provvedere un polipeptide, in forma di analogo sintetico, in un serbatoio donatore atto a venire posizionato in relazione di trasmissione dell'analogo con una superficie del corpo del paziente e applicare un campo elettrico al serbatoio per trasportare l'analogo attraverso la superficie del corpo mediante elettrotrasporto. Il flusso di elettrotrasporto (per esempio transdermico) dell'analogo è maggiore rispetto al flusso per elettrotrasporto (per esempio transdermico) del farmaco progenitore in condizioni simili (per esempio corrente di elettrotrasporto applicata, pH, concentrazione del farmaco, ecc.).

Il procedimento della presente invenzione può venire eseguito usando un dispositivo per la somministrazione per elettrotrasporto azionato elettricamente avente un serbatoio donatore, un serbatoio contenente l'analogo e configurato e dimensionato per venire posto in relazione di trasmissione dell'analogo con la pelle, ed una fonte di corrente elettrica. La fonte di corrente applica una corrente elettrica al serbatoio che provoca somministrazione per elettrotrasporto dell'analogo dal serbatoio dell'agente e attraverso la superficie del corpo. L'analogo ha uno o più, fino a tutti, i suoi residui di Gin sostituiti con residui di His (cioè rispetto alla struttura del polipeptide o proteina progenitore) e presente preferibilmente una attività biologica almeno quasi uguale a quella del polipeptide progenitore.

In un ulteriore aspetto, l'invenzione provvede una composizione terapeutica che comprende una formulazione di serbatoio donatore con una quantità sufficiente di un analogo sintetico di un farmaco polipeptidico progenitore terapeuticamente efficace quando somministrato per elettrotrasporto. L'analogo ha almeno uno o più residui di Gin del farmaco polipeptidico progenitore sostituiti con residui di His. L'analogo presenta preferibilmente una attività biologica almeno quasi uguale, o preferibilmente maggiore, di quella della proteina o polipeptide progenitore .

Il procedimento e la formulazione della presente invenzione non sono limitati ad un dispositivo di elettrotrasporto di qualsiasi struttura particolare. Un esempio di un dispositivo 10 di somministrazione per elettrotrasporto per l'uso nella presente invenzione, per la somministrazione di un analogo attraverso una superficie del corpo 22 (tipicamente pelle intatta o una membrana mucosa) è illustrato nella Figura 1.

Il dispositivo 10 di somministrazione per elettrotrasporto, comprende un gruppo di elettrodo donatore 8 ed un gruppo di controelettrodo 9. I gruppi di elettrodo 8 e 9 sono collegati elettricamente ad una fonte 27 di energia elettrica, che è formata tipicamente da una o più batterie a bassa tensione, ed un circuito di controllo opzionale 19 che viene descritto più dettagliatamente in seguito. Quando il dispositivo 10 viene posto sulla pelle o membrana mucosa di, per esempio, un paziente, il circuito fra gli elettrodi viene chiuso, e la fonte di energia inizia a distribuire corrente attraverso il dispositivo e attraverso la "pelle o membrana mucosa del paziente. I gruppi 8 e 9 di elettrodo donatore e controelettrodo comprendono normalmente un rivestimento di rilascio distaccabile (non rappresentato nella Figura 1) che viene rimosso prima dell'applicazione dei gruppi di elettrodo 8 e 9 alla superficie del corpo 22.

Il gruppo 8 di elettrodo donatore comprende un elettrodo donatore 11 ed un serbatoio di agente 15. Il serbatoio di agente 15 contiene l'analogo da somministrare mediante elettrotrasporto con il dispositivo 10. Il gruppo 8 di elettrodo donatore viene opportunamente fatto aderire alla superficie del corpo 22 per mezzo di uno strato adesivo 17 che conduce ioni.

Il dispositivo 10 comprende un gruppo 9 di controelettrodo che viene posto sulla superficie del corpo 22 in una posizione distanziata dal gruppo di elettrodo 8. Il gruppo 9 di controelettrodo comprende un controelettrodo 12 ed un serbatoio di elettrolita 16. Il gruppo 9 di controelettrodo viene opportunamente fatto aderire alla superficie del corpo 22 per mezzo di uno strato adesivo 18 che conduce ioni.

Gli elettrodi 11 e 12 sono elettricamente conduttivi e possono essere costituiti da un metallo, per esempio un foglio metallico oppure metallo depositato o verniciato su un fondo adatto. Esempi di metalli adatti comprendono argento, zinco, argento/cloruro di argento, alluminio, platino, acciaio inossidabile, oro e titanio. In alternativa, gli elettrodi 11 e 12 possono essere formati da una matrice polimerica contenente uno riempitivo conduttivo come un polvere metallica, grafite in polvere, fibre di carbonio o altro materiale (i) riempitivo noto elettricamente conduttivo.

Gli elettrodi 11 e 12 sono collegati elettricamente alla fonte di energia 27 usando mezzi ben noti, per esempio circuiti stampati flessibili, fogli metallici, fili o mediante contatto diretto.

Il serbatoio di elettrolita 16 contiene un sale adatto farmacologicamente accettabile. Sali adatti comprendono cloruro di sodio, sali di metalli alcalini, sali di metalli alcalino terrosi come cloruri, solfati, nitrati, carbonati, fosfati, e sali organici come ascorbati, citrati, acetati e loro miscele. Il serbatoio 16 può opzionalmente contenere un agente tampone .

I serbatoio 15 e 16 sono preferibilmente formati da qualsiasi materiale adatto ad assorbire e trattenere al suo interno una quantità sufficiente di liquido (cioè una soluzione liquida dell'analogo), per permettere il passaggio dell'analogo mediante elettrotrasporto. Preferibilmente, i serbatoio contengono uno o più polimeri idrofili come polivinilpirrolidone, alcool polivinilico oppure glicoli polietilenici, e opzionalmente uno o più polimeri idrofobi come poliisobutilene, polietilene oppure polipropilene. Mentre non sono limitati a forme o volumi particolari, i serbatoio 15 e 16 hanno ciascuno tipicamente uno spessore di 0,6 era (1/4") o meno ed un'area della sezione trasversale (per esempio di contatto con la pelle) nel campo da circa 1 a 50 cm<2>. L'analogo può venire aggiunto alla matrice polimerica del serbatoio 15 con mezzi convenzionali come miscelazione allo stato liquido e successivo stampaggio o estrusione della matrice-serbatoio contenente l'analogo.

La corrente di elettrotrasporto applicata mediante il dispositivo è tipicamente nel campo da circa 50 a 400 μΑ/cm<2>.

Si ritiene che il flusso di elettrotrasporto transdermico di analoghi secondo la presente invenzione sia almeno superiore di circa il 20%, e più preferibilmente almeno superiore di circa il 50%-100% rispetto a quello del polipeptide progenitore.

La presente invenzione viene spiegata ulteriormente con i seguenti esempi che non devono venire considerati limitativi dello scopo della presente invenzione .

Esempio 1: Analogo di G-CSF

Il G-CSF è una proteina farmaceutica usata per trattare pazienti dopo chemioterapia. Viene anche usata per terapia aggiuntiva per il trattamento di infezioni batteriche. Un analogo di G-CSF viene preparato secondo i procedimenti noti e convenzionali descritti in precedenza in cui i residui di glutammina alle posizioni 107, 119, 120, 131, 134, 145, 158 e 178 vengono sostituiti con residui di istidina. Questo analogo ha una carica utile a pH 6 prossima a 4.

Viene preparato un serbatoio donatore anodico comprendente una soluzione acquosa dell''analogo di G-CSF in una matrice di gel di idrossietilcellulosa (HEC). La formulazione contiene 5 mg/ml di analogo di G-CSF in tampone di istidina 5 mM, pH 6 in idrogel al 3% di HEC contenente l'l% di glicerolo.

Il serbatoio donatore contenente 1'analogo di G-CSF viene usato in un dispositivo di somministrazione per elettrotrasporto. Il dispositivo di somministrazione comprende un elettrodo anodico formato da un foglio di argento posizionato su una superficie del serbatoio donatore, ed un controelettrodo di cloruro di argento posto su una superficie di una matrice di idrogel· HEC contenente una soluzione fisiologica tamponata e usato come gruppo di controelettrodo/serbatoio. Gli elettrodi vengono collegati mediante strisce elettricamente conduttive alle uscite di un circuito di controllo e generazione della corrente di elettrotrasporto che fornisce una corrente di 2,0 mA. Ciascuno dei serbatoi donatore e controelettrodo in HEC ha un'area di contatto con la pelle di 20 cm<2>. Il dispositivo viene posto sulla pelle di un paziente, e applica una densità di corrente di elettrotrasporto di 100 μΑ/cm<2>. Il dispositivo è adatto a venire indossato per un periodo di tempo fino a 24 ore, durante le quali il dispositivo applica in continuo 2,0 mA di corrente di elettrotrasporto e quindi somministra l'analogo di G-CSF in continuo per il periodo di 24 ore.

Dopo inizio dell'elettrotrasporto, si prelevano periodicamente campioni di sangue, li si eparinizza, centrifuga e si conserva il plasma a -80°C. Le concentrazioni nel plasma dell'analogo vengono determinate mediante un procedimento di saggio immunologico legato ad enzima. I risultati indicano un aumento delle quantità nel plasma rispetto ad un controllo di elettrotrasporto di G-CSF non modificato.

Esempio 2: Analogo di PTH

L'ormone paratiroideo (PTH) è un polipeptide farmaceutico usato per trattare 1'osteoporosi . Un esempio di analogo di PTH è uno in cui il residuo di glutammina in posizione 29 è stato sostituito con istidina per aumentare la carica utile a circa 1 a pH 5. La sostituzione del residuo di glutammina in posizione 29 conserva approssimativamente l'attività biologica del composto progenitore.

Viene preparato un serbatoio donatore anodico comprendente una soluzione acquosa dell'analogo di PTH in una matrice di idrogel HEC. La formulazione contiene 10 mg/ral di analogo di PTH in tampone acetato 5 mM, pH 5, in idrogel HEC 3% contenente 1'1% di glicerolo.

Il serbatoio donatore contenente l'analogo di PTH viene usato in un dispositivo simile a quello descritto nell'Esempio 1 precedente, tranne che il circuito di generazione e controllo della corrente di elettrotrasporto opera in uno di due modi. Il primo modo è un modo di somministrazione continua come descritto nell'Esempio 1, e il secondo è un modo di somministrazione intermittente in cui la somministrazione dell'analogo di PTH si verifica periodicamente ad intervalli predeterminati durante il giorno.

Si prelevano ed analizzano campioni di sangue come descritto nell'Esempio 1, e i risultati indicano quantità di elettrotrasporto nel plasma migliorate rispetto al PTH non modificato.

Esempio 3: Analogo di h-GHRH

GHRH umano (h-GHRH) viene usato per trattare bambini con deficienze di crescita (cioè piccoli) e pazienti adulti anziani deboli. Viene preparato un analogo di h-GHRH in cui i residui glutamminilici alle posizioni 16, 24, 30 e 31 vengono sostituiti con residui istidilici. Tale analogo può avere una carica utile aumentata a circa 4 a pH 5.

Si prepara un serbatoio donatore anodico comprendente una soluzione acquosa dell'analogo di h-GHRH in una matrice di idrogel HEC. La formulazione contiene 4 mg/ml di analogo di h-GHRH in tampone acetato 5 mM, pH 5, in idrogel HEC 3% contenente l'l% di glicerolo .

Il serbatoio donatore contenente l'analogo di h-GHRH viene usato in un dispositivo come descritto nell'Esempio 1. Il dispositivo viene posto sulla pelle di un paziente e somministra l'analogo di h-GHRH in continuo per il periodo di utilizzo di 24 ore.

Si prelevano e analizzano campioni di sangue come descritto nell'Esempio 1, e i risultati indicano quantità di elettrotrasporto nel plasma aumentata rispetto a h-GHRH non modificato.

Riassumendo, la sostituzione con residui di istidina dei residui di glutammina, asparagina oppure treonina nei farmaci polipeptidici provvede proprietà di elettrotrasporto migliorate, poiché i due amminoacidi "hanno idrofobicità molto simile e tendenza simile a non formare α-elica. Essi hanno la stessa carica a pH fisiologico e hanno quasi esattamente la stessa geometria e capacità di legame idrogeno.

Mentre la presente invenzione è stata ora descritta ed esemplificata con una certa specificità, gli esperti nella tecnica noteranno che varie modificazioni, comprendenti variazioni, aggiunte e omissioni, possono venire apportate a quanto descritto. Di conseguenza, si intende che anche queste modificazioni rientrano nella presente invenzione e che lo scopo della presente invenzione è limitato soltanto dalla più ampia interpretazione legale secondo le rivendicazioni allegate.

ELENCO SEQUENZA

(1) INFORMAZIONE GENERALE:

(i) RICHIEDENTE: Holladay, Lesile A.

(ii) TITOLO DELL'INVENZIONE: MODIFICAZIONE DI FARMACI POLIPEPTIDICI PER ACCRESCERE IL FLUSSO PER ELETTROTRASPORTO

(ili) NUMERO DI SEQUENZE: 10

(iv).INDIRIZZO CORRISPONDENZA:

(A) INDIRIZZO: Stroud, Stroud, Willink, Thompson & Howard

(B) VIA: 25 West Main Street

(C) CITTÀ: Madison

(D) STATO: WI

(E) NAZIONE: USA

(F) ZIP: 53701-2236

(v) FORMA LEGGIBILE DA COMPUTER:

(A) TIPO SUPPORTO: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatibile

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, versione #1,25

(vi) DATI DOMANDA ATTUALE:

(A) NUMERO DOMANDA:

(B) DATA DEPOSITO:

(C) CLASSIFICAZIONE:

(vili) DATI PROCURATORE/AGENTE:

Claims (19)

1. RIVENDICAZIONI 1. Analogo sintetico di un polipeptide progenitore, il quale polipeptide progenitore ha almeno un residuo di amminpacido che ha una catena laterale polare, ma non caricata, detto analogo è caratterizzato dal fatto che almeno uno di detti residui è sostituito con un residuo di istidina.
2. 2. Analogo secondo la rivendicazione 1, detto analogo presentando una attività biologica almeno circa quasi uguale a quella del polipeptide progenitore.
3. 3. Analogo secondo la rivendicazione 1, in cui detto residuo di amminoacido che ha una catena laterale polare, ma non caricata, viene scelto dal gruppo formato da glutammina, asparagina e treonina.
4. 4. Analogo secondo la rivendicazione 3, in cui detto residuo di amminoacido che ha una catena laterale polare, ma non caricata, è glutammina.
5. 5. Composizione farmaceutica comprendente una quantità terapeuticamente efficace dell'analogo secondo la rivendicazione 1, 2, 3 oppure 4 e un suo veicolo o eccipiente fisiologicamente accettabile.
6. 6. Dispositivo per la somministrazione mediante elettrotrasporto avente un serbatoio donatore contenente l'analogo secondo la rivendicazione 1.
7. 7. Analogo sintetico di un agente farmaceutico polipeptidico progenitore, il quale progenitore ha almeno un residuo scelto dal gruppo formato da glutammina, treonina e asparagine, l'analogo sintetico presentando flusso di elettrotrasporto aumentato attraverso una superficie del corpo, detto analogo è caratterizzato dal fatto che di avere detto almeno un residuo sostituito con un residuo di istidina.
8. 8. Analogo secondo la rivendicazione 7, l'analogo presentando una attività biologica almeno circa quasi uguale a quella del polipeptide progenitore .
9. 9. Analogo secondo la rivendicazione 1, in cui ogni residuo di Gin nel polipeptide progenitore è sostituito con His nell'analogo.
10. 10. Analogo secondo la rivendicazione 7, in cui la carica globale di detto analogo è positiva ad un pH nel campo da circa 5 a 6, ma praticamente isoelettrica a pH 7,4.
11. 11. Analogo secondo la rivendicazione 7, in cui detto analogo ha una carica positiva ad un pH nel campo da circa 5 a 6 maggiore a quella del polipeptide progenitore.
12. 12. Dispositivo di somministrazione mediante elettrotrasporto avente un serbatoio donatore contenente l'analogo secondo la rivendicazione 7.
13. 13. Composizione comprendente un agente polipeptidico farmaceutico modificato per migliorare la somministrazione per elettrotrasporto dell'agente, l'agente polipeptidico essendo caratterizzato dal fatto che almeno un residuo di glutammina è sostituito con un residuo di istidina per esempio formare un analogo in cui l'analogo ha una carica globale maggiore rispetto alla carica sull'agente a pH di circa 5-6.
14. 14. Dispositivo di somministrazione mediante elettrotrasporto avente un serbatoio donatore contenente la composizione secondo la rivendicazione 13.
15. 15. Procedimento per modificare un agente polipeptidico farmaceutico progenitore per aumentare 1'elettrotrasporto attraverso una superficie del corpo, caratterizzato dal fatto che: si sostituisce con un residuo di istidina uno o più residui di glutammina dell'agente polipeptidico farmaceutico progenitore per formare un analogo sintetico dell'agente progenitore, detto analogo avente carica globale maggiore rispetto alla carica sull'agente progenitore a pH di circa 3,5-8.
16. 16. Procedimento per modificare un agente polipeptidico farmaceutico progenitore per aumentare 1'elettrotrasporto attraverso una superficie del corpo, caratterizzato dal fatto che si sostituisce almeno un residuo di amminoacido diverso da istidina dell'agente polipeptidico progenitore con un residuo di istidina (His}.
17. 17. Procedimento secondo la rivendicazione 16, in cui il residuo dell'agente polipeptidico progenitore viene scelto dal gruppo formato da-glutammina (Gin), treonina (Thr) e asparagina (Asn).
18. 18. Procedimento secondo la rivendicazione 16, in cui il residuo dell'agente polipeptidico progenitore comprende glutammina (Gin).
19. 19. Procedimento secondo la rivendicazione 15 oppure 16, in cui l'analogo presenta una almeno attività biologica circa uguale all'agente polipeptidico progenitore.