ITRM20090595A1 - Metodo per prolungare e migliorare la funzionalita' di spermatozoi in vitro. - Google Patents

Description

"METODO PER PROLUNGARE E MIGLIORARE LA FUNZIONALITA’ DI

SPERMATOZOI IN VITRO"

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce a un nuovo metodo per prolungare la vitalità e/o migliorare la funzionalità di spermatozoi in vitro comprendente la preparazione di co-colture di spermatozoi e di cellule del Sertoli e a colture cellulari ottenute secondo il metodo dell’invenzione.

STATO DELLA TECNICA ANTERIORE

L’infertilità à ̈ un problema che coinvolge un alto numero di coppie, solo negli Stati Uniti stimato oltre i 6 milioni. I problemi d’infertilità per oltre il 30% delle coppie à ̈ causato esclusivamente dall’infertilità maschile dovuta ad una funzionalità ridotta degli spermatozoi come ad esempio una riduzione dei parametri di motilità spermatica (astenozoospermia) o un basso numero di spermatozoi nell’eiaculato (oligozoospermia). Per poter risolvere i problemi d’infertilità sono state sviluppate diverse tecniche di procreazione medicalmente assistita quali ad esempio l’inseminazione intrauterina, la fertilizzazione in vitro, la fecondazione assistita e l’iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo. Tutte queste tecniche prevedono l’uso di spermatozoi in vitro.

È noto che gli spermatozoi appena eiaculati e posti in coltura, seppur incubati in terreni specifici (come ad esempio il terreno BWW), perdono rapidamente e progressivamente le loro caratteristiche funzionali in termini di motilità, vitalità e funzione mitocondriale (Calamela et al., Andrologia 33, 79-86, 2001). Calamera et al. (Andrologia 33, 79-86, 2001), dimostrano, in maniera molto netta, che le colture di spermatozoi umani, come quelle allestite per le metodiche di procreazione medicalmente assistita, oltre le 47 ore subiscono una netta perdita di tutti i parametri funzionali quali motilità, vitalità, frammentazione del DNA e capacità di attuare la reazione acrosomiale influenzando negativamente l’esito della fecondazione dell’ovocita. Gli autori mostrano anche che tale perdita di vitalità e funzionalità non può essere in alcun modo rallentata tramite l’aggiunta in coltura di sistemi di “scavenger†dei radicali liberi d’ossigeno, come la catalasi. Successivamente Chi et al. (Human reproduction 23(5),1023-1028, 2008) sono riusciti a migliorare la “performance†funzionale di spermatozoi umani, tramite l’aggiunta al sistema, oltre alla catalasi, anche dell’EDTA, soltanto però non oltre 24 ore dall’eiaculazione. Allo stato delle attuali conoscenze scientifiche, non esiste alcuna possibilità di prolungare la vitalità di colture di spermatozoi oltre le 48 ore mantenendone inalterate le caratteristiche funzionali. La rapida e progressiva perdita delle caratteristiche di vitalità ed efficienza degli spermatozoi in vitro influenza negativamente l’esito delle tecniche di procreazione medicalmente assistita non consentendo un’accurata selezione degli spermatozoi più vitali o un eventuale pre-trattamento degli spermatozoi con sostanze che ne migliorino i parametri funzionali come la motilità. Era pertanto molto sentito nello stato della tecnica il bisogno di proporre nuovi metodi per prolungare e/o migliorare la vitalità e funzionalità di spermatozoi in vitro.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Forma pertanto oggetto della presente invenzione un nuovo metodo in vitro per prolungare la vitalità e/o migliorare la funzionalità di spermatozoi comprendente i seguenti passaggi:

a. incubare in coltura per un tempo compreso tra 72 e 144 ore cellule del Sertoli isolate con un grado di purezza superiore al 90%;

b. aggiungere spermatozoi a detta coltura di cellule del Sertoli;

c. mantenere detta coltura ottenuta allo stadio b) in un rapporto numero di cellule del Sertoli/numero di spermatozoi sostanzialmente compreso tra 1:5 e 1:20 per un tempo compreso tra 1 e 7 giorni.

Gli inventori hanno evidenziato mediante la misura di parametri quali la motilità, vitalità, funzionalità mitocondriale e capacità di penetrazione degli ovociti che spermatozoi posti in co-coltura con le cellule del Sertoli secondo il metodo dell’invenzione hanno valori superiori nel tempo rispetto a spermatozoi posti in coltura secondo i metodi della tecnica nota.

L’invenzione presenta quindi i seguenti vantaggi rispetto alla tecnica nota:

- il prolungamento dei tempi di vitalità degli spermatozoi in vitro permette di selezionare in modo più accurato quelli più funzionali da utilizzare subito o previo pre-trattamento con sostanze che ne migliorino la funzionalità in tecniche di procreazione medicalmente assistita.

- gli spermatozoi coltivati in vitro secondo il metodo dell’invenzione oltre a rimanere vitali, mobili e funzionali per oltre 7 giorni, non vanno incontro a capacitazione né a reazione acrosomiale prematura. Questi due processi possono essere attivati a piacimento, in vitro, quando si deciderà di utilizzare gli spermatozoi per penetrare l’ovocita mediante ad esempio una delle tecniche di procreazione medicalmente assistita nota.

- spermatozoi che presentano una fertilità ridotta a causa di una riduzione dei parametri di motilità possono essere coltivati in vitro secondo il metodo dell’invenzione determinando un miglioramento dei parametri di motilità. Gli spermatozoi così ottenuti potranno essere usati con maggiore probabilità di successo per la fecondazione degli ovociti.

La presente invenzione si riferisce inoltre alle Colture cellulari comprendenti cellule del Sertoli e spermatozoi, ottenibili con questo metodo, e ai loro usi.

I vantaggi, caratteristiche e le modalità di impiego della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata di alcune forme di realizzazione, presentate a scopo esemplificativo e non limitativo.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE

FIGURA 1. La figura 1 mostra microfotografie di cellule del Sertoli suine. La figura 1A Immunocitochimica, ottenuta incubando il preparato con anticorpi anti-mullerian inhibiting factor (MIS). B: Immunocitochimica, ottenuta incubando il preparato con anticorpi anti-vimentina. C-D: Per dimostrare la scarsa presenza di cellule di Leydig e cellule peritubulari, il preparato é stato sottoposto a tecniche istochimiche per valutare la presenza di fosfatasi alcalina, colorazione con Fast- Red (C), e di attività 3-β-idrossisteroidodeidrogenasica, colorazione con Nitro-blu tetrazolium (D).

FIGURA 2. A: co-coltura di spermatozoi umani su monostrato di cellule del Sertoli. B: spermatozoi umani in terreno di controllo. Gli spermatozoi, chiaramente distinguibili dal sottostante monostrato di cellule del Sertoli, rimangono vitali ed in movimento durante tutta la durata del periodo di osservazione.

FIGURA 3. Risultati dei test funzionali (motilità, vitalità e funzione mitocondriale) eseguiti sugli spermatozoi in co-coltura con le SC. A-B: la motilità degli spermatozoi durante la co-coltura si mantiene costante attestandosi a circa 45 % (motilità A+B+C) (Pannello A) e 25 % (A+B) (Pannello B) dopo 7 giorni di co-coltura. C: La vitalità degli spermatozoi si mantiene costante fino al 4°-5° giorno, decrescendo poi al settimo. D: La funzionalità mitocondriale, indice dello status energetico dello spermatozoo, si mantiene costante durante tutto il periodo di osservazione. Tutti gli esperimenti sono risultati significativi (valore p) quando comparati ai controlli (terreno di coltura delle Sertoli e terreno di coltura standard per gli spermatozoi, BWW).

FIGURA 4. Risultati dei test di valutazione del movimento di calcio intracellulare (capacitazione) (Pannello A) e di reazione acrosomiale (Pannello B) eseguiti sugli spermatozoi in co-coltura con le SC. Dai risultati si deduce che gli spermatozoi dopo 7 giorni di co-coltura con cellule del Sertoli non vanno incontro né a capacitazione né a reazione acrosomiale, mantenendo così intatto il loro potere fecondante.

FIGURA 5. Risultati dei test di induzione della reazione acrosomiale con progesterone (Pannello A) e del test di penetrazione degli ovociti di hamster, HEPT (Pannello B). Ad ulteriore conferma della buona qualità degli spermatozoi a 7 giorni di co-coltura e della loro capacità fecondante, quando sottoposti a induzione della reazione acrosomiale reagiscono come gli spermatozoi a fresco. Inoltre, sottoposti all’HEPT, mantengono la loro capacità di penetrare l’ovocita.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Glossario

Nell’ambito della presente invenzione saranno utilizzate le seguenti definizioni con i seguenti significati:

cellule del Sertoli o SC: cellule ubicate nella parete dei tubuli seminiferi con ruolo trofico ed immuno-modulatorio sulle cellule germinali in via di maturazione; spermatozoo: la cellula germinale o gamete maschile che ha il ruolo di raggiungere il gamete femminile, l’uovo, per fecondarlo durante la riproduzione sessuale; astenozoospermia: una riduzione dei parametri di motilità spermatica < 50% di nemaspermi con motilità progressiva;

oligozoospermia: riduzione del numero di spermatozoi nell’eiaculato < 20 milioni/ml); teratozoospermia: una presenza nell’eiaculato di spermatozoi con morfologia normale < 30%;

procreazione medicalmente assistita: l’insieme delle tecniche mediche e biologiche che permettano la riproduzione al di fuori dei processi naturali.

processo di capacitazione: processo che consiste nella rimozione dalla membrana più esterna dello spermatozoo di una glicoproteina detta acrosome-stabilizing factor. La capacitazione dà l’avvio ai processi di attivazione dello spermatozoo che permettono l’incontro ed il contatto con l’ovocita.

reazione acrosomiale: durante la fecondazione, l'unione dello spermatozoo con l' ovocita secondario, innesca la liberazione degli enzimi idrolitici responsabili della digestione della membrana extracellulare dell'oocita, facilitando cosi l'accesso dello spermatozoo alla membrana plasmatica dell'oocita stesso. Questo processo prende il nome di " reazione acrosomiale".

Il metodo oggetto dell’invenzione comprende caratteristiche essenziali che saranno qui di seguito descritte con maggior dettaglio per le possibili forme di realizzazione per ciascuna di loro.

Il primo passaggio prevede l’incubazione di cellule del Sertoli isolate con un grado di purezza superiore a circa il 90% per un periodo di almeno 72 ore.

Cellule del Sertoli isolate possono essere ottenute mediante diverse tecniche note nell’arte anteriore. Le cellule del Sertoli possono essere isolate da varie fonti animali quali ad esempio maiale, ratto, topo, cane, gatto o uomo, preferibilmente da individui prepuberi. Gli animali morti o dopo anestesia sono sottoposti ad orchiectomia bilaterale. I testicoli, dopo la rimozione dell’epididimo, sono sottoposti a digestione multienzimatica. Dopo il completamento della digestione, il tessuto tubulare à ̈ sottoposto a filtrazione ed i tubuli cosi ottenuti sono posti in coltura. Sono noti nell’arte anteriore diversi terreni di coltura che possono essere usati sia nei passaggi d’isolamento delle cellule del Sertoli sia per il loro mantenimento in coltura come ad esempio il terreno DMEM (o HAM-F12).

Nella presente invenzione sono usate cellule del Sertoli isolate con una purezza superiore a circa il 90%. Il grado di purezza delle cellule del Sertoli isolate e trasferite in coltura dipenderà principalmente dalla presenza di altri tipi cellulari, quali cellule del Leydig o peritubulari, copurificate durante il procedimento d’isolamento. La purezza delle cellule del Sertoli isolate e trasferite in coltura può essere valutata con diverse metodiche note nell’arte anteriore. Ad esempio mediante tecniche di immunocitochimica, in cui il preparato à ̈ incubato con anticorpi anti-mullerian inhibiting factor (MIS), ed anti-vimentina fluoresceinati che marcano rispettivamente le molecole MIS e vimentina entrambe unicamente espresse dalle cellule del Sertoli e tecniche istochimiche per valutare la presenza sia di fosfatasi alcalina (colorazione con Fast-Red), tipica delle cellule peritubulari, che l’attività dell’enzima 3-β-idrossisteroidodeidrogenasi (colorazione con Nitro-blu tetrazolium) che à ̈ invece tipico delle cellule del Leydig.

Gli autori dell’invenzione hanno evidenziato che le cellule del Sertoli con questo grado di purezza e con un’eventuale presenza di cellule di Leydig in proporzioni non superiori al 5-8% rispetto al numero di cellule totali conferiscono una migliore funzionalità rispetto a cellule con un minore grado di purezza o con un’assenza di cellule di Leydig. L’incubazione delle cellule del Sertoli in coltura potrà essere eseguita ad una temperatura compresa tra 32 e 37° C, preferibilmente 37°C, ad un’atmosfera con circa il 5% di CO2in incubatori standard noti al tecnico del settore. La concentrazione cellulare cui incubare le cellule potrà essere sostanzialmente compresa in valori standard quali ad esempio 200x10<3>e 270 x 10<3>cellule/cm<2>. Dopo un certo tempo d’incubazione le cellule del Sertoli iniziano a aderire alle piastre di coltura formando un monostrato cellulare cui sono aggiunti spermatozoi come descritto in dettaglio di seguito. Il tempo d’incubazione prima dell’aggiunta di spermatozoi à ̈ di almeno 72 ore e preferibilmente di 96 ore e comunque non superiore a 144 ore.

Nel secondo passaggio del metodo sono aggiunti spermatozoi alla coltura di cellule del Sertoli ottenuta al primo passaggio.

Gli spermatozoi potranno essere aggiunti direttamente dopo eiaculazione a detta coltura cellulare o a seguito di un pretrattamento volto ad ottenere spermatozoi con un maggiore grado di purezza. Il tecnico del settore utilizzando le conoscenze note nello stato dell’arte sarà in grado di scegliere senza attività inventiva il pretrattamento più idoneo. Ad esempio in campioni appena eiaculati, utilizzando come pretrattamento il metodo di selezione per gradiente di Ficoll, come descritto negli esempi, gli spermatozoi potranno essere blandamente selezionati per rimuovere la componente cellulare non gametica.

In una forma vantaggiosa di realizzazione dell’invenzione gli spermatozoi sono aggiunti alla coltura di cellule del Sertoli in modo da ottenere un rapporto finale cellule del Sertoli /spermatozoi compreso tra circa 1:5 e circa 1:20.

Un esempio di concentrazione delle cellule del Sertoli cui aggiungere gli spermatozoi à ̈ circa 10 milioni/ml, il tecnico del settore sulla base della presente descrizione e gli insegnamenti della tecnica nota sarà in grado di definire una concentrazione idonea. In una forma vantaggiosa di realizzazione dell’invenzione prima di aggiungere gli spermatozoi le cellule del Sertoli ottenute al passaggio precedente sono trattare con un tampone di lisi come ad esempio un tampone tris che permette di eliminare, attraverso lisi osmotica, le cellule germinali residue.

Nel terzo passaggio del metodo la coltura cellulare comprendente spermatozoi e cellule del Sertoli ottenuta al secondo passaggio à ̈ incubata mantenendo un rapporto numero di cellule del Sertoli/numero spermatozoi sostanzialmente compreso tra 1:5 e 1:20 per un tempo compreso tra 1 e 7 giorni.

La coltura cellulare comprendente cellule del Sertoli e spermatozoi potrà essere incubata ad una temperatura compresa tra 35-38°C preferibilmente 37°C, ad un’atmosfera con circa il 5% di CO2in incubatori standard per un tempo compreso tra 1 e 7 giorni. Per assicurare che la vitalità degli spermatozoi rimanga elevata anche ad una settimana di distanza dal momento in cui gli spermatozoi sono aggiunti in coltura, il rapporto numero di cellule del Sertoli/numero spermatozoi dovrà essere compreso tra 1:5 e 1:20, preferibilmente 1:10.

Potranno essere aggiunte alle colture cellulari, ottenute nei vari passaggi del metodo oggetto dell’invenzione, sostanze idonee all’ottimizzazione di colture cellulari quali ad esempio terreni per coltura arricchiti, amminoacidi non essenziali, relaxina, carnitina, vitamina D, antiossidanti; il tecnico del settore sulla base della tecnica nota sarà in grado di selezionare quali composti e in che quantità aggiungerli.

Come dimostrato e descritto in dettaglio negli esempi mediante test funzionali gli spermatozoi isolati dalla co-coltura ottenuta secondo il metodo dell’invenzione mantengono valori di vitalità e funzionalità elevate dopo più di una settimana dalla loro aggiunta in coltura con cellule del Sertoli.

Le colture cellulari dell’invenzione potranno quindi essere utilizzate per selezionare gli spermatozoi con parametri di vitalità e funzionalità migliori che avranno quindi maggiori probabilità di fecondare l’ovocita quando usati in tecniche di procreazione medicalmente assistita.

In una forma di realizzazione il metodo dell’invenzione potrà quindi comprendere un quarto passaggio in cui sono isolati uno o più spermatozoi dalla co-coltura ottenuta al terzo passaggio del metodo della presente descrizione. La selezione degli spermatozoi dalle colture cellulari oggetto dell’invenzione potrà avvenire mediante procedure note al tecnico del settore.

L’invenzione della presente descrizione si riferisce anche alle colture cellulari comprendenti spermatozoi e cellule del Sertoli ottenibili secondo i metodi qui descritti e agli spermatozoi isolati da dette colture.

Sono oggetto della presente invenzione anche composizioni per prolungare la vitalità e/o migliorare la funzionalità di spermatozoi in vitro comprendenti cellule del Sertoli con un grado di purezza superiore al 90% e terreni per coltura cellulare.

ESEMPI

Esempio 1: Isolamento delle SC da suino neonato pre-pubere e preparazione della coltura.

Le SC vengono separate da testicoli di suini neonati (7-15 giorni di vita) “Large-White†. I suini, dopo anestesia tramite somministrazione i.m. di 0,1 mg/kg di azaperon (Stresnil® 40 mg/ml, Janssen, Beerse, Belgio) e 15 mg/kg di chetamina (Imalgene® 100 mg/ml, Gellini Farmaceutici), sono sottoposti ad orchiectomia bilaterale. I testicoli, dopo la rimozione dell’epididimo, vengono decorticati dall’albuginea, finemente tagliuzzati in piccoli frammenti tissutali (1-3 mm<3>) e immediatamente sottoposti ad una prima digestione enzimatica a base di collagenasi P (Roche Diagnostics, S.p.A., Monza, Italy) (2 mg/ml) in HBSS (Sigma Chemical Co, St.Louis, USA). La digestione à ̈ quindi proseguita fino alla separazione dei tubuli seminiferi. I tubuli raccolti sono quindi lavati in HBSS e centrifugati a 500 r.p.m. Dopo il lavaggio i tubuli vengono incubati con una soluzione di HBSS contenente tripsina (2 mg/ml) e DNAse I (Sigma). Dopo il completamento della seconda digestione, la soluzione di tripsina à ̈ diluita 1:1 con Hank’s 20% FBS per arrestarne l’attività enzimatica. I tubuli dopo ulteriori lavaggi con HBSS vengono separati dalle cellule peritubulari tramite blanda centrifugazione a 300 rpm. Il “pellet†contenente il tessuto tubulare viene adeguatamente filtrato con un filtro in acciaio inox con apertura di maglia di 500 µm. Infine, per rimuovere le eventuali cellule peritubulari e di Leydig contaminanti il preparato, la sospensione contenente i tubuli viene ulteriormente centrifugata a 800 rpm per 5 min e il pellet risultante viene trattato per 7 min con una soluzione di glicina 1 M ed EDTA 2 mM in HBSS a pH 7.2. I tubuli cosi ottenuti vengono posti in coltura in HAM F12 (Euroclone) supplementato con acido retinoico 0,166 nM (Sigma) e con 5 ml/500 ml di insulin-transferrin-selenium (ITS) (Becton Dickinson#354352), a 37°C in atmosfera al 5% di CO2. Dopo 48 ore di coltura, le SC iniziano a aderire alle piastre di coltura formando un monostrato cellulare. Al fine di rimuovere le cellule germinali residue, il monostrato di SC viene trattato con un tampone, tris-(idrossimetil)-amminometano idrocloruro (TRIS) (Sigma) che permette di eliminare, attraverso lisi osmotica, le cellule germinali residue. Infine le SC vengono coltivate nelle condizioni sopra riportate in fiasche di polistirene. Le SC ottenute sono state analizzate in termini di purezza, vitalità e funzionalità.

La purezza delle SC, risultata superiore al 90%, à ̈ stata valutata con tecniche di immunocitochimica, incubando il preparato con anticorpi anti-mullerian inhibiting factor (MIS), ed anti-vimentina fluoresceinati, che marcano rispettivamente le molecole MIS e vimentina entrambe unicamente espresse dalle SC (Fig.1 A,B). Per dimostrare la ridotta presenza di cellule di Leydig e peritubulari come possibili contaminanti, i preparati di SC sono stati sottoposti a valutazioni istochimiche. Questi test permettono di valutare sia la presenza di fosfatasi alcalina (colorazione con Fast-Red), tipica delle cellule peritubulari, che l’attività dell’enzima 3-β-idrossi-steroidodeidrogenasi (colorazione con Nitro-blu tetrazolium) che e’ invece tipico delle cellule del Leydig (Fig.1 C,D). I risultati ottenuti con queste indagini istochimiche hanno permesso di evidenziare la presenza del 5-8% di cellule peritubulari e di Leydig; queste popolazioni cellulari risultano peraltro utili (quando presenti in queste proporzioni) a garantire un “cross-talk†molecolare favorevole alle corretta funzionalità di queste popolazioni di cellule testicolari.

La vitalità delle SC à ̈ stata determinata mediante trattamento con bromuro di etidio (EB) e fluoresceina-diacetato (FDA) (Sigma). Le cellule, osservate con microscopio a fluorescenza mostravano, in tutte le condizioni, una vitalità superiore al 95%.

Il test di vitalità cellulare à ̈ routinariamente condotto immediatamente dopo l’isolamento e al secondo giorno di coltura.

Esempio 2 Co-coltura di spermatozoi umani e SC suine.

Gli spermatozoi eiaculati vengono ottenuti dal paziente dopo 3 giorni di astinenza sessuale. Dopo aver atteso la liquefazione del campione, gli spermatozoi vengono blandamente selezionati per rimuovere la componente cellulare non gametica tramite metodo a gradiente (Ficoll-Paque Plus [GE Healthcare] al 50%-75%-90%, centrifugati a 800 g per 20 minuti a temperatura ambiente). Successivamente, il pellet di spermatozoi viene lavato con sperm washing medium [Irvine Scientific] e posto in cocultura su piastre contenenti il monostrato di SC suine alla concentrazione di 10 milioni/ml e supplementate con terreno di coltura specifico per SC sopra descritto (punto A). Le piastre così ottenute vengono incubate a 37°C in atmosfera arricchita del 5% di CO2(Figura 2).

Esempio 3 Valutazione della vitalità e funzionalità degli spermatozoi in co-coltura con le cellule del Sertoli.

Ogni 2 giorni (fino ad un massimo di 7 giorni) sono stati eseguiti test funzionali sugli spermatozoi posti in co-coltura con le cellule del Sertoli. I test comprendono valutazione della motilità nemaspermica (scanner automatico), della vitalità (eosina test), della funzionalità mitocondriale (JC-1), della frammentazione del DNA (Tunel test), del calcio intracellulare (calcium orange), della reazione acrosomiale (CD-46), della capacità di penetrazione (Hamster egg penetration test). Tali test hanno evidenziato che, in confronto agli spermatozoi posti in solo terreno di coltura senza SC, dopo 7 giorni:

- Tutti i parametri funzionali valutati sono significativamente più conservati rispetto al controllo (figura 3);

- Gli spermatozoi non vanno incontro a capacitazione né a reazione acrosomiale prematura, come messo in evidenza dai test di valutazione del calcio intracellulare e di esposizione di CD-46 (Figura 4);

- Gli spermatozoi mantengono la capacità di penetrare l’ovocita (Figura 5).

Di seguito sono riportati nel dettaglio le procedure utilizzate per eseguire i test funzionali:

Esempio 4 Test per la valutazione dell’esposizione della Fosfatidil-serina mediante l†̃Annexin V-FITC, Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences)

Test per la valutazione dell’esposizione della Fosfatidil-serina, ligando specifico dell’Annessina V, all’esterno della membrana cellulare quale fenomeno caratteristico dell’apoptosi nelle sue fasi precoci. Viene ulizzata l’Annessina V, coniugata al FITC (fluorocromo che ha la proprietà di emettere a fluorescenza nel verde), con un indicatore di vitalità cellulare quale lo ioduro di propidio (fluorocromo che a fluorescenza emette nel rosso), intercalante del DNA. In breve, in una eppendorf (1,5 ml) si pone il liquido seminale (almeno 2 milioni spermatozoi) e si lava con PBS 1 X a 2500rpm per 10minuti. Successivamente si risospendono le cellule con 100ul di Binding Buffer 1X ad una concentrazione di 1-2 milioni di cellule/ml e si aggiunge 10 ul di Annexin V-FITC (mantenuta in frigorifero a 4°C) e si lasciare incubare al buio per 15 minuti. In seguito si Risospende con 500ul di Binding Buffer e si aggiungono 4 ul di PI (Concentrazione finale 25ug/ml). Il campione à ̈ così pronto per essere analizzato al citofluorimetro.

Esempio 5 Test per la valutazone energetica degli spermatozoi mediante il Mitoprobe JC-1 Assay Kit (Apoptosi Mitocondri) INVITROGEN

Valuta lo stato energetico degli spermatozoi, determinato in base al potenziale di membrana mitocondriale.Viene utilizzato il catione lipofilico 5, 5’, 6, 6’ tetcloro-1, 1’, 3, 3’ tetraetil-benzimidazolcarbocianide iodato (JC-1). Il JC-1 si trova in forma monomerica quando il Î ̈m mitocondriale à ̈ depolarizzato e se viene eccitato a 488nm emette nel verde; al contrario forma aggregazioni multimeriche quando Î ̈m mitocondriale à ̈ polarizzato e se viene eccitato emette nel rosso (590 nm). Gli spermatozoi vengono aliquotati all’interno di un’Eppendorf (da 1.5 ml) con una concentrazione di circa 2 x 10<6>e si aggiunge 1ml di PBS e 10ul di sonda. Si avvolge l’eppendorf sia con parafilm che con carta stagnola e si incubare per 30 minuti al buio a 37° C. Successivamente si centrifuga a 2500 rpm 10 minuti al cui termine il pellet viene lavato con 1 ml di PBS 1X e centrifugato a 2500rpm per 5 minuti. Infine si Risospende il pellet con 500 µl di PBS1X e si esaminano le cellule attraverso citofluorimetria.

Esempio 6 Valutazione del grado di frammentazione del DNA - DEATH DETECTION KIT, FLUORESCEIN (TUNEL)

Valuta il grado di frammentazione del DNA, presente ancora nel nucleo, nella popolazione spermatica (fenomeno tardivo del’apoptosi) mediante marcatura fluorescente delle estremità 3’-OH libere con FITC (fluoresceina) Viene utilizzata una colorazione di contrasto con DAPI (blu) che ci permette di evidenziare lo stato vitale positivo di una cellula. Portare a temperatura ambiente Paraformaldeide 4% in PBS (conservata a 4°C). Dopo aver lavato il liquido seminale con PBS 1X in volume 1:2 lo stesso viene centrifugato per 10 minuti a 2000 rpm, si elimina il surnatante e si aggiungono 3 ml di PBS 1X e si ripete la centrifugazione dopo aver rotto molto bene il pellet con una pipetta. A questo punto si eliminare il surnatante e si aggiungono 50-100µl di PBS 1X. A questo punto si striscia il pellet su un vetrino. Dopo averlo lasciato asciugare si fissa il preparato per 60 minuti a temperatura ambiente in camera oscura con Paraformaldeide. A conclusione si lava per 2 minuti con PBS 1X. Successivamente si pongono 100 microlitri di soluzione di permeabilizzazione sui vetrini (Triton, sigma) e si incuba 2 minuti in frigorifero ponendo i vetrini distesi all’interno di una scatola. Si lava 2 volte con PBS 1X contenuto in due giare diverse in modo da eliminare tutta la soluzione di permeabilizzazione. A questo punto ai campioni vengono aggiunti 50 µl di sonda a 37 °C in atmosfera umidificata per 60 minuti e successivamente si lava 2 volte con PBS 1X per 2 minuti ogni lavaggio e con 40 ml di PBS 1X 3 ul DAPI per 40 secondi. Aggiungere infine 10 ul di Antifade a vetrino umido e coprire con un vetrino copri-oggetto 24x40 e osservare al microscopio a fluorescenza a 100X in immersione.

Esempio 7 valutazione del grado di capacitazione dello spermatozoo mediante REAZIONE ACROSOMIALE

Valuta la presenza di cd46 esternalizzato come indice di avvenuta reazione acrosomiale dello spermatozoo.

Il liquido seminale viene lavato con terreno di coltura e si centrifuga a 2000 rpm per 10 minuti. Il pellet viene risospeso in 100 ul di anti-mouse IgG (vector 4°C) e si lascia incubare per 30 minuti al buio. Successivamente si eseguono due lavaggi e al pellet risospeso si aggiungono 10 ul di CD46-FITC (BD Pharmingen a+4°C). Si lascia incubare 30 minuti al buio. Si eseguono nuovamente dei lavaggi e dopo risospensione in 0,5 ml di PBS si aggiungono 4 ul di PI (25ug/ml) e si esegue la lettura del campione al citofluorimetro.

Esempio 8 valutazione della presenza di calcio nello spermatozoo- CALCIUM ORANGE

Valuta la presenza di calcio nello spermatozoo come indice di status di capacitazione dello stesso.Il liquido seminale viene lavato con PBS (3 ml) e successivamente centrifugato a 2500 rpm per 10 minuti. Il pellet viene risospeso in 0,5 ml di PBS e si aggiungono 5 ul di Cacium Orange (10uM, Invitrogen Molecular Probes 4°C) e il tutto viene lasciato per 30’ al buio a temperatura ambiente. A questo punto si aggiungono 3ml di PBS e si centrifugare a 2500 rpm per 10 minuti. Infine il pellet viene risospeso in 100 ul di PBS e viene allestito un vetrino per la lettura al microscopio a fluorescenza nel filtro della Rodamina.

Esempio 9 Pretrattamento di spermatozoi con il metodo di selezione per gradiente di Ficoll.

Il Ficoll à ̈ una sostanza a base di silicio colloidale che consente di separare le cellule secondo il loro gradiente di densità. In pratica in una provetta si stratificano le soluzioni di Percoll a concentrazioni crescenti, si depone il liquido seminale in cima alla provetta e si centrifuga per circa 30 minuti. In questo modo si otterrà una separazione degli elementi presenti nel liquido seminale in rapporto alla loro densità. In fondo alla provetta troveremo gli spermatozoi più mobili mentre la componente non gametica si troverà nella porzioni superiori. Il sedimento così ottenuto viene quindi diluito e lavato prima di essere utilizzato per la co-coltura.

BIBLIOGRAFIA

1. Calamera, J.C., Fernandez, P.J., Buffone, M.G., Acosta, A.A., Doncel, G.F. Effects of long term in vitro incubation of human spermatozoa: functional parameters and catalase effect. Andrologia 33, 79-86, 2001.

2. Chi H.J., Kim, J.H., Ryu, C.S., Lee, J.Y., Park, J.S., Chung, D.Y., Choi, S.Y., Kim, M.H., Chun, E.K., Roh, S.I. Protective effect of antioxidant supplementation in sperm-preparation medium against oxidative stress in human spermatozoa. Human reproduction 23(5),1023-1028, 2008.

Claims (13)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo in vitro per prolungare la vitalità e/o migliorare la funzionalità di spermatozoi comprendente i seguenti passaggi: a. incubare in coltura per un tempo compreso tra 72 e 144 ore cellule del Sertoli isolate con un grado di purezza superiore al 90%; b. aggiungere spermatozoi a detta coltura di cellule del Sertoli; c. mantenere detta coltura ottenuta allo stadio b) in un rapporto numero di cellule del Sertoli/numero di spermatozoi sostanzialmente compreso tra 1:5 e 1:20 per un tempo compreso tra 1 e 7 giorni.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui in dette cellule del Sertoli isolate sono presenti cellule di Leydig in una proporzione sostanzialmente compresa tra il 5 e 8% rispetto al numero di cellule totali.
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui dette cellule del Sertoli prima dell’aggiunta degli spermatozoi sono trattate con un tampone tris.
4. 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 in cui dette cellule del Sertoli isolate sono incubate ad una temperatura compresa tra 36 e 38 C° e ad un’atmosfera con circa il 5% di CO2.
5. 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 in cui dette cellule del Sertoli isolate sono incubate ad una concentrazione sostanzialmente compresa tra 200 x 103 e 270 x 103 cellule/cm2.
6. 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 in cui dette cellule del Sertoli isolate sono ottenute da tessuto di maiale, ratto, topo, cane, gatto, ovino, bovino o uomo.
7. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6 in cui detti spermatozoi prima di essere aggiunti sono trattati per rimuovere la componente cellulare non gametica.
8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 7 in cui detti spermatozoi prima di essere aggiunti sono trattati per rimuovere la componente cellulare non gametica con il metodo di selezione per gradiente di Ficoll.
9. 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8 comprendente un ulteriore passaggio in cui da detta coltura cellulare comprendente spermatozoi e cellule del Sertoli sono isolati uno o più spermatozoi.
10. 10. Coltura cellulare comprendente cellule del Sertoli e spermatozoi ottenibile secondo il metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9.
11. 11. Spermatozoi con funzionalità e vitalità migliorata ottenibili secondo il metodo della rivendicazione 10.
12. 12. Uso di cellule del Sertoli per prolungare la vitalità e/o migliorare la funzionalità di spermatozoi in vitro.
13. 13. Composizione per prolungare la vitalità e/o migliorare la funzionalità di spermatozoi in vitro comprendente cellule del Sertoli con un grado di purezza superiore al 90% ed un terreno per coltura cellulare.