ITMI20011708A1 - Coniugati di peptidi, loro derivati con complessi metallici e utilizzo per i'indagine diagnostica tramite imaging per risonanza magnetica(m - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

"CONIUGATI DI PEPTIDI, LORO DERIVATI CON COMPLESSI METALLICI E UTILIZZO PER L’INDAGINE DIAGNOSTICA TRAMITE IMAGING PER RISONANZA MAGNETICA (MRI)"

DESCRIZIONE

La presente invenzione descrive una nuova classe di agenti di contrasto utilizzabili nella risonanza magnetica nucleare (MRI), per l’individuazione e la localizzazione di tumori umani primari e loro metastasi, che sovraesprimono i recettori della colicistochinina di tipo CCK A e/o B e/o i recettori della somatostatina di tipo SSTR 1-5.

La diagnosi medica mediante “magnetic resonance imaging” (MRI), riconosciuta come un potente mezzo diagnostico nella pratica clinica, utilizza sopratutto composizioni farmaceutiche paramagnetiche, contenenti preferibilmente chelati complessi di ioni metallici paramagnetici bi e trivalenti con acidi poliamminopolicarbossilici e/o loro analoghi derivati.

Sono attualmente in uso clinico come agenti di contrasto per MRI alcuni composti (Gd-DTPA, sale di N-metilglucamina del complesso di gadolinio con l’acido dietilentriamminopentaacetico, MAGNEVIST®; Gd-DOTA, sale di N-metilglucammina del complesso di gadolinio con l’acido 1 ,4,7, 10-tetraazaciclododecan- 1 ,4,7, 10-tetraacetico, DOTAREM® ; Gd-HPD03A complesso di gadolinio con l’acido 10-(2-idrossipropil)- 1,4, 7,10-tetraazaciclododecan-l,4,7-triacetico, PROHANCE®; Gd-DTPA-BMA, complesso di gadolinio dell’acido dietilentriamminopentaacetico bis(metilammide), OMNISCAN<®>).

Tali agenti di contrasto e i loro derivati sono descritti in EP71564, DE-A-3401052, EP130934, US4,639,365, US4,615,879, EP65728, EP299795, EP230893, W08905802, EP258616, US4,826,673.

I mezzi di contrasto precedentemente elencati sono destinati ad un uso del tutto generale. Infatti dopo la somministrazione per iniezione intravenosa, l’agente di contrasto per MRI si distribuisce negli spazi extracellulari prima di essere escreto. In questo sono simili ai composti iodurati utilizzati per la diagnosi medica mediante raggi X.

Attualmente è sempre più fortemente sentita l’esigenza di agenti di contrasto che siano specifici per organi o per patologie che risultano normalmente non ben evidenziati con i prodotti attualmente disponibili.

In particolare, in ambito oncologico, in cui vengono utilizzate delle metodiche diagnostiche quali ecografia, tomografia assiale computerizzata (TAC), imaging per risonanza magnetica e scintigrafia con utilizzo di traccianti radioattivi, viene sempre più richiesta una diagnosi precoce e efficiente. Una diagnosi precoce tuttavia è ottenibile solo con l’utilizzo di metodiche estremamente sensibili e in grado di individuare la patologia sin dalle sue iniziali manifestazioni.

In tal senso, l’utilizzo di agenti di contrasto opportunamente funzionalizzati capaci di legarsi selettivamente a recettori sovraespressi da cellule tumorali, consentirebbe di ottenere una diagnosi estremamente sensibile e adatta alla diagnostica oncologica, soprattutto nel caso si impieghino tecniche MRI, notoriamente sensibili.

La somatostatina è un tetradecapeptide prodotto dall’ ipotalamo dotato di molteplici attività sul sistema nervoso centrale, sull’ ipotalamo, sul pancreas e sul tratto gastrointestinale. In particolare la somatostatina inibisce il rilascio di insulina e glucagone dal pancreas, il rilascio dell’ormone della crescita dall’ ipotalamo e riduce la secrezione gastrica nello stomaco.

La somatostatina venne caratterizzata e descritta inizialmente da Guillemin et al. (vd. US 3904594) nel 1975. Questo tetradecapeptide è caratterizzato da un legame ciclico tra due gruppi sulfidrilici di due residui di cisteina posti rispettivamente in posizione 3 e 14 del peptide.

La somatostatina esplica i suoi effetti legandosi a specifici recettori espressi anche sulla superficie di cellule tumorali di pancreas, stomaco e ipotalamo. Il legame della somatostatina a tali recettori può pertanto essere sfruttato ai fini diagnostici e terapeutici.

Recentemente è stato evidenziato che vi sono almeno cinque sottoclassi di recettori della somatostatina, tutte appartenenti alla famiglia dei recettori associati alle G-proteins (vd. ad es. US5436155; W09714715; Biochemical and Biophysical Research Communications, 258, 689-694, 1999).

Inoltre la presenza dei recettori della somatostatina è stata dimostrata per un elevata tipologia di tumori umani, come ad esempio tumori primari o metastatici neuroendocrini, della ghiandola pituitaria, del sistema nervoso centrale, del sistema gastro enteropancreatico, della mammella oltre a linfomi di Hodgkin e non Hodgkin.

Nonostante la somatostatina trovi impiego in un numero considerevole di applicazioni terapeutiche, la sua scarsa stabilità in vivo e in particolare la rapida degradazione in presenza delle peptidasi, ne limita l’utilizzo. Per questa ragione sono stati oggetto di studi approfonditi alcune classi di peptidi analoghi alla somatostatina tra i quali i più noti sono Octreotide, Vapreotide e Lanreotide.

Octreotide opportunamente funzionalizzato e marcato con In- 111 (Octreoscan®) è già disponibile per la diagnosi per scintigrafia di tumori (vd. ad es. J. Nucl. Med. 41, 1704-1713, 2000; Current Medicinal Chemistry, 7, 971-994, 2000).

Le colecistochinine (CCK), molecole di natura peptidica che esplicano la propria azione sia come ormone che come neurotrasmettitore, rappresentano un’ulteriore classe di sostanze di grande interesse. Le CCK hanno tutte origine da un processo di frammentazione che ha luogo su un preormone costituito da 115 residui aminoacidici e a cui segue un processo post translazionale di alfa-ammidazione del residuo di fenilalanina C-terminale e, talvolta, di solfatazione del residuo di tirosina contenuta nella porzione C-terminale.

Le colecistochinine esistono quindi in diverse forme molecolari le più importanti delle quali presentano rispettivamente una sequenza di 58, 39, 33, 22 o 8 amminoacidi aventi in comune la seguente sequenza C-terminale di 8 amminoacidi

in cui il residuo di tirosina può essere solfatato. L’octapeptide è noto con la sigla CCK8.

L’attività biologica della colecistochinina dipende dal tipo di recettore con cui interagisce. Sono noti due tipi di recettori: il recettore di tipo A (da Alimentary) ed il recettore di tipo B (da Brain). In situazioni non patologiche il recettore di tipo A è presente in tessuti di organi periferici come stomaco, cistifellea, intestino e pancreas. Le più importanti azioni fisiologiche dovute all’interazione dell’ ormone CCK con il recettore di tipo A sono: contrazione della cistifellea, secrezione di enzimi pancreatici, regolazione di secrezione e assorbimento nel tratto gastrointestinale. Il recettore di tipo B è prevalentemente presente invece nel Sistema Nervoso Centrale dove l’interazione con la colecistochinina provoca analgesia, sazietà, ansietà e regola il rilascio di dopamina.

Entrambi i recettori delle colecistochinine appartengono alla classe di G-Protein Coupled Receptors (GPCRs), recettori di membrana caratterizzati da sette eliche trans-membrana uniti da loop intra ed extra cellulari con un braccio N-terminale extracellulare e la parte C-terminale intracellulare. Entrambi i recettori possiedono alta affinità per le varie forme della colecistochinina; il recettore di tipo A possiede una più elevata affinità per le forme solfatate delle colecistochinine, quelle cioè che contengono un gruppo solforico sul residuo di Tyr 27, mentre il recettore di tipo B possiede alta affinità sia per le varie forme di colecistochinina non solfatate che per la gastrina. Ad oggi sono note una serie di molecole analoghe della colecistochinina sia di natura peptidica che non (P. De Tullio, Current Medicinal Chemistry, 6, 433, 1999; F. Noble, Progress in Neurobiology, 58, 349, 1999), con attività agonista o antagonista sia per il recettore di tipo A che per quello di tipo B. Nessuna delle molecole note ha trovato comunque applicazione farmacologica a causa di una bassa biodisponibilità dovuta o a scarsa solubilità o ad alta degradazione enzimatica.

I recettori delle colecistochinine sono spesso sovraespressi in tumori di varia tipologia. Il recettore di tipo B è frequentemente sovraespresso nel carcinoma midollare della tiroide, nel cancro a piccole cellule nel polmone, nell’astrocitoma, nel cancro stromal-ovarico, e con minore incidenza nel tumore gastroentero-pancreatico (vd. ad es. W09851337 e WO9835707), neH’adenocarcinoma della mammella, dell’ endometrio e delle ovaie. Il recettore di tipo A è invece sovraespresso sia nei tumori gastroenteropancreatici che nel meningioma e in alcuni neuroblastomi.

La presenza dei recettori delle colecistochinine in tumori umani, sia primari che metastasi, è stata descritta da J. C. Reubi in Cancer Research, 57, 1377, 1997 e W09731657. Lo stesso Autore descrive inoltre l’utilizzo di peptidi marcati con metalli radioattivi come <I25>I (Biochemical Journal, 89, 114-123, 1963), <ln>In o <U5>In nella medicina nucleare, per la visualizzazione di tumori umani.

In particolare tra le categorie di tumori precedentemente citati, quelli caratterizzati da piccole dimensioni o da una lenta crescita delle cellule, vengono individuati con difficoltà dalle classiche tecniche diagnostiche. Quindi rimane da parte della classe medica la necessità di avere a disposizione metodiche diagnostiche semplici, che siano selettive in vitro e in vivo per uno o più recettori e consentano con un opportuno binding di localizzare e diagnosticare la patologia tumorale.

La presente invenzione ha per oggetto agenti di contrasto per la diagnostica in vivo e in particolare per l’imaging per MRI, ottenibili per coniugazione di peptidi derivati da somatostatina o colecistochinina con chelati complessi con ioni metallici paramagnetici.

Oggetto della presente invenzione sono i composti di formula generale (I):

m cui;

B rappresenta uno o più peptidi lineari, ramificati o ciclici di formula generale (II) o (III)

m cui;

AAg corrisponde a Phe o al corrispondente amminoalcool, AA’ls AA’3 AA’6 e AA’8 rappresentano un qualunque amminoacido naturale e non in configurazione L o D;

AA’8 può anche essere un amminoalcool derivato da un qualunque amminoacido naturale e non, di configurazione L o D; R2 rappresenta un gruppo idrossilico, un gruppo amminico o un gruppo alcossi CVC4;

v rappresenta un numero intero da 1 a 5;

w rappresenta zero o 1 ;

Y rappresenta una catena spaziante legata rispettivamente ad una delle funzionalità presenti sulle catene laterali dei singoli aminoacidi del peptide B, oppure ad un gruppo amminico N-terminale o carbossi C-terminale di B e a gruppi funzionali presenti nei residui P o A come sotto definiti;

z è un numero intero che va da 0 a 5, laddove per valori diversi da 1, Y può assumere diversi significati;

P rappresenta una catena di natura polimerica lineare o ramificata in grado di legare covalentemente t unità di A e legata tramite legami covalenti ad una o più unità di Y o B;

t è un numero compreso tra 1 e 100;

A rappresenta un agente chelante ciclico o aciclico legato covalentemente a ( p ), ( p ) (p ) e contenente da 6 ad 8 siti di coordinazione quali ad esempio gruppi amminici e/o piridinici e/o carbossilici e/o fosfonici e/o fosfinici e/o ossidrilici e/o carbossammidici, detti gruppi A essendo in grado di chelare metalli bi-trivalenti aventi numero atomico variabile fra 21 e 29, 42, 44 o fra 57 e 71.

Esempio di composti secondo l’invenzione di formula generale (I) sono i composti di formula generale (IV), (V) e (VI)

in cui A, P, Y, B, t e v sono come sopra definiti, z è diverso da 0 e w è 0 nei composti IV; w è le z è zero nei composti V; z e w sono 0 nei composti VI in cui una o più unità di B presenti sono legate covalentemente e direttamente ad una o più unita chelanti A.

L’invenzione riguarda anche i chelati complessi dei composti di formula generale (I), (IV), (V) e (VI) con gli ioni bi-trivalenti degli elementi metallici aventi numero atomico variabile fra 21 e 29, 42, 44 o fra 57 e 71, con metalli paramagnetici e in particolare con Fe, Cu, Cr, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Mn come pure i loro sali con basi o acidi fisiologicamente compatibili.

Preferiti sono i chelati di

come pure i loro sali con basi o acidi fisiologicamente compatibili.

Particolamente preferiti sono i complessi di ioni bi-trivalenti di Eu(3+),

come pure i loro sali con basi o acidi

fisiologicamente compatibili.

In accordo con le formule generali (I), (IV), (V) e (VI) il peptide B, la catena spaziatrice Y, P e il legante A possono contenere opzionalmente nella loro struttura opportuni sintoni che consentono il binding a molecole biologiche anche diverse dalle proteine recettoriali e in cui tali sintoni sono eventualmente attivabili anche a stadi diversi dallo stadio del riconoscimento recettoriale iniziale; ad esempio nel caso in cui il peptide B inizialmente coniugato sia stato, in parte o completamente rimosso dal sistema enzimatico endo e/o eso cellulare presente nei sistemi biologici in cui sono sovraespressi e presenti i recettori medesimi.

I peptidi di formula II o III si legano in modo selettivo ad uno o più recettori della somatostatina, noti come recettori SSTR di tipo 1-5 e/o dei suoi derivati sottotipi e/o ad uno o più recettori della colecistochinina e dei suoi derivati, noti come recettori CCK-A e/o CCK-B, sovraespressi su di un particolare tipo di cellule presenti in un tessuto o un organo di un essere vivente, in vitro e/o in vivo.

I composti dell’ invenzione possono essere usati come agonisti e/o antagonisti della colecistochinina (recettori di tipo A e/o B) e/o della somatostatina (recettori SSTR di tipo 1-5) e come agenti diagnostici in MRI di organi, tessuti e cellule del corpo umano e animale, per la localizzazione ed individuazione di tumori primari e loro metastasi che sovraesprimono detti recettori.

Esempi di peptidi B preferiti (II) e (III), sono i peptidi di formula (VII), (Vili), (IX), (X), (XI) e (XII), sotto riportati:

Detti peptidi vengono preparati utilizzando metodi noti, quali metodi di sintesi peptidica in fase solida, sintesi peptidica in soluzione, metodiche sintetiche di chimica organica, oppure una qualunque combinazione fra di esse. Lo schema di sintesi prescelto dipenderà naturalmente dalla composizione della particolare molecola prescelta. Di preferenza sono utilizzate metodiche sintetiche basate su appropriate combinazioni di tecniche in fase solida e di metodi classici in soluzione, che comportano bassi costi produttivi in particolare su scala industriale. Nel dettaglio tali metodiche consistono nella sintesi in fase solida del peptide comprendente la ramificazione grazie all’utilizzo di amminoacidi protetti con funzioni ortogonali, eventuale coniugazione in fase solida del legante, distacco dalla resina del peptide protetto, ciclizzazione in soluzione in concentrazioni diluite, purificazione del composto, marcatura con metalli paramagnetici.

Il termine “qualunque amminoacido” sopra adoperato si riferisce agli isomeri L e D sia di amminoacidi naturali sia di amminoacidi “non proteici” comunemente adoperati nella chimica dei peptidi per la preparazione di analoghi sintetici di peptidi naturali. Alfa-amminoacidi sostituiti e non sostituiti nelle posizioni alfa e beta sia di configurazione L che D ed amminoacidi alfa-beta insaturi sono indicati tra gli amminoacidi non proteici.

Esempi, di amminoacidi “non proteici” sono norleucina, norvalina, alloisoleucina, allotreonina, omoarginina, tioprolina, deidroprolina, idrossiprolina, acido pipecolico, acido azetidinico, omoserina, cicloesilglicina, acido alfa-ammino-n-butirrico, cicloesilalanina, acido amminofenilbutirrico fenilalanine mono e di sostituite nelle posizioni orto, meta e para dell’anello aromatico, derivati O-alchilati della serina, treonina e tirosina, cisteina S-alchilata, lisina epsilon-alchilata, omitina delta-alchilata. Esempi di amminoacidi aromatici, sostituiti nelle posizioni meta o para dell’anello sono: fenilalanina-nitrato, solfato, fosfato, acetato, carbonato, metilsolfonato, metilfosfonato, tirosina-solfato, fosfato, solforato, fosfonato, para-amido-fenilalanina. Esempi di amminoacidi C-alfa,alfa-dialchilati sono: alfa,alfa-dimetilglicina (Aib), acido alfa-amminociclopropancarbossilico (Ac3c), acido alfa-amminociclobutancarbossilico (Ac4c), acido alfaamminociclopentancarbossilico (Ac5c), acido alfa-amminocicloesancarbossilico (Ac6c), dietilglicina (Deg), dipropilglicina (Dpg), difenilglicina (Dph). Esempi di beta-amminoacidi sono beta-alanina (beta-Ala), acido 2,3-diamminopropionico (Dap) cis e trans.

Nei composti di formula I e IV,

Y è preferibilmente un gruppo di formula:

in cui

r, 1, e q indipendentemente tra loro possono assumere i valori di 0 o 1;

p può variare tra 0 e 10, con la condizione che almeno uno di 1, r, e q sia diverso da zero;

X rappresenta un atomo di O, o un gruppo -NR dove R è un atomo di H o un gruppo alchile (C1-C5);

K rappresenta un nucleo benzenico, sostituito o no, oppure un gruppo -CHRi

dove Ri rappresenta un atomo di idrogeno oppure un gruppo

W rappresenta un gruppo -CO- o -CS-.

Altri esempi di unità Y sono rappresentate dalle seguenti formule generali (XIII), (XIV) e (XV):

Nelle formule sopra riportate, p, r, q, 1 R, W e z sono come sopra definiti.

Sono particolarmente preferiti i composti di formula (I) e (IV) in cui i gruppi Y sono residui di formula:

Nel caso siano presenti più unità Y( z diverso da 0 e 1), queste possono essere diverse tra loro.

Esempi di opportuni gruppi chelanti A comprendono:

un residuo di un acido poliamminopolicarbossilico e i suoi derivati, in particolare scelto tra acido etilendiamminotetracetico (EDTA), acido

residuo di chelanti macrociclici come le texafirine, le porfirine e le ftalocianine.

I gruppi chelanti A possono anche comprendere alcune classi di chelanti lineari poliamminoderivati di formula generale (XVI) e (XVII) sia in forma racema che otticamente attiva in cui:

Y1, Y2 e Y3 rappresentano indipendentemente tra loro H, un gruppo

R’ rappresenta H, un gruppo alchile Q-Cs, alcossi, cicloalchilico, idrossialchilico, arilico o eterociclico eventualmente sostituiti;

R: e R2 indipendentemente tra loro, sono H, un gruppo alchilico C1-C20, lineare o ramificato, saturo o insaturo, eventualmente interrotto da uno o più atomi di azoto o zolfo o da gruppi

ed eve

alogeno, -

o da uno o più gruppi c5-c10 cicloalchilici, arilici, eteroarilici o eterociclici, saturi, insaturi o aromatici e in cui la porzione arilica o eteroarilica comprende da 1 a 3 anelli fusi eventualmente interrotti da uno o più atomi di azoto, zolfo o ossigeno ed eventualmente sostituiti da uno o più atomi di alogeno e/o gruppi -

R3 può assumere i significati precedentemente definiti di Rj e R2I con la condizione che se Y2 corrisponde a -

m rappresenta un numero intero compreso tra 1 e 6;

R4 rappresenta H, un gruppo alchilico lineare o ramificato Cr C5 eventualmente sostituito da un gruppo c5-c10 cicloalchilico, arilico, eteroarilico o eterociclico a sua volta sostituito da uno o più atomi di alogeno, gruppi OH o alchile CrC5.

Esempi di composti preferiti di formula (XVI) sono i composti di formula (XVIII) e (XIX), in cui;

R5 rappresenta un gruppo ciclico saturo, insaturo o aromatico, eventualmente interrotto da uno o più atomi di azoto, zolfo o ossigeno ed eventualmente sostituito da uno o più gruppi

R4 ha il significato precedentemente definito;

m rappresenta un numero intero compreso tra 1 e 6;

n rappresenta un numero intero compreso tra 0 e 2;

R6 rappresenta un gruppo alchilico Q-Cs, eventualmente interrotto o sostituito da uno o più gruppi -

O da uno o più gruppi C5-C10 cicloalchilici, arilici, eteroarilici o eterociclici, saturi, insaturi o aromatici e in cui la porzione arilica o eteroarilica comprende da 1 a 3 anelli fusi eventualmente interrotti da uno o più atomi di azoto, zolfo o ossigeno ed eventualmente sostituiti da uno o più atomi di

Composti preferiti di formula (XVI) e (XVII) sono i composti di formula generale (XX), (XXI), (XXII) e (XXIII) in cui i significati di Rl5 R2 e R3 sono come sopra definiti.

Ulteriori esempi di residui A sono descritti nelle domande di brevetto MI99A 002656, WO9805625 e WO9805626 qui incorporati per riferimento. Una ulteriore classe di gruppi chelanti A sono i composti di formula (XXIV) e (XXV), in cui:

n, m, 1 rappresentano, indipendentemente tra loro, 0, 1 o 2;

D rappresenta gruppi, uguali o diversi tra loro, scelti fra:

oppure i gruppi D hanno lo stesso significato sotto specificato dei gruppi Q nel caso in cui n, m o 1, assume valore 0;

Q rappresenta un singolo legame covalente fra il gruppo chelante A e la catena Y o il residuo polimerico P o fra il gruppo A e il gruppo B;

R’ e R” rappresentano indipendentemente tra loro H o un gruppo alchile CrC5, alcossi, cicloalchilico, idrossialchilico, arilico o eterociclico, eventualmente sostituti;

E rappresenta un gruppo

dove X<' >corrisponde a CP, Br , Γ o CH3C02 ha il significato precedentemente definito.

Altri gruppi chelanti A di tipo macrociclico che possono essere utilizzati sono descritti in US6149890, US6177562, EP773936, US6093382, US5922862, W09935133, W09935134, WO9311802, W09311800, W09426313, WO9311801, WO9403464, W09426754, W09426755, W09731005, W091 10645, W091 10669, WO9204919 e W09519347 che vengono incorporati per riferimento.

Esempi di gruppi chelanti A particolarmente preferiti sono indicati nello Schema 1, in cui vengono riportati nella forma “acido libero”, utilizzata nella complessazione al metallo paramagnetico e in cui con Q si indica la posizione preferibile per il legame covalente con la parte restante della molecola, accordo con le formule generali (I), (IV), (V) e (VI) precedentemente definite:

La presenza nei prodotti di formula generale (I) e (V), di composti P di natura polimerica consente, variandone ad esempio la composizione in monomeri e/o oligomeri nella fase di preparazione, di influenzarne le caratteristiche chimico-fisiche correlate ad esempio alla loro viscosità, solubilità e stabilità intrinseca, oltre a consentire la presenza nella molecola stessa di un numero elevato di unità chelanti il metallo (vd. ad es. US5958372, US5681543, US5876698, US5900288).

Infatti i composti polimerici utilizzati comprendono ricorrenti unità funzionali quali gruppi carbossilici, amminici, idrossilici che possono essere coniugati ad agenti chelanti A di metalli paramagnetici.

Composti di questo tipo sono particolarmente utili in MRI, consentendo di veicolare al sito del recettore una quantità relativamente elevata di metallo paramagnetico per unità di molecola, generando così un corrispondente segnale specifico di elevata intensità anche a dosaggi molari relativamente bassi.

Il composto polimerico P può essere scelto fra polipeptidi quali polilisina, poliomitina, poliarginina, poliserina, acido poliglutammico, acido poliaspartico; poliaammine quali poliallilammina, polietilenimmina; derivati dell’acido poliacrilico quali poli-N-(2-aminoetil)metacrilamide, poli-N-(2-idrossipropil)metacrilamide (HPMA); esteri derivati dell’acido polietilenimminopoliacetico, poli(alchileneossidi), alfa(poliammino)poli-(alchilenossidi), poli(etilenossido) (PEO), poli(propilenossido) (PPO), poli(butilenossido), poliossipropilenglicole, poliossietilenglicole, poliossialchilenglicole, polialchilesteri, polialchilcianoacrilati, polimetilcianoacrilati, polietilcianoacrilati, polibutilcianoacrilati, polisobutilcianoacrilati in cui sono compresi nella definizione di P oltre ai polimeri citati anche copolimeri ottenuti ad esempio da una combinazione dei precedenti. I composti di natura polimerica P sono funzionalizzati in modo da consentire il legame con le unità chelanti A e vengono coniugati al composto di natura peptidica B direttamente o tramite la catena spaziatrice Y.

Tra i composti P coniugati con più unità chelanti A per molecola vengono preferiti quelli che hanno una buona solubilità in acqua, oltre ad una idonea viscosità e stabilità, proprietà che li rendono adatti alla coniugazione a Y-B o direttamente al peptide B, se la catena spaziatrice Y è assente.

Preferiti tra i composti di tipo polimerico sono ad esempio le polilisine, in particolare le poli-L-lisine, una classe di polipeptidi lineari e/o ramificati, in cui il numero di unità di monomero impiegate e le condizioni adottate nella preparazione ne determinano la lunghezza e la struttura. La sua caratteristica formula di struttura (Merck Index, 12<th >ed. Abstract 7549), contenente residui amminici primari, ne consente l’utilizzo per legare covalentemente le unità chelanti A direttamente ai gruppi amminici liberi.

Il peptide B è legato direttamente al gruppo chelante A tramite un legame covalente, ad esempio utilizzando un gruppo -NH2, -CO2H, -SH o -OH presente su di un aminoacido del peptide B, oppure utilizzando la catena spaziante Y, in accordo con il significato precedentemente definito ed eventualmente in presenza di P che viene legato direttamente con legame covalente a B o anche tramite l’utilizzo della catena spaziatrice Y, in accordo con la formula generale (I) e (IV).

La preparazione dei complessi dei composti di formula generale (I), (IV), (V) e (VI) con gli ioni metallici precedentemente definiti viene condotta secondo metodologie note, ad esempio per reazione del composto contenente una o più unità chelanti A, con l’ossido o l’alogenuro dello ione metallico scelto.

In particolare viene effettuata in acqua o in un’opportuna miscela di acqua e alcool, a temperature comprese tra 25°C e 100°C, preferibilmente tra 30°C e 80°C.

Nel caso in cui il complesso ottenuto sia insolubile nel solvente di reazione, il prodotto solido viene filtrato. Se è solubile, può essere convenientemente recuperato per evaporazione del solvente sino a residuo solido, ad esempio con tecniche di spray drying.

Nel caso in cui il complesso ottenuto contenga gruppi acidi liberi, lo si salifica sino a sale neutro per reazione con una base organica o inorganica. Per la preparazione dei sali neutri viene aggiunta una sufficiente quantità di base al complesso contenente gruppi acidi liberi, operando in soluzione acquosa o in sospensione e sino a neutralità.

La soluzione ottenuta può successivamente essere concentrata e il sale complesso risultante può essere opportunamente isolato con tecniche di insolubilizzazione o di cristallizzazione.

La scelta dello ione metallico e dell’eventuale ione neutralizzante è strettamente collegata all’utilizzo previsto del complesso.

Nello Schema 2 viene indicato un esempio di preparazione di un composto di formula generale (IV) e di formula (XXVI), complessato con lo ione di un metallo paramagnetico, la cui preparazione viene descritta nella parte sperimentale.

Nello Schema 3 sotto riportato viene indicata la preparazione del composto di formula (XXX).

Nello Schema 4 sotto riportato viene indicata la preparazione del composto di formula (XXXVIII) in cui il peptide coniugato è ciclico e nella molecola sono presenti quattro unità DTPA-GLU utilizzate come gruppi chelanti il metallo paramagnetico.

Esempi di composti preferiti di formula (I), (IV), (V) e (VI) sono ripor tati di seguito:

Esempi di composti analoghi a quelli precedentemente indicati ed ottenuti dalla coniugazione di un peptide con tre unità funzionali di lisina sono riportati di seguito.

In tal caso è interessante notare come la presenza di tre unità di lisina nella struttura del composto consentano di funzionalizzame la struttura con quattro unità chelanti, che risultano in tal modo presenti sulla medesima unità funzionalizzata del peptide.

I composti oggetto della presente invenzione si sono rivelati utili agenti di contrasto per MRI, in particolar modo per “l’imaging” di patologie tumorali e non caratterizzate da una sovraespressione dei recettori delle colecistochinine di tipo CCK A e/o B e/o delle somatostatine di tipo SSTR 1-5.

I composti della presente invenzione vengono utilizzati sia nella diagnostica in vivo che in vitro e principalmente nell’imaging di cellule tumorali, preferibilmente di cellule tumorali umane.

Va sottolineato che è possibile che al binding faccia seguito un processo di internalizzazione.

I composti di formula generale (I), (IV), (V) e (VI) utilizzati in “vitro” sono caratterizzati da valori di relassività elevati se confrontati con i mezzi di contrasto MRI noti e presenti in commercio. Contribuiscono all’ottenimento di alte relassivita’ il binding selettivo dell’agente di contrasto ai recettori sopramenzionati oltre al binding a macromolecole presenti nel mezzo circostante e/o nel sistema eso e/o endocellulare in cui è presente il composto e, ad esempio con proteine presenti nel plasma, nello spazio interstiziale cellulare o intracellulare.

L’interazione con la macromolecola può avvenire sia inizialmente con il riconoscimento recettoriale dell’agente di contrasto, che in fasi successive e può determinarsi in seguito all’interazione con le componenti di Y, P, B ed A presenti nei composti di formula generale (I). In tal senso il fenomeno di interazione del mezzo di contrasto con la macromolecola può essere influenzato anche dalla presenza in vivo di enzimi e/o di microrganismi (ad es. idrolasi, peptidasi, proteasi, esterasi e/o virus, batteri, lieviti..) che possono determinare la modifica in situ, dell’agente di contrasto con conseguenze sul binding alle macromolecole stesse e ai recettori sopramenzionati.

Ulteriori esempi di proteine caratterizzanti questo tipo di fenomeno è dato ad esempio dalla presenza di “human serum albumin” (HSA; presente sia nel plasma che nello spazio interstiziale a minore concentrazione), da “glutathione-S-transferase” (GST o ligandina), da “fatty acid binding protein” (FABP, Z-protein) e da “alpha 1-acid glycoprotein” (AAC). Infatti il binding del mezzo di contrasto alla macromolecola determina una diminuzione della flessibiltà della molecola nello stato legato e conseguentemente del parametro noto in MRI come “rotation tumbling time” o “rotational correlation time” che comporta come effetto risultante un’aumento della relassività.

L’interazione dell’agente di contrasto ad esempio con componenti proteici sulla superficie (ad esempio con i recettori sopra citati) o all’ interno della cellula, comporta un’aumento della velocità di rilassamento tipica del contrasto MRI, generando un contrasto significativamente aumentato del tessuto e visibile nella scansione generata dall’apparecchio.

I dati di relassività ottenuti con la sperimentazione in “vitro” dei composti di formula (I), consentono di estendere le potenziali applicazioni di questi composti come mezzi di contrasto nella risonanza magnetica per la visualizzazione di cellule, tessuti o organi in cui sono presenti delle neoplasie o patologie tumorali primarie o loro metastasi in “vivo”.

Ulteriore oggetto della presente invenzione è l’uso dei composti di formula generale (I), (IV), (V) e (VI) opportunamente formulati, per la visualizzazione ad esempio di tumori pancreatici e dell’esofago e altri tumori che sovraesprimono i recettori della colecistochinina di tipo A e di tumori delle piccole cellule del polmone, del colon, del tratto gastrointestinale, del carcinoma medullare della tiroide, di astrocitomi, tumori ovarici stromali e altri tumori che sovraesprimono i recettori della colecistochinina di tipo B e inoltre per la visualizzazione di tumori e loro metastasi che sovraesprimono i recettori delle somatostatine SSTR del tipo 1-5 come ad esempio: tumori del sistema neuroendocrino, della ghiandola pituitaria, del sistema nervoso centrale, linfoma di Hodgkin e non Hodgkin, tumore della mammella e del sistema gastro enteropancreatico.

Ulteriore oggetto della presente domanda di brevetto è una metodica per MRI comprendente la somministrazione di una opportuna quantità di un complesso paramagnetico secondo l invenzione, per la visualizzazione e la registrazione della immagine ad esempio di un organo del soggetto sottoposto alla indagine diagnostica.

I composti della presente invenzione sono adatti alla somministrazione orale o enterale.

Per somministrazione parenterale sono preferibilmente formulati come una soluzione o sospensione acquosa sterile, il cui pH può variare tra 6.0 e 8.5.

Tali soluzioni o sospensioni acquose possono essere somministrate in concentrazioni variabili tra 0.002 e 1.0 molare.

Tali formulazioni possono essere liofilizzate e fornite come tali in modo da essere ricostituite al momento dell'uso. Per uso gastrointestinale o per iniezione nelle cavità corporee, tali agenti possono essere formulati come una soluzione o sospensione contenente opportuni additivi adatti per esempio a controllarne la viscosità.

Per somministrazione orale possono venire formulati secondo metodi comunemente impiegati in tecnica farmaceutica, eventualmente anche come formulazione ricoperta in modo da avere una protezione addizionale contro il pH acido dello stomaco, essendo in tal modo impedito il rilascio dello ione metallico chelato, che si verifica particolarmente ai valori di pH tipici dei succhi gastrici.

Le formulazioni secondo l’invenzione comprendono aggregati non covalenti come ad esempio micelle, dispersioni colloidali, emulsioni “oil-in water”, liposomi, nanocapsule, microsfere, composti di inclusione, “solid lipid nanoparticles” o “pro-drugs”, la cui preparazione richiede una funzionalizzazione con legami di tipo covalente ad opportuni sistemi protettivi.

Esempi di preparazione di liposomi che possono contenere il mezzo di contrasto paramagnetico sono descritte in EP354855, US5013556, WOOOl 1007, US6060040, US5702722, US5833948, EP759785 che vengono qui incorporati per riferimento.

Con la definizione di “pro-drugs” si intendono precursori del mezzo di contrasto che in seguito alla somministrazione e per mezzo di un processo chimico e/o fisiologico, come ad esempio una idrolisi enzimatica, o la variazione di pH, consentono il rilascio del prodotto in vivo.

Esempi di “pro-drugs” sono composti in cui una funzione carbossilica viene sostituita da un gruppo estereo o da un gruppo amidico, una funzione alcolica viene derivatizzata a dare un estere o un etere, e ancora una funzione amminica viene sostituita con un opportuno gruppo protettivo adatto al rilascio in vivo del prodotto. Un’ulteriore esempio di “pro-drug” è dato dai composti ottenuti dalla coniugazione come “PEG derivatives” (vd. ad es. Biomaterials, 22, 405-417, 2001). Infatti il poly(ethylene glycol) (PEG), opportunamente coniugato al peptide o ad un gruppo funzionale, presente nei composti di formula generale (I), consente di modificarne alcune caratteristiche mantenendone le proprietà biologiche, quali il binding selettivo ai recettori, la aumentata stabilità alla degradazione enzimatica degli enzimi proteolitici, la modifica delle proprietà chimico fisiche, di biodistribuzione e di solubilità.

Nella preparazione farmaceutica vengono inoltre utilizzati anche eccipienti, come ad esempio edulcoranti e/o aromatizzanti di impiego convenzionale.

Le formulazioni dell’ invenzione dovranno comunque garantire una concentrazione della sonda inferiore ai limiti di tossicità’ e potranno comprendere sia aggregati non covalenti (micelle, SolidLipid Nanoparticles, liposomi, composti di inclusione,..) sia “pro-drugs” la cui realizzazione richieda il legame covalente ad opportuni sistemi protettivi (es. Peghilazione).

Cationi preferiti di basi inorganiche eventualmente adatte a salificare i complessi chelati oggetto della presente invenzione comprendono in particolare gli ioni di metalli alcalini o alcalino-terrosi quali potassio, sodio, calcio, magnesio, e loro miscele.

Cationi preferiti di basi organiche adatte allo scopo precedentemente esposto comprendono, fra gli altri, quelli di ammine primarie, secondarie e terziarie quali, ad esempio, etanolammina, dietanolammina, morfolina, glucammina, N-metilglucammina, N,N-dimetilglucammina.

Anioni preferiti di acidi inorganici eventualmente adatti a salificare i complessi chelati oggetto della presente invenzione comprendono, in particolare, gli ioni degli acidi alogenidrici quali cloruri, bromuri, ioduri o altri ioni quali ad es. solfato.

Anioni preferiti di acidi organici adatti allo scopo precedentemente esposto comprendono quelli di acidi normalmente impiegati in tecnica farmaceutica per la salificazione di sostanze basiche, quali ad esempio, acetato, succinato, citrato, fumarato, maleato e ossalato.

Cationi ed anioni preferiti di amminoacidi comprendono, ad esempio, quelli di taurina, glieina, lisina, arginina o ornitina o dell'acido aspartico e glutammico.

I seguenti esempi illustrano ulteriormente i composti dell’ invenzione. Nelle analisi cromatografiche di RP-HPLC sono state utilizzate le seguenti metodiche:

1) Metodica analitica

Strumentazione: Sistema Cromatografico Shimadzu 10A-LC Colonna: Phenomenex C18, 4.6’ 250 mm

Fase mobile: eluente A) H20/ 0,1 % TFA

eluente B) CH3CN/ 0,1 % TFA Gradiente: Gradiente di tipo lineare dal 95% al 30% di B per un tempo di 30 minuti

Velocità di flusso: 1 ml/min

Determinazione (UV): 210 nm

Quantità iniettata: 50 μΐ

Concentrazione campione: 1 mg/ml

2) Metodica analitico preparativa

Strumentazione: Sistema Cromatografico Waters Delta Prep 4000 collegato ad un rivelatore UV lambda-Max modello 481

Colonna: Vydac Clg, 22’ 250 mm

Fase mobile: eluente A) H20/ 0,1 % TFA

eluente B) CH3CN/ 0,1 % TFA

Gradiente: Gradiente di tipo lineare dal 95% al 30% di eluente B, per un tempo di 30 minuti

Determinazione (UV): 210 nm

Quantità iniettata: 5 mi

Concentrazione campione: 5 mg/ml

Esempio 1

ico tris(l,l-

Il prodotto è stato ottenuto mediante la metodica riportata in letteratura (vd. WO9527705). Il triestere t-butilico dell’acido 1 -formil- 1,4, 7,10-tetraazaciclododecan-l,4,7-triacetico (Inorg. Chem. 30, 1265-1269, 1991) è stato deformilato con idrossilammina cloridrata in EtOH anidro a riflusso, ottenendo D03A triestere ί-butilico monocloridrato. Tale prodotto è stato sospeso in CH2CI2 e K2CO3 acquoso e agitato fino ad ottenere dissoluzione.

La fase organica è stata separata, anidrificata con Na2S04, filtrata ed evaporata a dare D03A triestere ί-butilico come base libera,

b) Preparazione di tris(l,l-dimetiletil)estere dell’Acido 10[[4-(carbossimetil)fenil]metil] - 1 ,4,7, 10-tetraazaciclododecan- 1 ,4,7-triacetico (XXVIII)

L’acido 4-(bromometil)fenilacetico (0.934 mmol, 214 mg) è stato sciolto in 5.0 mL di etanolo contenente 0.234 mL di KOH 4 M. A questa soluzione si è aggiunta una sospensione di D03A triestere i-butilico (0.467 mmol, 240 mg) in 5.0 mL di etanolo. Il pH è stato tenuto a 10-11 aggiungendo pochi microlitri di KOH 4 M, e la miscela di reazione è stata scaldata per 18 ore a 70 °C. Dopo aver rimosso il solvente in vuoto, il grezzo è stato purificato su gel di silice usando come eluente una miscela di diclorometano e metanolo (90:10). Si sono ottenuti 250 mg di XXVIII puro sotto forma di polvere bianca (resa 81%). Il prodotto è stato caratterizzato per spettroscopia di massa (Maldi-Tof) e ’H-NMR.

Peso Molecolare= 662

Il coniugato peptidico XXIX è stato ottenuto per sintesi in fase solida in condizioni standard usando la tecnica Fmoc. Si sono eseguiti dei doppi accoppiamenti aggiungendo 4 equivalenti di amminoacidi protetti e attivati con PyBop e HOBt e 8 equivalenti di DIPEA in DMF. Si è tenuto in agitazione il sistema per 60 min per ogni accoppiamento, usando una scala 0.100 mmol. Si è deprotetta e lavata una piccola quantità della resina e il peptide così separato e indicato dalla seguente sequenza: Asp-Tyr-Nle-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2, è stato analizzato per spettroscopia di massa e HPLC (Metodo analitico 1). Dopo aver confermato l’identità del peptide, tutta la resina protetta caricata con il peptide ottenuto è stata deprotetta dall’ Fmoc e fatta reagire con 2 equivalenti di composto di formula (XXVIII), attivati con PyBop e HOBt e 4 equivalenti di DIPEA in DMF. Si è scaldato per otto ore in un singolo step.

Per la deprotezione e il cleavage della resina coniugata a (XXIX) si è usato TFA contenente triisopropilsilano (2.0%), etanditiolo (2.5%) e acqua (1.5%); il coniugato peptidico è stato precipitato a 0°C aggiungendo etere etilico goccia a goccia. La purificazione della miscela di reazione per RP-HPLC ha dato 34.0 mg di composto di formula (XXIX) puro al 98%.

Peso molecolare^ 1502.

Il complesso di formula (XXVI) è stato ottenuto miscelando quantità equimolari del composto di formula (XXIX) e di GdCl3 a temperatura ambiente, controllando il pH della soluzione mediante aggiunte di gocce di una soluzione concentrata di NaOH.

La relassività del complesso di formula (XXVI) è risultata essere 8.2 mM'1 s'1 (pH 7, 20 MHz).

Esempio 2

A) Preparazione dell’estere 1,1-dimetiletilico dell’acido V,V-bis[2-[bis[2-(l,l-dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-L-glutammico (XXXI)

Il prodotto è stato ottenuto mediante la metodica riportata in letteratura (F. Bioconjugate Chem. 10, 137-140, 1999). A tale scopo l’acido L-glutammico 5-benzil estere (Helv. Chem. Acta, 41, 1852-1867, 1958) è stato esterificato con isobutene in H2SO4 al 98% e diossano a dare acido L-glutammico l-(l,l-dimetiletil)5-benzil diestere, che è stato successivamente bisalchilato alFammino gruppo con A-(2-bromoetil)imminodiacetato di 1,1-dimetiletile (preparato secondo: J. Org. Chem., 58, 1151-1158, 1993) in Et0H/H20 a pH 8. L’idrogenazione catalizzata da Pd/C in EtOH del prodotto bisalchilato fornisce il composto di formula (XXXI) grezzo, che è stato purificato mediante cromatografia flash.

Anche il coniugato peptidico di formula (XXXII) è stato ottenuto per sintesi in fase solida in condizioni standard e con la tecnica Fmoc. Si sono eseguiti dei doppi accoppiamenti aggiungendo 4 equivalenti di amminoacidi protetti e attivati con PyBop e HOBt e 8 equivalenti di DIPEA in DMF. Si è tenuto in agitazione il sistema per 60 min per ogni accoppiamento, usando una scala 0.100 mmol. Si è deprotetta e lavata una piccola quantità della resina e il peptide ottenuto e dato dalla seguente sequenza: Gly-Asp-Tyr-Nle-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2, è stato analizzato per spettroscopia di massa e HPLC (Metodo analitico 1). Dopo aver confermato Γ identità del peptide, tutta la resina protetta e caricata con il peptide è stata deprotetta dall’ Fmoc e fatta reagire con il composto di formula (XXXI). L’accoppiamento è stato eseguito usando 2 equivalenti di XXXI, attivati con PyBop e HOBt e 4 equivalenti di DIPEA in DMF. Si è quindi scaldato per otto ore in un singolo step. Per la deprotezione e il cleavage dalla resina di XXXII si è usato TFA contenente triisopropilsilano (2.0%), etanditiolo (2.5%) e acqua (1.5%); il coniugato peptidico è stato precipitato a 0°C aggiungendo etere etilico goccia a goccia. La purificazione della miscela di reazione per RP-HPLC ha dato 42.0 mg di XXXII, puro al 98%.

Rt= 24.60 min;

MW= 1569

C

Il complesso di formula XXX è stato sintetizzato per aggiunte successive di una soluzione 1 mM di GdCl3 ad una soluzione di legante di formula XXXII, 1 mM fino a formare il complesso legante-Gd in rapporto 1:1 (il pH della soluzione è stato mantenuto a 7 aggiungendo poche gocce di una soluzione concentrata di NaOH). La relassività del complesso è risultata essere di 10.4 mM'1 s'1 a pH 7 e 20 MHz.

Esempio 3

(XXXIV)

Il composto di formula XXXIV coniugato con il peptide ciclico noto come

Vapreotide

Vapreotide, viene ottenuto utilizzando la tecnica di sintesi dei peptidi in fase solida in condizioni standard e con la tecnica Fmoc.

Il doppio accoppiamento viene ottenuto per aggiunta di 4 equivalenti di aminoacidi protetti, attivati da PyBop e HOBt e 8 equivalenti di DIPEA in DMF; il tempo di agitazione è di 60 min per ciascun accoppiamento, e viene

(XXXV)

utilizzata in reazione una scala corrispondente alle 0.100 mmol. Una quantità limitata del peptide lineare di formula (XXXV) presente sulla resina, viene trattato per la

deprotezione e il distacco dalla resina e il prodotto grezzo ottenuto corrispondente al peptide di formula (XXXV), viene analizzato con spettrometria di massa e HPLC (Metodo analitico 1). Dopo aver confermato l’identità del peptide, il composto coniugato e protetto di formula (XXXV) presente sulla resina, viene trasferito in un reattore predisposto per la deprotezione Fmoc e l’accoppiamento con il composto di formula (XXXI). L’accoppiamento con il composto di formula (XXXV) avviene utilizzando 2 equivalenti dell’ estere 1,1-dimetiletilico dell’acido A,A-bis[2-[bis[2-(l,ldimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-L-glutammico (XXXI), ottenuti come precedentemente descritto (vd. es. 2 A; [1]), attivati con PyBop, HOBt e 4 equivalenti di DIPEA in DMF; il tempo di agitazione per ogni singolo accoppiamento è di 8 ore.

Per la deprotezione e il distacco dalla resina, il composto peptidico protetto di formula (XXXV) e coniugato alla resina, viene trattato con TFA contenente tri-isopropilsilano (2.0%), etanditiolo (2.5%) e acqua (1.5%); e il peptide coniugato viene precipitato alla temperatura di 0°C con aggiunta di etere etilico. La purificazione della miscela grezza ottenuta, ed effettuata in RP-HPLC, consente di isolare 28 mg di composto di formula (XXXVI) avente una purezza HPLC del 98%.

La ciclizzazione S-S del peptide viene ottenuta per dissoluzione di 25 mg del composto lineare di formula (XXXVI) in 25 mi di DMSO 20% in acqua. La miscela di reazione viene mantenuta in agitazione a temperatura ambiente per 2 h, e la determinazione della formazione del legame S-S avviene con il test di Ellman. Quando l’ossidazione è completata, il prodotto viene purificato per RP-HPLC (Metodo analitico preparativa 2) ottenendo 16 mg di composto in polvere liofilizzato di formula (XXXIV).

R t (XXXIV) = 27.8 min;

MW (XXXIV) = 1617.

[1] Bioconjugate Chem., 10, 137-140, 1999.

B) Preparazione del composto di formula (XXXIII)

Il complesso di formula (XXXIII) è stato ottenuto per aggiunte successive di una soluzione 1 mM di GdCl3 ad una soluzione di legante 1 mM, composto di formula (XXXIV) a temperatura ambiente, controllando il pH della soluzione mediante aggiunte di gocce di una soluzione concentrata di NaOH. La relassività del complesso di formula (XXXIII) è risultata essere 12.5 mM'1 s'1.

Esempio 4

A) Preparazione del composto coniugato peptidico di formula XXXVIII

Il coniugato peptidico di formula (XXXVIII) (DTPA-GLU)4-(Lys)2-Lys-Gly-Vap(D-Phe) è costituito dal peptide Vap(D-Phe), un peptide S-S ciclico biologicamente attivo noto come vapreotide e di sequenza D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2 e dalla parte ramificata (DTPA-GLU)4-(Lys)2-Lys- separata da un residuo di Gly dal peptide biologicamente attivo. La sintesi è stata effettuata utilizzando la strategia di sintesi peptidica in fase solida, ed impiegando il sintetizzatore di peptidi Shimadzu per la sintesi in batch. In particolare è stata utilizzata la metodologia che impiega quale gruppo protettore della funzione alfa-amminica il gruppo Fmoc. La sintesi è stata condotta impiegando come supporto solido la resina PALPEG con grado di sostituzione 0.16 mmol/g ed usando una scala 0.100 mmolare. La sintesi è stata programmata con la seguente procedura: eccesso dei singoli amminoacidi 4.0 equivalenti, attivante PyBop e HOBt 1.0 equivalente rispetto all’ amminoacido, DIEA 2.0 equivalenti rispetto all 'amminoacido ed al PyBop, solvente DMF anidro, tempo di accoppiamento 120 minuti (singolo accoppiamento). Gli amminoacidi utilizzati in sequenza sono stati i seguenti: Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-D-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-D-Phe-OH e Fmoc-Gly-OH. Dopo aver accoppiato il residuo di glieina all’estremità N-terminale del peptide vapreotide è stata prelevata una piccola aliquota di resina per verificare l’andamento della sintesi. Si è proceduto quindi ad un distacco dalla resina utilizzando una soluzione di TFA contenente triisopropilsilano (2%), etanditiolo (2.5%) e acqua (1.5%). Il peptide Fmoc-Gly-Vap(D-Phe) così ottenuto è stato analizzato mediante spettroscopia di massa MALDI-TOF e cromatografia HPLC. L’analisi ha confermato l’identità e il grado di purezza.

Successivamente si è proseguito nella sintesi deproteggendo l’estremità N- terminale dal gruppo Fmoc con una soluzione 30% di piperidina in DMF e quindi aggiungendo quattro equivalenti di Fmoc-Lys(Mtt)-OH, attivata con PyBop e HOBt, 1.0 equivalente rispetto all’ amminoacido, e DIEA 2.0 equivalenti rispetto all’ amminoacido ed al PyBop, solvente DMF anidro, tempo di accoppiamento 120 minuti (singolo accoppiamento). Dopo l’accoppiamento si effettua la deprotezione prima del gruppo Mtt, con una miscela di DCM/TFA/TIS nel rapporto 91/4/5, e poi del gruppo Fmoc con una miscela di Piperidina/DMF nel rapporto di 30/70.

In questo modo possono essere legati due residui di lisina ai due gruppi amminici liberi della lisina presente sul peptide in posizione N-terminale. Pertanto si aggiungono 8 equivalenti, rispetto al peptide, di Fmoc-Lys(Mtt)OH (attivante PyBop e HOBt, 1.0 equivalente rispetto all’ amminoacido, DIEA 2.0 equivalenti rispetto all’ amminoacido ed al PyBop, solvente DMF anidro, tempo di accoppiamento 120 minuti).

Viene effettuato un distacco di prova per confermare l’identità del peptide utilizzando una soluzione di TFA contenente triisopropilsilano (2%), etanditiolo (2.5%) e acqua (1.5%). Il peptide (Fmoc-Lys(Mtt))2-Lys-Gly-Vap(D-Phe) così ottenuto è caratterizzato mediante spettroscopia di massa MALDI-TOF e cromatografia HPLC.

Confermata l’identità del peptide si effettua la deprotezione prima del gruppo Mtt, con una miscela di DCM/TFA/TIS nel rapporto 91/4/5, e poi del gruppo Fmoc con una miscela di Piperidina/DMF nel rapporto di 30/70.

La reazione di condensazione con il gruppo chelante corrispondente al composto di formula (XXXI) viene effettuata aggiungendo 6 equivalenti di chelante (24 eq rispetto al peptide per saturare tutti e quattro i gruppi amminici liberi delle lisine) ed attivando il gruppo carbossilico non protetto del chelante di formula (XXXI) con HATU (12 eq) e DIEA (12 eq) in DMF. La miscela di reazione è mantenuta sotto agitazione meccanica per otto ore a temperatura ambiente.

Per la deprotezione e il distacco del coniugato (DTPA-GLU)4-(Lys)2-Lys-Gly-Vap(D-Phe) dalla resina viene usata una miscela di TFA contenente triisopropilsilano (2%), etanditiolo (2.5%) e acqua (1.5%); il coniugato peptidico viene precipitato a 0°C aggiungendo etere etilico goccia a goccia.

L’omogeneità del prodotto grezzo è verificata mediante HPLC analitico: il prodotto grezzo mostra un picco principale con un tempo di ritenzione pari a 25.0 min. ed altri picchi di eluizione nel range di eluizione 24.5 - 25.7 min. (Metodica analitico preparativa 2). Il prodotto è stato purificato mediante HPLC preparativo con lo stesso metodo di separazione utilizzato in scala analitica. Si ottiene il prodotto ad un grado di purezza superiore al 90%, confermato da HPLC analitico, con una resa superiore al 50% del teorico atteso. L’identità del prodotto è stata confermata con spettroscopia di massa Maldi che mostra il picco al valore di massa atteso (3263) oltre ai picchi di massa relativi ad addotti con ioni Na<+ >e K<+>.

Sul composto purificato si provvede poi alla reazione di ciclizzazione tra i gruppi SH dei due residui di cisteina. La reazione viene effettuata in una soluzione acquosa di DMSO al 20% (concentrazione 1 mg/ml) e monitorata nel tempo con il test di Ellman. Quando la reazione di ciclizzazione va a compimento (test di Ellman incolore) il coniugato peptidico contenente il peptide vapreotide S-S ciclico viene purificato mediante HPLC.

B) Preparazione del composto di formula (XXXVII)

Il complesso di formula (XXXVII) è stato ottenuto per aggiunte successive di una soluzione 1 mM di GdCl3 ad una soluzione di legante 1 mM, composto di formula (XXXVIII) a temperatura ambiente, controllando il pH della soluzione mediante aggiunte di gocce di una soluzione concentrata di NaOH. La relassività del complesso di formula (XXXVII) è risultata essere

Claims (22)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composti di formula (I) m cui;
2. B rappresenta uno o più peptidi lineari, ramificati o ciclici di formula generale (II) o (III)
3. m cui; AAj corrisponde ad Asp o Giu; AA2 corrisponde a Tyr o S03H-Tyr; AA3 corrisponde a Met, Nle o Leu; AA6*corrisponde a Met, Nle o Leu; AA8 corrisponde a Phe o al corrispondente amminoalcool, AA’l5 A A’ 3 AA’6e AA’g rappresentano un qualunque amminoacido naturale e non in configurazione L o D; AA’g può anche essere un amminoalcool derivato da un qualunque amminoacido naturale e non, di configurazione L o D; R2 rappresenta un gruppo idrossilico, un gruppo amminico o un gruppo alcossi CrC4; v rappresenta un numero intero da 1 a 5; w rappresenta zero o 1 ; Y rappresenta una catena spaziante legata rispettivamente ad una delle funzionalità presenti sulle catene laterali dei singoli aminoacidi del peptide B, oppure ad un gruppo amminico N-terminale o carbossi C-terminale di B e a gruppi funzionali presenti nei residui P o A come sotto definiti; z è un numero intero che va da 0 a 5, laddove per valori diversi da 1, Y può assumere diversi significati; P rappresenta una catena di natura polimerica lineare o ramificata in grado di legare covalentemente t unità di A e legata tramite legami covalenti ad una o più unità di Y o B; t è un numero compreso tra 1 e 100; A rappresenta un agente chelante ciclico o aciclico legato covalentemente a B ( per w=z=0), Y ( per z=l)o P (per w=l) e contenente da 6 ad 8 siti di coordinazione quali ad esempio gruppi amminici e/o piridinici e/o carbossilici e/o fosfonici e/o fosfinici e/o ossidrilici e/o carbossammidici, detti gruppi A essendo in grado di chelare metalli bi-trivalenti aventi numero atomico variabile fra 21 e 29, 42, 44 o fra 57 e 71. 2. Composti secondo la rivendicazione 1, di formula generale (IV), (V) e (VI)
4. in cui A, P, Y, B, t e v sono come sopra definiti, z è diverso da 0 e w è 0 nei composti IV; w è le z è zero nei composti V; z e w sono 0 nei composti VI in cui una o più unità di B presenti sono legate covalentemente e direttamente ad una o più unità chelanti A. 3. Composti secondo le rivendicazioni da 1 a 2 in forma di complessi con gli ioni bi-trivalenti degli elementi metallici aventi numero atomico variabile fra 21 e 29, 42, 44 o fra 57 e 71, con metalli paramagnetici e in particolare con Fe, Cu, Cr, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Mn come pure i loro sali con basi o acidi fisiologicamente compatibili. 4. Composti secondo la rivendicazione 3 in forma di complessi con gli
5. sali con basi o acidi fisiologicamente compatibili. 5. Composti secondo la rivendicazione 4 in forma di complessi ottenuti con gli ioni bi-trivalenti di Eu(3+), Gd(3+), Dy(3+), Mn(2+) e Mn(3+), come pure i loro sali con basi o acidi fisiologicamente compatibili. 6. Composti secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, in cui i residui peptidici B di formula (II) e (III), sono scelti fra quelli di formula (VII), (Vili), (IX), (X), (XI) e (XII):
6. pp
7. 7. Composti secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui Y è un gruppo di formula:
8. in cui r, 1, e q indipendentemente tra loro possono assumere i valori di 0 o 1; p può variare tra 0 e 10, con la condizione che almeno uno di 1, r, e q sia diverso da zero; X rappresenta un atomo di 0, o un gruppo -NR dove R è un atomo di H o un gruppo alchile (C1-C5); K rappresenta un nucleo benzenico, sostituito o no, oppure un gruppo -CHR] dove Ri rappresenta un atomo di idrogeno oppure un gruppo -COOH o -SO3H; W rappresenta un gruppo -CO- o -CS-. 8. Compostisecondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui le catene Y sono, scelte fra i residui di formula:
9. dove p, r, q, 1, z, W, R sono come definiti nella rivendicazione precedente. 9. Composti secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui Y è una catena di formula:
10. 10. Composti secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 8 in cui il gruppo chelante A viene scelto nel gruppo costituito da: residui di acidi poliamminopolicarbossilici e derivati, acidi poliamminofosfonici e derivati, acidi poliamminofosfinici e derivati, residui di texafirine, porfirine e ftalocianine.
11. 11. Composti secondo la rivendicazioni 10 in cui il gruppo chelante A viene scelto nel gruppo costituito da: acido etilendiamminotetracetico (EDTA), acido dietilentriamminopentaacetico (DTP A), acido 1,4, 7,10-tetraazaciclododecan- 1,4, 7, 10-tetraacetico (DOTA), acido 1,4, 7,10-tetraazaciclododecan- 1, 4, 7-triacetico
12. 12. Composti secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 8 in cui il gruppo chelante A viene scelto nel gruppo costituito da: poliamminoderivati di formula generale (XVI) e (XVII) sia in forma racema che otticamente attiva in cui:

    R’ rappresenta H, un gruppo alchile CrC5, alcossi, cicloalchilico, idrossialchilico, arilico o eterociclico eventualmente sostituiti; R! e R2 indipendentemente tra loro, sono H, un gruppo alchilico CrC20, lineare o ramificato, saturo o insaturo, eventualmente interrotto da uno o più atomi di azoto o zolfo o da gruppi -CO-, -CO-NH-, -NHCO-, -SO-, -S02-, -S02NH-, ed eventualmente sostituita da gruppi -NH2, -N(R4)2, -OH, alogeno, -COOH, COOR4> -CON(R4)2, OR4I O da uno o più gruppi C5-C10 cicloalchilici, arilici, eteroarilici o eterociclici, saturi, insaturi o aromatici e in cui la porzione arilica o eteroarilica comprende da 1 a 3 anelli fusi eventualmente interrotti da uno o più atomi di azoto, zolfo o ossigeno ed eventualmente sostituiti da uno o più

    R3 può assumere i significati precedentemente definiti di Ri e R2> con la condizione che se Y2 corrisponde a

    (CH2)mCOOH o (CH2)mNH2; m rappresenta un numero intero compreso tra 1 e 6; R4 rappresenta H, un gruppo alchilico lineare o ramificato CrC5 eventualmente sostituito da un gruppo C5-C10 cicloalchilico, arilico, eteroarilico o eterociclico a sua volta sostituito da uno o più atomi di alogeno, gruppi OH o alchile Q-Cs.
13. 13. Composti secondo la rivendicazione 12, in cui il residuo A ha formula (XVIII) o (XIX):

    in cui: R5 rappresenta un gruppo ciclico saturo, insaturo o aromatico, eventualmente interrotto da uno o più atomi di azoto, zolfo o ossigeno ed eventualmente sostituito da uno o più gruppi

    R4 ha il significato precedentemente definito; m rappresenta un numero intero compreso tra 1 e 6; n rappresenta un numero intero compreso tra 0 e 2; R6 rappresenta un gruppo alchilico eventualmente interrotto o sostituito da uno o più gruppi

    O da uno o più gruppi C5-C10 cicloalchilici, arilici, eteroarilici o eterociclici, saturi, insaturi o aromatici e in cui la porzione arilica o eteroarilica comprende da 1 a 3 anelli fusi eventualmente interrotti da uno o più atomi di azoto, zolfo o ossigeno ed eventualmente sostituiti da uno o più atomi di alogeno e/o gruppi O
14. 14. Composti secondo la rivendicazione 12, in cui il residuo A è scelto fra composti di formula (XX), (XXI), (XXII) e (XXIII) in cui Rls R2 e R3 sono in accordo con le precedenti definizioni.
15. 15. Composti secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui i gruppi chelanti A sono residui di formula generale (XXIV) e (XXV)

    in cui: n, m, 1 rappresentano, indipendentemente tra loro, 0, 1 o 2; D rappresenta gruppi, uguali 0 diversi tra loro, scelti fra:

    oppure i gruppi D hanno lo stesso significato sotto specificato dei gruppi Q nel caso in cui n, m o 1, assume valore 0; Q rappresenta un singolo legame covalente fra il gruppo chelante A e la catena Y o il residuo polimerico P o fra il gruppo A e il gruppo B; R’ e R” rappresentano indipendentemente tra loro H o un gruppo alchile CrC5, alcossi, cicloalchilico, idrossialchilico, arilico o eterociclico, eventualmente sostituti; E rappresenta un gruppo

    ha il significato precedentemente definito.
16. 16. Composti secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui A è scelto fra:
17. 17. Composti secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 16 in cui il composto polimerico P è un polipeptide, una poliammina, esteri derivati dell’acido polietilenimminopoliacetico, poli(alchileneossidi), alfa(poliammino)poli(alchilenossidi), poli(etilenossido) (PEO), poli(propilenossido) (PPO), poli(butilenossido), poliossipropilenglicole, poliossietilenglicole, poliossialchilenglicole, polialchilesteri, polialchilcianoacrilati, polimetilcianoacrilati, polietilcianoacrilati, polibutilcianoacrilati, polisobutilcianoacrilati e loro copolimeri.
18. 18. Composti secondo la rivendicazione 17 in cui il composto polimerico P è una polilisina o una poli-L-lisina,
19. 19. Composti secondo una delle rivendicazioni precedenti scelti fra:
20. 20. Composizione farmaceutica e diagnostica contenente un composto delle rivendicazioni 1-19 in miscela con un veicolo opportuno.
21. 21. Uso dei composti delle rivendicazioni da 1 a 19 e dei loro sali per la preparazione di formulazioni diagnostiche utilizzate in metodiche di MRI, per la visualizzazione e la registrazione di immagini di organi e/o di tessuti.
22. 22. Uso secondo la rivendicazione 21, per la visualizzazione e la registrazione di immagini di cellule, tessuti o organi in cui sono presenti delle neoplasie o patologie tumorali primarie o loro metastasi in vitro e/o in vivo.