ITMI20090350A1 - Glicerosomi e loro impiego in preparazioni farmaceutiche e cosmetiche per uso topico - Google Patents

Description

“GLICEROSOMI E LORO IMPIEGO IN PREPARAZIONI FARMACEUTICHE E COSMETICHE PER USO TOPICOâ€

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

La somministrazione topica di farmaci, rispetto ad altre vie di somministrazione quali la via orale o parenterale, presenta potenziali vantaggi in quanto evita la degradazione del principio attivo sia nel tratto gastrointestinale che nel circolo epatico (essendo eliminato il cosiddetto first-pass metabolism) e risulta generalmente più accettabile da parte del paziente.

L’apparato tegumentario, tuttavia, rappresenta una barriera difficilmente permeabile per la maggior parte dei farmaci. La pelle à ̈ composta da due strati, uno più profondo o derma ed uno strato esterno o epidermide. Lo strato più profondo, o derma, di spessore variabile tra 0,3 e 4 mm, à ̈ costituito da un tessuto connettivo ricco di vasi sanguigni in cui trovano sede gli apparati piliferi e ghiandolari, nonché le strutture nervose che fanno della pelle un vero e proprio organo sensoriale. A questo livello i principi attivi possono attraversare le pareti dei capillari e raggiungere il torrente circolatorio che può distribuirli ai vari distretti. Lo strato più superficiale, o epidermide, che svolge la funzione di barriera evitando la penetrazione dall’esterno di sostanze estranee e microorganismi, à ̈ ricoperto da un film idrolipidico ed ha uno spessore compreso tra 50 e 150 µm. Le cellule caratteristiche dell’epidermide sono i cheratinociti che originano nello strato germinativo, a contatto con il derma, e che salgono progressivamente verso la superficie andando incontro alla cheratinizzazione, un processo di graduale trasformazione in lamelle cornee le quali costituiscono il cosiddetto strato corneo, di spessore variabile tra 10 e 30 µm. Soprattutto questo strato rappresenta un limite al passaggio dei principi attivi: infatti la velocità del processo di assorbimento transdermico dei farmaci à ̈ strettamente correlata alla loro velocità di penetrazione attraverso lo strato corneo, che in genere à ̈ molto bassa. Ciò si traduce in una ridotta biodisponibilità dei farmaci somministrati per via topica.

Per migliorare la diffusione dei principi attivi attraverso la cute sono stati proposti sia approcci chimico-fisici, che prevedono l’impiego di composti quali, per esempio, dimetilsolfossido, acidi grassi, glicole propilenico, urea e alcool etilico in funzione di promotori dell’assorbimento [Williams AC e Barry BW, 1992] sia metodi fisici comprendenti, tra gli altri, la iontoforesi, l’elettroporazione e l’applicazione di ultrasuoni a bassa frequenza [Lavon I e Kost J, 2004], sia una combinazione di metodi fisici associati all’impiego di agenti promotori dell’assorbimento.

Un diverso approccio proposto per migliorare la diffusione transdermica dei farmaci prevede l’impiego di strutture vescicolari generalmente indicate col termine di liposomi. I liposomi sono vescicole microscopiche con dimensioni di circa 50-500 nm costituite da fosfolipidi che, grazie alle loro caratteristiche di molecole amfipatiche, in ambiente acquoso orientano le teste idrofiliche nella parte superficiale a diretto contatto con il solvente polare e le code idrofobiche negli strati più interni, dove costituiscono una fase apolare separata dal solvente circostante organizzata in strutture lipidiche a doppio strato (bilayers) che si chiudono formando vescicole unilamellari o multilamellari che delimitano rispettivamente uno o più compartimenti acquosi.

Le proprietà chimico-fisiche dei liposomi possono essere facilmente modificate variando il metodo di preparazione e/o incorporando nella loro preparazione sostanze di varia natura quali, ad esempio, colesterolo che viene aggiunto per aumentare la stabilità del doppio strato lipidico o molecole lipidiche cariche positivamente o negativamente che impartiscono una carica di superficie alla membrana dei liposomi in modo da ridurre la tendenza delle vescicole ad aggregarsi tra loro.

Nelle vescicole liposomiali, le sostanze idrofile si disciolgono nei compartimenti acquosi, quelle lipofile si inseriscono nel doppio strato lipidico e quelle amfipatiche dispongono le porzioni polari in acqua e quelle apolari tra le lamelle lipidiche. Poiché i costituenti dei liposomi, oltre ad essere privi di effetti tossici e allergici, sono biocompatibili con le membrane cellulari, permettono l’interazione tra cellule e liposomi.

L’interazione tra cellule e liposomi non à ̈ stata ancora del tutto chiarita; i meccanismi proposti per spiegare questa interazione sono diversi e non à ̈ escluso che alcuni si verifichino contemporaneamente. L’endocitosi sembra essere il meccanismo più probabile: il liposoma viene fagocitato nella cellula intatto e quindi internalizzato nei lisosomi, dove le fosfolipasi degradano i bilayers liberando il farmaco.

Tra gli altri meccanismi proposti vi sono lo scambio di lipidi tra il liposoma e le membrane cellulari e l’adsorbimento a cui può seguire la fusione del bilayer con la membrana cellulare, per cui il contenuto della vescicola viene riversato, a seconda delle sue caratteristiche chimico-fisiche, nel citoplasma o nella membrana cellulare.

L’impiego di liposomi per realizzare la somministrazione mirata di farmaci a livello del derma e dell’epidermide, allo scopo di ridurre l’assorbimento sistemico e di minimizzare gli effetti indesiderati, à ̈ stato proposto fin dal 1980 [Mezei M e Gulasekharam V, 1980; Mezei M, 1988] e studiato successivamente da molti autori [(Lichtenberg D e Barenholz Y, 1988; Woodle MC e Papahdjopoulos D, 1989, Sinico C et. al 2005, Manconi M et. Al 2006].

D’altra parte, in dipendenza della composizione e del metodo di preparazione, à ̈ stato ipotizzato l’impiego di liposomi per veicolare farmaci o agenti cosmetici anche attraverso strutture accessorie della cute quali, per esempio, i follicoli piliferi e le ghiandole sebacee; a questo livello i principi attivi possono anche attraversare le pareti dei capillari e raggiungere, attraverso il torrente circolatorio, vari tessuti ed organi [El Maghraby G.M et al., 2006].

Nella maggior parte dei casi, tuttavia, l’impiego dei liposomi tradizionali in funzione di carrier per la somministrazione topica e/o transdermica di principi attivi presenta limiti evidenti in quanto i liposomi convenzionali hanno una limitata capacità di penetrare il tessuto cutaneo rimanendo confinati nelle strutture più superficiali dello strato corneo.

Successivamente, sono state sviluppate nuove classi di strutture lipidiche vescicolari quali, in particolare, i liposomi flessibili o deformabili e gli etosomi che, grazie alla presenza di specifici additivi, modificano le caratteristiche chimico-fisiche e funzionali dei liposomi convenzionali e sono potenzialmente più efficienti per veicolare farmaci agli strati profondi del tessuto cutaneo.

I liposomi flessibili o deformabili (indicati anche con il termine di Transfersomi®) contengono, oltre alla componente fosfolipidica di base, un surfattante a catena singola (selezionato, per esempio, tra i composti sodio colato, sodio deossicolato, potassio glicirrizinato, Span 60, Span 65, Span 80, Tween 20, Tween 60, Tween 80) che, avendo un elevato raggio di curvatura, destabilizza il doppio strato lipidico delle vescicole e ne aumenta la deformabilità e, di conseguenza, la capacità di penetrare nel tessuto cutaneo [Cevc G, Blume G, 1992]. I transferosomi sono morfologicamente simili ai liposomi convenzionali ma, dal punto di vista funzionale, si presentano come strutture sufficientemente deformabili e flessibili da penetrare attraverso pori molto più piccoli della loro dimensione. Per i transferosomi à ̈ stato proposto un meccanismo d’azione basato sia sulla migliorata capacità delle vescicole deformabili contenenti il farmaco di penetrare intatte nello strato corneo sia su un effetto successivo delle vescicole penetrate nello strato corneo di modificare, destabilizzandole, le strutture lipidiche intracellulari e di facilitare la diffusione del farmaco liberato dalle vescicole stesse. È stato tuttavia ipotizzato che, poichà ̈ il meccanismo di trasporto dei liposomi deformabili potrebbe in parte dipendere dalle caratteristiche chimico-fisiche del farmaco trasportato, la preparazione dei liposomi deformabili dovrebbe essere ottimizzata caso per caso [Elsayed MMA et al., 2006].

Un approccio alternativo per fluidizzare le membrane lipidiche dei liposomi e migliorarne la funzione di carrier di farmaci e/o di agenti cosmetici à ̈ rappresentato da vescicole lipidiche composte da fosfolipidi, etanolo e acqua nella quali l’etanolo à ̈ presente in concentrazioni elevate (generalmente variabili dal 20% al 50%) e sono per questo denominate etosomi [Touitou E, US Patent 5,716,638]. La presenza di una significativa concentrazione di etanolo riduce la grandezza degli etosomi e, in generale, ne aumenta la capacità di incorporare principi attivi diversi, tra i quali molecole a carattere lipofilo risultando in definitiva in un efficiente sistema per la somministrazione topica di farmaci [Touitou E at al., 2000].

Il meccanismo d’azione degli etosomi à ̈ probabilmente basato su una interazione sinergica tra l’etanolo, le vescicole lipidiche ed i lipidi della pelle dove la presenza di etanolo potrebbe conferire caratteristiche di flessibilità per una migliore penetrazione negli strati cutanei profondi oltre che esercitare la sua ben nota proprietà di promozione dell’assorbimento [Williams A, 2003]. A livello degli strati profondi della pelle, gli etosomi potrebbero quindi fondersi con i lipidi del tessuto cutaneo favorendo il rilascio del farmaco a livello del derma ed il suo eventuale assorbimento transdermico.

L’impiego topico di etosomi, sia in campo farmaceutico che cosmetico, potrebbe tuttavia presentare controindicazioni e/o problemi di irritazione in particolare nel caso di non completa integrità della pelle o in presenza di lesioni cutanee, a causa della elevata concentrazione di etanolo.

Nel corso degli studi rivolti allo sviluppo di formulazioni liposomo-simili, gli autori del presente brevetto hanno sorprendentemente trovato nuove formazioni vescicolari di particolare utilità quando siano impiegate come carrier di principi attivi in campo farmaceutico e cosmetico. Le nuove formulazioni, indicate con il termine di glicerosomi e costituenti l’oggetto principale della presente invenzione, sono essenzialmente composte da fosfolipidi e acqua ma sono specificatamente caratterizzate dalla presenza di una elevata quantità di glicerolo (variabile in percentuale ponderale dal 15% al 35%), sostanza molto meno aggressiva dell’etanolo presente negli etosomi e altamente accettabile per applicazioni topiche.

Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, i glicerosomi, purché mantengano la caratteristica di contenere glicerolo per almeno il 15% e fino al 35%, preferibilmente nell’intervallo tra il 20% e il 30%, o più preferibilmente una concentrazione di glicerolo pari al 25%, possono essere preparati a partire da tutti i diversi fosfolipidi naturali o sintetici normalmente utilizzati nella preparazione dei liposomi convenzionali e noti agli esperti dell’arte così come possono contenere uno o più additivi normalmente utilizzati nei liposomi convenzionali e noti agli esperti dell’arte così come possono essere preparati secondo le diverse tecniche normalmente utilizzate nella preparazione dei liposomi convenzionali note agli esperti dell’arte secondo quanto riportato, per esempio, nelle seguenti pubblicazioni e brevetti che vengono qui incorporati nella loro totalità come referenze: Vemuri S, Rhodes CT. 1995; Cevc G. 2004; Torchilin VP, Weissig V, 2003.

In un ulteriore aspetto della presente invenzione, i glicerosomi possono essere utilizzati come carrier di principi attivi incorporati in formulazioni per la somministrazione topica note nell’arte e comprendenti, ma senza che questo costituisca una limitazione dello scopo del presente brevetto, creme, emulsioni, ungenti, gel, lozioni, sospensioni e simili.

A titolo esemplificativo, ma senza che questo costituisca alcuna limitazione dello scopo del presente brevetto, i glicerosomi descritti nella presente invenzione possono avere la seguente composizione:

Componente Glicerolo Agenti Promotori Principio Conservanti H2O fosfolipidica modificanti dell’assorbimento attivo

1-10% 15-35% 0-2% 0-5% 0-20% 0-1%<q.b a>100%dove:

- la componente fosfolipidica può comprendere uno o più fosfolipidi di origine estrattiva o fosfolipidi ottenuti per semisintesi o sintesi chimica, quali per esempio fosfatidilcolina (lecitina), fosfatidiletanolammina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerolo, fosfatidilinositolo, dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), distearoil fosfatidilcolina, palmitoil-stearoil fosfatidilcolina, sfingomielina, eccetera. Le caratteristiche fondamentali del/dei fosfolipidi selezionati per la preparazione dei glicerosomi sono la capacità di formare vescicole in grado di incorporare il principio attivo, la compatibilità biologica, la degradabilità metabolica e l’assenza di tossicità.

- gli agenti modificanti addizionati in funzione stabilizzante dei glicerosomi e/o come modificanti della loro carica elettrica possono essere, per esempio, colesterolo, stearilammina, dicetilfosfato, eccetera - i promotori dell’assorbimento possono essere, per esempio, dimetilsolfossido, glicole propilenico, acidi grassi, alcool etilico, eccetera.

I glicerosomi della presente invenzione possono essere preparati con i diversi procedimenti noti nell’arte per la preparazione dei liposomi convenzionali tra i quali, a titolo di esempio, si possono citare il metodo di idratazione di film lipidici originariamente descritto da Bangham et al., 1965 ed i metodi derivati basati sullo stesso principio [Kirby C e Gregoriadis G, 1984]; la tecnica di evaporazione a fase inversa [Skoza F, Papahadjopoulos D, 1980; Papahadjopoulos D et al., U.S. Pat. No. 4,235,871; Pick U, 1981]; il metodo di evaporazione da fasi inverse supercritiche [Imura T et al., 2002].

In dipendenza della composizione e del metodo di preparazione i glicerosomi della presente invenzione possono presentarsi in forma di vescicole lipidiche unilamellari (piccole o grandi) o vescicole lipidiche multilamellari. I glicerosomi in forma di vescicole multilamellari possono essere convertiti in glicerosomi in forma di vescicole unilamellari mediante sonicazione, omogeneizzazione o mediante procedimenti di estrusione o di filtrazione attraverso membrane di opportuna porosità.

I glicerosomi della presente invenzione possono essere utilizzati come carrier per veicolare principi attivi di interesse farmaceutico e cosmetico tra i quali sono inclusi, a titolo di esempio e non come limitazione, sia composti lipofili come, per esempio, aciclovir, acido trans-retinoico, betametasone dipropionato, lidocaina, minoxidil, amfotericina B, gentamicina, rifampicina, vitamina E ed esteri o derivati lipofili della vitamina E, eccetera, sia composti idrofili come, per esempio, sodio diclofenac, lidocaina cloridrato, acido ialuronico, vitamina C e suoi derivati, derivati solubili della vitamina E, come vitamina E TPGS, eccetera.

Per illustrare la presente invenzione, senza che ne venga limitato lo scopo, sono state comparate le caratteristiche chimico-fisiche e funzionali di una preparazione di glicerosomi rispetto ad una preparazione di liposomi convenzionali, entrambe preparate come descritto nell’esempio 1 ed utilizzate come carrier del farmaco antivirale aciclovir, del composto steroideo di

sintesi betametasone dipropionato caratterizzato da una elevata lipofilia e del

composto d-alfa-tocoferil polietileneglicole-1000 succinato (Vitamina E-

TPGS o Tocophersolan), che à ̈ un derivato idrosolubile della vitamina E

naturale che trova impiego sia in campo farmaceutico che come antiossidante

in preparati per uso cosmetico.

Aciclovir à ̈ un nucleoside purinico aciclico che in forma di

somministrazione topica trova impiego per il trattamento delle manifestazioni

ricorrenti di lesioni oro-facciali, in particolare di herpes labiale, che sono

prevalentemente causate da infezioni da Herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-

1) e per il cui trattamento topico sono disponibili commercialmente

preparazioni di aciclovir formulate come crema con la denominazione

commerciale Zovirax® che contiene aciclovir alla concentrazione del 5%.

Le preparazioni vescicolari utilizzate come carrier, contenti

dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) come componente fosfolipidica e

colesterolo come agente modificante, sono state caricate con due diverse

concentrazioni di principio attivo (aciclovir 5% nelle preparazioni indicate

come glicerosomi-A e 1% nelle preparazioni indicate come glicerosomi-B)

come riportato nella tabella 1.

Tabella 1. Composizione percentuale delle preparazioni di

glicerosomi e liposomi caricate con aciclovir

DPPC Colesterolo Aciclovir Glicerolo Glicerosomi - A 3 0,1 5 25 Glicerosomi - B 3 0,1 1 25 Liposomi - A 3 0,1 5 -Liposomi - B 3 0,1 1

L’efficienza di incorporazione del principio attivo tiene conto della quota non incorporata nelle vescicole che, nella fase di purificazione, viene separata dai glicerosomi su una colonna di gel filtrazione. La quantità di principio attivo incorporata nei glicerosomi purificati viene determinata dopo rottura delle vescicole mediante aggiunta di Triton X-100 o metanolo.

Tenendo conto della quantità di farmaco iniziale e della quantità dosata dopo la purificazione dei glicerosomi, viene calcolata l’efficienza di incorporazione (E%) espressa come percentuale di principio attivo incorporato nelle vescicole rispetto alla quantità inizialmente caricata, secondo la formula:

E %= quantità di principio attivo nella dispersione purificata x 100/ quantità di principio attivo nella dispersione iniziale

I glicerosomi hanno dimostrato di avere una efficienza di incorporazione del principio attivo aciclovir significativamente superiore all’efficienza di incorporazione nei liposomi convenzionali, come riportato nella tabella 2.

Tabella 2. Efficienza di incorporazione di aciclovir nelle preparazioni di glicerosomi-A e di liposomi-A

Efficienza di incorporazione di aciclovir (%) Glicerosomi-A Liposomi-A

54,4 ± 8 30,6 ± 5

Un ulteriore vantaggio dei glicerosomi à ̈ rappresentato dal fatto che la loro preparazione avviene operando a temperatura ambiente, preferibilmente a temperatura inferiore a 30°C e ancora più preferibilmente alla temperatura di 25°qualunque sia il fosfolipide utilizzato mentre per la preparazione dei liposomi convenzionali si opera ad una temperatura maggiore o uguale alla temperatura di transizione (Tc) del fosfolipide utilizzato che, in alcuni casi, può anche essere elevata fino a 60-80°C (come per esempio DPPC che ha un valore Tc = 70°C). Il fatto di non sottoporre a riscaldamento la miscela di preparazione dei glicerosomi rappresenta un ovvio vantaggio nel caso in cui il principio attivo da incorporare sia termolabile o parzialmente degradabile se sottoposto a riscaldamento.

L’analisi morfologica dei glicerosomi caricati con il principio attivo aciclovir, condotta mediante analisi al microscopio ottico a luce polarizzata ha evidenziato la presenza di croci maltesi indicative della presenza di sistemi lamellari assimilabili a strutture vescicolari [Manosroi A et al., 2003; Mele S et al., 2003; Sinico C et al 2005].

L’analisi in microscopia elettronica a trasmissione (TEM) delle preparazioni dei glicerosomi (figura 1) ha confermato la presenza di sistemi vescicolari lamellari

La stabilità delle preparazioni à ̈ stata valutata mediante analisi dimensionale (secondo la tecnica di Photon Correlation Spectroscopy), misura del potenziale Z (mediante la tecnica di Dynamic Laser Light Scattering) e misura dell’indice di polidispersione condotte al momento della preparazione e ripetute ad intervalli di tempo fino a 3 settimane.

Le dimensioni medie dei glicerosomi e dei liposomi (calcolate su tre preparazioni, ciascuna delle quali misurata in triplo) sono risultate rispettivamente attorno a valori medi di 100 nm e 150 nm, mentre l’indice di polidispersione (PI), che rappresenta un importante parametro di omogeneità delle dimensioni vescicolari, mostra che le preparazioni di glicerosomi possiedono caratteristiche di omogeneità significativamente superiori dei liposomi con PI, rispettivamente, attorno a valori medi di 0,2 e 0,4 per i glicerosomi e i liposomi (figura 2).

La superiore omogeneità dei glicerosomi rispetto ai liposomi rappresenta un parametro particolarmente vantaggioso per l’impiego dei glicerosomi nei sistemi di delivery in campo farmaceutico e cosmetico.

La presenza nei glicerosomi di elevate concentrazione di glicerolo conferisce inoltre a questi sistemi vescicolari una maggiore flessibilità rispetto ai liposomi convenzionali come dimostrato da un test di estrusione nel quale le dimensioni medie ed il relativo indice di polidispersione erano valutati prima e dopo che le formulazioni erano sottoposte ad estrusione su un filtro con pori di dimensioni calibrate a 50 nm, come mostrato nella tabella 3.

Tabella 3. Test di estrusione su filtro da 50 nm di glicerosomi e liposomi caricati con 5% aciclovir

Vescicole non estruse Vescicole estruse Dimensioni PI Dimensioni PI nm ± SD nm ± SD

Glicerosomi - A 108 ± 33 0,23 105 ± 24 0.27 Liposomi- A 148 ± 28 0,45 98 ± 21 0,63 Dai risultati della tabella 3 risulta evidente la maggiore rigidità dei liposomi convenzionali nei quali l’estrusione provoca una significativa diminuzione delle dimensioni medie ed un aumento dell’indice di polidispersione in quanto attraverso il filtro passano solo le vescicole di dimensioni compatibili con la porosità della membrana filtrante e si verifica probabilmente la rottura delle vescicole di dimensioni maggiori.

La maggiore flessibilità dei glicerosomi rispetto ai liposomi convenzionali costituisce una ulteriore vantaggiosa caratteristica per l’impiego di queste strutture vescicolari come carrier per la somministrazione topica di farmaci in quanto la maggiore flessibilità à ̈ potenzialmente in grado di conferire loro una maggiore capacità di penetrazione e trasporto dei principi attivi negli strati profondi della cute [Cevc G, Gebauer D., 2003].

La valutazione dell’assorbimento transdermico, cioà ̈ della capacità di rilascio del principio attivo e di penetrazione attraverso la pelle, di preparazioni di glicerosomi e liposomi caricati con il 5% di aciclovir, à ̈ stata condotta utilizzando una cella di Franz verticale, che rappresenta un modello sperimentale affidabile per studiare la diffusione di un farmaco destinato alla somministrazione topica, operando in bagno termostatato, in modo che la pelle sia a temperatura fisiologica (32°C) e per un tempo fino a 24 ore secondo il procedimento descritto nell’esempio 6, ed utilizzando come membrana diffusionale pelle di maiale neonato.

Al termine della diffusione, i campioni di pelle di maiale utilizzati come membrane nella camera di Franz sono stati sezionati separando lo strato corneo, il derma e l’epidermide che sono stati analizzati separatamente per determinare l’accumulo di principio attivo nei diversi strati cutanei.

In questi esperimenti, le performance dei glicerosomi e dei liposomi caricati con il 5% di aciclovir sono state paragonate ad una formulazione topica convenzionale di aciclovir crema disponibile commercialmente (Zovirax® crema 5% aciclovir) ed i risultati ottenuti sono riportati nella figura 3 (permeazione di aciclovir in funzione del tempo) e in tabella 4 (accumulo di aciclovir e dose assorbita).

I risultati riportati nella figura 3 dimostrano che aciclovir 5% formulato in glicerosomi-A contenenti il 25% di glicerina possiede un flusso in vitro (espresso in µg di aciclovir/cm<2>di pelle) superiore sia rispetto alla formulazione nei liposomi convenzionali sia rispetto al preparato commerciale in crema Zovirax 5%.®. In particolare, la quantità di aciclovir veicolato nei glicerosomi dopo 24 ore corrisponde ad una capacita di permeazione di circa quattro volte superiore rispetto alla formulazione in crema del preparato commerciale. Il fatto che aciclovir formulato alla concentrazione dell’1% nei glicerosomi-B mantenga, come riportato nella figura 3, una capacità di permeazione ancora circa doppia rispetto alla formulazione commerciale al 5% in crema rappresenta un potenziale vantaggio in termini di safety, legato alla possibilità di utilizzare dosaggi inferiori di principio attivo, oltre che in termini economici/produttivi in quanto permetterebbe una riduzione della quantità di principio attivo. I risultati relativi all’accumulo di aciclovir nei diversi compartimenti cutanei, riportato nella tabella 4 dimostrano che, dopo 24 ore, nelle formulazioni vescicolari il maggior accumulo si riscontra a livello dell’epidermide mentre nel caso della formulazione commerciale la quota maggiore di principio attivo rimane confinata a livello dello strato corneo. Nonostante non vi siano differenze statisticamente rilevanti circa l’accumulo epidermico e dermico delle diverse formulazioni testate, questi risultati confermano la diversa velocità di diffusione delle formulazioni evidenziando ancora una volta la capacità dei glicerosomi di comportarsi da enhancer.

Tabella 4. Accumulo, nei diversi compartimenti cutanei, di aciclovir 5% formulato in glicerosomi e liposomi in confronto ad un preparato commerciale (Zovirax® 5% crema) dopo diffusione a 37°C per 24 ore, in una camera di Franz su una membrana di separazione (0,636 cm<2>) costituita da pelle di maiale neonato

Strato corneo Epidermide Dermaµg/g% doseµg/g% doseµg/g% dose assorbita assorbita assorbita Glicerosomi-A 67 ± 4 0.27 ± 0.002 227 ± 13 0.91 ± 0.05 67 ± 4 0.27 ± 0.03 Liposomi-A 76 ± 9 0.30 ± 0.003 178 ± 35 0.71 ± 0.14 44 ± 13 0.18 ± 0.05 Zovirax 527 ± 35 2.10 ± 0.140 183 ± 71 0.73 ± 0.28 80 ± 17 0.32 ± 0.07

Il betametasone dipropionato à ̈ un corticosteroide di sintesi lipofilo che, formulato come unguento, lozione o crema trova impiego per il trattamento topico di dermatiti sensibili ai corticosteroidi esercitando una azione locale antiprurito, antiinfiammatoria e vasocostrittiva.

Betametasone dipropionato viene incorporato nei glicerosomi con una maggiore efficienza rispetto all’incorporazione nei liposomi convenzionali come indicato dai valori dell’ indice di incorporazione E% che sono di circa il 68% per i glicerosomi rispetto a circa il 42% per i liposomi.

Lo studio della distribuzione nei diversi compartimenti cutanei di betametasone dipropionato 0,2% formulato in glicerosomi-A al 25% di glicerolo, in confronto ad una formulazione in liposomi convenzionali, dopo esperimenti di diffusione per 24 ore in celle di Franz attraverso pelle di maiale neonato, mette in evidenza che l’impiego dei glicerosomi come carrier favorisce, rispetto ai liposomi convenzionali, un accumulo negli strati cutanei profondi anche nel caso di un principio attivo che, come il composto betametasone dipropionato, à ̈ caratterizzato da una elevata lipofilia (figura 4).

Il composto d-alfa-tocoferil polietileneglicole-1000 succinato (Vitamina E-TPGS o Tocophersolan) Ã ̈ un derivato idrosolubile della vitamina E naturale ottenuto per esterificazione del carbossile libero della vitamina E succinato con una catena di glicole polietilenico con peso molecolare di 1000 Da. Essendo una molecola anfifilica, il composto Vitamina E-TPGS entra a far parte del doppio strato liposomiale.

La vitamina E-TPGS, oltre ad essere utilizzata come componente delle formulazioni farmaceutiche in qualità di emulsionante, surfattante e promotore dell’assorbimento, può essere impiegata in formulazioni cosmetiche per uso topico dove, in funzione delle sue proprietà antiossidanti, esplica una attività di protezione della pelle.

La diffusione in vitro di Vitamina E TPGS 10% formulata in glicerosomi-A al 25% di glicerolo e in liposomi convenzionali condotta in celle di Franz attraverso una membrana (0,636 cm<2>) costituita da pelle di maiale neonato mostra un profilo di permeazione caratteristico di un rilascio controllato che, in entrambi i casi, non supera nelle 24 ore un totale di 10-12 milligrammi di prodotto, corrispondenti a circa il 5% della quantità applicata. Nel caso di una soluzione acquosa di Vitamina E TPGS, nelle stesse condizioni sperimentali, la quantità permeata raggiunge il 20-22% della quantità iniziale a seguito di un burst abbastanza pronunciato che si verifica nelle prime 4 ore, come riportato nella figura 5.

Nello stesso esperimento la distribuzione nei diversi compartimenti cutanei di Vitamina E-TPGS 10% formulata in glicerosomi in confronto ad una formulazione in liposomi convenzionali e ad una soluzione acquosa, dimostra che, rispetto alla soluzione acquosa, l’incorporazione nei liposomi, e in misura ancora maggiore nei glicerosomi, aumenta significativamente l’accumulo di Vitamina E-TPGS negli strati cutanei profondi (epidermide profonda/derma), come riportato nella tabella 5.

Tabella 5. Accumulo di Vit. E TPGS negli strati profondi della pelle (epidermide profonda /derma)

Formulazioni Vitamina E TPGS

mg/gr tessuto

Soluzione 1,05 ± 0,49

Liposomi - A 1,80 ± 0,42

Glicerosomi - A 3,09 ± 0,58

La relazione tra i profili di diffusione e di accumulo nei vari strati cutanei mostra come i sistemi vescicolari fungono da sistema depot di Vitamina E TPGS; questo vale in particolare per Vitamina E TPGS formulata nei glicerosomi dove si osserva il maggior accumulo negli strati cutanei profondi ed una permeazione controllata in assenza di burst significativi. Nel caso di Vitamina E TPGS in soluzione acquosa il minor accumulo dermico unitamente al burst iniziale indicherebbe per questa formulazione una maggiore capacità di permeazione e cioà ̈ un più probabile assorbimento sistemico.

In conclusione, i glicerosomi che costituiscono l’oggetto principale della presente invenzione presentano, sia rispetto ai liposomi convenzionali che ad altre formulazioni per uso topico convenzionali quali creme, lozioni, unguenti o soluzioni, un miglioramento delle caratteristiche di permeazione fungendo da enhancer cutanei assolutamente biocompatibili e sono perciò impiegabili come carrier per la somministrazione topica di principi attivi farmaceutici e di prodotti cosmetici con elevata capacità di penetrazione nella pelle senza produrre fenomeni di irritazione cutanea.

I glicerosomi oggetto della presente invenzione infatti, essendo specificatamente caratterizzati dalla presenza di glicerolo in concentrazioni variabili dal 15% al 35%, sono privi di componenti aggressivi quali l’alcool etilico che potrebbe causare fenomeni irritativi in seguito ad applicazione topica e/o determinare bruciore se applicati in presenza di lesioni come nel caso, per esempio, dell’herpes labiale o di lesioni della pelle di altra natura.

Gli esempi di seguito riportati hanno unicamente lo scopo di illustrare la presente invenzione secondo una delle forme di realizzazione preferite, senza che costituiscano una limitazione del suo campo di applicazione.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1. Immagine TEM di una preparazione di glicerosomi caricati con il 5% di aciclovir.

Figura 2. Variazioni dell’indice di polidispersione (PI) di una preparazione di glicerosomi-A e di liposomi-A, caricati con 5% di aciclovir, valutato fino a 3 settimane dopo la preparazione.

Figura 3. Profili di permeazione di aciclovir 5%, formulato in glicerosomi-A, glicerosomi B e liposomi-A in confronto ad un preparato commerciale (Zovirax® 5% crema). Lo studio à ̈ stato condotto in celle di Franz operando in bagno termostatato, in modo che la pelle sia a temperatura fisiologica (32°C) e per 24 ore, su una membrana di diffusione (0,636 cm<2>) costituita da pelle di maiale neonato.

Figura 4. Distribuzione di betametasone 0,2% formulato in glicerosomi-A al 25% di glicerolo e in liposomi convenzionali dopo diffusione per 24 ore in celle di Franz attraverso una membrana di separazione (0,636 cm<2>) costituita da pelle di maiale neonato.

Figura 5. Profili di permeazione di Vitamina E TPGS 10% formulata in liposomi, glicerosomi-A al 25% di glicerolo in confronto ad una soluzione acquosa. Lo studio à ̈ stato condotto per 24 ore, in celle di Franz su una membrana di separazione (0,636 cm<2>) costituita da pelle di maiale neonato.

Esempio N° 1. Preparazione dei glicerosomi e dei liposomi Glicerosomi e liposomi sono stati preparati utilizzando una metodica basata sull’idratazione del film lipidico. I componenti lipofili della formulazione (fosfolipidi, colesterolo, principi attivi liposolubili, ed eventuali lipidi carichi come DCP o stearil-ammina) pesati nelle proporzioni della formulazione finale vengono disciolti in un piccolo volume di solvente organico (cloroformio o dicloro-metano) in un pallone di vetro di capacità almeno 10 volte superiore al volume finale di dispersione che si intende preparare. Alla soluzione limpida si aggiungono palline di vetro del diametro di circa 1 mm per facilitare la formazione, per evaporazione, di un film lipidico sottile (circa 4-5 ml di palline per 5 ml di dispersione finale in un pallone da 50 ml). Il solvente viene evaporato sottovuoto e a temperatura ambiente per almeno 2 ore fino ad ottenere un film lipidico privo di qualsiasi traccia di solvente organico.

Si addiziona un volume di soluzione acquosa di glicerolo (con concentrazioni di glicerolo variabili dal 15% al 35% e nella quale sono disciolti gli eventuali principi attivi idrosolubili) pari al volume della dispersione finale e la miscela, mantenuta a 25°C, viene sottoposta ad agitazione meccanica a 10.000 giri/minuto per 1 ora utilizzando una pala a mezza luna in plastica perfettamente aderente alla superficie del pallone. La dispersione ottenuta, costituita da vescicole multilamellari, viene fatta riposare per 60 minuti e successivamente omogeneizzata ad alta pressione (Omogeneizzatore Avestin Emulsiflex C5) operando per 10 minuti a 60.000-65.000 kPa a 25°C. La dispersione vescicolare omogeneizzata viene purificata per gel filtrazione su una colonna di resina Sephadex G-25 per separare i glicerosomi, che sono eluiti nel volume vuoto della colonna, dal principio attivo non incorporato. Dopo il caricamento della dispersione vescicolare, si eluisce con acqua raccogliendo l’eluato in frazioni che sono sottoposte ad analisi turbidimetrica (UV a 600 nm) al fine di selezionare le frazioni contenenti le vescicole.

Per la preparazione dei liposomi convenzionali, si applica la procedura descritta per la preparazione dei glicerosomi con la differenza che l’idratazione del film lipidico viene effettuata con un tampone acquoso (per esempio tampone fosfato salino) e che durante la fase di idratazione e la successiva fase di omogeneizzazione si opera ad una temperatura maggiore o uguale alla temperatura di transizione (Tc) del fosfolipide utilizzato (per esempio Tc = 70°C con DPPC; Tc = 25°C per DMPC; eccetera).

Esempio N° 2. Caratterizzazione dei glicerosomi

La caratterizzazione dei glicerosomi à ̈ stata effettuata mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM), microscopia ottica in luce polarizzata (PLM), Photon Correlation Spectroscopy (PCS) e determinazione dell’efficienza di incapsulazione (E%).

Per la preparazione dei campioni per la TEM, una goccia di dispersione, adsorbita su una griglia di rame, viene colorata con una soluzione di acido fosfotungstico allo 1% e successivamente il campione viene osservato e fotografato per confermare l’avvenuta formazione delle vescicole e definire la loro morfologia.

La misura delle dimensioni così come le misure di potenziale Z sono state condotte utilizzando un dynamic laser light scattering (DLLS) dotato di rilevatore Z-potential (Malvern).

L’E% esprime la percentuale di farmaco effettivamente incapsulata nelle vescicole rispetto alla quantità iniziale (100%). La separazione della dispersione vescicolare dal farmaco libero viene effettuata per gel cromatografia su una colonna di Sephadex G-25 preparata ed eluita con acqua.

Esempio N° 3. Determinazione quantitativa di aciclovir

La determinazione quantitativa dell’aciclovir à ̈ stata fatta mediante spettrofotometria UV, utilizzando per la preparazione dei campioni il protocollo descritto dalla Farmacopea Britannica. In breve, i campioni contenenti aciclovir vengono trattati con una soluzione di acido solforico 0,5M, che consente la completa dissoluzione del farmaco e successivamente addizionati di acetato di etile al fine di separare i componenti lipofili. Effettuata la separazione i campioni vengono analizzati, previa preparazione di una retta di calibrazione, alla lunghezza d’onda di 254 nm.

Esempio N° 4. Preparazione della pelle suina

Negli esperimenti di permeazione in vitro à ̈ stata utilizzata pelle di maiale neonato, fornita da un allevatore locale, asportata immediatamente dopo la morte dell'animale. Trattandosi di maiale neonato la pelle à ̈ sottile, ha uno spessore molto regolare e non ha grasso sotto lo strato dermico. La pelle à ̈ stata lavata con abbondante acqua corrente, distesa, avvolta in fogli di alluminio e congelata a -20°C.

Esempio N° 5. Test di flessibilità

Al fine di valutare le caratteristiche di flessibilità delle vescicole, le formulazioni vescicolari sono state sottoposte ad un test di estrusione che consiste nel misurare le dimensioni medie con relativo indice di polidispersione prima e dopo che le formulazioni sono state sottoposte ad estrusione su un filtro con pori di dimensioni calibrate a 50 nm.

Esempio N° 6. Studi di permeazione e di accumulo

Gli studi di permeazione in vitro sono stati eseguiti utilizzando le celle di diffusione di Franz tenute sotto costante agitazione per tutto il periodo dell’esperimento. Il campione in esame (500 µl) viene caricato nel compartimento donatore, rappresentato dalla cella superiore. Preparazioni di pelle di maiale congelate sono reidratate per 4 ore a temperatura ambiente in tampone fosfato pH 7,4 e tagliate in dischetti che vengono inseriti tra i due compartimenti della cella di Franz, tenuti saldamente uniti da una pinza metallica. La superficie utile di ciascun dischetto di pelle à ̈ di 0.636 cm<2>. Nel corso dell’esperimento, a tempi successivi (30 min, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 24 ore) si preleva completamente il contenuto del compartimento inferiore e si riempie nuovamente la celletta con soluzione tampone avendo cura che non si formino bolle d’aria al di sotto della pelle. I campioni prelevati vengono conservati a 4°C e successivamente sottoposti ad analisi per la determinazione quantitativa del principio attivo.

Al termine dell’esperimento di permeazione, la pelle viene recuperata e lasciata asciugare all’aria. Lo strato corneo viene separato mediante stripping con nastro adesivo Tesafilm (tipo 40021) applicato alla pelle per 10 secondi sotto leggera pressione e ripetendo lo stripping dopo avere ruotato la pelle di circa 40°. Il derma, separato dall’epidermide mediante bisturi, viene tagliato in piccoli pezzi e sottoposto a diversi cicli di ultrasuoni in soluzione tampone.

La sospensione viene filtrata e sulla porzione filtrata viene determinato il contenuto del principio attivo mediante analisi quantitativa.

Ogni esperimento à ̈ stato condotto contemporaneamente in tre celle, calcolando la media dei tre valori ottenuti, e ripetuto almeno tre volte.

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Claims (11)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composizioni vescicolari liposomo-simili, denominate col termine di glicerosomi ed utilizzabili per applicazioni topiche in campo farmaceutico e cosmetico, caratterizzate dal fatto di comprendere a) glicerolo in concentrazioni variabili dal 15 al 35%, preferibilmente dal 20% al 30%, ancora più preferibilmente alla concentrazione del 25%; b) almeno una componente fosfolipidica in concentrazione dall’1 al 10% e c) almeno un principio attivo farmaceutico o un prodotto cosmetico.
2. 2. Glicerosomi secondo la rivendicazione 1, caratterizzati dal fatto che la componente fosfolipidica comprende uno o più fosfolipidi sia di origine estrattiva che ottenuti per sintesi chimica.
3. 3. Glicerosomi secondo le rivendicazioni 1 e 2, caratterizzati dal fatto che la componente fosfolipidica comprende almeno un composto selezionato tra fosfatidilcolina (lecitina), fosfatidiletanolammina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerolo, fosfatidilinositolo, dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), distearoil fosfatidilcolina (DSPC), palmitoil-stearoil fosfatidilcolina, sfingomielina, miscele di fosfolipidi idrogenati e non idrogenati derivati dalla soia come Phospholipon 90 (p90), Phospholipon 100 (p100), Phospholipon 90G (p90G), Phospholipon 90H (p90H).
4. 4. Glicerosomi secondo le rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzati dal fatto di comprendere concentrazioni variabili dallo 0 al 2% di agenti modificanti delle membrane vescicolari e concentrazioni variabili dallo 0 al 5% di agenti promotori dell’assorbimento cutaneo del principio attivo.
5. 5. Glicerosomi secondo le rivendicazioni da 1 a 4, caratterizzati dal fatto che l’agente modificante delle membrane fosfolipidiche à ̈ selezionato tra colesterolo, stearilammina, dicetilfosfato e fosfatidil-glicerolo (PG).
6. 6. Glicerosomi secondo le rivendicazioni da 1 a 5, caratterizzati dal fatto che l’agente promotore dell’assorbimento cutaneo del principio attivo à ̈ selezionato tra glicole propilenico, mentolo, alcool etilico e un acido grasso saturo o insaturo.
7. 7. Glicerosomi secondo le rivendicazioni da 1 a 6, caratterizzati dal fatto che il principio attivo farmaceutico o di impiego cosmetico à ̈ un composto a carattere lipofilo o un composto a carattere idrofilo.
8. 8. Glicerosomi secondo la rivendicazione 7 caratterizzati dal fatto che il principio attivo farmaceutico o di impiego cosmetico à ̈ selezionato tra farmaci antivirali, vitamine e loro derivati, estratti vegetali, farmaci antiinfiammatori, corticosteroidi, farmaci antibiotici e antifungini, farmaci antipsoriasi, aciclovir, acido trans-retinoico, betametasone e suoi derivati, lidocaina, minoxidil, amfotericina B, gentamicina, rifampicina, vitamina E ed esteri o derivati lipofili della vitamina E, sodio diclofenac, lidocaina cloridrato, alcaloidi, idrossiacidi, acido ialuronico, vitamina C e suoi derivati, derivati solubili della vitamina E, vitamina E TPGS, agenti antirughe, agenti antiinvecchiamento, agenti antiossidanti, agenti per la cura del capello, umettanti e protettori solari.
9. 9. Un processo per la preparazione di glicerosomi per uso topico in campo farmaceutico o cosmetico secondo le rivendicazioni da 1 a 8, che comprende la miscelazione di 1%-10% di uno o più fosfolipidi estrattivi o sintetici, del 15%-35% di glicerolo, di 0,1%-20% di principio attivo, di 0-2% di un agente modificante delle membrane fosfolipidiche, di 0-5% di un agente promotore dell’assorbimento cutaneo e di acqua quanto basta a 100% per formare un sistema colloidale costituito da vescicole unilamellari o multilamellari che promuovono l’assorbimento del principio attivo attraverso la pelle.
10. 10. Un processo per la preparazione di glicerosomi per uso topico in campo farmaceutico o cosmetico secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che l’intero procedimento preparativo avviene a temperatura ambiente, preferibilmente a temperatura inferiore a 30°C, ancora più preferibilmente a 25°C qualunque sia la temperatura di transizione Tc del fosfolipide estrattivo o sintetico utilizzato.
11. 11. L’impiego di glicerosomi secondo le rivendicazione da 1 a 10 per la preparazione di creme, emulsioni, unguenti, gel, lozioni, sospensioni o altre formulazioni farmaceuticamente accettabili o formulazioni idonee per l’impiego cosmetico utilizzabili per la somministrazione topica di principi attivi farmaceutici o di prodotti cosmetici.