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ITMI20060678A1 - Composto peptidico ad attivita' b iologica sua preparazione e sue applicazioni - Google Patents

Composto peptidico ad attivita' b iologica sua preparazione e sue applicazioni Download PDF

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ITMI20060678A1
ITMI20060678A1 IT000678A ITMI20060678A ITMI20060678A1 IT MI20060678 A1 ITMI20060678 A1 IT MI20060678A1 IT 000678 A IT000678 A IT 000678A IT MI20060678 A ITMI20060678 A IT MI20060678A IT MI20060678 A1 ITMI20060678 A1 IT MI20060678A1
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ala
alanine
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Sanofi Aventis Otc S P A
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Description

Descrizione dell’invenzione avente per titolo:
“Composto peptidico ad attività biologica, sua preparazione e sue applicazioni”
La presente invenzione si riferisce a un composto peptidico ad attività biologica, che possiede in particolare delle proprietà antimicrobiche, alla sua preparazione e alle sue applicazioni.
È noto che certi microorganismi sono in grado, quando sono somministrati vivi all’uomo o all’animale, di indurre un effetto benefico sulla salute dell’ospite, in particolare mediante la produzione di sostanze antimicrobiche.
Tali organismi sono generalmente chiamati organismi probiotici.
Numerosi studi hanno mostrato gli effetti benefici per l’uomo o l’animale di questi organismi probiotici, in particolare nel trattamento dei disordini gastrointestinali, come la diarrea, la diarrea acuta, la diarrea associata all’assunzione di medicamenti.
Gli organismi probiotici più studiati a tutt’oggi sono i batteri lattici, ma è altresì riportato che altri organismi vivi possono presentare una attività benefica sulla salute.
Tali altri organismi comprendono per esempio Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus cereus, Bacillus clausii, Bacillus polyfermentans.
Tra questi, il Bacillus clausii è usato da numerosi anni in una composizione farmaceutica commercializzata con il marchio Enterogermina®.
Questa composizione farmaceutica è in particolare destinata a combattere i disordini gastro-intestinali e comprende una miscela di quattro ceppi di Bacillus clausii.
L’attività biologica antimicrobica di questi organismi probiotici è generalmente legata alla produzione naturale di composti ad attività antimicrobica, come i lantibiotici. Così dei ceppi di Bacillus clausii, Streptomyces mutans, Lactococccus lactis producono rispettivamente la sublitina, delle mutacine e delle nisine.
Numerosi antibiotici sono usati oggigiorno come sostanze terapeutiche per il trattamento delle malattie infettive ma gli agenti patogeni diventano sempre più resistenti alle sostanze farmaceutiche utilizzate. Certi mo sono già noti per essere “multi-resistenti” e il trattamento delle infezioni di cui sono responsabili è talvolta estremamente difficile.
Delle nuove molecole aventi proprietà antibiotiche sono dunque sempre ricercate.
Scopo dell’invenzione è rispondere a questa richiesta, proponendo un composto ad attività antimicrobica ottenuto a partire da Bacillus clausii.
Un primo oggetto dell’invenzione concerne un composto ad attività antimicrobica.
Un secondo oggetto dell’invenzione concerne un procedimento per la preparazione del composto ad attività antimicrobica dell’invenzione.
Un terzo oggetto dell’invenzione concerne una composizione farmaceutica contenente il composto ad attività antimicrobica dell’invenzione.
Un quarto oggetto dell’invenzione concerne gli usi del composto ad attività antimicrobica dell’invenzione.
Secondo un primo aspetto, l’invenzione concerne un composto ad attività antimicrobica.
È stata in effetti isolata e caratterizzata una molecola prodotta dal Bacillus clausii, e che presenta una attività antimicrobica.
Il composto dell’invenzione ad attività antimicrobica è di natura peptidica ed è suscettibile di essere ottenuto da una coltura di Bacillus clausii in un mezzo appropriato fino alla sporulazione, raccolta del sumatante della coltura dopo centrifugazione e filtrazione, ed estrazione della frazione ad attività antimicrobica.
II composto dell’invenzione, attivo principalmente contro i batteri gram positivi è suscettibile di essere ottenuto a partire da Bacillus clausii , possiede una massa molecolare da 2107,5 Da, determinata per spettrometria di massa col metodo MALDI TOF e ESI.
Secondo un’altra caratteristica, il composto dell’invenzione è un lantibiotico, che presenta nella sua sequenza peptidica dei ponti lantionina e degli animino acidi modificati.
Secondo una delle sue caratteristiche, il composto dell’invenzione comprende la sequenza di amminoacidi e derivati di amminoacidi seguente:
Phe - Dhb - Ala - Val - Dha - Phe - Ala - Abu - Pro - Gly - Ala - Gly - Giu - Dhb -Gly - Ala - Phe - Asn - Ala - Phe - Ala
in cui
Dhb rappresenta un dideidroamminobutirrato;
Dha rappresenta una dideidroalanina;
Abu rappresenta un amminobutirrato.
II composto dell’invenzione possiede due ponti lantionina, uno tra l’alanina in posizione 3 e l’alanina in posizione 7, e l’altro tra l’alanina in posizione 16 e l’alanina in posizione 21.
Un ponte metil-lantionina è inoltre presente tra il residuo amminobutirrato in posizione 8 e l’alanina in posizione 11. Un quarto ponte esiste tra il gruppo ammino-vinil-cisteinico C-terminale e il residuo dell’alanina in posizione 19.
Rappresentato con i ponti esistenti, il composto dell’invenzione presenta la sequenza seguente:
in cui Dha, Dhb e Abu sono come sopra definiti.
Secondo un secondo aspetto l’invenzione concerne un procedimento per la preparazione del composto dell’invenzione.
Secondo l’invenzione, il composto dell’invenzione può essere estratto da Bacillus clausii secondo il procedimento che segue.
II procedimento di preparazione del composto dell’invenzione comprende le fasi di:
coltura dei ceppi di Bacillus clausii in un mezzo appropriato fino alla sporulazione dei ceppi;
raccolta del sumatante dalla coltura dopo centrifugazione e filtrazione; estrazione in fase solida della frazione ottenuta ed eluizione.
Eventualmente la frazione ottenuta, che corrisponde alla molecola dell’ invenzione, può essere purificata per cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC).
Secondo un'altra modalità di esecuzione, il composto dell’invenzione può
essere preparato per sintesi chimica classica, secondo dei metodi noti all’esperto del ramo.
Il composto dell’invenzione presenta attività antimicrobica verso dei batteri gram positivi. Ha in particolare mostrato una attività antimicrobica verso S. aureus, Enterococcus faecium, Micrococcus sp, Lactococcus lactis, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Listeria monocytogen.es e i batteri gram positivi del cavo orale.
Per la sua natura lantibiotica, il composto dell’invenzione può presentare uno spettro di attività biologica più ampio, per esempio antivirale, antiparassitaria o immunomodulatrice.
Il composto dell’invenzione può dunque essere utilizzato per la preparazione di medicamenti.
Così secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto dei medicamenti che comprendono il composto dell’invenzione.
Questi medicamenti trovano il loro impiego in terapia, in particolare nel trattamento e nella prevenzione delle malattie infettive.
Questi medicamenti trovano anche impiego nel trattamento e/o nella prevenzione dei disordini intestinali, per esempio nel trattamento e nella prevenzione del dismicrobismo intestinale e la disvitaminosi endogena, come pure nel trattamento coadiuvante nel recupero della flora microbica intestinale alterata a seguito di una terapia antibiotica o di una chemioterapia.
Essi trovano anche applicazione nella prevenzione e nel trattamento della diarrea, in particolare nelle diarree acute e nelle diarree associate all’assunzione di medicamenti.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione concerne delle composizioni farmaceutiche comprendenti, come principio attivo, il composto secondo l’invenzione, per il trattamento e/o per la prevenzione delle patologie sopra descritte. Queste composizioni farmaceutiche contengono una dose efficace del composto secondo l’invenzione, come pure almeno un eccipienti farmaceuticamente efficace.
I detti eccipienti sono scelti a seconda della forma farmaceutica e la via di somministrazione desiderata, tra gli eccipienti abituali che sono noti all’esperto del ramo.
Nelle composizioni farmaceutiche della presente invenzione per la somministrazione orale, sublinguale, sottocutanea, intramuscolare, endovenosa, topica, locale, intratracheale, endonasale, transdermica o rettale, il composto può essere somministrato in unità di dosaggio, in miscela con degli eccipienti farmaceutici classici, agli animali e agli esseri umani per la prevenzione o per il trattamento dei disturbi o delle malattie di cui sopra.
Le unità di dosaggio appropriate comprendono le forme per via orale come le compresse, le capsule molli o dure, le polveri, i granuli e le soluzioni o sospensioni orali, le forme di somministrazione sublinguale, buccale, intratracheale, intraoculare, endonasale, per inalazione, le forme di somministrazione topica, transdermica, sottocutanea, intramuscolare o endovenosa, le forme di somministrazione rettale e gli impianti. Per l’applicazione topica, si possono utilizzare i composti secondo l’invenzione in creme, gel, pomate o lozioni.
La composizione dell’invenzione può essere somministrata secondo la via più appropriata e una dose che dipende in particolare dalla natura dell’infezione, dal tipo di ospite in questione, dalla sua età, dal peso, dallo stato generale, dai trattamenti concomitanti che riceve, come pure dalla sua risposta al trattamento e al razionale terapeutico.
In generale, per una somministrazione all’uomo, la composizione è somministrata per via orale sotto forma di una composizione farmaceutica delle spore. Per esempio la dose può essere di circa 10 miliardi di spore al giorno, per esempio da 1 a 8 miliardi di spore al giorno, in particolare 2, 4 o 6 miliardi di spore al giorno, in una sola somministrazione o in più somministrazioni.
Possono esserci dei casi particolari in cui dei dosaggi più elevati o più bassi sono appropriati; tali dosaggi non escono dall’ambito dell’invenzione.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione concerne l’uso del composto dell’invenzione, per la preparazione di un medicamento destinato a prevenire e/o a trattare le patologie sopra descritte.
L’invenzione secondo un altro dei suoi aspetti concerne anche un metodo di trattamento delle patologie sopra indicate che comprende la somministrazione, a un paziente, di una dose efficace del composto dell’invenzione.
Secondo un altro dei suoi aspetti, il composto dell’invenzione può essere anche utilizzato come prodotto di addizione nelle composizioni cosmetiche o alimentari.
Secondo questa utilizzazione, il composto dell’ invenzione è aggiunto in una quantità sufficiente per inibire la crescita della crescita batterica nelle composizioni cosmetiche o alimentari e permetterne così la conservazione.
Gli esempi che seguono illustrano l’invenzione senza tuttavia limitarla. 1. Produzione della molecola
Produzione del sumatante.
Un ceppo O/C di Bacillus clausii (proveniente dalla composizione farmaceutica commercializzata con il marchio Enterogermina®) è messo in coltura per tre giorni su un mezzo di Mueller Hinton a 37°C e 180 giri al minuto fino all’ ottenimento della sporulazione del ceppo.
La coltura è quindi centrifugata poi il sumatante è filtrato con una membrana a 0,45 pm per eliminare ogni residuo di cellule.
Estrazione
L’estrazione del composto ad attività antimicrobica è effettuato in fase solida su cartuccia Sep Pak plus Ci8(Waters). Per fare ciò, 150 mi di sumatante ottenuto nella fase precedente sono depositate su una cartuccia e l’eluizione è realizzata con del metanolo al 100%, dopo tre lavaggi successivi con NH4HC0325 mM, pH 8; NH4HCO325 mM, pH 8 metanolo al 10% e NH4HCO325 mM, pH 8 metanolo al 50%.
L’insieme delle frazioni attive eluite con il metanolo al 100%, sono riunite e concentrate per evaporazione sotto vuoto fino all’ottenimento di un fattore di riduzione volumetrico di 10.
II concentrato è stoccato a -20°C. Non è stata osservata nessuna perdita di attività dopo 6 mesi di conservazione in tali condizioni.
Purificazione
La purificazione fino all’omogeneizzazione della sostanza estratta in fase solida è realizzata per HPLC.
Una prima fase semi-preparativa è realizzata su colonna C4Synchropack 100 x 8 mm. Le frazioni di eluato che presentano l’attività antimicrobica sono raccolte e riunite. La purezza del composto ottenuta alla fine di questa fase è superiore all’80% e la resa di estrazione - purificazione è circa 6 mg-Γ<1>di sumatante.
Una seconda fase analitica è realizzata su colonna Ci Bischoff 150 x 4,6 min. Le frazioni di eluato che presentano un’attività antimicrobica sono raccolte e riunite. La purezza del composto raggiunta alla fine di questa fase è superiore al 90%.
2. Studio Strutturale
Determinazione della massa molecolare
Il composto purificato ottenuto nell’esempio 1 qui sopra possiede una massa molecolare di 2107,5 Da determinata per spettrometria di massa col metodo MALD TOF e confermata per spettrometria di massa col metodo ESI.
Spettro di assorbimento UV/visibile
II composto dell’invenzione assorbe nell’ultravioletto e presenta in particolare un picco a 265 nm compatibile con la presenza di amminoacidi aromatici nella sua struttura.
Composizione degli amminoacidi
Dopo idrolisi totale con HC1 5,7 N, sotto vuoto, per 16 ore a 115°C la presenza di vari amminoacidi è messa in evidenza nella struttura del composto purificato.
Ricerca delle differenti forme enantiomeriche degli amminoacidi
Le forme enantiomeriche L e D degli amminoacidi che compongono la sequenza del composto ad attività antimicrobica sono state ricercate dopo l’idrolisi acida totale, per derivazione con Na-(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-L-alaninaide (reattivo di Marfey) secondo il metodo descritto da Szokan (J. Chromato., 1988, 444, pp. 115-122). I risultati indicano che tutti i residui degli amminoacidi che costituiscono la molecola antibiotica sono degli enantiomeri in forma L.
Effetti dei trattamenti enzimatico o chimico sulla struttura
La perdita totale di attività conseguente a un trattamento enzimatico con pronasi conferma la natura peptidica del nuovo composto antibiotico.
I ponti disolfuro sono esclusi poiché un dosaggio specifico della cisterna si è rivelato negativo. Al contrario la presenza dei ponti lantionina, sensibili al trattamento riduttore in mezzo alcalino (Meyer, Anal. Biochem, 223, pp 185-190, 1994) può giustificare la perdita di attività osservata in presenza del β mercaptoetanolo conseguente a una modifica strutturale messa in evidenza con la HPLC a fase inversa. La caduta, solamente parziale, di attività misurata all’uscita del trattamento meno drastico come una incubazione a pH neutro in presenza di DTT 25 mM può essere la conseguenza della riduzione specifica dei dideidroamminoacidi presenti nella struttura. Queste osservazioni permettono di formulare l’ipotesi secondo la quale la molecola antimicrobica prodotta dal Bacillus clausii è un lantibiotico. Questa famiglia di antibiotici si caratterizza normalmente per la presenza nella loro struttura di ponti lantionina e di amminoacidi modificati.
Sequenziamento della molecola nativa
II sequenziamento è realizzato con l’aiuto di un sequenziatore automatico Procise 492 A (Applied Biosystem) per degradazione ricorrente di Edman a partire dalla estremità N-terminale. I PTH amminoacidi formati sono analizzati per HPLC a fase inversa su colonna microbore CI 8. Il sequenziamento della molecola antibiotica, allo stato nativo, è bloccato all’uscita del primo passo di degradazione chimica di Edman. Il solo residuo identificato corrisponde a una fenilalanina che occupa la posizione N-terminale.
Sequenziamento della molecola dopo modifica chimica
Le informazioni relative alla sequenza potenziale della nuova sostanza antimicrobica prodotta dal Bacillus clausii, dedotte dalla sequenza del gene codificante, combinate con quelle risultanti dall’analisi della composizione in amminoacidi e dal comportamento nel mezzo riduttore rivelano la presenza di modifiche post-traduzione caratteristiche dei lantibiotici.
La presenza di dideidro-amminoacidi e dei ponti lantionina nella struttura sta aH’origine del blocco del sequenziamento della molecola allo stato nativo. I deidroamminoacidi come il Dha (dideidroalanina) e Dhb (dideidroamminobutirrato) si deamminano durante la degradazione chimica di Edman e bloccano così l’avanzamento del sequenziamento. Questi stessi residui Dha e Dhb non sono rilevabili con l’analisi della composizione in amminoacidi dopo idrolisi acida totale per le stesse ragioni, la loro deamminazione rende inefficace la reazione di derivazione con il 6-amminochinolil-N-idrossisuccinimidil carbammato o con AQC (Waters), specifica delle funzioni amminiche primarie.
Al fine di superare i problemi legati alla presenza di aminoacidi modificati e dei ponti lantionina, una doppia reazione chimica è stata applicata al peptide antibiotico prima del suo sequenziamento. Il metodo messo in opera è adattato dai lavori di Smith, Eur. J. Biochem. 2000, 267, p. 6810-6816. A questo scopo, 50 nmoli del peptide purificato sono ripresi con 10 μΐ di H20 4 mg di NaBH4. Sono aggiunti 190 μΐ di una soluzione denaturante e antiossidante (570 mg di cloruro di guanidina 0,1 mi di N-etilmorfolina, regolata a pH 8,5 e a un volume finale di 1 mi con H20) poi il mezzo di reazione in corrente di N2è incubato per 72 ore a 37°C.
Questo trattamento riduce in modo specifico i dideidro-amminoacidi senza toccare i ponti lantionina.
Il peptide così ridotto è recuperato su una colonna Prosorb (Perkin Elmer) equipaggiata con una membrana PVDF. Dopo lavaggio della membrana con 200 μΐ di TFA allo 0,1%, il peptide assorbito su questo supporto subisce una seconda riduzione in presenza di etanetiolo (aggiunta di 20 μΐ di una soluzione costituita da 280 μΐ di metanolo 200 μΐ di H20 65 mi di NaOH 60 μΐ di etanetiolo) per un’ora a 50°C.
Struttura covalente della molecola antibiotica prodotta con Bacillus clausii
La struttura covalente è in accordo con l’insieme dei dati acquisiti. La massa molecolare calcolata sulla base delle masse dei residui mono-isotopici è di 2107,5 Da. La molecola antimicrobica secreta dal Bacillus clausii è un lantibiotico che possiede 4 ponti lantionina e metilantionina come pure 3 residui dideidroamminoacidi nella sua struttura. La struttura è in accordo con la massa trovata, 2107,5 Da, con i risultati ottenuti dopo le modifiche chimiche effettuate sulla molecola, e con la sequenza in amminoacidi dedotta a partire dal gene che codifica per la sua produzione ritrovato nel B. clausii. La struttura è stata confermata con analisi NMR.
I tre altri ceppi (N/R, SIN, T) di Bacillus clausii presenti nella composizione farmaceutica Enterogermina® hanno presentato lo stesso profilo di attività antimicrobica del ceppo O/C.

Claims (12)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composto peptidico che presenta attività antimicrobica, suscettibile di essere ottenuto da una coltura di Bacìllus clausii in un mezzo appropriato fino alla sporulazione, raccolta del sumatante dalla coltura dopo centrifugazione e filtrazione, ed estrazione della frazione ad attività antimicrobica.
  2. 2. Composto secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che possiede una massa molecolare di 2107,5 Da.
  3. 3. Composto secondo le rivendicazioni 1 o 2, caratterizzato dal fatto che è un lantibiotico e presenta dei ponti lantionina e degli amminoacidi modificati.
  4. 4. Composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzato dal fatto che comprende la sequenza di amminoacidi seguente: Phe - Dhb - Ala - Val - Dha - Phe - Ala - Abu - Pro - Gly - Ala - Gly - Giu - Dhb -Gly - Ala - Phe - Asn - Ala - Phe - Ala in cui Dhb rappresenta un dideidroamminobutirrato; Dha rappresenta una dideidroalanina; Abu rappresenta un amminobutirrato
  5. 5. Composto secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che possiede due ponti lantionina, uno tra l’alanina in posizione 3 e l’alanina in posizione 7, e l’altro tra l’alanina in posizione 16 e l’alanina in posizione 21; un ponte metil-lantionina tra il residuo amminobutirrato in posizione 8 e l’alanina in posizione 11 e un quarto ponte tra il gruppo ammino-vinil-cisteinico C-terminale e il residuo dell’alanina in posizione 19.
  6. 6. Composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, caratterizzato dal fatto che i residui degli amminoacidi sono degli enantiomeri in forma L.
  7. 7. Procedimento per la preparazione di un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, che comprende le fasi di coltura dei ceppi di Bacillus clausii in un mezzo appropriato fino alla sporulazione dei ceppi; raccolta del sumatante dalla coltura dopo centrifugazione e filtrazione; estrazione in fase solida della frazione ottenuta ed eluizione; eventualmente purificazione della frazione ottenuta per cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC).
  8. 8. Medicamento caratterizzato dal fatto che comprende un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6.
  9. 9. Composizione farmaceutica, caratterizzata dal fatto che comprende un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, e almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
  10. 10. Uso di un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 per la preparazione di un medicamento destinato al trattamento e/o alla prevenzione dei disordini intestinali, delle malattie infettive.
  11. 11. Uso di un composto secondo la rivendicazione 10 per il trattamento e/o la prevenzione del dismicrobismo intestinale e la disvitaminosi endogena, per il recupero della flora microbica intestinale alterata a seguito di una terapia antibiotica o di una chemioterapia, per il trattamento e la prevenzione delle diarree, in particolare la diarrea acuta o la diarrea associata alla assunzione di medicamenti.
  12. 12. Uso di un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 come prodotto di addizione in composizioni cosmetiche o alimentari.
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PE2007000409A PE20080351A1 (es) 2006-04-06 2007-04-04 Compuesto peptidico antimicrobiano a partir de bacillus clausii su preparacion y composicion farmaceutica
CL2007000955A CL2007000955A1 (es) 2006-04-06 2007-04-04 Compuesto peptidico lantibiotico con actividad antimicrobiana obtenido de un cultivo de bacillus clausii; procedimiento de preparacion; composicion famrceutica que lo comprende; y uso del compuesto peptidico para tratar trastornos intestinales producto de enfermedades infecciosas.
JO2007115A JO2739B1 (en) 2006-04-06 2007-04-04 Amino acid compounds with bioactivity and its preparations and applications
ARP070101421A AR060350A1 (es) 2006-04-06 2007-04-04 Compuesto peptidico de actividad biologica, su preparacion y sus aplicaciones
TW096112195A TWI380994B (zh) 2006-04-06 2007-04-04 具有生物活性之肽化合物、其製備及其應用
MEP-2008-319A ME00194B (me) 2006-04-06 2007-04-06 Peptidno jedinjenje biološke aktivnosti, njegovo dobijanje i njegova primjena
PCT/IB2007/002003 WO2007113691A2 (en) 2006-04-06 2007-04-06 Peptide compound with biological activity, its preparation and its application
NZ571477A NZ571477A (en) 2006-04-06 2007-04-06 Peptide compound with antimicrobial activity which is obtained from Bacillus clausii and is a lantibiotic and has lanthionine bridges and modified amino acids
CA2646892A CA2646892C (en) 2006-04-06 2007-04-06 Antimicrobial peptide compound, its preparation and its applications
HK09106147.0A HK1128480B (en) 2006-04-06 2007-04-06 Peptide compound with biological activity, its preparation and its application
EA200870414A EA015943B1 (ru) 2006-04-06 2007-04-06 Пептидное соединение с антимикробной активностью, полученное из bacillus clausii, и его применение
UAA200812913A UA92793C2 (ru) 2006-04-06 2007-04-06 Пептидное соединение с биологической активностью, способ его получения и его применения
MEP-319/08A MEP31908A (en) 2006-04-06 2007-04-06 Peptide compound with biological activity, its preparation and its application
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CN2007800121521A CN101415725B (zh) 2006-04-06 2007-04-06 具有生物活性的肽化合物、其制备及其应用
JP2009503687A JP5196407B2 (ja) 2006-04-06 2007-04-06 生物学的活性を有するペプチド化合物、その調製及びその適用
AT07735006T ATE535540T1 (de) 2006-04-06 2007-04-06 Peptidverbindung mit biologischer wirkung, deren herstellung und deren anwendung
GEAP200710966A GEP20115282B (en) 2006-04-06 2007-04-06 Peptide compound with biological activity, its preparation and its application
KR1020087024170A KR101556414B1 (ko) 2006-04-06 2007-04-06 생물학적 활성을 갖는 펩티드 화합물, 이의 제법 및 이의 용도
MX2008012730A MX2008012730A (es) 2006-04-06 2007-04-06 Compuesto peptidico con actividad biologica, su preparación y sus aplicaciones.
BRPI0710846-0A BRPI0710846A2 (pt) 2006-04-06 2007-04-06 composto de peptìdeo com atividade biológica, sua preparação e suas aplicações
AU2007232210A AU2007232210B2 (en) 2006-04-06 2007-04-06 Peptide compound with biological activity, its preparation and its application
CR10302A CR10302A (es) 2006-04-06 2008-09-19 Compuesto peptidico de actividad biologica, su preparacion y sus aplicaciones
IL194325A IL194325A (en) 2006-04-06 2008-09-24 Antimicrobial peptide compound, preparation thereof, pharmaceutical compositions comprising the same and use thereof in the preparation of a medicament, cosmetic or foodstuff
TNP2008000377A TNSN08377A1 (en) 2006-04-06 2008-09-25 Peptide compound with biological activity, its preparation and its application
ZA2008/08328A ZA200808328B (en) 2006-04-06 2008-09-30 Peptide compound with biological activity,its preparation and its application
EC2008008785A ECSP088785A (es) 2006-04-06 2008-10-01 Compuesto peptidico de actividad biologica, su preparacion y sus aplicaciones
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NI200800265A NI200800265A (es) 2006-04-06 2008-10-03 Compuesto peptidico de actividad biológica, su preparación y sus aplicaciones.
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US12/245,841 US8691773B2 (en) 2006-04-06 2008-10-06 Peptide compound with biological activity, its preparation and its applications
MA31358A MA30465B1 (fr) 2006-04-06 2008-11-04 Compose peptidique dote d'une activite biologique, sa preparation et ses applications.
NO20084671A NO341813B1 (no) 2006-04-06 2008-11-05 Peptidforbindelse med biologisk aktivitet, dets fremstilling, farmasøytiske sammensetninger inneholdende slike og deres anvendelser
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LU92906B1 (en) 2015-12-14 2017-06-20 Luxembourg Inst Science & Tech List Method for enzymatically modifying the tri-dimensional structure of a protein
CN106366168B (zh) * 2016-08-26 2020-09-15 上海交通大学 羊毛硫肽类抗菌肽及其脱氢衍生物的制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9609281A (pt) * 1995-06-23 1999-06-15 Ambi Inc Método para o controle de bactérias gram-positivas resistentes a antibióticos e tratamento de infecções
US5985823A (en) * 1997-06-09 1999-11-16 Ambi Inc. Method for the treatment of diarrheal disease and for eliminating particular bacterial populations from the colon
US5932469A (en) * 1997-06-10 1999-08-03 University Of Florida Antimicrobial polypeptide, nucleic acid, and methods of use
ITMI20021800A1 (it) * 2002-08-07 2004-02-08 Proge Farm Srl Composizione farmaceutica e/o nutraceutica comprendente una associazione di microorganismi probiotici non sporigeni e spore di bacillus subtilis e/o clausii.
CA2404356A1 (en) * 2002-09-18 2004-03-18 Canadian Inovatech Inc. Gram-positive antibacterial composition and method for use
US7354888B2 (en) * 2004-11-10 2008-04-08 Danisco A/S Antibacterial composition and methods thereof comprising a ternary builder mixture

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