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ITMO970182A1 - Bioreattore destinato ad ospitare cellule animali (da utilizzarsi come organo bioartificiale). - Google Patents

Bioreattore destinato ad ospitare cellule animali (da utilizzarsi come organo bioartificiale). Download PDF

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Publication number
ITMO970182A1
ITMO970182A1 IT97MO000182A ITMO970182A ITMO970182A1 IT MO970182 A1 ITMO970182 A1 IT MO970182A1 IT 97MO000182 A IT97MO000182 A IT 97MO000182A IT MO970182 A ITMO970182 A IT MO970182A IT MO970182 A1 ITMO970182 A1 IT MO970182A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
bioreactor
cells
dimensional
dimensional structure
macroporous
Prior art date
Application number
IT97MO000182A
Other languages
English (en)
Inventor
Giuliana Gavioli
Original Assignee
Braun Carex Spa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Braun Carex Spa filed Critical Braun Carex Spa
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Publication of ITMO970182A1 publication Critical patent/ITMO970182A1/it
Application granted granted Critical
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Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/10Hollow fibers or tubes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/16Hollow fibers

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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

BACKGROUND
L'utilizzo di organi bioartificiali per applicazioni cliniche sull'uomo è conosciuto. Negli ultimi anni sono stati sviluppati e utilizzati sia sperimentalmente che in clinica modelli di bioreattori che si basano sulla capacità di alloggiare cellule di mammifero che esprimono funzioni differenziate.
Uno degli organi bioartificiali più sperimentati è il fegato bioartificiale che, con soluzioni bioingegneristiche diverse, ha come obiettivo fondamentale quello di ottenere una coltura cellulare di epatociti con metabolismo e sintesi proteica efficaci e costanti. Questo obiettivo deve essere soddisfatto prevedendo una separazione fisica, costituita da 1 semipermeabile tra la coltura cellulare ed il plasma del paziente da trattare, che permette scambi di soluti e di gas ma impedisce il passaggio delle cellule al paziente al fine di evitare fenomeni di immunizzazione.
I problemi tecnici legati al raggiungimento dell'obiettivo sopra descritto sono:
) . Una massa cellulare tale da sostituire la funzione epatica, La massa cellulare è strettamente legata allo spazio utile destinato alla coltura cellulare nel bioreattore ed alle modalità di supporto delle cellule stesse. Nel caso in cui si renda necessario un carrier di supporto esso occupa circa i due terzi del volume disponibile alla massa cellulare.
2. Uno scambio efficace tra la massa cellulare ed il paziente; questo obiettivo è strettamente legato al tipo di membrana utilizzata come superficie di scambio tra plasma e cellule ed al conseguente flusso necessario affinché avvengano gli scambi tra plasma e cellule.
3 . Preparazione del bioreattore per l'uso clinico sul paziente in tempi molto limitati per poter soddisfare all'esigenza primaria dell* intervento rapido nelle fasi acute. ;;TECNICHE PRECEDENTI ;In campo clinico i primi bioreattori utilizzati hanno sfruttato la tecnica della diffusione attraverso le membrane di dialisi come modalità di scambio di soluti, utilizzando come bioreattori in un primo momento veri e propri dializzatori a fibre piatte1 e successivamente filtri contenenti fibre cave2·3 con la presenza o meno della ossigenazione de! plasma destinato alla coltura di epatociti. ;Successivamente viene sfruttato il principio della perfusione in bioreattori basati su fibre cave4 ottenendo una distribuzione più omogenea e uno scambio più completo dei soluti associato ad una ossigenazione diretta degli epatociti all'interno del bioreattore. ;Molti studi di bioreattori sperimentali utilizzati in vitro sono stati recentemente pubblicati: essi si basano su concetti diversi dai precedenti come il fegato artificiale costituito da monostrati di epatociti polari colture di epatociti alloggiati all'interno delle fibre cave7, o alloggiamenti per colture cellulari costituiti da resine porose* o tessutino n tessuti .
DESCRIZIONE
Tutti i bioreattori basati su fibre cave attualmente utilizzati nel trattamento dell'epatite fulminante acuta come supporti per colture cellulari hanno una limitata capacità di scambio(mass transfer). Il sangue o il plasma del paziente raggiunge lo spazio extrafibre, riempito di epatociti, passando attraverso le fibre stesse solo con la applicazione di una elevata pressione che danneggia la coltura cellulare. Inoltre, a causa dell'elevata resistenza assiale del flusso, la capacità di scambio decresce proporzionalmente nel bioreattore ed è fortemente ridotta nella parte distale di esso: questo rende la porzione distale del bioreattore inutilizzata. Inoltre i bioreattori a fibre cave possono accogliere una quantità relativamente piccola di cellule mentre è riconosciuto che per compensare la funzione epatica compromessa occorrono almeno 200-300 gr di epatociti. Noi abbiamo sviluppato un bioreattore costituito da una membrana semipermeabile di porosità nominale compresa tra 0,1 e 0,2 5 μ collocata all' interno ed all'esterno di una struttura di supporto cellulare tridimensionale costituita da monofilamenti di materiale polimerico non saldati ed al 100% biocompatibili che permettono l'adesione cellulare anche senza coating. Il plasma del paziente entra nella parte centrale del modulo, attraversa la membrana semipermeabile, diffonde attraverso uno spazio occupato da una struttura tridimensionale riempita con gli epatociti, attraversa di nuovo la membrana s emlpermeabile e ritorna al paziente. Una tale configurazione permette un flusso radiale che consente uno stretto contatto tra plasma e cellule senza che vi sia la necessità di un sistenta di perfusione ad alti flussi ed equilibra la concentrazione dei componenti del plasma, incluso l’ossigeno, all'interno del modulo. La membrana semipermeabile evita la diffusione delle cellule nel sistema ed al paziente. In esperimenti in vitro sono stati inoculati nella struttura tridimensionale del bioreattore gli epatociti. Essi sono stati perfusi ad una velocità di 20 ml/min. con Dulbecco Medium serum-free a 37°, ossigenato al 20%, supplementato con 100p.g/l di insulina, 3 4 , 83 μ g/l di glucagone, 6 7 μ. g / 1 di dexametasone e oligoelementi, in cui una soluzione di cloruro di ammonio a concentrazione 1 m M è stato aggiunto. La rimozione di ammonio è stata misurata col metodo dell'indofenolo e la sintesi dell'urea col metodo dicetilmonoxime dopo 12 ore di studio sperimentale. Alla fine dell'esperimento il modulo è stato aperto e gli epatociti attaccati alla matrice tridimensionale sono stati esaminati con la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e a scansione (SEM). I risultati hanno evidenziato un aumento della produzione di urea (mg/1 x 10<6>ce!lule). 0,133 mg (84%) a 4 ore, 0,143 mg (98%) a 8 ore e 0,152 mg (109%) a 12 ore. L’ammonio è stato rimosso ad un flusso costante (mg/I x I0<6>cellule) di 0,045 mg (4%) a 4 ore, 0,049 mg (12%) a 8 ore, e 0,052 mg (19%) a 12 ore. Con le tecniche TEM e SEM, la maggior parte delle cellule si rivela attaccata alla struttura tridimensionale mostrando le tipiche caratteristiche degli epatociti funzionanti come la presenza del reticolo endoplasmatico, granuli di glicogeno, mitodondri ben differenziati e formazione di canalicoli biliari tra le cellule epatiche adiacenti. Il nostro studio ha dimostrato la fattibilità di un bioreattore a flusso radiale e la superiorità di tale configurazione rispetto ai bioreattori basati su fibre cave.

Claims (8)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un bioreattore caratterizzato da una struttura tridimensionale macro porosa (Fig.l: 1) che costituisce il supporto degli epatociti, 100% biocompatibile, fabbricato a partire da un materiale polimerico come ad esempio poliestere, polisulfone, poliolefine.
  2. 2. Un bioreattore caratterizzato da una struttura tridimensionale macroporosa (Fig.l: 1) che occupa dall'8 al 15% del volume destinato alla massa cellulare.
  3. 3 . U n bioreattore caratterizzato da una struttura tridimensionale macroporosa (Fig.l : 1) costituita da una struttura tessuta superiore ed inferiore interconnessa da fi lamenti non tessuti.
  4. 4. Un bioreattore caratterizzato da una struttura tridimensionale macroporosa (Fig.l: 1) avente la caratteristica di una elevatissima porosità (>250p)che permette colture cellulari ad alta densità di tipo tridimensionale e non monostrato.
  5. 5. Un bioreattore caratterizzato da una struttura tridimensionale macroporosa (Fig. l: 1) dove le cellule trovano alloggiamento aderendo direttamente alla superficie della struttura stessa anche senza coating con matrici biologiche.
  6. 6 . Bioreattore caratterizzato dalla presenza di una membrana semipermeabile (Fig.l: 2) che delimita sia internamente che esternamente la struttura tridimensionale. Tale membrana semipermeabile ha una porosità compresa tra 0,1 e 0,3 μ, permette così il passaggio attraverso la membrana dei soluti ed impedisce il passaggio delle cellule al paziente.
  7. 7 . B i o r e at t o r e caratterizzato da configurazione tale da permettere un flusso radiale (Fig. 1: 3) che permette l'equìlibrazione dei componenti plasmatici, incluso l'ossìgeno, senza l’impiego di flussi elevati che danneggiano le cellule in coltura.
  8. 8 . Bioreattore caratterizzato da una struttura tridimensionale atta ad alloggiare le cellule in coltura il cui riempimento viene attuato attraverso cateteri (Fig. 1 : 4) inseriti direttamente all'interno della struttura tridimensionale stessa.
IT97MO000182A 1997-10-16 1997-10-16 Bioreattore destinato ad ospitare cellule animali (da utilizzarsi come organo bioartificiale). IT1295621B1 (it)

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EP98119487A EP0909811A3 (en) 1997-10-16 1998-10-15 Bioreactor for culturing animal and/or human cells, particularly hepatocytes

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Publications (3)

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ITMO970182A0 ITMO970182A0 (it) 1997-10-16
ITMO970182A1 true ITMO970182A1 (it) 1999-04-16
IT1295621B1 IT1295621B1 (it) 1999-05-14

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