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ITFI960155A1 - Proteina capace di inibire l'attivita' ribosomiale,sua preparazione ed uso come immunoconiugato chimico o ricombinante e sequenza di cdna - Google Patents

Proteina capace di inibire l'attivita' ribosomiale,sua preparazione ed uso come immunoconiugato chimico o ricombinante e sequenza di cdna Download PDF

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ITFI960155A1
ITFI960155A1 IT96FI000155A ITFI960155A ITFI960155A1 IT FI960155 A1 ITFI960155 A1 IT FI960155A1 IT 96FI000155 A IT96FI000155 A IT 96FI000155A IT FI960155 A ITFI960155 A IT FI960155A IT FI960155 A1 ITFI960155 A1 IT FI960155A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
protein
sequence
clavin
cdna
preparation
Prior art date
Application number
IT96FI000155A
Other languages
English (en)
Inventor
Antonio Mele
Santis Rita De
Dino Parente
Maria Ines Colnaghi
Original Assignee
Ministero Uni Ricerca Scient E
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to PCT/EP1997/003359 priority patent/WO1997049726A1/en
Priority to AU34375/97A priority patent/AU3437597A/en
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Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo: Proteina capace di inibire l'attività ribosomiale, sua preparazione ed uso come immunoconiugato chimico o ricombinante e sequenza di cDNA esprimente detta proteina.
Campo dell'invenzione
La presente invenzione si riferisce ad una nuova proteina capace di inibire la funzionalità dei ribosomi quando veicolata all'interno della cellula da opportuno vettore e quindi utilizzabile in terapia antitumorale e/o antivirale.
Stato dell'arte
E' noto che proteine estratte da funghi filamentosi del genere Asperqillus come ad esempio la alfasarcina, restrictocina e mitogillina, sono capaci di inibire la sintesi proteica inattivando i ribosomi, eucariotici; è nota pure la sequenza nucleotidica del DNA genomico che esprime dette proteine , L'attività antivirale delle RIP è correlata alla maggiore permeabilità di membrana alle RIP stesse delle cellule infettate da virus con conseguente danno ai loro ribosomi e conseguente morte della cellula infettata e quindi . arresto della replicazione virale.
Recentemente è stato riportato che molte RIP inibiscono la replicazione di HIV ed un preparato della RIP tricosantina (una proteina estratta da radici di Trichosantes kiriloowii) è stato utilizzato in studi clinici di fase I/II [Byers,VS. et al . : A phase I/II study of trichosantin treatment of HIV disease. AIDS: 4:1189-1196 (1990)] Allo scopo di ottenere molecole selettivamente citotossiche molte delle RIP conosciute sono state legate a vettori proteici e non-proteici capaci di trasportarle su specifiche popolazioni cellulari bersaglio. La scelta più frequente per preparare composti dotati di azione citotossica specifica è quella di utilizzare anticorpi monoclonali quali vettori delle proteine (immunotossine ). Tuttavia anche ormoni, fattori di crescita e lectine sono stati utilizzati come vettori per la terapia oncologica.
Fino ad oggi la proteina più utilizzata per il suo effetto tossico nella costruzione di immunotossine è stata la catena A della ricina, ma più recentemente molte RIP di tipo 1 (gelonina, PAP , saporina, momordina, briodìna, barley RIP) sono state sperimentate nella terapia di malattie quali tumori, malattie autoimmunitarie rigetto di trapianti, parassitosi ed altre.
In considerazione del fatto che in molti casi le cellule tumorali sviluppano resistenza all'azione delle tossine e che tutte le tossine fino ad oggi utilizzate in terapia inducono una risposta immunologica nei pazienti trattati, la identificazione e purificazione··all'omogeneità di nuove RIP è importante in tutte le applicazioni terapeutiche ed in particolare nella generazione di nuove immunotossine.
Breve descrizione delle Figure
Fig. 1 - Sequenza del cDNA completo (cioè comprendente le sequenze 3' e 5' non codificanti) della clavina, in cui:
1-279 = 5'UTR (zona 5' non tradotta);
280-360 = sequenza codificante per ipotetica sequenza di secrezione;
361-813 = sequenza codificante per la proteina matura (clavina);
814-1011 - 3'UTR (zona 3' non tradotta) polyA.
Fig. 2 - Sequenza del cDNA codificante per la proteina matura e relativa sequenza aminoacidica Fig. 3 - Sequenza proteica della clavina
Fig. 4 - Sequenza del DNA codificante per 1'immunotossina in pRSET, in cui :
1-108 = Sequenza del pRSET contenente le 6 Istidine e il sito di taglio per 1 'enterochinasi;
109-861 = sequenza codificante per ScFv di Mgr6 (109-462 = sequenza variabile della catena pesante Bankit I.D. (Gene Bank) 54241 N° di accesso U 61494 (463-507 = Sequenza linker)
(508-861 = Sequenza .variabile della catena leggera Bankit I.D. (Gene bank) 54263 N° di accesso U 61495 862-1311 = Sequenza codificante per la clavina.
Fig. 5 - Sequenza proteica dell'immunotossina Mgr6-clavina prodotta in pRSET
Descrizione dettagliata dell'invenzione
E' pertanto oggetto della presente invenzione una nuova proteina RIP che inibisce la sintesi proteica inattivando i ribosomi.
E' un ulteriore oggetto della presente invenzione la sequenza di DNA responsabile dell'espressione della proteina stessa.
Sono inoltre oggetto della presente invenzione anche i coniugati della proteina suddetta con anticorpi monoclonali, ormoni, liposomi, fattori di crescita, citochine, transferrina e peptidi costituiti da frammenti di dette proteine, ottenibili mediante coniugazione chimica o mediante tecniche di ricombinazione -genica ove applicabile.
La proteina RIP secondo l'invenzione verrà qui di seguito indicata con il nome di clavina. La proteina purificata mostra un livello di purezza > 95 % come dimostrato "per- analisi SDS/PAGE, sequenziamento N-terminale e HPCL in fase inversa; la proteina ha un peso molecolare di circa 17kDa. Il processo di purificazione della proteina secondo la presente invenzione sarà più e meglio compreso alla luce degli esempi seguenti.
Isolamento e sequenziamento del· cDNA
Da Asperqillus clavatus IFO 8605 (fornito dall 'Institute of Fermentation di Osaka) si è estratto l'RNA totale e quindi si è purificato il mRNA utilizzando rispettivamente i kit di purificazione di RNA totale e mRNA (Clontech). Sono stati sintetizzati i due seguenti primers:
3 ' alfa-primer: 5'-ACGTAAGCTTCTAATGAGAGCAGAGCTT-3 ' 5' alfa-primer: 5'-ACGTCTGCAGTGACCTGGACCTGCTTGAACG-3' I primers sono stati disegnati sulla base della sequenza nota di alfa-Sarcina assumendo una elevata omologia di sequenza aminoacidica con la tossina di Asperqillus clavatus.
La sintesi del cDNA con 5 ug di mRNA e il 3' alfaprimer è stata condotta usando un kit di sintesi di cDNA (BRL). Una parte del prodotto ottenuto è stato aggiunto ad una miscela di reazione per PCR contenente Taq polimerasi (USB) ed entrambi i primers suddetti operando l'amplificazione del cDNA per un totale di 30 cicli utilizzando un ciclizzatore termico per DNA (Perkin-Elmer).
Ogni ciclo consiste di 1 minuto di denaturazione a 94°C, 1 minuto di annealing a 42°C e 2 minuti di estensione a 72°C, nel ciclo finale l'estensione è di 8 minuti sempre a 72°C.
Questo amplificato corrisponde al cDNA della clavina ma contiene le sequenze imposte dai primers 3'alfa e 5 'alfa. Per l'isolamento del cDNA nativo completo della clavina abbiamo utilizzato il metodo della RACE.
Sulla estremità 3' la RACE è stata eseguita secondo Frohman usando il seguente primer:
5'- GACTCGAGTCGACATCGA(T) 17-3 ' ed il primer di adattamento : 5'-GACTCGAGTCGACATCG—3'. Il primer: 5'-ACGTGGATCCTCTACAACCAGAAC-3 ', che si riferisce ai codoni per gli amminoacidi 23-29 della proteina matura e recanti un sito di restrizione BamHI, è stato utilizzato come primer gene-specifico.
Sulla estremità 5' la RACE è stata eseguita con il 5'-AmpliFINDER RACE Kit (Clontech), ed i primers: 5'-TGAACCAGTGAGGATAG-3 '
5'-ACGTCTGCAGGCGCTTGTTCTCATA-3 '
che si riferiscono rispettivamente ai codoni per gli aminoacidi 47 - 53 e 18 - 23 della proteina matura sono stati usati come primers gene-specifici; il secondo di tali primers contiene.anche un sito di restrizione Pstl.
I vari prodotti della PCR sono stati purificati, digeriti e subclonati in pUC19. Le sequenze sono state analizzate utilizzando il software PC GENE (Intelligenetics) .
La sequenza completa del cDNA così ottenuta è riportata in Fig. 1. Tale sequenza contiene un ORF che codifica per una catena polipeptidica di 177 amminoacidi. I primi 27 rappresentano un segnale peptidico coinvolto nel processo di secrezione mentre la proteina matura è costituita dai 150 aminoacidi riportati in figura.
Espressione eterologa della clavina ricombinante Per l'espressione eterologa di clavina ricombinante si è utilizzato il vettore pEZZ18 (Pharmacia) che dirige l'espressione di proteine fuse con un dominio sintetico legante IgG (ZZ) basato sulla proteina A di stafilococco (Nilsson et al. 1987). Il cDNA della clavina ottenuto per PCR con i primers basati sulla alfa-Sarcina come precedentemente descritto è stato riamplificato con il primer 5':
5'-GATCCTGCAGCGACCTGGACTTGCATGAACGAGCAGAAGAACCCAAAG-ACC-3'
e con il primer 3': 5'-ACGTAAGCTT.CTAATGAGAGCAGAGCTT-3' per ottenere la sequenza nativa della clavina matura e clonato nei siti di restrizione Pstl-HindlII del vettore pEZZ18. Per ottenere pMRS116 il frammento EcoRI-PstI è stato sostituito dal linker B che contiene una sequenza codificante per il sito di cleavage del fattore Xa Ile-Glu-Gly-Arg , più un residuo Thr, inserito per preservare il sito di restrizione PstI. Il linker B è stato ottenuto per annealing dei due oligonucleotidi:
alfa28 : 5'-AATTCGATCGAAGGTCGTACTGCA-3'
alfa29 : 5'-GTACGACCTTCGATCG—3'.
Per la produzione di clavina il costrutto pMRS116 è stato propagato in Escherichia coli HB 101 [supE44 , hsdS20(rg mg-)recA13, ara-14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20, xyl-5, mtl-1] e coltivato secondo le istruzioni fornite dal produttore (Pharmacia).
Purificazione della clavina ricombinante
I sovranatanti della coltura sono stati portati a pH 7.6, si è aggiunto fenilmetilsulfonil fluoruro ImM e i sovranatanti sono stati caricati su una colonna di IgG Sepharose Fast Flow (Pharmacia) equilibrata con tampone (50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl e 0.05% Tween 20, pH 7.6). La colonna è stata lavata dapprima con lo stesso tampone e quindi con ammonio acetato 5mM pH5.1; la proteina di fusione é stata eluita con ammonio acetato 0.5 M, pH 3.4, liofilizzata, disciolta a 2-8 mg/ml in -.20 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, 1 mM CaC^ / pH 8.0 e digerito con fattore Xa (Boehringer) in un .rapporto, enzima/substrato di 1:100 a 25°C per 18-24 ore.
La clavina è stata purificata -usando un processo cromatografico in due fasi. Nella prima fase la miscela di digestione è stata caricata su una colonna con S Sepharose ' Fast Flow (Pharmacia )equilibrata con sodio fosfato 20 mM pH 5.8 ed eluita in gradiente di NaCl; la proteina di fusione rimasta non digerita e la clavina sono eluite in un picco singolo. La seconda fase è stata eseguita sulla stessa colonna di IgG Sepharose Fast Flow: la clavina è stata raccolta con l'eluente mentre la proteina non digerita è eluita dalla colonna con ammonio acetato 0.5 M , pH 3.4.
Sintesi e purificazione della immunotossina (coniugato chimico)
La clavina è stata derivatizzata con un eccesso 40-molare di S-acetil-3-propiontioimidato di etile per 1 h a 4‘C per dare uri rapporto medio molare (gruppi S-acetil-3-propiontioimidato di etile)/(molecola di tossina) di 1.2.
L 'anticorpo monoclonale Mgr6 , diretto contro il dominio extracellulare di ErbB2 e prodotto dall 'ibridoma Mgr6-C4 MCB c i 762■depositato presso la banca Interlab Celi Line Collection (CBA), Autorità internazionale di deposito, è stato purificato da liquido ascitica :come descritto in Centis et al. 1992. E' stato 'poi.derivatizzato con un eccesso 10-molare di 2-imminotiolano in etanolo per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi si è aggiunto 5,5' - ditio-bis(acido 2-nitrobenzoico) per bloccare i gruppi -SH liberi ed ottenere un rapporto molare gruppi/molecola di tossina di 1.6 e la miscela è stata applicata ad una colonna BioGel P-6DG per rimuovere tutti i reagenti.
I prodotti derivatizzati sono stati mescolati usando un eccesso 5-molare di clavina e concentrati fino ad un volume finale di 1 mi; dopo aggiunta di 100 ul di idrossilammina 0.5 M, EDTA 12.5 mM, pH 7.2, la soluzione è stata agitata per 14 h a 22°C e per altre 18 h a 4°C. La reazione è stata bloccata per aggiunta di 20 ul di N-etilmaleimmide 200 mM.
L 'immunoconiugato è stato purificato ad omogeneità per cromatografia a scambio ionico.
Immunotossina ricombinante Mqr6-clavina
Costrutto genico
Il gene codificante per le regioni variabili del1 'anticorpo monoclonale Mgr6 è stato ottenuto mediante il kit "Recombinant Phage Antibody System" (Pharmacia) a partire dall' mRNA del1 'ibridoma producente 1'anticorpo. Tale procedura permette di ottenere il DNA codificante per il ScFv (single chain Fv) in cui le sequenze· per le regioni variabili delle catene pesante e leggera sono unite da una sequenza linker. Il DNA per- il ScFv è’ stato quindi legato al DNA della clavina,. per ottenere il gene per l'immunotossina e clonato nel vettore commerciale pRSET (Introvigen ), le Fig. 4 e 5 riortano rispettivamente la sequenza nucleotidica e aminoacidica della immunotossina inserita nel pRSET. Il plasmide risultante possiede le seguenti caratteristiche :
a) il gene della Proteina di fusione è sotto il controllo del promotore della T7 polimerasi;
b) la proteina risultante possiede al suo N-terminale una estensione contenente sei Istidine, utilizzabili per la purificazione con IMAC (immobilized metal affinity chromatography ) ed un sito di taglio per 1'enterochinasi K.
Espressione dell 'immunotossina ricombinante in E.coli
Cellule competenti B834 (DE3 )pLys sono state trasformate e piastrate su dieci piastre-di LB agar contenente Ampicillina (100 ug/ml) ed incubate per una notte a 37"C.
Le colonie sono state recuperate in 500 mi di terreno LB contenente Ampic.il.rina (100 ug/ml), glucosio, (0,5%) e MgS04 (1,62 mM) e coltivate a 37 °C sotto agitazione fino ad -OD^QQ = 2,3/2,5. Si è quindi aggiunto 1 litro di -terreno di coltura (LB, Ampicillina, glucosio, MgSC>4) e si è effettuato l'accrescimento a 37°C sotto -agitazione fino ad OD600 = 1'2‘
Le cellule sono state centrifugate e risospese in 1,5 litri di terreno LB con ampicillina ed indotte mediante aggiunta di IPTG (1 mM finale) per 1,5 ore sotto agitazione a 37°C. Il pellet cellulare è stato infine recuperato mediante centrifugazione.
Purificazione dell'immunotossina ricombinante
Il pellet proveniente da 1,5 litri di coltura è stato risospeso in 150 mi di Tris-HCl 50 mM, pH 8 e congelate. Sono state quindi scongelate e sonicate aliquote di 30 mi, 3 x 20 sec. che sono state poi centrifugate a 16000g per 30 minuti a 4°C.
Il pellet così ottenuto è stato risospeso in 50 mi del tampone STET (Tris-HCl 50 mM pH 8,5, saccarosio 8%, triton X-100 5%, EDTA 50 mM) e la sospensione è stata sonicata 3 x 45 sec. e centrifugata per 20 min. a 30000g. L'operazione di lavaggio descritta è stata ripetuta per altre 2 volte, sono stati quindi eseguiti altri 2 lavaggi con 50.mi di Tris-HCl 50 mM pH 8,5, NaCl 100 mM.
Denaturazione
Il campione viene risospeso in 30 mi del tampone A (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, Gu-HCl 6 M, imidazolo 5mM) e incubato a temperatura ambiente per almeno 2 ore. Purificazione dell'immunotossina mediante IMAC
Il campione viene centrifugato per 30 min a 12000g e il sovranatante sottoposto' a cromatografia di affinità ai metalli chelati (IMAC) utilizzando 20 mi di resina Chelating sepharose FF (Pharmacia) caricata con Ni++.
La colonna viene lavata con 5 volumi di acqua, caricata con 5 volumi di NiS04 0,1 M, lavata con 5 volumi di acqua ed equilibrata con 5 volumi del Tampone A.
Dopo caricamento del campione la colonna viene lavata con 5 volumi del tampone A.
Le proteine adsorbite vengono eluite in step di pH utilizzando i seguenti tamponi:
Tris-Acetato 50 mM pH 5,5; Gu-HCl 6M (Tampone B) Tris-Acetato 50 mM pH 4,0; Gu-HCl 6M (Tampone C). L 'immunotossina eluisce in Tampone C.
Riduzione dell'immunotossina
Il campione proveniente da IMAC (alla concentrazione di 1-2 mg/ml) viene porato a pH 8,3 con Tris base 1M. Vengono aggiunti EDTA 2 mM e DTT 300 mM finali. Si incuba per 3 ore a temperatura ambiente.
Refoldinq dell'immunotossina
Il campione ridotto viene diluito'rapidamente 1:100 nel tampone di refolding (Tris-HCl 50 mM, pH 8,3, L-Arg 0.5 M, EDTA 2 mM, GSSG 4 mM, DTT 2 mM) e incubato a 10’C per 60 ore.
Concentrazione e dialisi della immunotossina
Al campione (circa 500 mi) si aggiungono Tween-20 (0,005% finale) e si concentra per ultrafiltrazione utilizzando una membrana Amicon YM 10.
Si dializza utilizzando una membrana a cut off 10000, contro il tampone di dialisi (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,2 M, Tween-20 0,005%, glicerolo 10%). Si centrifuga a 12000g per 30 minuti e si recupera il sovranatante contenente 1'immunotossina.
Inibizione della sintesi proteica cellulare (immunoconiugato chimico)
La capacità della clavina e dell 'immunotossina Mgr6-clavina di inibire la sintesi proteica è stata misurata su SKBr3 (cellule ErbB2+) e su MeWo (cellule ErbB2-) coltivate in RPMI 1640 contenente 10% FCS. Il test è stato eseguito essenzialmente come descritto da Casalini et al. 1993. L 'immunotossina , la tossina o 1'anticorpo monoclonale sono stati diluiti in serie nel mezzo di coltura. 1.2xl06 cellule- sono state incubate in provette di polipropilene in 800 ul di terreno di coltura contenente le appropriate-concentrazioni di -immunotossina, tossina o anticorpo monoclonale da solo ed incubate per 3 h a 4 "C Cellule di controllo sono state incubate con il solo mezzo di coltura. Quindi le cellule sono state centrifugate, risospese in mezzo di coltura fresco e seminate in triplicato in piastre a 96-pozzetti (3x10^ cellule/pozzetto). Dopo incubazione a 37°C per 48 h, il mezzo di coltura è stato rimosso e si è aggiunto mezzo di coltura fresco contenente [ H]prolina (luCi/pozzetto) . Dopo 48 ore le cellule sono state lavate ed è stata determinata la quantità di [ H]prolina incorporata.
La clavina mostra un effetto, dose/risposta con valori di IC5Q compresi fra 0.1 - 1 uM in diversi saggi.
La citotossicità del coniugato Mgr6-clavina è simile a quella della Ricina A unita.allo stesso anticorpo monoclonale.
Inibizione della sintesi proteica cellulare
(immunoconiugato ricombinante)
La capacità dell'immunotossina ricombinante Mgr6-clavina di inibire la sintesi proteica è stata misurata come descritto precedentemente per 1'immunoconiugato chimico. L'IC50 dell 'immunotossina ricombinante è compresa tra 0.1 e 1 uM, mentre 1'anticorpo Mgr6 non ha alcun effetto
La clavina si presenta dunque come un buon candidato alla produzione di immunotossine.

Claims (8)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Sequenza di cDNA avente la seguente composizione nucleotidica :
  2. 2. Proteina capace di inattivare l'attività ribosomiale avente la seguente sequenza aminoacidica:
  3. 3. Sequenza di cDNA che esprime il coniugato Mgr6-clavina avente la composizione nucleotidica e relativa sequenza aminoacidica:
  4. 4 . Coniugati , sia per via chimica che per ricombinazione genica , della proteina secondo la rivendicazione 2 con ormoni , ' liposomi , anticorpi monoclonali , fattori di crescita , citochine , transferrina, e peptidi costituiti da frammenti di dette proteine.
  5. 5. Coniugati secondo la rivendicazione 4 in cui la proteina e coniugata con anticorpi monoclonali .
  6. 6. Coniugati secondo la rivendicazione 5 in cui l ' anticorpo monoclonale è Mgr6 .
  7. 7 . Composizioni farmaceutiche contenenti come principio attivo la proteina secondo la rivendicazione 2 e/o i coniugati secondo le rivendicazioni 4-6 in combinazione con gli opportuni additivi .
  8. 8 . Uso della proteina secondo la rivendicazione 2 e/o dei coniugati secondo le rivendicazioni 4-6 , o loro miscele , per la preparazione di formulazioni farmaceutiche utili come antitumorali e/o antivirali .
IT96FI000155A 1996-06-27 1996-06-27 Proteina capace di inibire l'attivita' ribosomiale,sua preparazione ed uso come immunoconiugato chimico o ricombinante e sequenza di cdna IT1286663B1 (it)

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IT96FI000155A IT1286663B1 (it) 1996-06-27 1996-06-27 Proteina capace di inibire l'attivita' ribosomiale,sua preparazione ed uso come immunoconiugato chimico o ricombinante e sequenza di cdna
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