IT202200025416A1 - BIOSENSOR FOR VIRAL PARTICLE DETECTION - Google Patents
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Description
BIOSENSORE PER LA RILEVAZIONE DI PARTICELLE VIRALI BIOSENSOR FOR VIRAL PARTICLE DETECTION
La presente invenzione riguarda un biosensore ed un dispositivo che lo comprende per la rilevazione di particelle virali e/o loro frammenti. Formano oggetto dell?invenzione anche un kit comprendente detto biosensore e/o dispositivo nonch? l?uso degli stessi per la rilevazione di particelle virali o loro frammenti in un campione cos? come per la diagnosi in vitro di infezioni virali, e un procedimento per la preparazione del biosensore. The present invention relates to a biosensor and a device comprising it for the detection of viral particles and/or fragments thereof. The invention also relates to a kit comprising said biosensor and/or device as well as the use thereof for the detection of viral particles or fragments thereof in a sample as well as for the in vitro diagnosis of viral infections, and a process for the preparation of the biosensor.
STATO DELLA TECNICA STATE OF THE TECHNOLOGY
Le infezioni di natura virale, e in particolare le infezioni respiratorie virali acute, rappresentano la principale causa infettiva nel mondo. ? dunque fondamentale disporre di test diagnostici selettivi e tempestivi per identificare, isolare e trattare i pazienti infetti e quindi prevenire l'ulteriore diffusione del virus. La diagnosi di laboratorio di una infezione virale prevede generalmente l?identificazione dell?RNA del virus mediante l?applicazione di tecniche basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR o qRT-PCR) e su metodi di immunizzazione, quali ELISA, per la rilevazione di anticorpi contro il virus in campioni di siero ottenuti da un paziente. Viral infections, particularly acute respiratory viral infections, are the leading cause of infection worldwide. It is therefore essential to have selective and timely diagnostic tests to identify, isolate and treat infected patients and thus prevent further spread of the virus. Laboratory diagnosis of a viral infection generally involves the identification of the virus RNA by applying techniques based on the polymerase chain reaction (PCR or qRT-PCR) and immunization methods, such as ELISA, for the detection of antibodies against the virus in serum samples obtained from a patient.
Questi metodi si basano su una rilevazione di tipo indiretto del virus e risultano poco efficaci nell?individuazione dei casi infettivi: la presenza di RNA virale non fornisce informazioni riguardo l?infettivit? del soggetto, mentre la presenza di anticorpi nel siero non implica che l?infezione sia ancora in atto. Inoltre, questi metodi non sono rapidi: gli anticorpi, ad esempio, possono essere rilevati solo dopo numerosi giorni dalla comparsa dei sintomi, mentre il metodo della PCR richiede diverse ore per ottenere il risultato nonch? personale specializzato e attrezzature di laboratorio sofisticate. These methods are based on an indirect detection of the virus and are not very effective in identifying infectious cases: the presence of viral RNA does not provide information about the infectivity of the subject, while the presence of antibodies in the serum does not imply that the infection is still active. Furthermore, these methods are not rapid: antibodies, for example, can only be detected several days after the onset of symptoms, while the PCR method requires several hours to obtain the result as well as specialized personnel and sophisticated laboratory equipment.
Pertanto, tali metodi non sono in grado di soddisfare le esigenze di diagnosi rapida e precoce dell?infezione virale o di screening clinico nelle fasi iniziali dell?infezione. Therefore, these methods cannot meet the needs of rapid and early diagnosis of viral infection or clinical screening in the early stages of infection.
In particolare, nel caso di infezioni da SARS-CoV-2, la rilevazione di RNA virale in un test con tampone non rappresenta una condizione sufficiente perch? si possa dimostrare l?infettivit? del soggetto in esame. In particular, in the case of SARS-CoV-2 infections, the detection of viral RNA in a swab test does not represent a sufficient condition to demonstrate the infectivity of the subject being examined.
Tra i vari strumenti diagnostici ad oggi disponibili sul mercato, i biosensori FRET (F?rster Resonance Energy Transfer), basati su trasferimento di energia per risonanza, offrono numerosi vantaggi per una rilevazione rapida e selettiva di particelle virali. Among the various diagnostic tools currently available on the market, FRET (F?rster Resonance Energy Transfer) biosensors, based on resonance energy transfer, offer numerous advantages for the rapid and selective detection of viral particles.
I biosensori rappresentano esempi interessanti di dispositivi basati su FRET, poich?, in tali sistemi, un fenomeno non radiativo di trasferimento di energia tra due ?elementi di interazione?, nel seguito meglio definiti, ? sfruttato per rilevare le interazioni molecolari e/o il legame con proteine o altre biomolecole di interesse mediante generazione di un segnale di fluorescenza o variazione dell?intensit? di detto segnale. Biosensors are interesting examples of FRET-based devices, since, in such systems, a non-radiative phenomenon of energy transfer between two "interaction elements", better defined below, is exploited to detect molecular interactions and/or binding with proteins or other biomolecules of interest by generating a fluorescence signal or by varying the intensity of said signal.
Al meglio della conoscenza degli inventori, sono stati proposti in letteratura biosensori per la rilevazione di infezioni virali basati su fluorescenza che si basano per? sul legame all?RNA o DNA del virus, ad esempio il tristemente noto SARS-CoV-2. To the best of the inventors' knowledge, fluorescence-based biosensors for the detection of viral infections have been proposed in the literature, but they rely on binding to the RNA or DNA of the virus, for example the infamous SARS-CoV-2.
Sono anche stati proposti saggi molecolari per rilevare il dominio di legame del recettore della proteina spike (S-RBD) di SARS-CoV-2 utilizzando ?molecular beacon? validati dal punto di vista computazionale che consentono il rilevamento della presenza di S-RBD attraverso la produzione di un segnale di fluorescenza rilevato da microscopi TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Tali molecular beacon comprendono due oligopeptidi che formano un eterodimero, un ligando per S-RBD e una coppia fluoroforoquecher alle estremit? terminali del beacon in cui il meccanismo di quenching dipende da un cambio conformazionale che fa allontanare due oligopeptidi del coiled-coil, piuttosto che da una interazione specifica che deve essere spiazzata da un'altra interazione specifica; ci? potrebbe influire negativamente sulla specificit?. Inoltre, il fatto che la rilevazione del segnale di fluorescenza sia affidato a microscopi TIRF rende la metodica proposta difficilmente implementabile su larga scala come test diagnostico rapido. Molecular assays to detect the SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain (S-RBD) have also been proposed using computationally validated “molecular beacons” that enable the detection of the presence of S-RBD through the production of a fluorescence signal detected by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopes. Such molecular beacons comprise two oligopeptides forming a heterodimer, a ligand for S-RBD and a fluorophore-quenching pair at the terminal ends of the beacon where the quenching mechanism depends on a conformational change that pushes two oligopeptides of the coiled-coil apart, rather than on a specific interaction that needs to be displaced by another specific interaction; this could negatively affect specificity. Furthermore, the fact that the detection of the fluorescence signal is entrusted to TIRF microscopes makes the proposed method difficult to implement on a large scale as a rapid diagnostic test.
In questo contesto, ? pertanto ancora molto sentita l?esigenza di disporre di biosensori FRET per la rilevazione di particelle virali caratterizzati s? da maggiori rapidit? e selettivit?, ma allo stesso tempo da una elevata sensibilit? nella rilevazione. In this context, there is still a strong need for FRET biosensors for the detection of viral particles characterized by greater speed and selectivity, but at the same time by high sensitivity in detection.
Idealmente, il biosensore FRET dovrebbe anche prestarsi all?utilizzo in metodi diagnostici in vitro su larga scala da parte anche di personale non specializzato. Ideally, the FRET biosensor should also be suitable for use in large-scale in vitro diagnostic methods even by non-specialized personnel.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE SUMMARY OF THE INVENTION
L?invenzione qui proposta si riferisce ad un nuovo biosensore caratterizzato da elevata specificit? e sensibilit? per l?uso nella rilevazione di particelle virali e/o loro frammenti. The invention proposed herein relates to a novel biosensor characterized by high specificity and sensitivity for use in the detection of viral particles and/or fragments thereof.
In particolare, gli autori della presente invenzione hanno messo a punto una proteina chimerica (di seguito denominata anche biosensore o sonda) comprendente un dominio di legame, ad esempio un recettore virale o una sua porzione, in grado di legare in maniera specifica una particella virale e/o un suo frammento e la cui emissione di fluorescenza ? sensibile alla concentrazione di particelle virali o frammenti di particelle virali, in particolare alla proteina Spike del virus Sars-Cov-2 o suoi frammenti. In particular, the authors of the present invention have developed a chimeric protein (hereinafter also referred to as a biosensor or probe) comprising a binding domain, for example a viral receptor or a portion thereof, capable of specifically binding a viral particle and/or a fragment thereof and whose fluorescence emission is sensitive to the concentration of viral particles or fragments of viral particles, in particular to the Spike protein of the Sars-Cov-2 virus or fragments thereof.
Questa proteina chimerica, ottenuta mediante tecnica del DNA ricombinante, consente di riconoscere e legare particelle virali nonch? di generare un segnale di fluorescenza e/o una variazione di intensit? del segnale di fluorescenza facilmente rilevabile che ne conferma il riconoscimento biologico. In altre parole, la proteina chimerica funge da sonda in grado di legare e rilevare le particelle virali senza bisogno di ulteriori agenti o cofattori separati. This chimeric protein, obtained by recombinant DNA technology, allows to recognize and bind viral particles as well as to generate an easily detectable fluorescence signal and/or a change in intensity of the fluorescence signal that confirms its biological recognition. In other words, the chimeric protein acts as a probe capable of binding and detecting viral particles without the need for additional separate agents or cofactors.
Le prove effettuate dimostrano una sensibilit? e specificit? nella rilevazione di frammenti di particelle virali nel range nanomolare e sub-nanomolare. Oltre a possedere ottime sensibilit? e selettivit?, il biosensore cos? sviluppato ? caratterizzato da un?elevata facilit? d?uso, nonch? da una notevole rapidit? di risposta nella rilevazione di particelle virali, caratteristiche ideali per una diagnosi tempestiva delle infezioni. The tests performed demonstrate sensitivity and specificity in the detection of fragments of viral particles in the nanomolar and sub-nanomolar range. In addition to possessing excellent sensitivity and selectivity, the biosensor thus developed is characterized by high ease of use, as well as a remarkable rapidity of response in the detection of viral particles, ideal characteristics for a timely diagnosis of infections.
La presente invenzione si riferisce dunque ad un biosensore (o sonda) comprendente una proteina chimerica che a sua volta comprende almeno un primo dominio di interazione e un secondo dominio di interazione, pi? avanti meglio definiti, un fluoroforo e, opzionalmente, un quencher tale che - in assenza dell?analita di interesse - l?interazione molecolare tra il primo ed il secondo elemento di interazione permette l?instaurarsi di un fenomeno non radiativo di trasferimento di energia che causa lo spegnimento della fluorescenza del fluoroforo mentre in presenza dell?analita di interesse -? a causa di una maggior affinit? per il primo elemento di interazione ? l?analita spiazza il secondo elemento di interazione interrompendo l?azione di spegnimento della fluorescenza da parte del quencher con conseguente emissione di fluorescenza o incremento nella intensit? di fluorescenza. The present invention therefore refers to a biosensor (or probe) comprising a chimeric protein which in turn comprises at least a first interaction domain and a second interaction domain, better defined below, a fluorophore and, optionally, a quencher such that - in the absence of the analyte of interest - the molecular interaction between the first and the second interaction element allows the establishment of a non-radiative energy transfer phenomenon which causes the fluorescence of the fluorophore to be quenched, while in the presence of the analyte of interest - due to a greater affinity for the first interaction element - the analyte displaces the second interaction element, interrupting the fluorescence quenching action of the quencher with consequent emission of fluorescence or increase in fluorescence intensity.
Nel contesto delle estensive sperimentazioni effettuate, gli inventori hanno notato che il biosensore funziona anche senza il quencher. Ci? ? stato confermato per mezzo di prove sperimentali che hanno mostrato come, anche in assenza del quencher e quindi anche in assenza di uno spegnimento iniziale del segnale di fluorescenza, ? possibile rivelare la presenza dell?analita di interesse in quanto il legame, ad esempio della proteina virale o suo frammento, al primo elemento di interazione causa in ogni caso una variazione, nello specifico un incremento, dell?intensit? del segnale di fluorescenza del fluoroforo. In the context of the extensive experiments carried out, the inventors noted that the biosensor also works without the quencher. This was confirmed by experimental tests that showed how, even in the absence of the quencher and therefore also in the absence of an initial quenching of the fluorescence signal, it is possible to reveal the presence of the analyte of interest since the binding, for example of the viral protein or its fragment, to the first interaction element causes in any case a variation, specifically an increase, in the intensity of the fluorophore fluorescence signal.
Pertanto, la presente invenzione si riferisce ad un biosensore come definito nella rivendicazione indipendente 1. Altre caratteristiche preferite o accessorie del biosensore sono ricomprese dalle rispettive rivendicazioni dipendenti. Therefore, the present invention relates to a biosensor as defined in independent claim 1. Other preferred or accessory features of the biosensor are encompassed by the respective dependent claims.
Vantaggiosamente, la capacit? del biosensore di rilevare particelle virali pu? essere sfruttata sia per la rilevazione del virus presente nell?ambiente, ad esempio in campioni di aria o acqua, sia per la diagnosi rapida di infezioni di carattere virale, ad esempio infezioni da SARS-CoV-2, facilitando l?isolamento di quei soggetti maggiormente infettivi, e consentendo in egual modo di ottenere importanti informazioni relative alla prognosi della patologia. Inoltre, nella sua forma costruttivamente pi? semplice (senza quencher) risulta ancor pi? versatile e, ad esempio, adatto ad essere impiegato anche in saggi fluorimetrici e/o di anisotropia di fluorescenza. Advantageously, the biosensor's ability to detect viral particles can be exploited both for the detection of the virus present in the environment, for example in air or water samples, and for the rapid diagnosis of viral infections, for example SARS-CoV-2 infections, facilitating the isolation of those subjects who are more infectious, and equally allowing to obtain important information relating to the prognosis of the pathology. Furthermore, in its constructively simpler form (without quencher) it is even more versatile and, for example, suitable for use in fluorimetric and/or fluorescence anisotropy assays.
Come riportato nella descrizione dettagliata, il biosensore oggetto della presente invenzione pu? essere facilmente integrato all?interno di un dispositivo portatile, ed ? quindi operabile anche in ambito domiciliare da personale non esperto per finalit? diagnostiche o per il monitoraggio di parametri ambientali. Il biosensore della presente invenzione risulta particolarmente versatile e pu? essere impiegato anche come sonda per screening di molecole, come sonda fluorescente in test cellulari e in generale per altre indagini scientifiche che presuppongono il riconoscimento di un analita di interesse. As reported in the detailed description, the biosensor object of the present invention can be easily integrated into a portable device, and can therefore also be operated at home by non-expert personnel for diagnostic purposes or for monitoring environmental parameters. The biosensor of the present invention is particularly versatile and can also be used as a probe for screening molecules, as a fluorescent probe in cellular tests and in general for other scientific investigations that presuppose the recognition of an analyte of interest.
Pertanto, formano oggetto della presente invenzione: Therefore, the object of this invention is:
? Un biosensore comprendente, o costituito da, una proteina chimerica, in cui detta proteina chimerica comprende preferibilmente nell?ordine dall?estremit? N-terminale: ? A biosensor comprising, or consisting of, a chimeric protein, wherein said chimeric protein preferably comprises in order from the N-terminal end:
- un primo elemento di interazione comprendente, o costituito da, una sequenza amminoacidica che ha affinit? di legame per un secondo elemento di interazione; - un secondo elemento di interazione comprendente, o costituito da, la sequenza amminoacidica del Receptor Binding Domain (RBD) o Receptor Binding Motif (RBM) di una proteina virale, nonch? un loro frammento o loro peptido-mimetico, e - a first interaction element comprising, or consisting of, an amino acid sequence that has binding affinity for a second interaction element; - a second interaction element comprising, or consisting of, the amino acid sequence of the Receptor Binding Domain (RBD) or Receptor Binding Motif (RBM) of a viral protein, as well as a fragment or peptido-mimetic thereof, and
- un fluoroforo. - a fluorophore.
L?interazione della proteina virale, nonch? un suo frammento o peptido-mimetico, con il primo elemento di interazione modula il segnale di fluorescenza emesso dal fluoroforo. The interaction of the viral protein, or its fragment or peptide mimetic, with the first interaction element modulates the fluorescence signal emitted by the fluorophore.
? Un dispositivo portatile comprendente almeno un biosensore secondo una qualsiasi delle forme realizzative dell?invenzione alloggiato in un contenitore atto ad accogliere un campione, biologico oppure ambientale, da analizzare. ? A portable device comprising at least one biosensor according to any of the embodiments of the invention housed in a container suitable for receiving a sample, biological or environmental, to be analyzed.
? L?uso del biosensore secondo una qualsiasi delle forme realizzative dell?invenzione come sonda fluorescente in saggi cellulari. ? The use of the biosensor according to any of the embodiments of the invention as a fluorescent probe in cell-based assays.
? L?uso del biosensore e/o del dispositivo secondo una qualsiasi delle forme realizzative dell?invenzione per la diagnosi di infezioni virali in vitro, preferibilmente in cui le infezioni virali sono infezioni da SARS-CoV-2, e/o per la rilevazione di particelle virali nell?ambiente. ? The use of the biosensor and/or device according to any of the embodiments of the invention for the diagnosis of viral infections in vitro, preferably where the viral infections are SARS-CoV-2 infections, and/or for the detection of viral particles in the environment.
? Un metodo per rivelare la presenza di una particella virale e/o di un suo frammento all?interno di un campione biologico o ambientale e/o per diagnosticare una infezione virale comprendente i seguenti passaggi: ? A method for detecting the presence of a viral particle and/or a fragment thereof within a biological or environmental specimen and/or for diagnosing a viral infection comprising the following steps:
i. mettere in contatto un campione biologico da analizzare con un biosensore secondo una qualsiasi delle forme realizzative dell?invenzione; e i. contacting a biological sample to be analyzed with a biosensor according to any embodiment of the invention; and
ii. rivelare reazioni di legame con una particella virale e/o un suo frammento per mezzo di un segnale di fluorescenza o un incremento della intensit? di fluorescenza del segnale emesso da detto uno o pi? biosensori. ii. detect binding reactions with a viral particle and/or a fragment thereof by means of a fluorescence signal or an increase in the fluorescence intensity of the signal emitted by said one or more biosensors.
? Un kit di parti per la rilevazione di una particella virale e/o un suo frammento e/o per la diagnosi di una infezione virale comprendente un biosensore e/o un dispositivo secondo una qualsiasi delle forme realizzative dell?invenzione, e un reagente di controllo. ? A kit of parts for the detection of a viral particle and/or a fragment thereof and/or for the diagnosis of a viral infection comprising a biosensor and/or a device according to any of the embodiments of the invention, and a control reagent.
Ulteriori vantaggi, cos? come le caratteristiche e le modalit? di impiego della presente invenzione, risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata. Further advantages, as well as features and methods of use of the present invention, will become apparent from the following detailed description.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1. Rappresentazione grafica di alcune forme realizzative del biosensore secondo l?invenzione: a) schema generale della sonda; b) Sonda 1.0; c) Sonda 2.0; d) Sonda 3.0. Figure 1. Graphical representation of some embodiments of the biosensor according to the invention: a) general diagram of the probe; b) Probe 1.0; c) Probe 2.0; d) Probe 3.0.
Figura 2. Snapshots rappresentativi delle simulazioni della struttura della sonda 2.0 nella versione con RBM aperta (sinistra) o con RBM chiusa (destra). Figure 2. Representative snapshots of the simulations of the 2.0 probe structure in the open RBM version (left) or closed RBM version (right).
Figura 3. Clonazione della sequenza corrispondente alla sonda 3.0 in vettore di espressione procariotica (pET11a). Figure 3. Cloning of the sequence corresponding to probe 3.0 into a prokaryotic expression vector (pET11a).
Figura 4. Overview della procedura di isolamento della sonda 2.0 nella versione con RBM o RBD. Figure 4. Overview of the probe isolation procedure 2.0 in the version with RBM or RBD.
Figura 5. Induzione e purificazione della sonda 3.0. Figure 5. Induction and purification of probe 3.0.
Figura 6. Grafico della determinazione della minima concentrazione rilevabile in saliva della sonda S (RBM 2.0 e RBM 3.0). Figure 6. Graph of the determination of the minimum detectable concentration in saliva of the S probe (RBM 2.0 and RBM 3.0).
Figura 7. Grafico della misura dell?intensit? della fluorescenza ottenuta per i diversi campioni dopo 30 e 60 minuti di incubazione. L'intensit? ? stata normalizzata al valore della Sonda S e di EGFP, in assenza della proteina Spike. I risultati hanno mostrato come entrambi i prototipi di Sonda S possono essere rilevati fino ad un range minimo di concentrazione compreso tra 0,05-0,1 nM. Figure 7. Graph of the fluorescence intensity measurement obtained for the different samples after 30 and 60 minutes of incubation. The intensity was normalized to the value of Probe S and EGFP, in the absence of the Spike protein. The results showed that both prototypes of Probe S can be detected up to a minimum concentration range of 0.05-0.1 nM.
Figura 8. Schema di reazione di click chemistry per l?inserimento del quencher sul sensore. Figure 8. Click chemistry reaction scheme for quencher insertion on the sensor.
Figura 9. Grafico della misura dell?abbattimento dell?intensit? della fluorescenza ottenuta per diverse concentrazioni di due preparazioni con quencher della sonda (SQ1 e SQ2) rispetto alla sonda S. Figure 9. Graph of the fluorescence intensity reduction measurement obtained for different concentrations of two preparations with probe quencher (SQ1 and SQ2) compared to the probe S.
GLOSSARIO GLOSSARY
I termini impiegati nella presente descrizione sono come generalmente compresi dall?esperto della tecnica, salvo ove diversamente indicato. The terms used in this description are as generally understood by those skilled in the art, unless otherwise indicated.
Una definizione di biosensore generalmente accettata nella tecnica ? la seguente: ?dispositivo analitico che comprende un materiale biologico associato o integrato con un trasduttore fisico-chimico o con un sistema di trasduzione?. Nel contesto della presente invenzione, il termine ?biosensore? - usato interscambiabilmente con ?sonda? ? ? in particolare impiegato per indicare una proteina chimerica che consente di rivelare una molecola biologica mediante un segnale di fluorescenza o mediante variazione dell?intensit? di detto segnale. A generally accepted definition of a biosensor in the art is as follows: "an analytical device comprising a biological material associated with or integrated with a physicochemical transducer or transduction system". In the context of the present invention, the term "biosensor" - used interchangeably with "probe" - is particularly used to indicate a chimeric protein that allows the detection of a biological molecule by means of a fluorescence signal or by varying the intensity of said signal.
La dicitura ?proteina chimerica? ? intesa qui indicare una proteina artificiale ottenuta dalla combinazione di diverse proteine o parti di proteine. Si ottiene in seguito alla creazione per ricombinazione del DNA di un gene comprendente i codoni codificanti per le proteine o parti di proteine desiderate. Le proteine di fusione possono anche essere chiamate proteine chimeriche. The term "chimeric protein" is here used to indicate an artificial protein obtained by combining different proteins or parts of proteins. It is obtained following the creation by recombination of DNA of a gene comprising the codons coding for the desired proteins or parts of proteins. Fusion proteins can also be called chimeric proteins.
La dicitura ?primo elemento di interazione? indica il primo, a partire dalla posizione N-terminale, dei due elementi di interazione che regola un cambiamento del biosensore dalla conformazione chiusa (ossia spenta) a quella aperta (ossia accesa). The term “first interaction element” indicates the first, starting from the N-terminal position, of the two interaction elements that regulates a change of the biosensor from the closed (i.e. off) to the open (i.e. on) conformation.
La dicitura ?secondo elemento di interazione? indica il secondo, a partire dalla posizione N-terminale, dei due elementi di interazione che regola un cambiamento del sensore dalla conformazione chiusa ossia spenta a quella aperta ossia accesa. The term "second interaction element" indicates the second of the two interaction elements, starting from the N-terminal position, that regulates a change of the sensor from the closed, i.e. off, conformation to the open, i.e. on, conformation.
La dicitura ?Receptor Binding Domain (o RBD)? indica un frammento immunogenico corto di un virus che si lega ad una specifica sequenza di un recettore endogeno per entrare nella cellula ospite. In particolare, si riferisce ad una porzione della glicoproteina ?Spike? (S-domain) che ? appunto responsabile di interagire con il recettore e facilitare la fusione con la membrana. Generalmente l?RBD ? il target primario nella prevenzione e/o nel trattamento delle infezioni virali, specialmente delle infezioni da SARS-CoV-2. The term ?Receptor Binding Domain (or RBD)? indicates a short immunogenic fragment of a virus that binds to a specific sequence of an endogenous receptor to enter the host cell. In particular, it refers to a portion of the ?Spike? glycoprotein (S-domain) that is responsible for interacting with the receptor and facilitating fusion with the membrane. Generally, the RBD is the primary target in the prevention and/or treatment of viral infections, especially SARS-CoV-2 infections.
La dicitura ?Receptor Binding Motif (o RBM)? indica la porzione di RBD maggiormente coinvolta nel legame con il recettore. The term ?Receptor Binding Motif (or RBM)? indicates the portion of the RBD most involved in binding to the receptor.
Il termine ?proteina Spike? utilizzato nel contesto della presente descrizione si riferisce alla glicoproteina trimerica transmembrana (anche nota come glicoproteina S) presente nello strato pi? esterno del virus SARS-CoV-2, i cui monomeri sono costituiti ciascuno da due subunit? (S1 e S2). La sequenza di tale proteina ? disponibile in banca dati UniProtKB come SPIKE_SARS2, Accession Number P0DTC2, Sequence Version 1, entry version 13 (https://rest.uniprot.org/uniprotkb/P0DTC2.txt). The term "Spike protein" used in the context of this description refers to the trimeric transmembrane glycoprotein (also known as S-glycoprotein) present in the outermost layer of the SARS-CoV-2 virus, whose monomers are each made up of two subunits (S1 and S2). The sequence of this protein is available in the UniProtKB database as SPIKE_SARS2, Accession Number P0DTC2, Sequence Version 1, entry version 13 (https://rest.uniprot.org/uniprotkb/P0DTC2.txt).
Come noto in letteratura, l?interazione tra il virus SARS-CoV-2 e l?enzima ACE2, mediante riconoscimento della proteina virale Spike glicosilata (S) sulla superficie del virione, favorisce l?ingresso delle particelle virali all?interno delle cellule epiteliali dell?apparato respiratorio umano, innescando il processo infettivo. Le strutture molecolari risolte delle proteine Spike suggeriscono la presenza di un solo monomero intrappolato con il dominio legante il recettore (RBD) nella configurazione attiva (up), necessario per legare ACE2 ed innescare l?invasione delle cellule ospite. As known in the literature, the interaction between the SARS-CoV-2 virus and the ACE2 enzyme, through recognition of the glycosylated viral Spike protein (S) on the surface of the virion, favors the entry of viral particles into the epithelial cells of the human respiratory tract, triggering the infectious process. The solved molecular structures of the Spike proteins suggest the presence of a single trapped monomer with the receptor-binding domain (RBD) in the active (up) configuration, necessary to bind ACE2 and trigger the invasion of the host cells.
Con l?espressione ?recettore virale? s?intende una proteina in cui almeno una sua porzione ? espressa sulla superficie cellulare ed ? in grado di legare almeno un virus, in particolare una o pi? proteine della particella virale. The term "viral receptor" refers to a protein in which at least one portion of it is expressed on the cell surface and is capable of binding at least one virus, in particular one or more proteins of the viral particle.
Con il termine ?proteina in grado di legare in maniera specifica una particella virale e/o un suo frammento? s?intende una proteina che ha un?affinit? specifica per una parte del virus. The term "protein capable of specifically binding to a viral particle and/or a fragment thereof" refers to a protein that has a specific affinity for a part of the virus.
La dicitura ?fluoroforo? ? come comunemente intesa nella tecnica. In particolare, la dicitura ?Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)? si riferisce ad una variante particolarmente brillante della proteina fluorescente verde. La sequenza di tale proteina ? reperibile in banca dati INH (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAB02572), Accession Number AAB02572, Versione AAB02572.1 con il nome Enhanced green fluorescent protein [Cloning vector pEGFP-1]. The term "fluorophore" is commonly understood in the art. In particular, the term "Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)" refers to a particularly bright variant of the green fluorescent protein. The sequence of this protein is available in the INH database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAB02572), Accession Number AAB02572, Version AAB02572.1 with the name Enhanced green fluorescent protein [Cloning vector pEGFP-1].
La dicitura ?quencher? ? comunemente intesa nella tecnica. In particolare, nel contesto della presente invenzione si intende un fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter. The term ?quencher? is commonly understood in the art. In particular, in the context of the present invention it means a low-energy fluorochrome that quenches the fluorescence of the reporter.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Dopo estensiva sperimentazione, gli inventori della presente invenzione hanno messo a punto una proteina chimerica fluorescente la cui emissione di fluorescenza ? sensibile alla concentrazione di una particella virale e/o un suo frammento, ad esempio un frammento della proteina Spike del virus Sars-Cov-2, e che risulta quindi adatta a fungere come biosensore per la rilevazione di particelle virali e/o loro frammenti. After extensive experimentation, the inventors of the present invention have developed a fluorescent chimeric protein whose fluorescence emission is sensitive to the concentration of a viral particle and/or a fragment thereof, for example a fragment of the Spike protein of the Sars-Cov-2 virus, and which is therefore suitable to act as a biosensor for the detection of viral particles and/or fragments thereof.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detta proteina ? dunque una proteina in grado di legare in maniera specifica e selettiva una particella virale e/o un suo frammento. Per ?frammento? si intende, nel contesto della presente descrizione, una qualsiasi porzione della particella virale in grado di legare in maniera specifica detta proteina, ad esempio un polipeptide che contenga almeno una porzione sufficiente a conferire a detto polipeptide un legame specifico a detta proteina. According to one aspect of the invention, said protein is therefore a protein capable of specifically and selectively binding a viral particle and/or a fragment thereof. By ?fragment? is meant, in the context of the present description, any portion of the viral particle capable of specifically binding said protein, for example a polypeptide containing at least a portion sufficient to confer to said polypeptide a specific binding to said protein.
In una forma di realizzazione secondo l?invenzione, detta proteina ? in particolare una proteina in grado di legare una particella virale di SARS-CoV-2 e/o un suo frammento. In particolare, il biosensore ? in grado di rilevare la presenza dell?antigene di superficie Spike del virus Sars-Cov-2 mediante modificazione della emissione di fluorescenza della proteina fluorescente, a titolo esemplificativo, GFP. Il biosensore ? stato progettato per avere una struttura modulare che, come apparir? evidente dal seguito della descrizione, ? congeniale ai successivi step di ottimizzazione e a pi? applicazioni e/o metodiche. Come schematizzato in Figura 1, secondo una forma realizzativa della presente invenzione, il biosensore prevede la presenza di due elementi ?reporter?, ossia elementi coinvolti nella rivelazione del segnale di fluorescenza, uno all?N-terminale e uno al C-terminale della proteina e di due ?elementi di interazione?, contigui tra loro, che separano gli elementi reporter: In an embodiment according to the invention, said protein is in particular a protein capable of binding a SARS-CoV-2 viral particle and/or a fragment thereof. In particular, the biosensor is capable of detecting the presence of the Spike surface antigen of the Sars-Cov-2 virus by modifying the fluorescence emission of the fluorescent protein, for example, GFP. The biosensor has been designed to have a modular structure which, as will be evident from the following description, is congenial to the subsequent optimization steps and to multiple applications and/or methods. As schematized in Figure 1, according to an embodiment of the present invention, the biosensor provides for the presence of two ?reporter? elements, i.e. elements involved in the detection of the fluorescence signal, one at the N-terminus and one at the C-terminus of the protein and two ?interaction elements?, contiguous to each other, which separate the reporter elements:
PRIMO REPORTER ? PRIMO ELEMENTO DI INTERAZIONE ? SECONDO ELEMENTO DI INTERAZIONE ? FIRST REPORTER? FIRST ELEMENT OF INTERACTION? SECOND ELEMENT OF INTERACTION?
SECONDO REPORTER SECOND REPORTER
In assenza dell?analita di interesse, l?interazione molecolare tra i due elementi di interazione permette l?instaurarsi di un fenomeno non radiativo di trasferimento di energia tra gli elementi reporter (un fluoroforo e un quencher) che causa lo spegnimento della fluorescenza del fluoroforo della proteina. Tuttavia, quando presente, l?analita di interesse spiazza uno degli elementi di interazione, interrompendo il quenching (o spegnimento) del fluoroforo, ed ? quindi possibile rilevare un segnale di fluorescenza che testimonia la presenza dell?analita di interesse. In the absence of the analyte of interest, the molecular interaction between the two interacting elements allows the establishment of a non-radiative phenomenon of energy transfer between the reporter elements (a fluorophore and a quencher) that causes the fluorescence of the protein fluorophore to be quenched. However, when present, the analyte of interest displaces one of the interacting elements, interrupting the quenching (or quenching) of the fluorophore, and it is therefore possible to detect a fluorescence signal that attests to the presence of the analyte of interest.
Come sopra anticipato, nel contesto delle sperimentazioni effettuate, gli inventori hanno notato che il biosensore funziona anche senza il primo reporter. Ci? ? stato confermato per mezzo di prove sperimentali che hanno mostrato come, anche in assenza di uno dei reporter, il quencher, e quindi anche in assenza di uno spegnimento iniziale del segnale di fluorescenza, ? possibile rivelare la presenza dell?analita di interesse in quanto il legame, ad esempio della proteina virale o suo frammento, ad uno degli elementi di interazione comporta, in ogni caso, una variazione, nello specifico un incremento, dell?intensit? del segnale di fluorescenza. As anticipated above, in the context of the experiments carried out, the inventors noted that the biosensor works even without the first reporter. This was confirmed by means of experimental tests that showed how, even in the absence of one of the reporters, the quencher, and therefore also in the absence of an initial switch-off of the fluorescence signal, it is possible to reveal the presence of the analyte of interest since the binding, for example of the viral protein or its fragment, to one of the interaction elements involves, in any case, a variation, specifically an increase, in the intensity of the fluorescence signal.
Pertanto, la presente invenzione si riferisce ad un biosensore comprendente una proteina chimerica, in cui detta proteina chimerica comprende: Therefore, the present invention relates to a biosensor comprising a chimeric protein, wherein said chimeric protein comprises:
- un primo elemento di interazione comprendente, o costituito da, una sequenza amminoacidica che ha affinit? di legame con un secondo elemento di interazione; - un secondo elemento di interazione comprendente, o costituito da, la sequenza amminoacidica del Receptor Binding Domain (RBD) o Receptor Binding Motif (RBM) di una proteina virale, nonch? un loro frammento o loro peptido-mimetico; e - a first interaction element comprising, or consisting of, an amino acid sequence that has binding affinity to a second interaction element; - a second interaction element comprising, or consisting of, the amino acid sequence of the Receptor Binding Domain (RBD) or Receptor Binding Motif (RBM) of a viral protein, as well as a fragment or peptido-mimetic thereof; and
- un fluoroforo - a fluorophore
in cui l?interazione di una proteina virale, nonch? un suo frammento o peptidomimetico, con il primo elemento di interazione comporta una modulazione o variazione del segnale di fluorescenza emesso dal fluoroforo, in particolare un incremento nella intensit? di detto segnale. wherein the interaction of a viral protein, or a fragment or peptidomimetic thereof, with the first interacting element results in a modulation or variation of the fluorescence signal emitted by the fluorophore, in particular an increase in the intensity of said signal.
Di seguito, i componenti del biosensore sono descritti pi? nello specifico. Below, the components of the biosensor are described in more detail.
Il primo elemento di interazione ? preferibilmente una sequenza amminoacidica che ha affinit? di legame con l?RBD o l?RBM della proteina Spike del virus Sars-Cov-2, ad esempio la sequenza amminoacidica dell?enzima 2 convertitore dell?angiotensina (ACE2), un suo frammento o un suo peptido-mimetico. The first interaction element is preferably an amino acid sequence that has binding affinity with the RBD or RBM of the Spike protein of the Sars-Cov-2 virus, for example the amino acid sequence of the angiotensin converting enzyme 2 (ACE2), a fragment thereof or a peptide mimetic thereof.
In relazione al primo elemento di interazione, con la dicitura ?un suo frammento o peptido-mimetico? si intende un frammento o peptido-mimetico che ha (o conserva) affinit? di legame con un secondo elemento di interazione, preferibilmente con l?RBD o l?RBM della proteina Spike del virus Sars-Cov-2. In relation to the first interaction element, the term "a fragment or peptide mimetic thereof" means a fragment or peptide mimetic that has (or retains) binding affinity with a second interaction element, preferably with the RBD or RBM of the Spike protein of the Sars-Cov-2 virus.
Preferibilmente detto frammento di ACE2 ? una sequenza peptido-mimetica di una lunghezza compresa tra 56 e 72 aa corrispondente alle due eliche alfa dell?estremit? N-terminale di ACE2. La sequenza di ACE2 ? disponibile in banca dati UniprotKB, Accession Number Q9BYF1, sequence version 2, entry version 191 (https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q9BYF1/entry) con il nome ACE2_HUMAN. In particolare, ? risultato adatto ai fini della presente invenzione il frammento di 69 aa avente SEQ. ID. No.1. Preferably, said ACE2 fragment is a peptido-mimetic sequence of a length between 56 and 72 aa corresponding to the two alpha helices of the N-terminal end of ACE2. The ACE2 sequence is available in the UniprotKB database, Accession Number Q9BYF1, sequence version 2, entry version 191 (https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q9BYF1/entry) with the name ACE2_HUMAN. In particular, the 69 aa fragment having SEQ. ID. No.1 has proven to be suitable for the purposes of the present invention.
Detto peptido-mimetico del recettore ACE2 ? preferibilmente scelto tra i peptidomimetici denominati LCB1, recentemente descritto in letteratura (Science, 9 Sep 2020, Vol 370, Issue 6515, pp.426-431, DOI: 10.1126/science.abd9909) e LCB3. Le sequenze amminoacidiche menzionate sono disponibili in banca dati, rispettivamente per LCB1 vedere banca dati RCSB PDB, Accession Number 7JZU, con il nome SARS-CoV-2 spike in complex with LCB1 entry version 1.1 (SEQ. ID. No: 2), e per LCB3 vedere banca dati RCSB PDB, Accession Number 7JZM, con il nome SARS-CoV-2 spike in complex with LCB3 entry version 1.1 (SEQ. ID. No: 3). The said peptide mimetic of the ACE2 receptor is preferably chosen among the peptidomimetics called LCB1, recently described in the literature (Science, 9 Sep 2020, Vol 370, Issue 6515, pp.426-431, DOI: 10.1126/science.abd9909) and LCB3. The mentioned amino acid sequences are available in the database, respectively for LCB1 see RCSB PDB, Accession Number 7JZU, with the name SARS-CoV-2 spike in complex with LCB1 entry version 1.1 (SEQ. ID. No: 2), and for LCB3 see RCSB PDB, Accession Number 7JZM, with the name SARS-CoV-2 spike in complex with LCB3 entry version 1.1 (SEQ. ID. No: 3).
Il secondo elemento di interazione pu?, ad esempio, comprendere l?RBD o l?RBM della proteina Spike del virus Sars-Cov-2 nonch? un loro frammento o peptido-mimetico. La sequenza amminoacidica di RBD ? disponibile in banca dati, vedere banca dati UniprotKB, Accession Number P0DTC2, con il nome SPIKE_SARS2 sequence version 1, entry version 13 (SEQ. ID No: 4). La porzione di RBM ? stata invece estrapolata dalla struttura di RBD e riportata in Jun Lan et al., Nature, volume 581, pages 215?220 (2020), DOI: 10.1038/s41586-020-2180-5 (SEQ. ID. No: 5). The second interaction element may, for example, comprise the RBD or the RBM of the Spike protein of the Sars-Cov-2 virus as well as a fragment or peptido-mimetic thereof. The amino acid sequence of the RBD is available in the database, see UniprotKB database, Accession Number P0DTC2, with the name SPIKE_SARS2 sequence version 1, entry version 13 (SEQ. ID No: 4). The RBM portion was instead extrapolated from the RBD structure and reported in Jun Lan et al., Nature, volume 581, pages 215-220 (2020), DOI: 10.1038/s41586-020-2180-5 (SEQ. ID No: 5).
Preferibilmente, detto primo elemento di interazione ? un frammento di RBD della proteina Spike del virus Sars-Cov-2 che comprende, o ? costituito da, una sequenza amminoacidica di 78 aa comprendente l?RBM di detta proteina (72 aa) e i 3 amminoacidi contigui a detta sequenza RBM, sia all?estremit? N-terminale sia all?estremit? C-terminale (SEQ. ID. No: 6). Preferably, said first interaction element is a fragment of the RBD of the Spike protein of the Sars-Cov-2 virus which comprises, or is constituted by, an amino acid sequence of 78 aa comprising the RBM of said protein (72 aa) and the 3 amino acids contiguous to said RBM sequence, both at the N-terminal end and at the C-terminal end (SEQ. ID. No: 6).
Il fluoroforo del biosensore ? preferibilmente una proteina fluorescente o un suo frammento. A titolo esemplificativo, pu? essere impiegata la Green Fluorescent Protein (GFP). La forma nativa della GFP ? espressa da una medusa (Aequorea victoria); essa consta di 238 amminoacidi (aa) dal peso molecolare totale di 27 kDa ed ? responsabile della luminescenza verde dell?animale, tramite un meccanismo di fotoconversione della luce blu dello spettro UV-vis. La caratterizzazione della GFP ha dimostrato che le sue propriet? ottiche sono conservate se la proteina viene prodotta in sistemi biologici diversi da Aequorea victoria e che essa pu? inoltre essere ingegnerizzata e modificata ad hoc in modo che la sua emissione di fluorescenza diventi sensibile a un parametro di interesse. In tal senso, GFP pu? diventare un sensore fluorescente del suddetto parametro. Per lo scopo dell?invenzione, ? risultata pi? adatta una variante particolarmente brillante della GFP nota come EGFP o Enanched Green Fluorescent Protein. La sequenza di tale proteina ? reperibile in banca dati INH (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAB02572), Accession Number AAB02572, Versione AAB02572.1 con il nome Enhanced green fluorescent protein [Cloning vector pEGFP-1] (SEQ. ID. No: 7). The fluorophore of the biosensor is preferably a fluorescent protein or a fragment thereof. For example, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used. The native form of GFP is expressed by a jellyfish (Aequorea victoria); it consists of 238 amino acids (aa) with a total molecular weight of 27 kDa and is responsible for the green luminescence of the animal, through a mechanism of photoconversion of the blue light of the UV-vis spectrum. The characterization of GFP has shown that its optical properties are preserved if the protein is produced in biological systems other than Aequorea victoria and that it can also be engineered and modified ad hoc so that its fluorescence emission becomes sensitive to a parameter of interest. In this sense, GFP can become a fluorescent sensor of the aforementioned parameter. For the purpose of the invention, it has been found more suitable adapts a particularly bright variant of GFP known as EGFP or Enhanced Green Fluorescent Protein. The sequence of this protein is available in the INH database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAB02572), Accession Number AAB02572, Version AAB02572.1 under the name Enhanced green fluorescent protein [Cloning vector pEGFP-1] (SEQ. ID. No: 7).
Come risulter? evidente ad un tecnico del settore dalla sezione sperimentale della presente descrizione, la posizione del fluoroforo nella sequenza amminoacidica della proteina influenza anche in modo significativo la stabilit? del costrutto. Una corretta orientazione dei vari elementi che compongono il costrutto (biosensore) consente di ottenere una elevata stabilit? dell?interazione tra primo e secondo elemento di interazione, un corretto folding e dunque anche elevata selettivit? e sensibilit? nella rilevazione. As will be evident to a technician of the field from the experimental section of this description, the position of the fluorophore in the amino acid sequence of the protein also significantly influences the stability of the construct. A correct orientation of the various elements that make up the construct (biosensor) allows to obtain a high stability of the interaction between the first and second interaction element, a correct folding and therefore also high selectivity and sensitivity in the detection.
Preferibilmente, il biosensore (o sonda) dell?invenzione comprende nell?ordine - dalla estremit? N-terminale a quella C-terminale - un primo reporter o quencher (opzionale), un primo elemento di interazione, un secondo elemento di interazione e un secondo reporter (fluoroforo). Preferably, the biosensor (or probe) of the invention comprises in order - from the N-terminal to the C-terminal end - a first reporter or quencher (optional), a first interaction element, a second interaction element and a second reporter (fluorophore).
Il biosensore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte pu? comprendere inoltre uno (SEQ. ID. No: 8) o pi? peptidi Gly(His)6, preferibilmente due (SEQ. ID. No: 9), collegati all?estremit? N-terminale di detto primo elemento di interazione. Il peptide Gly(His)6 ? una sequenza di 7 amminoacidi generalmente nota nella tecnica (SEQ. ID. No: 8) e costituita da un tradizionale His-tag preceduto dagli amminoacidi metionina e glicina (Gly). Questa sequenza ? necessaria per la purificazione biochimica del biosensore, come meglio spiegato nella sezione sperimentale della descrizione che, se duplicata, consente una maggiore efficienza di purificazione. The biosensor according to any of the embodiments described herein may further comprise one (SEQ. ID. No: 8) or more Gly(His)6 peptides, preferably two (SEQ. ID. No: 9), attached to the N-terminal end of said first interaction element. The Gly(His)6 peptide is a 7 amino acid sequence generally known in the art (SEQ. ID. No: 8) and consists of a traditional His-tag preceded by the amino acids methionine and glycine (Gly). This sequence is necessary for the biochemical purification of the biosensor, as better explained in the experimental section of the description which, if duplicated, allows for greater purification efficiency.
Il peptide Gly(His)6, pu? essere coniugato covalentemente ad un quencher organico, ad esempio, mediante una reazione di click chemistry recentemente descritta in letteratura (Nature Communications, volume 9, Article number: 3307 (2018)). The peptide Gly(His)6, can be covalently conjugated to an organic quencher, for example, by a click chemistry reaction recently described in the literature (Nature Communications, volume 9, Article number: 3307 (2018)).
Pertanto, nel biosensore secondo una qualsiasi delle forme realizzative qui descritte, uno di detti pepetidi Gly(His)6 pu? essere coniugato covalentemente ad una molecola organica, preferibilmente un cromoforo non fluorescente, preferibilmente N-succinimidil estere dell?acido 4-[4-(Dimetilammino)fenilazo]benzoico (Dabcyl). Therefore, in the biosensor according to any of the embodiments described herein, one of said Gly(His)6 peptides may be covalently conjugated to an organic molecule, preferably a non-fluorescent chromophore, preferably N-succinimidyl ester of 4-[4-(Dimethylamino)phenylazo]benzoic acid (Dabcyl).
Nella forma di realizzazione che prevede il primo reporter (o quencher) in assenza della particella virale da rilevare, detto quencher si trova in prossimit? sufficiente al fluoroforo tale da consentire al quencher di spegnere la fluorescenza del fluoroforo mentre, in presenza della proteina virale, il legame della proteina virale al secondo elemento di interazione comporta l?allontanamento del cromoforo dal fluoroforo con conseguente rivelazione della presenza della particella virale mediante segnale di fluorescenza o incremento nella intensit? di detto segnale di fluorescenza. In the embodiment that provides the first reporter (or quencher) in the absence of the viral particle to be detected, said quencher is in sufficient proximity to the fluorophore to allow the quencher to quench the fluorescence of the fluorophore while, in the presence of the viral protein, the binding of the viral protein to the second interaction element causes the chromophore to move away from the fluorophore with consequent detection of the presence of the viral particle by means of a fluorescence signal or an increase in the intensity of said fluorescence signal.
Per un ottimale funzionamento del biosensore, ? anche importante la presenza di specifici linker tra ogni elemento del biosensore, oltre alla gi? discussa posizione del fluoroforo. For optimal functioning of the biosensor, the presence of specific linkers between each element of the biosensor is also important, in addition to the already discussed position of the fluorophore.
Il biosensore pu? infatti comprendere ulteriormente: The biosensor may in fact further comprise:
- un linker tra primo reporter e primo elemento di interazione (linker 1 o primo linker) comprendente, o costituito da, il motivo alanina-prolina-alanina-prolina-alanina (APAPA). Le proline garantiscono una certa rigidit? e una minore libert? di movimento tale che i reporter siano influenzati solo dal cambiamento conformazionale derivante dal legame dei due elementi di interazione. - a linker between the first reporter and the first interaction element (linker 1 or first linker) comprising, or consisting of, the alanine-proline-alanine-proline-alanine (APAPA) motif. The prolines provide a certain rigidity and a smaller freedom of movement such that the reporters are influenced only by the conformational change resulting from the binding of the two interaction elements.
- un linker flessibile tra i due elementi di interazione (linker 2 o secondo linker), preferibilmente un linker ricco in glicina, alanina, e serina che garantisce un ottimale ripiegamento dei due elementi di interazione in modo da facilitare il loro legame, - un linker tra il secondo elemento di interazione e il secondo reporter (linker 3 o terzo linker) comprendente, o costituito da, il motivo APAPA. - a flexible linker between the two interaction elements (linker 2 or second linker), preferably a linker rich in glycine, alanine, and serine that ensures optimal folding of the two interaction elements so as to facilitate their binding, - a linker between the second interaction element and the second reporter (linker 3 or third linker) comprising, or consisting of, the APAPA motif.
Nelle forme realizzative in cui ? presente, il quencher ? preferibilmente collegato all?estremit? N-terminale del primo elemento di interazione attraverso il primo linker peptidico, il secondo elemento di interazione ? collegato all?estremit? C-terminale del primo elemento di interazione attraverso il secondo linker peptidico ed il fluoroforo ? collegato all?estremit? C-terminale del secondo elemento di interazione attraverso il terzo linker peptidico. In embodiments where it is present, the quencher is preferably linked to the N-terminal end of the first interaction element through the first peptide linker, the second interaction element is linked to the C-terminal end of the first interaction element through the second peptide linker, and the fluorophore is linked to the C-terminal end of the second interaction element through the third peptide linker.
Preferibilmente, il primo linker ? un linker avente sequenza amminoacidica GTAPAPA (SEQ. ID. No: 10); e/o il secondo linker un linker avente sequenza amminoacidica scelta tra: (GLY-GLY-SER)7 (SEQ. ID No: 11), (GLY-GLY-GLY)7 (SEQ. ID No: 12), e AAASSGGGGGASGASGGAGG (SEQ. ID No: 13), pi? preferibilmente AAASSGGGGGASGASGGAGG (SEQ. ID No: 13); e/o il terzo linker ? un linker avente sequenza amminoacidica scelta tra LEAPAPA (SEQ. ID No: 14) e LEGASA (SEQ. ID No: 15), ed ? preferibilmente LEAPAPA (SEQ. ID No: 14). Preferably, the first linker is a linker having the amino acid sequence GTAPAPA (SEQ. ID No: 10); and/or the second linker is a linker having the amino acid sequence selected from: (GLY-GLY-SER)7 (SEQ. ID No: 11), (GLY-GLY-GLY)7 (SEQ. ID No: 12), and AAASSGGGGGASGASGGAGG (SEQ. ID No: 13), more preferably AAASSGGGGGASGASGGAGG (SEQ. ID No: 13); and/or the third linker is a linker having the amino acid sequence selected from LEAPAPA (SEQ. ID No: 14) and LEGASA (SEQ. ID No: 15), and is preferably LEAPAPA (SEQ. ID No: 14).
Secondo una forma realizzativa (denotata come sonda 1.0 in Figura 1 b)), l?invenzione si riferisce in particolare ad un biosensore per la rilevazione di SARS-CoV-2 comprendente: According to one embodiment (denoted as probe 1.0 in Figure 1 b)), the invention relates in particular to a biosensor for the detection of SARS-CoV-2 comprising:
la sequenza amminoacidica Gly(His)6 (SEQ. ID. No: 8) o Gly(His)6 x2 (SEQ. ID. No: 9) legata mediante primo linker GTAPAPA (SEQ. ID. No: 10) all?N-terminale del dominio RBM della proteina Spike di Sars-Cov-2 (SEQ. ID. No: 6) legata all?N-terminale dell?enzima ACE2 (residui 27-87) e avente (SEQ. ID No: 16) mediante il secondo linker avente sequenza amminoacidica AAASSGGGGGASGASGGAGG (SEQ. ID No: 13), a sua volta legato alla proteina EGFP come sopra definita (SEQ. ID. No: 7) mediante il terzo linker di sequenza SEQ. ID No: 14. the amino acid sequence Gly(His)6 (SEQ. ID. No: 8) or Gly(His)6 x2 (SEQ. ID. No: 9) linked by the first linker GTAPAPA (SEQ. ID. No: 10) to the N-terminus of the RBM domain of the Spike protein of Sars-Cov-2 (SEQ. ID. No: 6) linked to the N-terminus of the ACE2 enzyme (residues 27-87) and having (SEQ. ID No: 16) by the second linker having the amino acid sequence AAASSGGGGGASGASGGAGG (SEQ. ID No: 13), in turn linked to the EGFP protein as defined above (SEQ. ID. No: 7) by the third linker of sequence SEQ. ID No: 14.
Secondo una forma di realizzazione preferita il biosensore ? quindi un biosensore avente sequenza SEQ: ID. No 16 e/o SEQ: ID. No 17. According to a preferred embodiment the biosensor is therefore a biosensor having sequence SEQ: ID. No 16 and/or SEQ: ID. No 17.
Un?altra forma di realizzazione secondo l?invenzione (denotata come sonda 2.0 in Figura 1 c)) si riferisce in particolare ad un biosensore per la rilevazione di SARS-CoV-2 comprendente: Another embodiment according to the invention (denoted as probe 2.0 in Figure 1 c)) relates in particular to a biosensor for the detection of SARS-CoV-2 comprising:
la sequenza amminoacidica Gly(His)6 (SEQ. ID. No: 8) legata mediante il primo linker GTAPAPA (SEQ. ID. No: 10) all?N-terminale di LCB1 avente SEQ. ID. No.1 legata all?N-terminale del RBM della proteina Spike di Sars-Cov-2 (SEQ. ID. No: 6) mediante il secondo linker avente sequenza amminoacidica AAASSGGGGGASGASGGAGG (SEQ. ID No: 13), a sua volta legato alla proteina EGFP come sopra definita (SEQ. ID. No: 7) mediante il terzo linker di sequenza LEAPAPA (SEQ. ID No: 14). the amino acid sequence Gly(His)6 (SEQ. ID. No: 8) linked by the first linker GTAPAPA (SEQ. ID. No: 10) to the N-terminus of LCB1 having SEQ. ID. No.1 linked to the N-terminus of the RBM of the Spike protein of Sars-Cov-2 (SEQ. ID. No: 6) by the second linker having the amino acid sequence AAASSGGGGASGGAGG (SEQ. ID No: 13), in turn linked to the EGFP protein as defined above (SEQ. ID. No: 7) by the third linker of sequence LEAPAPA (SEQ. ID No: 14).
Secondo una forma di realizzazione preferita il biosensore ? quindi un biosensore di sequenza SEQ: ID. No 18 e/o SEQ: ID. No 19. According to a preferred embodiment the biosensor is therefore a biosensor of sequence SEQ: ID. No 18 and/or SEQ: ID. No 19.
Ancora un?altra forma di realizzazione secondo l?invenzione si riferisce in particolare ad un biosensore (denotato come sonda 3.0 in Figura 1 d)) per la rilevazione di SARS-CoV-2 comprendente: Yet another embodiment according to the invention relates in particular to a biosensor (denoted as probe 3.0 in Figure 1 d)) for the detection of SARS-CoV-2 comprising:
La sequenza amminoacidica Gly(His)6X2 (SEQ. ID No: 9) ? legata mediante il primo linker GTAPAPA (SEQ. ID. No: 10) all?N-terminale di LCB1 avente SEQ. ID. No.1 legata all?N-terminale del RBM della proteina Spike di Sars-Cov-2 (SEQ. ID. No: 6) mediante il secondo linker avente sequenza amminoacidica AAASSGGGGGASGASGGAGG (SEQ. ID No: 13), a sua volta legato alla proteina EGFP come sopra definita (SEQ. ID. No: 7) mediante il terzo linker LEAPAPA (SEQ. ID No: 14). The amino acid sequence Gly(His)6X2 (SEQ. ID No: 9) is linked by the first linker GTAPAPA (SEQ. ID No: 10) to the N-terminus of LCB1 having SEQ. ID. No.1 linked to the N-terminus of the RBM of the Spike protein of Sars-Cov-2 (SEQ. ID No: 6) by the second linker having the amino acid sequence AAASSGGGGASGGAGG (SEQ. ID No: 13), in turn linked to the EGFP protein as defined above (SEQ. ID No: 7) by the third linker LEAPAPA (SEQ. ID No: 14).
Secondo una forma di realizzazione preferita il biosensore ? quindi un biosensore avente sequenza SEQ: ID. No 20 e/o SEQ: ID.No 21. According to a preferred embodiment the biosensor is therefore a biosensor having sequence SEQ: ID. No 20 and/or SEQ: ID.No 21.
Ancora un?altra forma di realizzazione secondo l?invenzione si riferisce in particolare ad un biosensore FRET (denotato come sonda 3.0 Quenched (SQ) in Figura 1 e)) comprendente: Yet another embodiment according to the invention relates in particular to a FRET biosensor (denoted as Quenched (SQ) probe 3.0 in Figure 1 e)) comprising:
N-succinimidil estere dell?acido 4-[4-(Dimetilammino)fenilazo]benzoico (Dabcyl, Q) legato alla sequenza amminoacidica Gly(His)6X2 (SEQ. ID No: 9) a sua volta legata mediante il primo linker GTAPAPA (SEQ. ID. No: 10) all?N-terminale di LCB1 avente (SEQ. ID No: 1) legata all?N-terminale del RBM della proteina Spike di Sars-Cov-2 (SEQ. ID No: 6) mediante il secondo linker avente sequenza amminoacidica AAASSGGGGGASGASGGAGG (SEQ. ID No: 13), a sua volta legato alla proteina EGFP (SEQ. ID. No: 7) come sopra definita mediante il terzo linker LEAPAPA (SEQ. ID No: 14). N-succinimidyl ester of 4-[4-(Dimethylamino)phenylazo]benzoic acid (Dabcyl, Q) linked to the amino acid sequence Gly(His)6X2 (SEQ. ID No: 9) in turn linked by the first linker GTAPAPA (SEQ. ID No: 10) to the N-terminus of LCB1 having (SEQ. ID No: 1) linked to the N-terminus of the RBM of the Spike protein of Sars-Cov-2 (SEQ. ID No: 6) by the second linker having the amino acid sequence AAASSGGGGASGASGGAGG (SEQ. ID No: 13), in turn linked to the protein EGFP (SEQ. ID No: 7) as defined above by the third linker LEAPAPA (SEQ. ID No: 14).
Secondo una forma di realizzazione preferita il biosensore ? quindi un biosensore di SEQ: ID. No 20 e/o SEQ. ID. No: 21 avente N-succinimidil estere dell?acido 4-[4-(Dimetilammino)fenilazo]benzoico (Dabcyl, Q) legato alla prima sequenza amminoacidica Gly(His)6. According to a preferred embodiment the biosensor is therefore a biosensor of SEQ: ID. No 20 and/or SEQ. ID. No: 21 having N-succinimidyl ester of 4-[4-(Dimethylamino)phenylazo]benzoic acid (Dabcyl, Q) linked to the first amino acid sequence Gly(His)6.
Come sopra menzionato, grazie alla generazione di un segnale di fluorescenza rilevabile in risposta al legame di dette particelle virali con l?elemento di interazione, il biosensore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte pu? essere impiegato per la rilevazione di particelle virali e/o di loro frammenti, preferibilmente del virus SARS-CoV-2, all?interno di un campione biologico a scopo diagnostico. Forma pertanto oggetto dell?invenzione anche un biosensore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte per uso nella diagnosi in vitro di infezioni virali, in particolare infezioni da SARS-CoV-2. As mentioned above, by generating a detectable fluorescence signal in response to the binding of said viral particles to the interaction element, the biosensor according to any of the embodiments described herein can be used for the detection of viral particles and/or fragments thereof, preferably of the SARS-CoV-2 virus, within a biological sample for diagnostic purposes. The invention therefore also provides a biosensor according to any of the previously described embodiments for use in the in vitro diagnosis of viral infections, in particular SARS-CoV-2 infections.
Vantaggiosamente, un biosensore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte pu? essere incorporato all?interno di un dispositivo portatile per una rilevazione rapida ed efficiente di particelle virali presenti all?interno di un campione biologico di - o prelevato da - un soggetto oppure anche in un campione ambientale, ad esempio di aria o acqua. Forma dunque oggetto della presente invenzione anche un dispositivo portatile comprendente almeno un biosensore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte. Advantageously, a biosensor according to any of the embodiments described herein can be incorporated into a portable device for rapid and efficient detection of viral particles present within a biological sample of - or taken from - a subject or even in an environmental sample, for example air or water. The present invention therefore also includes a portable device comprising at least one biosensor according to any of the embodiments described above.
Per incrementare l?efficienza del dispositivo, il dispositivo potr? anche comprendere una pluralit? di detti biosensori, ad esempio due, tre, quattro o pi? biosensori. To increase the efficiency of the device, the device may also comprise a plurality of said biosensors, for example two, three, four or more biosensors.
Per agevolare la rilevazione di particelle virali presenti in un campione biologico, detto dispositivo potr? ulteriormente comprendere una camera atta a raccogliere o contenere detto campione biologico da analizzare e detto biosensore o pluralit? di biosensori. In una forma di realizzazione dell?invenzione, detta camera potr? essere realizzata in forma tubolare o cilindrica, in materiale adatto come noto ad un tecnico del settore. La camera potr? comprendere una estremit? monouso, intercambiabile, adatta per raccogliere un campione biologico di un soggetto, ad esempio un beccuccio intercambiabile per raccogliere un campione di saliva, e configurata in maniera tale da accogliere un campione liquido da analizzare e veicolarlo in corrispondenza del sensore tale che eventuali particelle virali presenti all?interno del fluido biologico del soggetto possano essere rilevate. To facilitate the detection of viral particles present in a biological sample, said device may further comprise a chamber suitable for collecting or containing said biological sample to be analyzed and said biosensor or plurality of biosensors. In an embodiment of the invention, said chamber may be made in a tubular or cylindrical shape, in suitable material as known to a person skilled in the art. The chamber may comprise a disposable, interchangeable end, suitable for collecting a biological sample from a subject, for example an interchangeable nozzle for collecting a saliva sample, and configured in such a way as to receive a liquid sample to be analyzed and convey it to the sensor such that any viral particles present within the biological fluid of the subject can be detected.
Secondo un aspetto della presente invenzione, detto dispositivo potr? ulteriormente comprendere mezzi di elaborazione di un segnale di fluorescenza prodotto da detti uno o pi? biosensori, detti mezzi essendo configurati per rilevare detto segnale di fluorescenza ed elaborarlo in un dato di output comprendente informazioni sulla presenza di particelle virali in detto campione. Esempi non limitanti di mezzi di elaborazione di detto segnale di fluorescenza comprendono qualsiasi mezzo di elaborazione noto nella tecnica. According to an aspect of the present invention, said device may further comprise means for processing a fluorescence signal produced by said one or more biosensors, said means being configured to detect said fluorescence signal and process it into an output data item comprising information on the presence of viral particles in said sample. Non-limiting examples of means for processing said fluorescence signal include any processing means known in the art.
Detto dispositivo potr? inoltre comprendere un microcontrollore che possa supervisionare le operazioni dell?intero sistema e lanciare gli algoritmi di rilevazione. Detto dispositivo potr? comprendere anche mezzi di trasmissione di dette informazioni associati a detti mezzi di elaborazione. Mezzi di trasmissione di dette informazioni comprenderanno almeno una tra unit? di visualizzazione di detto dato di output, ad esempio uno schermo, e/o unit? di trasmissione a radiofrequenza, ad esempio una unit? di trasmissione mediante Wi-Fi, Bluetooth o infrarossi; e/o unit? di trasferimento seriale, ad esempio una porta USB. Said device may also comprise a microcontroller that can supervise the operations of the entire system and launch the detection algorithms. Said device may also comprise means of transmission of said information associated with said processing means. Means of transmission of said information will comprise at least one of a display unit of said output data, for example a screen, and/or a radio frequency transmission unit, for example a transmission unit via Wi-Fi, Bluetooth or infrared; and/or a serial transfer unit, for example a USB port.
Secondo un aspetto della presente invenzione, detto dispositivo comprender? un sistema di alimentazione. According to one aspect of the present invention, said device will include a power supply system.
Come precedentemente accennato, la generazione di un segnale di fluorescenza rilevabile in risposta al riconoscimento di una particella virale e/o di un suo frammento da parte del biosensore secondo una qualsiasi delle forme realizzative qui descritte, offre il vantaggio di poter rivelare in maniera rapida, con elevate selettivit? e sensibilit?, la presenza di dette particelle virali in un campione biologico e/o ambientale. As previously mentioned, the generation of a detectable fluorescence signal in response to the recognition of a viral particle and/or a fragment thereof by the biosensor according to any of the embodiments described herein, offers the advantage of being able to rapidly detect, with high selectivity and sensitivity, the presence of said viral particles in a biological and/or environmental sample.
? pertanto oggetto della presente invenzione anche l?uso in vitro di un biosensore o di un dispositivo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte per la diagnosi di infezioni virali. Secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, dette infezioni virali sono in particolare infezioni da SARS-CoV-2. ? therefore, the object of the present invention is also the in vitro use of a biosensor or device according to any of the embodiments described herein for the diagnosis of viral infections. According to a preferred embodiment of the present invention, said viral infections are in particular SARS-CoV-2 infections.
Un ulteriore aspetto dell?invenzione si riferisce ad un metodo in vitro per rivelare la presenza di una particella virale e/o di un suo frammento all?interno di un campione biologico e/o per diagnosticare in vitro una infezione virale comprendente i seguenti passaggi: A further aspect of the invention relates to an in vitro method for detecting the presence of a viral particle and/or a fragment thereof within a biological sample and/or for diagnosing a viral infection in vitro comprising the following steps:
i. mettere in contatto un campione biologico da analizzare con un biosensore o con un dispositivo comprendente uno o pi? biosensori secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte; e i. contacting a biological sample to be analyzed with a biosensor or a device comprising one or more biosensors according to any of the embodiments described herein; and
ii. rilevare reazioni di legame con una particella virale e/o un suo frammento per mezzo di un segnale di fluorescenza o per mezzo di un incremento della intensit? di fluorescenza del segnale emesso da detti uno o pi? biosensori. Un campione biologico da analizzare secondo la presente invenzione pu? essere un campione di saliva, sangue, urina, muco, mucosa della rinofaringe e/o della faringe, essudato, espettorato, e/o espirato di un soggetto. ii. detect binding reactions with a viral particle and/or a fragment thereof by means of a fluorescence signal or by means of an increase in the fluorescence intensity of the signal emitted by said one or more biosensors. A biological sample to be analyzed according to the present invention may be a sample of saliva, blood, urine, mucus, nasopharyngeal and/or pharyngeal mucosa, exudate, sputum, and/or expired breath of a subject.
Il campione da sottoporre all?analisi mediante un biosensore o un dispositivo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte pu? essere un campione ottenuto da un soggetto asintomatico, oppure da un soggetto che gi? presenti sintomi di infezione virale, come ad esempio, nel caso di infezione da SARS-CoV-2, sintomi di moderata entit?, quali febbre, tosse respiro corto, disturbi gastrointestinali, oppure sintomi pi? severi, quali polmonite. The sample to be tested by a biosensor or device according to any of the embodiments described herein may be a sample obtained from an asymptomatic subject, or from a subject who already presents symptoms of viral infection, such as, in the case of SARS-CoV-2 infection, moderate symptoms, such as fever, cough, shortness of breath, gastrointestinal disturbances, or more severe symptoms, such as pneumonia.
Secondo un aspetto della presente invenzione, il metodo qui descritto pu? comprendere un ulteriore passaggio: According to one aspect of the present invention, the method described herein may comprise a further step:
iii. diagnosticare detta infezione virale quando detto biosensore e/o dispositivo produce un segnale di fluorescenza o una variazione, in particolare un incremento, della intensit? di fluorescenza del segnale in risposta al legame con detta particella virale e/o un suo frammento. Come precedentemente accennato, la produzione di un segnale deriva da una variazione del trasferimento di energia di risonanza tra primo e secondo elemento di interazione indotta dalla reazione di legame biologico con una particella virale o un suo frammento, la quale ? in grado di determinare un cambiamento nella fluorescenza del fluoroforo. In una forma di realizzazione secondo la presente invenzione, detta particella virale ? una particella di SARS-CoV-2 e/o un suo frammento. iii. diagnosing said viral infection when said biosensor and/or device produces a fluorescence signal or a variation, in particular an increase, in the fluorescence intensity of the signal in response to binding to said viral particle and/or a fragment thereof. As previously mentioned, the production of a signal derives from a variation in the resonance energy transfer between the first and second interaction element induced by the biological binding reaction with a viral particle or a fragment thereof, which is capable of determining a change in the fluorescence of the fluorophore. In an embodiment according to the present invention, said viral particle is a SARS-CoV-2 particle and/or a fragment thereof.
Vantaggiosamente, la capacit? del biosensore della presente invenzione di rilevare intere particelle virali pu? essere utilizzata anche per la rilevazione di particelle virali presenti nell?ambiente; pertanto, ? oggetto della presente invenzione anche l?uso di un biosensore o di un dispositivo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte per la rilevazione di particelle virali in matrici o campioni ambientali, quali ad esempio aria o acqua. Advantageously, the ability of the biosensor of the present invention to detect entire viral particles can also be used for the detection of viral particles present in the environment; therefore, the use of a biosensor or a device according to any of the previously described embodiments for the detection of viral particles in environmental matrices or samples, such as for example air or water, is also an object of the present invention.
Pertanto, forma oggetto della presente invenzione anche l?uso del biosensore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte per rilevare la presenza di una particella virale e/o di un suo frammento all?interno di un campione prelevato dall?ambiente nonch? un metodo per rilevare la presenza di una particella virale e/o di un suo frammento all?interno di un campione prelevato dall?ambiente, il metodo comprendendo i seguenti passaggi: Therefore, the present invention also relates to the use of the biosensor according to any of the embodiments described to detect the presence of a viral particle and/or a fragment thereof within a sample taken from the environment as well as a method for detecting the presence of a viral particle and/or a fragment thereof within a sample taken from the environment, the method comprising the following steps:
i. mettere in contatto un campione prelevato dall?ambiente con un biosensore o con un dispositivo comprendente uno o pi? biosensori secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte; e i. contacting a sample taken from the environment with a biosensor or a device comprising one or more biosensors according to any of the embodiments described herein; and
ii. rilevare reazioni di legame con una particella virale e/o un suo frammento per mezzo di un segnale di fluorescenza o un incremento della intensit? di fluorescenza del segnale emesso da detto uno o pi? biosensori. ii. detect binding reactions with a viral particle and/or a fragment thereof by means of a fluorescence signal or an increase in the fluorescence intensity of the signal emitted by said one or more biosensors.
Secondo un aspetto della presente invenzione, campioni prelevati da matrici ambientali analizzabili mediante un biosensore o un dispositivo secondo il metodo qui descritto comprendono preferibilmente campioni di aria e/o di acqua. According to one aspect of the present invention, samples taken from environmental matrices analyzable by a biosensor or device according to the method described herein preferably include air and/or water samples.
Il biosensore secondo una qualsiasi delle forme realizzative qui descritte ?, come detto, molto versatile e si presta anche a diverse ulteriori applicazioni. The biosensor according to any of the embodiments described here is, as mentioned, very versatile and also lends itself to several further applications.
Ad esempio, pu? essere impiegato come sonda fluorescente in saggi cellulari inter alia per selezionare composti/trattamenti in grado di interferire con l?interazione tra Spike e ACE2. For example, it can be used as a fluorescent probe in cell-based assays inter alia to select compounds/treatments able to interfere with the interaction between Spike and ACE2.
? inoltre oggetto della presente invenzione anche un procedimento per la preparazione di un biosensore o proteina chimerica secondo una qualsiasi delle forme realizzative qui descritte basato su tecnologia del DNA ricombinante. ? furthermore, the present invention also provides a process for the preparation of a biosensor or chimeric protein according to any of the embodiments described herein based on recombinant DNA technology.
In particolare, il procedimento comprende i seguenti passaggi: clonaggio in vettore di espressione procariotica, trasformazione in cellule procariotiche di E. coli BL21, espressione della proteina mediante induzione, raccolta e lisi delle cellule e purificazione della proteina da lisato cellulare mediante cromatografia di affinit?. In particular, the procedure includes the following steps: cloning into a prokaryotic expression vector, transformation into prokaryotic E. coli BL21 cells, expression of the protein by induction, collection and lysis of the cells, and purification of the protein from cell lysate by affinity chromatography.
Per quanto detto sopra, formano oggetto della presente invenzione anche un acido nucleico che codifica per la proteina chimerica secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, nonch? un vettore di espressione che comprende detto acido nucleico, operativamente connesso a sequenze controllo che ne consentono l?espressione in una cellula procariotica cos? come una cellula procariotica geneticamente ingegnerizzata con l?acido nucleico o il vettore di espressione summenzionati, preferibilmente in cui detta cellula procariotica ? un battere grampositivo o negativo, pi? preferibilmente E. Coli. In accordance with the above, the present invention also includes a nucleic acid encoding the chimeric protein according to any of the embodiments described herein, as well as an expression vector comprising said nucleic acid, operably connected to control sequences that allow its expression in a prokaryotic cell as well as a prokaryotic cell genetically engineered with the above-mentioned nucleic acid or expression vector, preferably wherein said prokaryotic cell is a gram-positive or gram-negative bacterium, more preferably E. Coli.
Forma oggetto della presente invenzione anche un biosensore ottenibile mediante detto procedimento. The present invention also relates to a biosensor obtainable using the said process.
Un aspetto della presente invenzione riguarda anche un kit per la rilevazione di una particella virale e/o un suo frammento e/o per la diagnosi di una infezione virale comprendente un biosensore e/o un dispositivo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, e uno o pi? reagenti di controllo. An aspect of the present invention also relates to a kit for the detection of a viral particle and/or a fragment thereof and/or for the diagnosis of a viral infection comprising a biosensor and/or a device according to any of the embodiments described herein, and one or more control reagents.
Reagenti di controllo adatti ad essere impiegati in un kit secondo la presente invenzione includono reagenti di controllo negativo, ad esempio soluzioni comprendenti proteine, quali proteine virali, che non siano in grado di legare in maniera specifica detto primo elemento di interazione del biosensore. In una forma di realizzazione secondo la presente invenzione, detto kit comprende una soluzione di BSA, della proteasi mPRO di SARS-CoV-2 come reagente di controllo negativo. In generale, reagenti di controllo adatti sono quelli comunemente noti nella tecnica purch? non abbiano affinit? per il biosensore o meglio per il primo elemento di interazione del biosensore. Suitable control reagents for use in a kit according to the present invention include negative control reagents, for example solutions comprising proteins, such as viral proteins, which are not able to specifically bind said first biosensor interaction element. In an embodiment according to the present invention, said kit comprises a solution of BSA, the SARS-CoV-2 mPRO protease as a negative control reagent. In general, suitable control reagents are those commonly known in the art as long as they have no affinity for the biosensor or rather for the first biosensor interaction element.
Sono di seguito riportati esempi che hanno lo scopo di illustrare meglio i biosensori e le metodologie rivelate nella presente descrizione, tali esempi non sono tuttavia in alcun modo da considerare come una limitazione della precedente descrizione e delle rivendicazioni annesse. The following are examples intended to better illustrate the biosensors and methodologies disclosed in this description, however, such examples are in no way to be considered as a limitation of the preceding description and the attached claims.
PARTE SPERIMENTALE EXPERIMENTAL PART
Validazione computazionale del disegno Computational validation of the design
La sequenza del biosensore (sonda 1.0) ? stata costruita a partire dai dettagli strutturali dell'interazione RBD/ACE2 completamente risolti attraverso crioscopia elettronica (PDB: 6M0J). Per le sonde 2.0 e 3.0, i dettagli strutturali usati sono invece riferiti al co-cristallo della proteina Spike, e in particolare il suo dominio RBD, con la mini-proteina LCB1 (PDB: 7JZU). The biosensor sequence (probe 1.0) was constructed starting from the structural details of the RBD/ACE2 interaction fully resolved by electron cryoscopy (PDB: 6M0J). For probes 2.0 and 3.0, the structural details used are instead referred to the co-crystal of the Spike protein, and in particular its RBD domain, with the mini-protein LCB1 (PDB: 7JZU).
Un primo set di simulazioni ? stato eseguito su sei diversi costrutti a partire da LCB1, collegato prima attraverso C-terminale e poi attraverso N-terminale, a RBM e RDB con le sequenze (GLY-GLY-SER)7, (GLY-GLY-GLY)7 e AAASSGGGGGASGASGGAGG. Essendo risultate abbastanza simili le fluttuazioni dei diversi linker, si ? deciso di impiegare il linker AAASSGGGGGASGASGGAGG perch? gi? in uso. Tali simulazioni (effettuate con dinamica atomistica di 500 ns con il force field CHARMM36) avevano anche lo scopo di capire la stabilit? del folding di RBM e RBD nella sonda e decidere quale fosse il pi? piccolo frammento della Spike Protein impiegabile. Tale analisi ha permesso di identificare il frammento di RBM come sufficientemente stabile per poter essere impiegato nel costrutto col vantaggio di avere un peso molecolare inferiore a RBD. In un secondo set di simulazioni si ? agganciata la GFP, prima attraverso il C-terminale di LCB1, poi attraverso il N-terminale di RBD. Stessa cosa ? stata ripetuta sostituendo RBD con RBM. In tutti i casi la GFP ? stata collegata attraverso due linker di sequenza LEAPAPA e LEGASA. Dall?analisi ? emerso che la posizione alla quale legare la GFP ha un peso importante sulla stabilit? del costrutto. Il legame di GFP attraverso il C-terminale di LCB1 ne altera significativamente il folding e perturba l?interazione LCB1/RBD, avendo la mini-proteina LCB1 un peso molecolare molto inferiore a quello della GFP. Si ? quindi optato per una configurazione con aggancio di GFP attraverso C-terminale di RBD/RBM, aggancio di LCB1 attraverso N-terminale di RBD/RBM e aggancio del quencher attraverso N-terminale di LCB1. Le simulazioni sono state analizzate in dettaglio anche allo scopo di predire l?efficienza di quenching dell?emissione di GFP, nell?evenienza che un quencher organico fosse coniugato in corrispondenza dell?elemento Reporter 1 per utilizzare la sonda in modalit? ?molecular beacon?. Questa ? stata calcolata sulla base delle fluttuazioni di lunghezza dei due linkers LEAPAPA e LEGASA e della distanza e orientazione relativa di cromoforo e quencher. Dall?analisi emerge che la combinazione di LEAPAPA con RBM rappresenta il costrutto pi? promettente (Figura 2). A first set of simulations was performed on six different constructs starting from LCB1, linked first through the C-terminus and then through the N-terminus, to RBM and RDB with the sequences (GLY-GLY-SER)7, (GLY-GLY-GLY)7 and AAASSGGGGGASGASGGAGG. Since the fluctuations of the different linkers were quite similar, it was decided to use the AAASSGGGGASGASGGAGG linker because it was already in use. These simulations (performed with atomistic dynamics of 500 ns with the CHARMM36 force field) also had the aim of understanding the folding stability of RBM and RBD in the probe and deciding which was the smallest fragment of the Spike Protein that could be used. This analysis allowed us to identify the RBM fragment as sufficiently stable to be used in the construct with the advantage of having a lower molecular weight than RBD. In a second set of simulations, the RBM fragment was identified as stable enough to be used in the construct with the advantage of having a lower molecular weight than RBD. GFP was attached, first through the C-terminus of LCB1, then through the N-terminus of RBD. The same thing was repeated replacing RBD with RBM. In all cases, GFP was linked through two linkers of the sequence LEAPAPA and LEGASA. The analysis showed that the position to which GFP is attached has an important weight on the stability of the construct. The binding of GFP through the C-terminus of LCB1 significantly alters its folding and perturbs the LCB1/RBD interaction, since the mini-protein LCB1 has a much lower molecular weight than GFP. We therefore opted for a configuration with GFP attachment through the C-terminus of RBD/RBM, LCB1 attachment through the N-terminus of RBD/RBM and attachment of the quencher through the N-terminus of LCB1. The simulations were also analyzed in detail in order to predict the quenching efficiency of GFP emission, in the event that an organic quencher was conjugated to the Reporter 1 element to use the probe in ?molecular beacon? mode. This was calculated on the basis of the length fluctuations of the two linkers LEAPAPA and LEGASA and of the distance and relative orientation of chromophore and quencher. The analysis shows that the combination of LEAPAPA with RBM represents the most promising construct (Figure 2).
Produzione del prototipo in sistema biologico e sua purificazione Production of the prototype in a biological system and its purification
La sequenza corrispondente alla sonda 1.0 (SEQ: ID. No 16) ? stata clonata in un vettore di espressione procariotica (pET11a). La strategia di clonaggio (Figura 3) si ? basata sull'amplificazione PCR dei cDNA di RBM, ACE2 e GFP utilizzando primer disegnati ad hoc per consentirne la fusione mediante overlap extension PCR (OE-PCR). The sequence corresponding to probe 1.0 (SEQ: ID. No 16) was cloned into a prokaryotic expression vector (pET11a). The cloning strategy (Figure 3) was based on PCR amplification of RBM, ACE2 and GFP cDNAs using primers designed specifically to allow their fusion by overlap extension PCR (OE-PCR).
NdeI -G-(H)6 tag- KpnI-RL- IAW-RBM-RVV- NotI -FL- ACE2 residui 27-87- XhoI -RL-EGFP- BamHI NdeI -G-(H)6 tag- KpnI-RL- IAW-RBM-RVV- NotI -FL- ACE2 residues 27-87- XhoI -RL-EGFP- BamHI
In seguito a simulazioni in silico del biosensore 1.0, la sequenza ? stata ottimizzata in modo tale da ottenere la sonda 2.0. Following in silico simulations of biosensor 1.0, the sequence was optimized to obtain probe 2.0.
La sequenza nucleotidica corrispondente al segmento The nucleotide sequence corresponding to the segment
KpnI (GT) ? APAPA-NheI- LCB1 - NotI ? Linker Flex ? IAW RBM RVV ? XhoI e al segmento KpnI (GT) ? APAPA-NheI- LCB1 - NotI ? Linker Flex? IAW RBM RVV ? XhoI and to the segment
KpnI (GT) ? APAPA-NheI -1LCB1 -NotI ? Linker Flex ? RBD ? XhoI sono state acquistate gi? inserite in vettore plasmidico (ThermoFisher ? GeneArt) e successivamente subclonate nel vettore contenente la sonda 1.0 mediante tecnica ?cut and paste? utilizzando gli enzimi di restrizione KpnI/XhoI. KpnI (GT) ? APAPA-NheI -1LCB1 -NotI ? Linker Flex ? RBD ? XhoI were purchased already inserted into a plasmid vector (ThermoFisher ? GeneArt) and subsequently subcloned into the vector containing probe 1.0 using the ?cut and paste? technique using the KpnI/XhoI restriction enzymes.
I plasmidi contenenti la sonda 2.0 RBM e la sonda 2.0 RBD sono stati utilizzati per trasformare strain di E.Coli del tipo BL21 Star (DE3). L?espressione della proteina ? stata indotta mediante l?aggiunta di IPTG al mezzo di crescita e monitorata tramite lisi del pellet batterico ed elettroforesi su gel di poliacrilammide. Il pellet batterico ? stato quindi raccolto in seguito ad incubazione overnight, lisato mediante l?utilizzo di un tampone di lisi (Lysis Buffer) e sottoposto a chiarificazione per raccogliere il surnatante, presumibilmente contenente la proteina indotta. Come si pu? notare dalla Figura 4b, ? stato possibile ottenere solo un buon livello di espressione del biosensore 2.0 RBM. Il surnatante ? stato quindi sottoposto a purificazione mediante l?utilizzo di resine Plasmids containing the 2.0 RBM probe and the 2.0 RBD probe were used to transform E. Coli strains of the BL21 Star (DE3) type. Protein expression was induced by adding IPTG to the growth medium and monitored by lysis of the bacterial pellet and electrophoresis on polyacrylamide gel. The bacterial pellet was then collected after overnight incubation, lysed using a lysis buffer (Lysis Buffer) and subjected to clarification to collect the supernatant, presumably containing the induced protein. As can be seen in Figure 4b, only a good level of expression of the 2.0 RBM biosensor could be obtained. The supernatant was then subjected to purification using resins
contenenti ioni Ni2+ in grado di complessare i residui di istidina presenti nel frammento containing Ni2+ ions capable of complexing the histidine residues present in the fragment
His-Tag all?N terminale della proteina. La proteina ? stata eluita dalla resina mediante buffer a concentrazioni crescenti di imidazolo (Buffer E1-E4) e raccolta in frazioni da 1 mL ciascuno. Le frazioni sono state successivamente unite e sottoposte a dialisi in Storage Buffer per sostituire il tampone nel quale ? presente la proteina con uno privo di imidazolo, pi? adatto a permettere il folding. La soluzione contenente il biosensore ? stata quindi concentrata utilizzando delle colonnine specifiche con un cut-off di 10 kDa. La concentrazione finale del biosensore ? stata stimata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide utilizzando come standard soluzioni a concentrazioni note di BSA (Figura 4). Inoltre, al fine di migliorare la resa di purificazione, la sequenza KpnI-2.0RBM-XhoI ? stata subclonata in un plasmide contenente a monte due residui di His-Tag, ottenendo cos? la sonda 3.0. Il biosensore 3.0 ? stato quindi purificato utilizzando la medesima procedura sopra descritta (Figura 5). His-Tag at the N terminus of the protein. The protein was eluted from the resin using buffers with increasing concentrations of imidazole (Buffer E1-E4) and collected in fractions of 1 mL each. The fractions were then combined and dialyzed in Storage Buffer to replace the buffer containing the protein with one without imidazole, more suitable for allowing folding. The solution containing the biosensor was then concentrated using specific columns with a cut-off of 10 kDa. The final concentration of the biosensor was estimated by polyacrylamide gel electrophoresis using solutions with known concentrations of BSA as standards (Figure 4). Furthermore, in order to improve the purification yield, the sequence KpnI-2.0RBM-XhoI was subcloned into a plasmid containing two upstream residues of His-Tag, thus obtaining the probe 3.0. The biosensor 3.0 was It was then purified using the same procedure described above (Figure 5).
Determinazione della minima concentrazione rilevabile della sonda in saliva Determination of the minimum detectable concentration of the probe in saliva
Le sonde 2.0 e 3.0 (da ora denominati Sonda S o semplicemente S) sono stati testati al fine di determinare la loro minima concentrazione rilevabile in un campione biologico salivare. A questo scopo, ? stato allestito un saggio in piastra in cui l?intensit? di fluorescenza ? stata valutata in seguito all?aggiunta di diverse concentrazioni dei due prototipi di sonda S alla saliva e misurata tramite lettore multipiastra EnSight. Probes 2.0 and 3.0 (hereafter referred to as Probe S or simply S) were tested to determine their minimum detectable concentration in a salivary biological sample. For this purpose, a plate assay was set up in which the fluorescence intensity was evaluated following the addition of different concentrations of the two S probe prototypes to saliva and measured using an EnSight multi-plate reader.
5 mL del campione biologico sono stati raccolti in una provetta da 50 mL circa 12 ore prima dell?esperimento e conservato in frigo a 4?C. Particolari accortezze per la raccolta sono state: I) evitare il consumo da parte dei donatori di alcool, nicotina, caffeina almeno nelle due ore precedenti il prelievo; II) effettuare il prelievo almeno un?ora dopo il consumo del pasto; III) il prelievo fatto prima di effettuare l?igiene dentale quotidiana. La mattina dell?esperimento, il fluido biologico ? stato centrifugato a 1200 rpm per 5 minuti e il supernatante ? stato raccolto e distribuito nei pozzetti. 5 mL of the biological sample were collected in a 50 mL test tube approximately 12 hours before the experiment and stored in the refrigerator at 4?C. Special precautions for the collection were: I) avoid the consumption of alcohol, nicotine, caffeine by the donors at least two hours before the collection; II) carry out the collection at least one hour after the consumption of the meal; III) the collection was done before carrying out daily dental hygiene. On the morning of the experiment, the biological fluid was centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes and the supernatant was collected and distributed in the wells.
Le concentrazioni delle Sonde S in prova, preparate in Storage Buffer, sono state 0,05-0,1-0,5-1-5-10-100 nM. In particolare, sono state preparate diluizioni seriali concentrate 200x rispetto alla concentrazione in prova e mescolate direttamente nel pozzetto con la saliva, in un volume finale di 100 ?L. The concentrations of the S Probes under test, prepared in Storage Buffer, were 0.05-0.1-0.5-1-5-10-100 nM. In particular, serial dilutions concentrated 200x with respect to the concentration under test were prepared and mixed directly in the well with saliva, in a final volume of 100 μL.
I risultati ottenuti sono mostrati nella Figura 6. The obtained results are shown in Figure 6.
PoC della risposta del sensore a concentrazioni crescenti di Spike purificata PoC of sensor response to increasing concentrations of purified Spike
Sono stati effettuati saggi volti a dimostrare la capacit? del biosensore di essere sensibile alla Spike e, eventualmente, al virus Sars-Cov2 in un fluido biologico. Tests were carried out to demonstrate the biosensor's ability to be sensitive to the Spike and, possibly, to the Sars-Cov2 virus in a biological fluid.
Per dimostrare questa ipotesi, abbiamo allestito un saggio in cui l'intensit?? di fluorescenza della Sonda S ? stata valutata in seguito all?aggiunta di concentrazioni crescenti della proteina purificata Spike (Sp) e della proteina BSA, usata come controllo. Inoltre, una eventuale specificit?? della sonda S nel riconoscimento della Spike ? stata valutata mettendo in relazione le intensit?? di fluorescenza di S con la sola EGFP. Le proteine sono state mescolate direttamente nel pozzetto, in tampone Storage Buffer, e incubate per diversi tempi (da 0 a 3 ore). In grafico (Figura 7), la misura dell'intensit?? della fluorescenza ottenuta per i diversi campioni dopo 30 e 60 minuti di incubazione, tempistiche che potrebbero essere ottimali per scopi diagnostici. L'intensit?? ? stata normalizzata al valore della Sonda S e di EGFP, in assenza della proteina Spike (Figura 7). To demonstrate this hypothesis, we set up an assay in which the fluorescence intensity of Probe S was assessed following the addition of increasing concentrations of the purified Spike protein (Sp) and of the BSA protein, used as a control. Furthermore, a possible specificity of the S probe in recognizing the Spike was assessed by comparing the fluorescence intensities of S with EGFP alone. The proteins were mixed directly in the well, in Storage Buffer, and incubated for different times (from 0 to 3 hours). The graph (Figure 7) shows the measurement of the fluorescence intensity obtained for the different samples after 30 and 60 minutes of incubation, times that could be optimal for diagnostic purposes. The intensity was normalized to the value of Probe S and EGFP, in the absence of the Spike protein (Figure 7).
Reazione di click chemistry sul biosensore per l?inserimento del quencher. Click chemistry reaction on the biosensor for quencher insertion.
Per il secondo tipo di misurazione in fluorescenza, sfruttabile per la rilevazione del virus SarsCov2 in fluido biologico, ovvero quello relativo alla misurazione dello switch tra la forma spenta (OFF) e accesa (ON) di GFP, nel caso in cui la sonda venga usata come sonda ?molecular beacon?, abbiamo utilizzato un approccio di marcatura per introdurre il quencher mediante reazione di click chemistry di una molecola di quencher Dabcyl, sul primo residuo del tag Gly-His presente nella sonda 2.0. La procedura descritta da Manuel C. Martos-Maldonado et al., in NATURE COMMUNICATIONS | (2018) 9:3307 | DOI: 10.1038/s41467-018-05695-3, che si intende qui interamente incorporato per riferimento, ? stata ottimizzata al fine di adattarla al nostro biosensore 2.0 RBM. In particolare, sono stati cambiati i tempi di durata delle reazioni e minimizzata la percentuale di solvente organico per evitare fenomeni di denaturazione proteica. For the second type of fluorescence measurement, which can be used for the detection of the SarsCov2 virus in biological fluid, i.e. the measurement of the switch between the OFF and ON form of GFP, in the case in which the probe is used as a ?molecular beacon? probe, we used a labeling approach to introduce the quencher by click chemistry reaction of a Dabcyl quencher molecule, on the first residue of the Gly-His tag present in the probe 2.0. The procedure described by Manuel C. Martos-Maldonado et al., in NATURE COMMUNICATIONS | (2018) 9:3307 | DOI: 10.1038/s41467-018-05695-3, which is hereby incorporated in its entirety by reference, has been optimized in order to adapt it to our RBM biosensor 2.0. In particular, the reaction duration times were changed and the percentage of organic solvent was minimized to avoid protein denaturation phenomena.
In dettaglio, la reazione ? stata effettuata seguendo 3 step (Figura 8): In detail, the reaction was carried out following 3 steps (Figure 8):
1) 25 mg di Dabcyl-NHS estere (A) sono stati fatti reagire con un eccesso del crosslinker NH2-DBCO (B). La reazione ? stata monitorata mediante cromatografia TLC e il prodotto (C) ? stato precipitato mediante aggiunta di ghiaccio. 1) 25 mg of Dabcyl-NHS ester (A) was reacted with an excess of the crosslinker NH2-DBCO (B). The reaction was monitored by TLC chromatography and the product (C) was precipitated by the addition of ice.
2) 100 ?L di Dabcyl-DBCO 10 mM sono stati fatti reagire con una quantit? equimolare del prodotto (D) contenente il gruppo azide N3 per 1 ora a temperatura ambiente, per ottenere il prodotto (E). 2) 100 ?L of 10 mM Dabcyl-DBCO was reacted with an equimolar amount of product (D) containing the N3 azide group for 1 hour at room temperature, to obtain product (E).
3) 20 o 30 equivalenti del prodotto (E) sono stati fatti reagire con il biosensore 2.0 RBM in solvente acetonitrile, per una o due overnight a 4?C, rispettivamente, ottenendo presumibilmente i biosensori con quencher, denominati SQ1 e SQ2 (F). 3) 20 or 30 equivalents of product (E) were reacted with the 2.0 RBM biosensor in acetonitrile solvent, for one or two overnights at 4°C, respectively, presumably obtaining the quenched biosensors, designated SQ1 and SQ2 (F).
SQ1 e SQ2 sono stati successivamente dializzati in Storage Buffer per 24 ore a 4?C e concentrati. La concentrazione finale ? stata quindi stimata come precedentemente descritto. Successivamente, sono stati effettati saggi volti a capire se il quencher coniugato con RBM 3.0 mostri un quenching della fluorescenza della EGFP rispetto alla sonda non coniugata (Figura 9). SQ1 and SQ2 were subsequently dialyzed in Storage Buffer for 24 h at 4?C and concentrated. The final concentration was then estimated as previously described. Subsequently, assays were performed to understand whether the RBM 3.0-conjugated quencher shows quenching of EGFP fluorescence compared to the unconjugated probe (Figure 9).
LISTA SEQUENZE NELLA DESCRIZIONE LIST OF SEQUENCES IN THE DESCRIPTION
SEQ. ID. No: 1 - Frammento ACE-2 SEQ. ID. No: 1 - Fragment ACE-2
STIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPL QE STIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPL QE
SEQ. ID No: 2 - peptido-mimetico del recettore ACE2 denominato LCB1 SEQ. ID No: 2 - ACE2 receptor peptide mimetic called LCB1
GGSDKEWILQKIYEIMRLLDELGHAEASMRVSDLIYEFMKKGDERLLEEAERLLEEVERGS GGSDKEWILQKIYEIMRLLDELGHAEASMRVSDLIYEFMKKGDERLLEEAERLLEEVERGS
SEQ. ID No: 3 - peptido-mimetico del recettore ACE2 denominato LCB3 SEQ. ID No: 3 - ACE2 receptor peptide mimetic called LCB3
MSHHHHHHHHSENLYFQSGSASHMGGSGGLNDDELHMLMTDLVYEALHFAKDEEIKKRVFQLFELAD MSHHHHHHHHSENLYFQSGSASHMGGSGGLNDDELHMLMTDLVYEALHFAKDEEIKKRVFQLFELAD
KAYKNNDRQKLEKVVEELKELLERLLSGSGGSGLEGGGS KAYKNNDRQKLEKVVEELKELLERLLSGSGGSGLEGGGS
SEQ. ID No: 4 - RBD della proteina Spike del virus Sars-Cov-2 SEQ. ID No: 4 - RBD of the Spike protein of the Sars-Cov-2 virus
(SEQUENCE 1273 AA; 141178 MW; B17BE6D9F1C4EA34 CRC64) (SEQUENCE 1273 AA; 141178 MW; B17BE6D9F1C4EA34 CRC64)
MFVFLVLLPL VSSQCVNLTT RTQLPPAYTN SFTRGVYYPD KVFRSSVLHS TQDLFLPFFS MFVFLVLLPL VSSQCVNLTT RTQLPPAYTN SFTRGVYYPD KVFRSSVLHS TQDLFLPFFS
NVTWFHAIHV SGTNGTKRFD NPVLPFNDGV YFASTEKSNI IRGWIFGTTL DSKTQSLLIV NVTWFHAIHV SGTNGTKRFD NPVLPFNDGV YFASTEKSNI IRGWIFGTTL DSKTQSLLIV
NNATNVVIKV CEFQFCNDPF LGVYYHKNNK SWMESEFRVY SSANNCTFEY VSQPFLMDLE NNATNVVIKV CEFQFCNDPF LGVYYHKNNK SWMESEFRVY SSANNCTFEY VSQPFLMDLE
GKQGNFKNLR EFVFKNIDGY FKIYSKHTPI NLVRDLPQGF SALEPLVDLP IGINITRFQT GKQGNFKNLR EFVFKNIDGY FKIYSKHTPI NLVRDLPQGF SALEPLVDLP IGINITRFQT
LLALHRSYLT PGDSSSGWTA GAAAYYVGYL QPRTFLLKYN ENGTITDAVD CALDPLSETK LLALHRSYLT PGDSSSGWTA GAAAYYVGYL QPRTFLLKYN ENGTITDAVD CALDPLSETK
CTLKSFTVEK GIYQTSNFRV QPTESIVRFP NITNLCPFGE VFNATRFASV YAWNRKRISN CTLKSFTVEK GIYQTSNFRV QPTESIVRFP NITNLCPFGE VFNATRFASV YAWNRKRISN
CVADYSVLYN SASFSTFKCY GVSPTKLNDL CFTNVYADSF VIRGDEVRQI APGQTGKIAD CVADYSVLYN SASFSTFKCY GVSPTKLNDL CFTNVYADSF VIRGDEVRQI APGQTGKIAD
YNYKLPDDFT GCVIAWNSNN LDSKVGGNYN YLYRLFRKSN LKPFERDIST EIYQAGSTPC YNYKLPDDFT GCVIAWNSNN LDSKVGGNYN YLYRLFRKSN LKPFERDIST EIYQAGSTPC
NGVEGFNCYF PLQSYGFQPT NGVGYQPYRV VVLSFELLHA PATVCGPKKS TNLVKNKCVN NGVEGFNCYF PLQSYGFQPT NGVGYQPYRV VVLSFELLHA PATVCGPKKS TNLVKNKCVN
FNFNGLTGTG VLTESNKKFL PFQQFGRDIA DTTDAVRDPQ TLEILDITPC SFGGVSVITP FNFNGLTGTG VLTESNKKFL PFQQFGRDIA DTTDAVRDPQ TLEILDITPC SFGGVSVITP
GTNTSNQVAV LYQDVNCTEV PVAIHADQLT PTWRVYSTGS NVFQTRAGCL IGAEHVNNSY GTNTSNQVAV LYQDVNCTEV PVAIHADQLT PTWRVYSTGS NVFQTRAGCL IGAEHVNNSY
ECDIPIGAGI CASYQTQTNS PRRARSVASQ SIIAYTMSLG AENSVAYSNN SIAIPTNFTI ECDIPIGAGI CASYQTQTNS PRRARSVASQ SIIAYTMSLG AENSVAYSNN SIAIPTNFTI
SVTTEILPVS MTKTSVDCTM YICGDSTECS NLLLQYGSFC TQLNRALTGI AVEQDKNTQE SVTTEILPVS MTKTSVDCTM YICGDSTECS NLLLQYGSFC TQLNRALTGI AVEQDKNTQE
VFAQVKQIYK TPPIKDFGGF NFSQILPDPS KPSKRSFIED LLFNKVTLAD AGFIKQYGDC VFAQVKQIYK TPPIKDFGGF NFSQILPDPS KPSKRSFIED LLFNKVTLAD AGFIKQYGDC
LGDIAARDLI CAQKFNGLTV LPPLLTDEMI AQYTSALLAG TITSGWTFGA GAALQIPFAM LGDIAARDLI CAQKFNGLTV LPPLLTDEMI AQYTSALLAG TITSGWTFGA GAALQIPFAM
QMAYRFNGIG VTQNVLYENQ KLIANQFNSA IGKIQDSLSS TASALGKLQD VVNQNAQALN QMAYRFNGIG VTQNVLYENQ KLIANQFNSA IGKIQDSLSS TASALGKLQD VVNQNAQALN
TLVKQLSSNF GAISSVLNDI LSRLDKVEAE VQIDRLITGR LQSLQTYVTQ QLIRAAEIRA TLVKQLSSNF GAISSVLNDI LSRLDKVEAE VQIDRLITGR LQSLQTYVTQ QLIRAAEIRA
SANLAATKMS ECVLGQSKRV DFCGKGYHLM SFPQSAPHGV VFLHVTYVPA QEKNFTTAPA SANLAATKMS ECVLGQSKRV DFCGKGYHLM SFPQSAPHGV VFLHVTYVPA QEKNFTTAPA
ICHDGKAHFP REGVFVSNGT HWFVTQRNFY EPQIITTDNT FVSGNCDVVI GIVNNTVYDP ICHDGKAHFP REGVFVSNGT HWFVTQRNFY EPQIITTDNT FVSGNCDVVI GIVNNTVYDP
LQPELDSFKE ELDKYFKNHT SPDVDLGDIS GINASVVNIQ KEIDRLNEVA KNLNESLIDL LQPELDSFKE ELDKYFKNHT SPDVDLGDIS GINASVVNIQ KEIDRLNEVA KNLNESLIDL
QELGKYEQYI KWPWYIWLGF IAGLIAIVMV TIMLCCMTSC CSCLKGCCSC GSCCKFDEDD QELGKYEQYI KWPWYIWLGF IAGLIAIVMV TIMLCCMTSC CSCLKGCCSC GSCCKFEDD
SEPVLKGVKL HYT SEPVLKGVKL HYT
SEQ. ID No: 5 - RBM della proteina Spike del virus Sars-Cov-2 SEQ. ID No: 5 - RBM of the Spike protein of the Sars-Cov-2 virus
SNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVG YQ SNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVG YQ
SEQ. ID No: 6 - frammento di RBD della proteina Spike del virus Sars-Cov-2 SEQ. ID No: 6 - RBD fragment of the Spike protein of the Sars-Cov-2 virus
IAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT NGVGYQPYRVV IAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPT NGVGYQPYRVV
SEQ. ID No: 7 ? EGFP SEQ. ID No: 7 ? EGFP
1 mvskgeelft gvvpilveld gdvnghkfsv sgegegdaty gkltlkfict tgklpvpwpt 61 lvttltygvq cfsrypdhmk qhdffksamp egyvqertif fkddgnyktr aevkfegdtl 121 vnrielkgid fkedgnilgh kleynynshn vyimadkqkn gikvnfkirh niedgsvqla 181 dhyqqntpig dgpvllpdnh ylstqsalsk dpnekrdhmv llefvtaagi tlgmdelyk 1 mvskgeelft gvvpilveld gdvnghkfsv sgegegdaty gkltlkfict tgklpvpwpt 61 lvttltygvq cfsrypdhmk qhdffksamp egyvqertif fkddgnyktr aevkfegdtl 121 vnrielkgid fkedgnilgh kleynynshn vyimadkqkn gikvnfkirh niedgsvqla 181 dhyqqntpig dgpvllpdnh ylstqsalsk dpnekrdhmv llefvtaagi tlgmdelyk
SEQ. ID No: 8 - Gly(His)6 SEQ. ID No: 8 - Gly(His)6
MGHHHHHH MGHHHHHH
<SEQ. ID No: 9 - Gly(His)>6 <X2><SEQ. ID No: 9 - Gly(His)>6 <X2>
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGHHHHHH MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGHHHHHH
SEQ. ID No: 10 - primo linker peptidico SEQ. ID No: 10 - first peptide linker
GTAPAPA GTAPAPA
SEQ. ID No: 11 - secondo linker peptidico SEQ. ID No: 11 - second peptide linker
GGS GGS GGS GGS GGS GGS GGS GGS GGS GGS GGS GGS GGS GGS
SEQ. ID No: 12 - secondo linker peptidico SEQ. ID No: 12 - second peptide linker
GGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG
SEQ. ID No: 13 ? secondo linker pepetidico SEQ. ID No: 13 ? second peptide linker
AAASSGGGGGASGASGGAGG AAASSGGGGASGGAGG
SEQ. ID No: 14 - terzo linker peptidico SEQ. ID No: 14 - third peptide linker
LEAPAPA LEAPAP
SEQ. ID No: 15 - terzo linker peptidico SEQ. ID No: 15 - third peptide linker
LEGASA LEGAS
SEQ ID No: 16 - Sequenza cDNA del costrutto sonda 1.0 SEQ ID No: 16 - cDNA sequence of probe construct 1.0
CATATG GGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC GGT ACC GCT CCT GCA CCG GCT ATC GCA TGG AAC TCA AAC AAC CTC GAC TCC AAA GTA GGT GGT AAT TAT AAT TAC TTG TAT CGC CTG TTT CGA AAG AGC AAT TTG AAG CCT TTT GAG CGG GAT ATT TCA ACC GAA ATT TAC CAA GCA GGC AGT ACG CCA TGT AAC GGA GTA GAG GGA TTT AAT TGC TAC TTT CCT CTT CAA TCT TAT GGC TTT CAA CCA ACA AAC GGA GTG GGG TAT CAA CCT TAT AGA GTG GTA GCG GCC GCT TCA TCT GGT GGT GGT GGT GGT GCC TCA GGA GCA AGC GGC GGC GCC GGT GGT TCC ACC ATT GAG GAA CAG GCC AAG ACA TTT TTG GAC AAG TTT AAC CAC GAA GCC GAA GAC CTG TTC TAT CAA AGT TCA CTT GCT TCT TGG AAT TAT AAC ACC AAT ATT ACT GAA GAG AAT GTC CAA AAC ATG AAT AAT GCT GGG GAC AAA TGG TCT GCC TTT TTA AAG GAA CAG TCC ACA CTT GCC CAA ATG TAT CCA CTA CAA GAA C TC GAG GCT CCC GCG CCT GCA GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG CTG GAC GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG CCC ACC CTC GTG ACC ACC CTG ACC TAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC CGC TAC CCC GAC CAC ATG AAG CAG CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC GAA GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC ATC TTC TTC AAG GAC GAC GGC AAC TAC AAG ACC CGC GCC GAG GTG AAG TTC GAG GGC GAC ACC CTG GTG AAC CGC ATC GAG CTG AAG GGC ATC GAC TTC AAG GAG GAC GGC AAC ATC CTG GGG CAC AAG CTG GAG TAC AAC TAC AAC AGC CAC AAC GTC TAT ATC ATG GCC GAC AAG CAG AAG AAC GGC ATC AAG GTG AAC TTC AAG ATC CGC CAC AAC ATC GAG GAC GGC AGC GTG CAG CTC GCC GAC CAC TAC CAG CAG AAC ACC CCC ATC GGC GAC GGC CCC GTG CTG CTG CCC GAC AAC CAC TAC CTG AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC AAA GAC CCC AAC GAG AAG CGC GAT CAC ATG GTC CTG CTG GAG TTC GTG ACC GCC GCC GGG ATC ACT CTC GGC ATG GAC GAG CTG TAC AAG TAA GGA TCC CATATG GGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC GGT ACC GCT CCT GCA CCG GCT ATC GCA TGG AAC TCA AAC AAC CTC GAC TCC AAA GTA GGT GGT AAT TAT AAT TAC TTG TAT CGC CTG TTT CGA AAG AGC AAT TTG AAG CCT TTT GAG CGG GAT ATT TCA ACC GAA ATT TAC CAA GCA GGC AGT ACG CCA TGT AAC GGA GTA GAG GGA TTT AAT TGC TAC TTT CCT CTT CAA TCT TAT GGC TTT CAA CCA ACA AAC GGA GTG GGG TAT CAA CCT TAT AGA GTG GTA GCG GCC GCT TCA TCT GGT GGT GGT GGT GGT GCC TCA GGA GCA AGC GGC GGC GCC GGT GGT TCC ACC ATT GAG GAA CAG GCC AAG ACA TTT TTG GAC AAG TTT AAC CAC GAA GCC GAA GAC CTG TTC TAT CAA AGT TCA CTT GCT TCT TGG AAT TAT AAC ACC AAT ATT ACT GAA GAG AAT GTC CAA AAC ATG AAT AAT GCT GGG GAC AAA TGG TCT GCC TTT TTA AAG GAA CAG TCC ACA CTT GCC CAA ATG TAT CCA CTA CAA GAA C TC GAG GCT CCC GCG CCT GCA GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG CTG GAC GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG CCC ACC CTC GTG ACC ACC CTG ACC TAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC CGC TAC CCC GAC CAC ATG AAG CAG CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC GAA GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC ATC TTC TTC AAG GAC GAC GGC AAC TAC AAG ACC CGC GCC GAG GTG AAG TTC GAG GGC GAC ACC CTG GTG AAC CGC ATC GAG CTG AAG GGC ATC GAC TTC AAG GAG GAC GGC AAC ATC CTG GGG CAC AAG CTG GAG TAC AAC TAC AAC AGC CAC AAC GTC TAT ATG ATG GCC GAC AAG CAG AAG AAC GGC ATC AAG GTG AAC TTC AAG ATC CGC CAC AAC ATC GAG GAC GGC AGC GTG CAG CTC GCC GAC CAC TAC CAG CAG AAC ACC CCC ATC GGC GAC GGC CCC GTG CTG CTG CCC GAC AAC CAC TAC CTG AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC AAA GAC CCC AAC GAG AAG CGC GAT CAC ATG GTC CTG CTG GAG TTC GTG ACC GCC GCC GGG ATC ACT CTC GGC ATG GAC GAG CTG TAC AAG TAA GGA TCC
SEQ ID No:17 - Sequenza amminoacidica del costrutto sonda 1.0 SEQ ID No:17 - Amino acid sequence of probe construct 1.0
MGHHHHHHGTAPAPAIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNC YFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVAAASSGGGGGASGASGGAGGSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSL ASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQELEAPAPAVSKGEELFTGVVPILVELDGD VNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGY VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIK VNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLG MDELYK MGHHHHHHGTAPAPAIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNC YFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVAAASSGGGGGASGASGGAGGSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSL ASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQELEAPAPAVSKGEELFTGVVPILVELDGD VNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGY VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIK VNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLG MDELYK
SEQ ID No:18 - Sequenza cDNA del costrutto sonda 2.0 SEQ ID No:18 - cDNA sequence of probe construct 2.0
CAT ATG GGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC GGT ACC GCT CCT GCA CCG GCT AGC GAC AAA GAA TGG ATA CTG CAG AAA ATC TAT GAA ATC ATG CGT CTG CTG GAT GAA CTG GGT CAT GCC GAA GCA AGC ATG CGT GTT AGC GAT CTG ATT TAT GAG TTC ATG AAA AAA GGT GAT GAA CGC CTG CTG GAA GAA GCA GAA CGT CTG TTA GAA GAA GTT GAA GCG GCC GCT TCA TCT GGT GGT GGT GGT GGT GCC TCA GGA GCA AGC GGC GGC GCC GGT GGT ATC GCA TGG AAC TCA AAC AAC CTC GAC TCC AAA GTA GGT GGT AAT TAT AAT TAC TTG TAT CGC CTG TTT CGA AAG AGC AAT TTG AAG CCT TTT GAG CGG GAT ATT TCA ACC GAA ATT TAC CAA GCA GGC AGT ACG CCA TGT AAC GGA GTA GAG GGA TTT AAT TGC TAC TTT CCT CTT CAA TCT TAT GGC TTT CAA CCA ACA AAC GGA GTG GGG TAT CAA CCT TAT AGA GTG GTA C TC GAG GCT CCC GCG CCT GCA GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG CTG GAC GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG CCC ACC CTC GTG ACC ACC CTG ACC TAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC CGC TAC CCC GAC CAC ATG AAG CAG CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC GAA GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC ATC TTC TTC AAG GAC GAC GGC AAC TAC AAG ACC CGC GCC GAG GTG AAG TTC GAG GGC GAC ACC CTG GTG AAC CGC ATC GAG CTG AAG GGC ATC GAC TTC AAG GAG GAC GGC AAC ATC CTG GGG CAC AAG CTG GAG TAC AAC TAC AAC AGC CAC AAC GTC TAT ATC ATG GCC GAC AAG CAG AAG AAC GGC ATC AAG GTG AAC TTC AAG ATC CGC CAC AAC ATC GAG GAC GGC AGC GTG CAG CTC GCC GAC CAC TAC CAG CAG AAC ACC CCC ATC GGC GAC GGC CCC GTG CTG CTG CCC GAC AAC CAC TAC CTG AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC AAA GAC CCC AAC GAG AAG CGC GAT CAC ATG GTC CTG CTG GAG TTC GTG ACC GCC GCC GGG ATC ACT CTC GGC ATG GAC GAG CTG TAC AAG TAA GGA TCC CAT ATG GGC CAT CAT CAT CAT CAC GGT ACC GCT CCT GCA CCG GCT AGC GAC AAA GAA TGG ATA CTG CAG AAA ATC TAT GAA ATC ATG CGT CTG CTG GAT GAA CTG GGT CAT GCC GAA GCA AGC ATG CGT GTT AGC GAT CTG ATT TAT GAG TTC ATG AAA AAA GGT GAT GAA CGC CTG CTG GAA GAA GCA GAA CGT CTG TTA GAA GAA GTT GAA GCG GCC GCT TCA TCT GGT GGT GGT GGT GGT GCC TCA GGA GCA AGC GGC GGC GCC GGT GGT ATC GCA TGG AAC TCA AAC AAC CTC GAC TCC AAA GTA GGT GGT AAT TAT AAT TAC TTG TAT CGC CTG TTT CGA AAG AGC AAT TTG AAG CCT TTT GAG CGG GAT ATT TCA ACC GAA ATT TAC CAA GCA GGC AGT ACG CCA TGT AAC GGA GTA GAG GGA TTT AAT TGC TAC TTT CCT CTT CAA TCT TAT GGC TTT CAA CCA ACA AAC GGA GTG GGG TAT CAA CCT TAT AGA GTG GTA C TC GAG GCT CCC GCG CCT GCA GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG CTG GAC GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG CCC ACC CTC GTG ACC ACC CTG ACC TAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC CGC TAC CCC GAC CAC ATG AAG CAG CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC GAA GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC ATC TTC TTC AAG GAC GAC GGC AAC TAC AAG ACC CGC GCC GAG GTG AAG TTC GAG GGC GAC ACC CTG GTG AAC CGC ATC GAG CTG AAG GGC ATC GAC TTC AAG GAG GAC GGC AAC ATC CTG GGG CAC AAG CTG GAG TAC AAC TAC AAC AGC CAC AAC GTC TAT ATC ATG GCC GAC AAG CAG AAG AAC GGC ATC AAG GTG AAC TTC AAG ATC CGC CAC AAC ATC GAG GAC GGC AGC GTG CAG CTC GCC GAC CAC TAC CAG CAG AAC ACC CCC ATC GGC GAC GGC CCC GTG CTG CTG CCC GAC AAC CAC TAC CTG AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC AAA GAC CCC AAC GAG AAG CGC GAT CAC ATG GTC CTG CTG GAG TTC GTG ACC GCC GCC GGG ATC ACT CTC GGC ATG GAC GAG CTG TAC AAG TAA GGA TCC
SEQ ID No:19 - Sequenza amminoacidica del costrutto sonda 2.0 SEQ ID No:19 - Amino acid sequence of probe construct 2.0
MGHHHHHHGTAPAPASDKEWILQKIYEIMRLLDELGHAEASMRVSDLIYEFMKKGDERLLEEAERLLEEV EAAASSGGGGGASGASGGAGGIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNG VEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVLEAPAPAVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGE GDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDG NYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDG SVQLADHYQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK MGHHHHHHGTAPAPASDKEWILQKIYEIMRLLDELGHAEASMRVSDLIYEFMKKGDERLLEEAERLLEEV EAAASSGGGGGASGASGGAGGIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNG VEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVLEAPAPAVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGE GDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDG NYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDG SVQLADHYQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
SEQ. ID No.20 - Sequenza cDNA del costrutto sonda 3.0 SEQ. ID No.20 - cDNA sequence of probe construct 3.0
ATG GGC AGC AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG GGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC GGT ACC GCT CCT GCA CCG GCT AGC GAC AAA GAA TGG ATA CTG CAG AAA ATC TAT GAA ATC ATG CGT CTG CTG GAT GAA CTG GGT CAT GCC GAA GCA AGC ATG CGT GTT AGC GAT CTG ATT TAT GAG TTC ATG AAA AAA GGT GAT GAA CGC CTG CTG GAA GAA GCA GAA CGT CTG TTA GAA GAA GTT GAA GCG GCC GCT TCA TCT GGT GGT GGT GGT GGT GCC TCA GGA GCA AGC GGC GGC GCC GGT GGT ATC GCA TGG AAC TCA AAC AAC CTC GAC TCC AAA GTA GGT GGT AAT TAT AAT TAC TTG TAT CGC CTG TTT CGA AAG AGC AAT TTG AAG CCT TTT GAG CGG GAT ATT TCA ACC GAA ATT TAC CAA GCA GGC AGT ACG CCA TGT AAC GGA GTA GAG GGA TTT AAT TGC TAC TTT CCT CTT CAA TCT TAT GGC TTT CAA CCA ACA AAC GGA GTG GGG TAT CAA CCT TAT AGA GTG GTA C TC GAG GCT CCC GCG CCT GCA GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG CTG GAC GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG CCC ACC CTC GTG ACC ACC CTG ACC TAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC CGC TAC CCC GAC CAC ATG AAG CAG CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC GAA GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC ATC TTC TTC AAG GAC GAC GGC AAC TAC AAG ACC CGC GCC GAG GTG AAG TTC GAG GGC GAC ACC CTG GTG AAC CGC ATC GAG CTG AAG GGC ATC GAC TTC AAG GAG GAC GGC AAC ATC CTG GGG CAC AAG CTG GAG TAC AAC TAC AAC AGC CAC AAC GTC TAT ATC ATG GCC GAC AAG CAG AAG AAC GGC ATC AAG GTG AAC TTC AAG ATC CGC CAC AAC ATC GAG GAC GGC AGC GTG CAG CTC GCC GAC CAC TAC CAG CAG AAC ACC CCC ATC GGC GAC GGC CCC GTG CTG CTG CCC GAC AAC CAC TAC CTG AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC AAA GAC CCC AAC GAG AAG CGC GAT CAC ATG GTC CTG CTG GAG TTC GTG ACC GCC GCC GGG ATC ACT CTC GGC ATG GAC GAG CTG TAC AAG TAA GGA TCC SEQ ID No.21 - Sequenza amminoacidica del costrutto sonda 3.0 ATG GGC AGC AGC CAT CAT CAT CAT CAC AGC AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG GGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC GGT ACC GCT CCT GCA CCG GCT AGC GAC AAA GAA TGG ATA CTG CAG AAA ATC TAT GAA ATC ATG CGT CTG CTG GAT GAA CTG GGT CAT GCC GAA GCA AGC ATG CGT GTT AGC GAT CTG ATT TAT GAG TTC ATG AAA AAA GGT GAT GAA CGC CTG CTG GAA GAA GCA GAA CGT CTG TTA GAA GAA GTT GAA GCG GCC GCT TCA TCT GGT GGT GGT GGT GGT GCC TCA GGA GCA AGC GGC GGC GCC GGT GGT ATC GCA TGG AAC TCA AAC AAC CTC GAC TCC AAA GTA GGT GGT AAT TAT AAT TAC TTG TAT CGC CTG TTT CGA AAG AGC AAT TTG AAG CCT TTT GAG CGG GAT ATT TCA ACC GAA ATT TAC CAA GCA GGC AGT ACG CCA TGT AAC GGA GTA GAG GGA TTT AAT TGC TAC TTT CCT CTT CAA TCT TAT GGC TTT CAA CCA ACA AAC GGA GTG GGG TAT CAA CCT TAT AGA GTG GTA C TC GAG GCT CCC GCG CCT GCA GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG CTG GAC GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG CCC ACC CTC GTG ACC ACC CTG ACC TAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC CGC TAC CCC GAC CAC ATG AAG CAG CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC GAA GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC ATC TTC TTC AAG GAC GAC GGC AAC TAC AAG ACC CGC GCC GAG GTG AAG TTC GAG GGC GAC ACC CTG GTG AAC CGC ATC GAG CTG AAG GGC ATC GAC TTC AAG GAG GAC GGC AAC ATC CTG GGG CAC AAG CTG GAG TAC AAC TAC AAC AGC CAC AAC GTC TAT ATC ATG GCC GAC AAG CAG AAG AAC GGC ATC AAG GTG AAC TTC AAG ATC CGC CAC AAC ATC GAG GAC GGC AGC GTG CAG CTC GCC GAC CAC TAC CAG CAG AAC ACC CCC ATC GGC GAC GGC CCC GTG CTG CTG CCC GAC AAC CAC TAC CTG AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC AAA GAC CCC AAC GAG AAG CGC GAT CAC ATG GTC CTG CTG GAG TTC GTG ACC GCC GCC GGG ATC ACT CTC GGC ATG GAC GAG CTG TAC AAG TAA GGA TCC SEQ ID No.21 - Amino acid sequence of probe construct 3.0
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGHHHHHHGTAPAPASDKEWILQKIYEIMRLLDELGHAEASMRVSDLIYE FMKKGDERLLEEAERLLEEVEAAASSGGGGGASGASGGAGGIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLK PFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVLEAPAPAVSKGEELFTGVVPI LVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFF KSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMA DKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLE FVTAAGITLGMDELYK MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGHHHHHHGTAPAPASDKEWILQKIYEIMRLLDELGHAEASMRVSDLIYE FMKKGDERLLEEAERLLEEVEAAASSGGGGGASGASGGAGGIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLK PFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVLEAPAPAVSKGEELFTGVVPI LVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFF KSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMA DKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLE FVTAAGITLGMDELYK
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