IT201900016736A1 - Antigeni fusi alla proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) e loro uso nella vaccinazione preventiva e terapeutica. - Google Patents
Antigeni fusi alla proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) e loro uso nella vaccinazione preventiva e terapeutica. Download PDFInfo
- Publication number
- IT201900016736A1 IT201900016736A1 IT102019000016736A IT201900016736A IT201900016736A1 IT 201900016736 A1 IT201900016736 A1 IT 201900016736A1 IT 102019000016736 A IT102019000016736 A IT 102019000016736A IT 201900016736 A IT201900016736 A IT 201900016736A IT 201900016736 A1 IT201900016736 A1 IT 201900016736A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- antigen
- fusion protein
- polynucleotide
- cea
- plasmid
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 83
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 83
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 83
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 35
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title claims description 20
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 title claims description 15
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims description 10
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 title claims description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 54
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 claims description 44
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 40
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 40
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 27
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 27
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 24
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 11
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims description 10
- 241000724205 Rice stripe tenuivirus Species 0.000 claims description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 claims description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 8
- 241000186781 Listeria Species 0.000 claims description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 7
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 claims description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 7
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 claims description 6
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 claims description 6
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 6
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 6
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 claims description 6
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 claims description 6
- 241000589562 Brucella Species 0.000 claims description 6
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 claims description 6
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 6
- 201000009182 Chikungunya Diseases 0.000 claims description 6
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims description 6
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 6
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 claims description 6
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 claims description 6
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 claims description 6
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 claims description 6
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 claims description 6
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 claims description 6
- 241000589248 Legionella Species 0.000 claims description 6
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 claims description 6
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 claims description 6
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 6
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 claims description 6
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 claims description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 6
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 claims description 6
- 241000713124 Rift Valley fever virus Species 0.000 claims description 6
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 claims description 6
- 241000589886 Treponema Species 0.000 claims description 6
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 claims description 6
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 claims description 6
- 208000020329 Zika virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 5
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 4
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims description 4
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 4
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 4
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 claims description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 3
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 claims description 2
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 claims description 2
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004373 mandible Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004359 mandibular condyle Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002050 maxilla Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003681 parotid gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000752 vestibulocochlear nerve Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 claims 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 5
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims 1
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 25
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 21
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 21
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 230000004044 response Effects 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 12
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 12
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100026894 Lymphotoxin-beta Human genes 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 6
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 5
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 5
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 5
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 4
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 102000011195 Profilin Human genes 0.000 description 3
- 108050001408 Profilin Proteins 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 101001023030 Toxoplasma gondii Myosin-D Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011239 genetic vaccination Methods 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 101150011571 BSL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 101100126074 Caenorhabditis elegans imp-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100463133 Caenorhabditis elegans pdl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000712899 Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100481579 Mus musculus Tlr11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100481580 Mus musculus Tlr12 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000913681 Questa Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000607149 Salmonella sp. Species 0.000 description 1
- 102100024219 T-cell surface glycoprotein CD1a Human genes 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150024410 Xcl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001780 adrenocortical effect Effects 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- RGHILYZRVFRRNK-UHFFFAOYSA-N anthracene-1,2-dione Chemical compound C1=CC=C2C=C(C(C(=O)C=C3)=O)C3=CC2=C1 RGHILYZRVFRRNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000860 cochlear nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- HDZGCSFEDULWCS-UHFFFAOYSA-N monomethylhydrazine Chemical class CNN HDZGCSFEDULWCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 platinum coordination complex Chemical class 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 229960000714 sipuleucel-t Drugs 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000583 toxicological profile Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000002476 tumorcidal effect Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001154—Enzymes
- A61K39/001157—Telomerase or TERT [telomerase reverse transcriptase]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
- A61K39/001182—Carcinoembryonic antigen [CEA]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
ANTIGENI FUSI ALLA PROTEINA PROFILIN-LIKE DI TOXOPLASMA GONDII (PFTG) E LORO USO NELLA VACCINAZIONE PREVENTIVA
E TERAPEUTICA
La presente invenzione concerne antigeni fusi alla proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) e loro usi nella vaccinazione preventiva e terapeutica.
In particolare, l’invenzione concerne una proteina di fusione comprendente uno o più antigeni fusi alla proteina PFTG che può essere utilizzata come vaccino per trattare il cancro o malattie infettive in mammiferi, più in particolare nell’uomo.
È noto che l’attivazione del sistema immunitario contro patogeni tramite la vaccinazione ha cambiato la storia dell’umanità. Le vaccinazioni, infatti, costituiscono il primo intervento preventivo per eliminare il rischio di far contrarre pericolose malattie infettive, che possono diffondersi in gran parte della popolazione provocando, a volte, vere epidemie. I vaccini combattono malattie infettive molto pericolose per le quali non esiste una terapia (poliomielite e epatite B) o non è sempre efficace (difterite, tetano) oppure malattie che possono essere causa di gravi complicanze (morbillo, rosolia e pertosse).
Allo stesso modo, l’attivazione del sistema immunitario tramite immunomodulatori ha prodotto risultati eccellenti anche in Oncologia. L’immunoterapia ha infatti dimostrato di essere efficace contro diversi tipi di tumore. Ad oggi sono stati approvati anticorpi immunomodulatori, ad esempio contro PD1/PDL-1 e contro CTLA-4 per il trattamento del melanoma e del tumore del polmone [1]. Questa nuova classe di agenti terapeutici non svolge la sua funzione attraverso un meccanismo diretto antitumorale, come gli anticorpi di prima generazione quali Trastuzumab (contro Her-2) o Cetuximab (contro EGFR) [2], bensì agisce riattivando la risposta delle cellule T contro i tumori. In particolare, viene stimolata la risposta delle cellule T citotossiche CD8+ e helper CD4+ che era stata inibita dai meccanismi di evasione messi in atto dal tumore stesso.
Solo recentemente si è cominciato a comprendere quali siano i fattori critici per un’efficace terapia con gli immunomodulatori. Una serie di lavori ha dimostrato come sia importante l’espressione del recettore target ma anche la presenza di una risposta di cellule T CD8+ intratumorale o peritumorale preesistente al trattamento [3]. Se questa osservazione dovesse essere confermata in studi con altri tipi tumorali, si potrebbe ipotizzare che, per allargare la platea dei pazienti che rispondono al trattamento, sia necessario associare questa terapia con una vaccinazione attiva contro antigeni tumorali in grado di promuovere un infiltrato linfocitario in tumori che ne sono privi. Una potente vaccinazione in grado di ovviare all’ambiente immunosoppressivo del tumore potrebbe facilitare il coordinamento della risposta delle cellule T helper CD4+ ed effettrici CD8+ nel tumore stesso. Si è infatti visto che la presenza dei CD4+ consente una espansione dei CD8+ specifici per il tumore [4]. Inoltre, la presenza di cellule CD4+ all’interno del tumore favorisce l’infiltrazione da parte delle cellule effettrici CD8+, aumentando la loro proliferazione locale e le conseguenti funzioni tumoricide. Le cellule CD4+ giocano dunque un ruolo non solo nella fase iniziale ma anche nella fase effettrice [4, 5].
Diverse strategie di vaccinazione sono state sviluppate per orchestrare una risposta efficace di cellule sia CD4+ che CD8+. Ad esempio, la formulazione di antigeni con acidi nucleici o con alcuni domini proteici in grado di attivare una risposta di pericolo (danger signal) esercita un potente effetto adiuvante per la risposta immune [6]. I danger signals rispondono alla teoria che il sistema immunitario possa attivarsi in seguito al riconoscimento di strutture comuni a diversi patogeni. Questa teoria ha poi trovato conferma nella scoperta dei Toll Like Receptors (TLR).
Tuttavia, nonostante si possano raggiungere significative risposte immunitarie contro antigeni tumorali, queste non sono poi in grado di indurre un effetto terapeutico. Allo stesso modo, finora vaccini contro agenti virali, come HIV ed HCV, sono stati fallimentari, nonostante l’induzione di risposte immunitarie specifiche [7].
Pertanto, alla luce di quanto sopra, appare evidente la necessità di fornire strategie di vaccinazione più efficaci, che superino i limiti dei metodi attualmente noti.
È noto che la fusione di alcuni antigeni tumorali con ligandi dei TLR porta ad una diretta presentazione da parte delle cellule dendritiche (DC) e contemporaneamente all’attivazione dei recettori TLR con un migliore effetto antitumorale [8]. Il meccanismo sembra essere mediato dall’immagazzinamento dell’antigene nelle cellule DC con un rilascio continuo nel tempo e presentazione alle cellule T CD8+ [9, 10]. Tuttavia, la fusione con i ligandi di cellule dendritiche non sempre genera di per sé un’attivazione delle risposte effettrici: ad esempio la fusione con CLEC9a, un recettore di una sottoclasse delle cellule DC definite dall’espressione di CD8, genera principalmente cellule CD4 regolatorie (T-reg) mentre se dato in presenza di polyI:C risulta in una forte cross-presentazione e induzione di una risposta di cellule T CD8+ citotossica dipendente da IL-12 [11]. Inoltre, altri tipi cellulari possono influenzare l’esito della vaccinazione. Le cellule natural killer (NK), ad esempio, possono interferire nella crosspresentazione delle cellule DC attraverso il recettore TRAIL-DR5-d [12], mentre le cellule NKT possono favorire la cross-presentazione attraverso il recettore CD1 che lega la galattoceramide [13].
Al fine di indurre una risposta immunitaria efficace sono stati sviluppati diversi metodi di vaccinazione, tra questi i vaccini genetici hanno mostrato di indurre la più alta frequenza di risposte di cellule T effettrici [7, 14]. In questi vaccini è possibile incorporare immunomodulatori che potenziano la risposta, come la fusione dell’antigene tumorale con una proteina batterica altamente immunogenica quale la subunità B della Tossina di Escherichia Coli (LTB) [15]. Queste fusioni sono state prima studiate nei modelli preclinici come il topo dove hanno evidenziato come una maggiore risposta sia di cellule T citotossiche CD8+ che helper CD4+ correli con una protezione contro il tumore [15], ma anche nelle scimmie [16] ed infine nell’uomo [17].
A livello clinico attualmente sono stati condotti molti studi con vaccini antitumorali nelle diverse fasi di sviluppo. Ad esempio, Sipuleucel-T, un vaccino basato su cellule immunitarie autologhe del paziente è stato approvato dalle agenzie regolatorie per il trattamento del tumore della prostata [18]. Più recentemente, molti studi clinici di fase 1 e 2 basati sull’utilizzo di vettori virali e di acidi nucleici (DNA e RNA) hanno confermato la potenza immunologica di queste piattaforme contro antigeni tumorali e neoantigeni, ossia antigeni unici del tumore generati da mutazioni e visibili al sistema immunitario [19]. Tra queste, un approccio promettente è l’utilizzo di DNA plasmidico codificante per antigeni fusi a chemochine come Xcl1 o Xcl2 il cui meccanismo di azione è mediato proprio da un tropismo verso le DC e una più efficace induzione della risposta immunitaria [20]. Data la correlazione tra l’intensità della risposta immunitaria indotta e la protezione contro il tumore risulta dunque importante potenziare questa risposta al fine di aumentare la possibilità di controllare la crescita tumorale.
L’antigene Eimeria Antigen (EA), che deriva da un batterio endemico dello stomaco Eimeria spp., è noto per essere stato studiato come immunomodulatore. Ha la capacità di indurre produzione di IL-12 da parte di cellule dendritiche e da cellule regolatrici della risposta infiammatoria in vivo. Inoltre, ha mostrato proprietà antitumorali nei modelli murini non solo nel topo ma anche in altre specie con un profilo tossicologico molto buono. Si pensa che questa proteina si leghi al recettore TLR11-12 che attiva il segnale attraverso MyoD. Le cellule umane mancano di TLR11-12, ma lavori recenti con monociti derivati dal sangue periferico hanno mostrato come ci sia attivazione di cellule natural killer (NK). Cellule NK stimolate con EA aumentano l’espressione di CD69, CD107 e NKG2D e l’espressione di citochine come IFN-γ e granzyme B. Questi dati hanno portato allo studio del ruolo di EA come adiuvante nei vaccini [21].
È, inoltre, noto che PFTG è una proteina tipo “Profilina” espressa dal protozoo Toxoplasma gondii in grado di indurre anch’essa una risposta IL-12 in cellule DC murine in modo dipendente da MyoD 88 [22]. PFTG attiva le cellule DC attraverso TLR-11 ed è stato il primo ligando identificato per questo recettore anche se non si può escludere che leghi altri recettori. In effetti, i topi che mancano solo del TLR-11 (TLR-11 ko) sono più sensibili all’infezione con Toxoplasma Gondii rispetto ai controlli, ma riescono a sopravvivere mentre i topi che mancano completamente del segnale mediato dai TLR (MyoD ko) soccombono. Questi dati suggeriscono comunque un ruolo predominante di TLR-11 nel riconoscimento del protozoo che porta alla produzione di IL-12 e il controllo dell’infezione. IL-12 è prodotta da diversi tipi cellulari come DC, macrofagi e neutrofili ed è una citochina chiave per la produzione di IFN-γ che a sua volta attiva una risposta immunitaria in grado di risolvere l’infezione [22]. Il meccanismo con cui PFTG è riconosciuto dal sistema immunitario nell’uomo non è noto [21]. Linfociti periferici (PBMC) o linee cellulari umane producono IL-6, IL-8 e IL-12p70 quando sono trattati con PFTG. Queste citochine sono prodotte a livelli molto più bassi quando si utilizzano monociti con la mutazione R392X nel gene di TLR-5 o quando viene usato un anticorpo neutralizzante per TLR-5 in cellule normali. Questi risultati suggeriscono che nell’uomo PFTG sia riconosciuta da TLR-5.
In questo contesto viene ad inserirsi la presente invenzione, che si propone di fornire un vaccino in grado di aumentare la risposta immunitaria cellulare e anticorpale contro antigeni, più specificamente contro antigeni tumorali e virali, attraverso la fusione di questi con la Profilin-like protein di Toxoplasma Gondii (PFTG).
Secondo la presente invenzione, infatti, è stato sorprendentemente trovato che vaccini genetici contro antigeni tumorali, come l’antigene carcinoembrionico (CEA) sono più immunogenici ed efficaci quando fusi a PFTG rispetto al controllo e rispetto ad altre proteine di fusione (EA, LTB). La stessa osservazione è stata confermata con un altro antigene, come la Telomerasi (TERT) e un vaccino contro i neoantigeni di un tumore del colon. Le fusioni con PFTG inducono inoltre un notevole incremento del titolo anticorpale contro antigeni virali, come UL119 e UL132 del citomegalovirus umano (CMV), quando somministrati tramite vaccinazione genetica.
La presente invenzione riguarda vaccini preferibilmente basati su DNA plasmidico e/o vettori genetici contenenti una sequenza ottimizzata nell’uso del codice genetico e codificante per un antigene fuso alla Profilin-like protein di Toxoplasma Gondii (PFTG). La vaccinazione con DNA in presenza di elettroporazione genera vantaggiosamente una potente risposta immunitaria contro vari tipi di antigeni.
Il metodo secondo la presente invenzione concerne preferibilmente una vaccinazione genetica utilizzando un vettore genetico, ad esempio DNA plasmidico, contenente il cDNA ottimizzato di un antigene fuso a PFTG. Tale vettore è preferibilmente somministrato per via intramuscolare e, successivamente, viene applicato un campo elettrico tramite un apparato per elettroporazione allo scopo di aumentare il livello di espressione dell’antigene e generare nell’ospite una risposta immune anticorpale e/o cellulo-mediata contro l’antigene di interesse.
La presente invenzione si riferisce anche a un metodo per la generazione di anticorpi monoclonali con il vaccino di cui sopra.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione una proteina di fusione, un polinucleotide che codifica la proteina di fusione, un vettore di espressione o plasmide comprendente il polinucleotide, detta proteina di fusione comprendendo o essendo consistente in:
- una porzione ammino-terminale consistente in una sequenza antigenica che consiste in o comprende almeno un antigene o un determinante antigenico della stessa o un neoantigene; e
- una porzione carbossi-terminale consistente in una sequenza amminoacidica che consiste in o comprende la proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) o un frammento funzionale da essa derivato.
La sequenza amminoacidica può comprendere o consistere in SRSDWDPVVKEWLVDTGYCCAGGIANAEDGVVFAAAADDDDGWSKLYKDDHEEDT IGEDGNACGKVSINEASTIKAAVDDGSAPNGVWIGGQKYKVVRPEKGFEYNDCTF DITMCARSKGGAHLIKTPNGSIVIALYDEEKEQDKGNSRTSALAFAEYLHQSGY
(SEQ ID NO:1).
L’antigene o determinante antigenico o neoantigene può essere scelto dal gruppo che consiste in un antigene di cancro, come l’antigene carcinoembrionico (CEA) o l’antigene Telomerasi (TERT), un antigene virale come un antigene dei virus HIV, HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HSV, HTLV, RSV, encefalite Giapponese, Rift Valley Fever virus, HPV, EBV, RSV, Adenovirus, CMV, come UL119 e UL132, virus dell’influenza, virus della rabbia, Leukemia Virus, parvovirus, Rubella, West Nile Virus, Coronavirus, Zika, Rotavirus, Varicella Zoster, Chikungunya, antigeni di microorganismi dei generi Aeromonas, Arthrobacter, Aspergillus, Bacillus, Borrelia, Brucella, Bordetella, Campylobacter, Candida, Chlamydia, Clostridium, Corynebacterium, E. Coli, Haemophilus, HP, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Pseudomonas, Reaplasma, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Clostridium, Treponema, Yersinia. Il vettore di espressione che comprende il polinucleotide dell’invenzione, operativamente legato a un promotore o a un elemento trascrizionale regolatorio, può essere scelto ad esempio tra: plasmidi batterici, ampliconi, adenovirus, poxvirus, vaccinia virus, fowlpox, herpes virus, adeno-associated virus (AAV), alphavirus, lentivirus, fago lambda, virus della coriomeningite lymphocitaria, Listeria sp, Salmonella sp.
La presente invenzione concerne inoltre una proteina di fusione, un polinucleotide o un vettore di espressione o un plasmide, come definiti sopra, per l’uso come medicamento.
Inoltre, la presente invenzione concerne una proteina di fusione, un polinucleotide che codifica la proteina di fusione o un vettore di espressione o un plasmide, come definiti sopra, per l’uso nella vaccinazione preventiva e terapeutica.
Come menzionato sopra, detta sequenza amminoacidica può comprendere o consistere in SEQ ID NO:1.
Secondo la presente invenzione, detto almeno un antigene o determinante antigenico o neoantigene può essere scelto dal gruppo che consiste in un antigene di cancro, come l’antigene carcinoembrionico (CEA) o l’antigene Telomerasi (TERT), antigene dei virus HIV, HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HSV, HTLV, RSV, encefalite Giapponese, Rift Valley Fever virus, HPV, EBV, RSV, Adenovirus, CMV, come UL119 e UL132, virus dell’influenza, virus della rabbia, Leukemia Virus, parvovirus, Rubella, West Nile Virus, Coronavirus, Zika, Rotavirus, Varicella Zoster, Chikungunya, antigeni di microorganismi dei generi Aeromonas, Arthrobacter, Aspergillus, Bacillus, Borrelia, Brucella, Bordetella, Campylobacter, Candida, Chlamydia, Clostridium, Corynebacterium, E. Coli, Haemophilus, HP, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Pseudomonas, Reaplasma, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Clostridium, Treponema, Yersinia.
Le vaccinazioni preventiva e terapeutica possono essere contro i tumori o contro le infezioni.
I tumori che possono essere trattati secondo la presente invenzione sono ad esempio tumori di ghiandola adrenale, ano, nervo uditivo, dotti biliari, vescica, ossa, cervello, seno, sistema nervoso centrale, cervice, colon, orecchio, endometrio, esofago, occhio, palpebre, tuba di falloppio, tratto gastrointestinale, testa-collo, cuore, rene, laringe, fegato, polmone, mandibola, condile mandibolare, maxilla, bocca, nasofaringe, naso, cavità orale, ovaio, pancreas, ghiandola parotidea, pene, pinna, pituitaria, ghiandola prostatica, retto, retina, ghiandole salivari, pelle, intestino tenue, colonna vertebrale, stomaco, testicolo, tiroide, uretra, vagina, nervo vestibolococleare e vulva.
Pertanto, il polinucleotide secondo la presente invenzione può essere vantaggiosamente impiegato in un metodo per prevenire, trattare o rallentare tumori in un mammifero (come ad esempio l’uomo o un animale come ad esempio il cane), che prevede la somministrazione ad un mammifero, per il quale tale trattamento di prevenzione e rallentamento è necessario o desiderabile, di un polinucleotide codificante la proteina di fusione della presente invenzione, ovvero un suo frammento funzionale. In conseguenza alla somministrazione è quindi generata una risposta immunitaria contro detto tumore e detto tumore che viene prevenuto, curato o rallentato.
A seguito della somministrazione del polinucleotide secondo la presente invenzione verrà generato un anticorpo in grado di legarsi a un epitopo nel dominio extracellulare della proteina di fusione con PFTG e che esibisce proprietà di inibizione della proliferazione di cellule che esprimono l’antigene e/o capacità di diminuire i livelli di antigene sulle superfici cellulari.
La presente invenzione concerne inoltre una composizione farmaceutica comprendente o consistente in un polinucleotide che codifica una proteina di fusione o un vettore di espressione o un plasmide comprendente il polinucleotide, opzionalmente in combinazione con un potenziatore della risposta immunitaria in un mammifero e/o con uno o più antineoplastici, in associazione con uno o più eccipienti e/o adiuvanti, in cui detta proteina di fusione comprende o consiste in:
- una porzione ammino-terminale consistente in una sequenza antigenica che consiste in o comprende almeno un antigene o un determinante antigenico della stessa o un neoantigene; e
-una porzione carbossi-terminale consistente in una sequenza amminoacidica che consiste in o comprende la proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG).
Come menzionato sopra, detta sequenza amminoacidica può comprendere o consistere in SEQ ID NO:1.
Secondo la presente invenzione, detto almeno un antigene o determinante antigenico o neoantigene può essere scelto dal gruppo che consiste in un antigene di cancro, come l’antigene carcinoembrionico (CEA) o l’antigene Telomerasi (TERT), antigene dei virus HIV, HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HSV, HTLV, RSV, encefalite Giapponese, Rift Valley Fever virus, HPV, EBV, RSV, Adenovirus, CMV, come UL119 e UL132, virus dell’influenza, virus della rabbia, Leukemia Virus, parvovirus, Rubella, West Nile Virus, Coronavirus, Zika, Rotavirus, Varicella Zoster, Chikungunya, antigeni di microorganismi dei generi Aeromonas, Arthrobacter, Aspergillus, Bacillus, Borrelia, Brucella, Bordetella, Campylobacter, Candida, Chlamydia, Clostridium, Corynebacterium, E. Coli, Haemophilus, HP, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Pseudomonas, Reaplasma, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Clostridium, Treponema, Yersinia.
L’agente antineoplastico può essere un agente anti-angiogenico, un agente alchilante, un antimetabolita, un prodotto naturale, un complesso di coordinazione del platino, un antracenedione, un’urea sostituita, un derivativo della metilidrazina, un inibitore adrenocorticale, un ormone, un antagonista, un inibitore oncogenico, un gene o una proteina di un oncosoppressore, un anticorpo terapeuticoe un oligonucleotide contro un oncogene.
In particolare, la composizione farmaceutica può essere un vaccino a DNA.
In tal caso, la composizione farmaceutica può essere somministrata mediante elettroporazione (ovvero in situ nel tumore).
L’elettroporazione del DNA è una tecnologia molto efficiente per l’induzione della risposta cellulomediata contro un antigene, ma anche per la generazione di anticorpi monoclonali contro targets molto difficili. I costrutti consistono in plasmidi in cui l’espressione dell’antigene di interesse viene guidata dal promotore e dall’introne A del citomegalovirus (CMV-IA) e dal poly-A del bovine growth hormone (bGH). Il cDNA viene ottimizzato per espressione genica e per elevata immunogenicità. L’ottimizzazione del cDNA consiste nella sostituzione dei codoni originali con triplette nucleotidiche riconosciute dai tRNA più frequenti ed efficienti nelle cellule dell’organismo di interesse. E’ noto che questa operazione porta ad un aumento dell’espressione di circa 10-100 volte rispetto alla proteina nativa e ad un conseguente aumento del titolo anticorpale. Secondo le proprietà della proteina identificata, come la localizzazione cellulare, l’attività enzimatica e le interazioni con altre proteine fuori e dentro la cellula, il cDNA della proteina di interesse andrà ulteriormente modificato. Le modifiche consisteranno ad esempio in fusioni con sequenze leader o domini trans-membrana, che possono far secernere o localizzare una proteina tipicamente nucleare o citoplasmatica sulla membrana cellulare oppure vengono introdotte mutazioni che bloccano l’attività enzimatica per evitare effetti tossici o le interazioni proteina-proteina, se queste ne mascherano epitopi di interesse. Queste modifiche della proteina originaria non devono comunque interferire con la conformazione e la struttura terziaria della molecola, con l’obiettivo di ottenere anticorpi che siano in grado di riconoscere il target naturale. Infine, il cDNA di interesse potrà essere fuso con porzioni di cDNA codificanti proteine batteriche altamente immunogeniche che possono ulteriormente aumentare il titolo anticorpale contro la proteina di interesse.
La presente invenzione concerne inoltre l'uso nella prevenzione e nella terapia vaccinale, ad esempio contro il cancro o le infezioni.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione concerne la proteina di fusione, polinucleotide o vettore di espressione o plasmide come definiti sopra, per l’uso in un metodo per la generazione di anticorpi, in cui detto metodo comprende somministrare detti proteina di fusione, polinucleotide o vettore di espressione o plasmide in un animale, ad esempio il topo, in cui detto polinucleotide o vettore di espressione o plasmide è somministrato mediante elettroporazione. L’anticorpo secondo l’invenzione può essere un anticorpo policlonale o monoclonale, che può essere umanizzato.
La presente invenzione concerne inoltre una sequenza amminoacidica che consiste in o comprende la proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) per l'uso come coadiuvante nella prevenzione e nella terapia basata su vaccinazione a DNA, ad esempio contro il cancro o le infezioni.
Il vaccino a DNA secondo la presente invenzione può essere preparato mediante un procedimento che comprende a) preparazione di un gene di fusione fondendo una sequenza nucleotidica codificante una sequenza antigenica che consiste in o comprende almeno un antigene o un determinante antigenico della stessa o un neoantigene alla porzione N-terminale di una sequenza nucleotidica codificante una sequenza amminoacidica che consiste in o comprende la proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG); b) clonaggio del gene di fusione in un vettore plasmidico per l'espressione in cellule di mammifero, come CHO, HEK293, HeLa e cellule di lievito; e c) amplificazione del vettore plasmidico in un microrganismo batterico adatto, come Escherichia Coli e l'isolamento delle stesse da un microorganismo. La sequenza amminoacidica può comprendere o consistere in SEQ ID NO:1.
La presente invenzione verrà ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo una sua forma preferita di realizzazione, con particolare riferimento ad esempi e alle figure dei disegni allegati, in cui:
- la Figura 1 mostra lo schema delle fusioni con CEA. LTB, EA e PFTG sono fuse al C-Terminale di CEA, a cui è stata rimossa la sequenza di ancoraggio alla membrana (GPI-anchor).
- la Figura 2 mostra la mappa dei vettori pTK1-CEA-EAopt e pTK1-CEA-PFTGopt. La cassetta di espressione è guidata dal promotore del citomegalovirus umano (hCMV) e dall’Introne A. Immediatamente a monte del transgene è presente una sequenza Kozak ottimizzata per incrementare il livello di espressione.
- la Figura 3 mostra un Western Blot dove è stato usato un anticorpo anti-profilina per valutare l’espressione della proteina di fusione. Nelle lanes 1, 2 e 3 è stato caricato il sopranatante di cellule HEK293 trasfettate con pTK1-CEA-EAopt, pTK1-CEAopt e pTK1-CEA-PFTGopt, rispettivamente.
- la Figura 4 mostra la secrezione di IL12 misurata tramite ELISA da parte di splenociti murini trattati con i sopranatanti derivanti dalla trasfezione di cellule HEK293 con i plasmidi esprimenti CEA, CEA-LTB, CEA-EA o CEA-PFTG.
- la Figura 5 mostra la secrezione di IL12 misurata tramite ELISA da parte di PBMC umani trattati con i sopranatanti derivanti dalla trasfezione di cellule HEK293 con i plasmidi esprimenti CEA, CEA-LTB, CEA-EA o CEA-PFTG.
- la Figura 6 mostra la secrezione di IL12 misurata tramite ELISA da parte di PBMC di cane trattati con i sopranatanti derivanti dalla trasfezione di cellule HEK293 con i plasmidi esprimenti CEA, CEA-LTB, CEA-EA o CEA-PFTG.
- la Figura 7 mostra la percentuale di PBMC CD3+/CD8+ secernenti IFNγ determinata tramite la tecnica dell’Intracellular staining al citofluorimetro dopo stimolazione per 16 ore con un peptide immunodominante presente nella proteina CEA, in topi transgenici per CEA umano e vaccinati tramite elettroporazione del DNA. I simboli neri indicato la percentuale per il singolo topo, il rombo indica la media geometrica del gruppo.
- la Figura 8 mostra la percentuale di splenociti CD3+/CD8+ secernenti IFNγ determinata tramite la tecnica dell’Intracellular staining al citofluorimetro dopo stimolazione per 16 ore con 4 pools di peptidi 15meri e sovrapposti per 11 residui aminoacidici che coprono l’intera proteina CEA, in topi transgenici per CEA umano e vaccinati tramite elettroporazione del DNA. I simboli neri indicato la percentuale per il singolo topo, il cerchio bianco indica la media geometrica del gruppo.
- la Figura 9 mostra la percentuale di splenociti CD3+/CD8+ e CD3+/CD4+ secernenti IFNγ, TNFα o IL2 determinata tramite la tecnica dell’Intracellular staining al citofluorimetro dopo stimolazione per 16 ore con 4 peptidi immunodominanti per le risposte CD4+ e CD8+, precedentemente identificati, in topi C57Bl/6 iniettati sotto cute con cellule MC38-CEA e vaccinati tramite elettroporazione del DNA.
- la Figura 10 mostra la cinetica di crescita dei tumori MC38-CEA impiantati in topi C57Bl/6 e vaccinati tramite elettroporazione del DNA con i vettori esprimenti CEA, CEA-LTB, CEA-EA o CEA-PFTG.
- la Figura 11 mostra la risposta immunitaria indotta contro hTERT in topi BALB/c vaccinati tramite DNA-EP con i vettori pTK1-hTERT-LTB o pTK1-hTERT-PFTG e misurata tramite Intracellular staining per IFNγ, dopo stimolazione di 16 ore con un pool di peptidi che copre la regione N-terminale della proteina.
- la Figura 12 mostra la risposta immunitaria indotta contro neoantigeni identificati nel tumore MC38 (TK8) in topi C57Bl/6 vaccinati tramite DNA-EP con i vettori pTK1-TK8 o pTK1-TK8-PFTG e misurata tramite Intracellular staining per IFNγ, dopo stimolazione di 16 ore con un pool di peptidi contentente gli epitopi TK8. I simboli neri indicano il numero di spots ottenuti per singolo topo e il cerchio bianco la media geometrica del gruppo.
- la Figura 13 mostra il titolo di anticorpi specifici per le glicoproteine di hCMV UL119 e UL132 misurate tramite saggio cell-ELISA presenti nel siero di topi BALB/c vaccinati tramite DNA-EP con i vettori pTK1-UL119opt, pTK1-UL119-PFTGopt, pTK1-UL132 e pTK1-UL132-PFTG.
ESEMPI
Con riferimento all’Articolo 170bis CPI, si dichiara che gli studi su organismi geneticamente modificati citati di seguito sono avvenuti all’interno dell’impianto con livello di contenimento BSL2, con ID notifica RM/IC/Imp2/04/001, Takis s.r.l. autorizzato in data 09/04/2015.
ESEMPIO 1. Disegno della sequenza nucleotidica ottimizzata di PFTG.
Il disegno del cDNA ottimizzato codificante per PFTG consente di aumentare i livelli di espressione dell’antigene. La sequenza aminoacidica di PFTG è stata dedotta dalla sequenza della profilina depositata sul database NCBI con Accession number: AAX33672.1. Alla sequenza sopra menzionata sono stati aggiunti due aminoacidi (SR) all’N-terminale derivati dalla creazione di un sito di clonaggio con l’enzima di restrizione XbaI, codificato dalla sequenza nucleotidica TCTAGA, per la generazione delle fusioni con gli antigeni, ottenendo la seguente sequenza:
SRSDWDPVVKEWLVDTGYCCAGGIANAEDGVVFAAAADDDDGWSKLYKDDHEEDT IGEDGNACGKVSINEASTIKAAVDDGSAPNGVWIGGQKYKVVRPEKGFEYNDCTF DITMCARSKGGAHLIKTPNGSIVIALYDEEKEQDKGNSRTSALAFAEYLHQSGY
(SEQ ID NO:1). Il cDNA codificante per questa sequenza è stato ottimizzato per codon usage. L’ottimizzazione del cDNA consiste nella sostituzione dei codoni originali con triplette nucleotidiche riconosciute dai tRNA più frequenti ed efficienti nelle cellule dell’organismo di interesse. Per fare questo è stato utilizzato un algoritmo (GeneOptimizer, Thermofisher) che consente di disegnare il cDNA di interesse per aumentarne i livelli di espressione in cellule della specie in cui si vuole utilizzare l’antigene (Homo Sapiens). Inoltre, siti di restrizione non desiderati o di splicing eventualmente generati in silico da questa operazione sono stati rimossi. Per aumentare ulteriormente i livelli di traduzione della proteina, è stata aggiunta una sequenza Kozak ottimizzata al 5’ del cDNA (non mostrata) e due codoni di stop consecutivi al 3’, codificati dalla sequenza TGATGA. Alle estremità sono stati inoltre aggiunti siti di restrizione per facilitare clonaggi nel vettore desiderato. Il DNA è stato sintetizzato alla Invitrogen GeneArt (Germania) e clonato nel vettore pPCR-Script (Invitrogen). La sequenza del cDNA ottimizzato è
TCTAGAAGCGACTGGGACCCCGTGGTGAAGGAATGGCTGGTGGACACCGGCTACT GCTGTGCCGGCGGAATCGCCAACGCCGAGGATGGCGTGGTGTTCGCCGCTGCAGC CGACGATGACGACGGCTGGAGCAAGCTGTACAAGGACGACCACGAGGAGGACACC ATCGGCGAGGACGGCAACGCCTGTGGCAAGGTGTCCATCAACGAGGCCAGCACCA TCAAGGCCGCCGTGGACGACGGCAGCGCCCCCAACGGAGTGTGGATCGGCGGCCA GAAATACAAGGTTGTGAGGCCCGAGAAGGGCTTCGAGTACAACGACTGTACCTTC GACATCACCATGTGTGCCAGAAGCAAAGGCGGAGCCCACCTGATCAAGACCCCCA ACGGCAGCATCGTGATCGCCCTGTACGACGAGGAGAAGGAGCAGGACAAGGGCAA CAGCAGAACCAGCGCCCTGGCCTTCGCCGAGTACCTGCACCAGAGCGGCTACTGA TGA (SEQ ID NO:2).
ESEMPIO 2. Generazione di vaccini codificanti per l’antigene tumorale CEA fuso a PFTG e ad altri immunomodulatori e studio dei loro effetti sul sistema immunitario e sul tumore.
Generazione di vaccini codificanti antigeni tumorali fusi a immunomodulatori
In questo esempio sono state generate fusioni dell’antigene Carcinoembrionico (CEA) con le proteine EA e con PFTG. Studi precedenti con questo antigene hanno dimostrato una maggiore efficacia di induzione di risposta immunitaria e antitumorale quando un vaccino genetico codificante per CEA fuso alla subunità B della enterotossina di Escherichia Coli (LTB) veniva usato per vaccinare topi trasgenici per CEA umano [15].
CEA è stato fuso al C terminale con EA e con PFTG, generando le proteine CEA_EA avente sequenza:
MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLV HNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQ NIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAF TCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNP VSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNG TFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSN NSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTR NDVGPYECGIQNELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAA SNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTIT VSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLS NGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSY LSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNL ATGRNNSIVKSITVSASGTSRGEADTQAWDTSVREWLVDTGRVFAGGVASIADGC RLFGAAVEGEGNAWEELVKTNYQIEVPQEDGTSISVDCDEAETLRQAVVDGRAPN GVYIGGTKYKLAEVKRDFTFNDQNYDVAILGKNKGGGFLIKTPNENVVIALYDEE KEQNKADALTTALNFAEYLHQSGF (SEQ ID NO:3)
e
CEA_PFTG avente sequenza:
MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLV HNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQ NIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAF TCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNP VSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNG TFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSN NSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTR NDVGPYECGIQNELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAA SNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTIT VSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLS NGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSY LSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNL ATGRNNSIVKSITVSASGTSRSDWDPVVKEWLVDTGYCCAGGIANAEDGVVFAAA ADDDDGWSKLYKDDHEEDTIGEDGNACGKVSINEASTIKAAVDDGSAPNGVWIGG QKYKVVRPEKGFEYNDCTFDITMCARSKGGAHLIKTPNGSIVIALYDEEKEQDKG NSRTSALAFAEYLHQSGY (SEQ ID NO:4).
I costrutti delle proteine di fusione utilizzate sono mostrati in Fig.1.
CEA non modificato e la fusione CEA-LTB vengono usati come riferimento rispetto allo stato dell’arte. Per esplorare il potenziale immunogenico delle proteine CEA-EA e CEA-PFTG sono stati generati i due costrutti pTK1-CEA_EAopt e pTK1-CEA_PFTGopt, in cui i geni codificanti per le proteine di fusione sono stati ottimizzati impiegando i codoni di espressione usati nelle proteine più espresse nell’uomo, come nell’esempio precedente. L’espressione degli antigeni era sotto il controllo del promotore del citomegalovirus (CMV), dell’introne A e del segnale di poliadenilazione bGH (Fig. 2).
I costrutti pTK1-CEA_PFTGopt e pTK1-CEAopt sono stati trasfettati in cellule HEK293 (ATCC®-LGC, CRL-1573™) e i sovranatanti esaminati per la presenza di PFTG tramite Western blot. 48 ore dopo la trasfezione, 20 µl di sovranatante sono stati caricati su un gel di poliacrilammide (NuPAGE® Novex® 10% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 12 well #NP0302PK2, ThermoFisher) e la presenza della proteina è stata rilevata grazie ad un anticorpo anti-profilina (Goat Polyclonal to Toxoplasma gondii Inflammatory Profilin Protein #LS-C75062, LSBio). Come si vede dalla Fig.3, PFTG viene prodotta solo nel sovranatante di cellule trasfettate con pTK1-CEA_PFTGopt (lane 3) e non con i controlli pTK1-CEA_EAopt e pTK1-CEAopt (lane 1 and 2). Questo dato conferma la corretta espressione di PFTG “in frame” a valle di CEA.
Induzione di IL-12 in splenociti trattati con la proteina di fusione CEA_PFTG.
Al fine di capire se il meccanismo di azione della fusione CEA_PFTG è simile a quello di PFTG è stato verificato se la fusione CEA_PFTG induce IL-12 in splenociti di topo (BALB/c, Envigo, Olanda). I sovranatanti delle cellule trasfettate sono stati poi usati per trattare splenociti di topo. Dopo 48 ore dal trattamento, la presenza dell’IL-12 è stata rilevata tramite saggio ELISA (IL-12 p40/70 Mouse ELISA Kit, Thermofisher). Come si vede dalla Figura 4, gli splenociti murini secernono IL-12 dopo stimolazione con le proteine ricombinanti, dimostrandone l’attività biologica.
Induzione di IL-12 in PBMC umani trattati con la proteina di fusione CEA_PFTG
Allo scopo di valutare se la proteina di fusione CEA-PFTG fosse in grado di indurre la secrezione di citochine infiammatorie da parte di cellule umane, PBMC isolati dal sangue periferico degli inventori sono stati trattati con i sovranatanti su descritti e con lo stesso protocollo. 5 ml di sangue periferico sono stati purificati usando delle colonne Accuspin<TM >System-Histopaque®-1077 (Sigma A 6929) e le relative istruzioni del kit. I PBMC sono stati risospesi in 1 ml di RPMI Medium 1640 (1X), con L-glutamine, 500 ml (Gibco Invitrogen, Cat #11875-093), contati al citofluorimetro (Cytoflex, Beckman Coulter) e seminati in una piastra da 96 pozzetti a 10.000 cellule a pozzetto in 100µl. 100µl di sovranatante contenente CEA, CEA-LTB o CEA-PFTG sono stati aggiunti alle cellule. Dopo 48 ore la presenza di IL-12 è stata analizzata per ELISA (IL-12 p40 Human ELISA Kit, ThermoFisher). I risultati in figura 5 mostrano che la proteina di fusione CEA-PFTG induce la secrezione di IL12.
Induzione di IL-12 in PBMC canini trattati con la proteina di fusione CEA_PFTG.
Per verificare se PFTG e le sue proteine di fusione fossero in grado di indurre la secrezione di citochine anche in un'altra specie di mammifero, come il cane, 5 ml di sangue periferico da un cane il cui proprietario ha firmato un consenso informato per uso a scopo di ricerca, sono stati purificati usando delle colonne Accuspin<TM >System-Histopaque®-1077 (Sigma A 6929) e le relative istruzioni del kit. I PBMC sono stati risospesi in 1 ml di RPMI Medium 1640 (1X), con L-glutamine, 500 ml (Gibco Invitrogen, Cat # 11875-093), contati al citofluorimetro (Cytoflex, Beckman Coulter) e seminati in una piastra da 96 pozzetti a 10.000 cellule a pozzetto in 100µl. 100µl di sovranatante contenente CEA, CEA-LTB o CEA-PFTG sono stati aggiunti alle cellule. Dopo 48 ore la presenza di IL-12 è stata analizzata per ELISA (Canine IL-12/IL-23 p40 DuoSet ELISA, R&D Systems). I risultati (Figura 6) mostrano che la proteina di fusione CEA-PFTG induce la secrezione di IL12 anche da parte di cellule canine.
Risposte immunitarie indotte dalle proteine di fusione.
In linea con le evidenze pubblicate precedentemente riguardo alle proprietà immunostimolatorie di LTB per i vaccini contro il tumore [13], si è cercato di capire se altre fusioni di CEA con proteine immunomodulatorie, come CEA_EA e CEA_PFTG, potessero aumentare la risposta immunitaria contro l’antigene tumorale target.
Allo scopo di ottenere una forte risposta immunitaria contro CEA è stato adottato un approccio di vaccinazione genetica basato sull’elettroporazione nel muscolo scheletrico (DNA-EP) dei due costrutti pTK1-CEA-EAopt e pTK1-CEA-PFTGopt in topi transgenici per CEA (gentilmente forniti dal Dott. J. Primus, Vanderbilt University, USA) che sono quindi un modello immunologicamente tollerante per l’antigene CEA. Questa tecnica di vaccinazione consente di utilizzare costrutti ingegnerizzati in laboratorio di diverse dimensioni e non induce una risposta neutralizzante come nel caso di vettori virali permettendo dunque di ripetere le vaccinazioni più volte. Il protocollo d’immunizzazione consisteva in 4 iniezioni nel quadricipite di 50µg di pTK1-CEA-PFTGopt, pTK1-CEA-EAopt, pTK1-CEA-LTBopt o pTK1-CEAopt spaziate di 1 settimana l’una dall’altra. Il DNA era formulato in Phosphate Buffered Saline (PBS) alla concentrazione di 1mg/ml. La DNA-EP è stata effettuata con un elettroporatore BTX 830 ed elettrodi piatti con distanza di 0.5cm (BTX, Harward apparatus) con le seguenti condizioni elettriche in modalità Low Voltage: 2 impulsi di 60 msec a 100V, 250msec di pausa tra gli impulsi. Per misurare la risposta immunitaria indotta dal vaccino si è misurata la produzione di IFN-γ tramite colorazione intracellulare al FACS in PBMC prelevati 2 settimane dopo l’ultima vaccinazione. I PBMC sono stati stimolati per 16 ore con un peptide di 9 aminoacidi immunodominante di CEA, avente sequenza CGIQNSVSA (SEQ ID NO:5), specifico per le cellule CD8+ e analizzati tramite la tecnica dell’Intracellular Staining (ICS) per le citochine. Al peptide, è stata aggiunta brefeldina e si è quindi proceduto alla colorazione di superficie con gli anticorpi contro CD3, CD4 e CD8. Successivamente si è effettuata la colorazione intracellulare per IFN-γ. I dati sono stati acquisiti con un citofluorimetro FACScalibur (Becton Dickinson). Come si vede dalla Figura 7 tutti i topi immunizzati con pTK1-CEA-PFTGopt hanno risposto al vaccino (risposta superiore allo 0.1% dei CD8+ circolante) diversamente da quelli trattati con pTK1-CEAopt e con pTK1-CEA-EAopt. Solo 2 topi su 6 avevano risposto usando il costrutto pTK1-CEA-LTBopt, che rappresenta la versione più immunogenica disponibile per lo stato dell’arte. Un’analisi più dettagliata è stata eseguita sugli splenociti, usando 4 pool di 70 peptidi ciascuno (A, B, C e D), contenenti peptidi 15meri overlappanti di 11 aminoacidi e che coprono l’intera sequenza dell’antigene CEA. L’ICS ha mostrato che la fusione con PFTG risultava in una risposta poli-specifica dopo stimolo con il Pool A, B, C e D (Fig. 8). Questa analisi non solo conferma che solo i topi immunizzati con CEA-PFTG rispondono al pool D (che contiene l’epitopo immunodominante CD8+ usato per l’analisi con i PBMC) nel 100% dei casi ma anche che la media delle risposte CD8+ IFN-γ+ antigene specifiche è più alta. Questi risultati indicano che la fusione CEA-PFTG è fortemente immunogenica e capace di suscitare nuove specificità contro l’antigene tumorale CEA. Questo effetto sulla risposta cellulo-mediata può essere mediato nel modello murino dal recettore TLR11.
Effetto antitumorale di CEA-PFTG
Per verificare se la maggiore induzione della risposta immunitaria contro CEA fosse associata a una protezione antitumorale in un modello terapeutico, gruppi di topi C57Bl/6 (Envigo, Olanda) sono stati iniettati sotto cute con 5x10<5 >cellule di carcinoma di colon murino (gentilmente fornite dal Dr J. Primus, Vanderbilt University, USA) che overesprimono CEA (MC38-CEA, generate nel nostro laboratorio) e, a partire da 4 giorni dopo, vaccinati 2 volte tramite DNA-EP con i vaccini pTK1-CEAopt, pTK1-CEA-EAopt,pTK1-CEA-LTBopt e pTK1-CEA-PFTGopt (50µg per iniezione) con un intervallo di 2 settimane. Dopo 2 settimane dalla seconda iniezione (al giorno 28 dell’esperimento), la risposta immunitaria contro CEA è stata misurata al citofluorimetro (Cytoflex, Beckman Coulter) tramite un ICS multiparametrico. I dati in Figura 9 mostrano che la fusione CEA-PFTG induce una forte attivazione dei CD8+ con la secrezione di citochine infiammatorie come IFNγ e TNFα anche in presenza di un tumore.
L’effetto della vaccinazione sulla crescita dei tumori impiantati è mostrato nella figura 10, che indica che in monoterapia, il vaccino più efficace nel rallentare la progressione del tumore MC38-CEA è pTK1-CEA-PFTGopt.
ESEMPIO 3. Fusione di PFTG con hTERT.
Allo scopo di verificare se l’effetto adiuvante di PFTG possa essere applicabile ad un altro antigene tumorale classico, sono stati generati i costrutti pTK1-hTERT-LTBopt e pTK1-hTERT-PFTGopt che codifica per la seguente sequenza amminoacidica:
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSEIPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRL GPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQ RLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLL RRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRR LGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPV GQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAG PPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLV ETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLR AAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRR LVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGV GCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVW SKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNM DYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWR TFVLRVRAQDPPPELYFVKVAITGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAV VQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEA SSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAG IRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVED EALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKA GRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPF HQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQ AFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTIL DSRSDWDPVVKEWLVDTGYCCAGGIANAEDGVVFAAAADDDDGWSKLYKDDHEED TIGEDGNACGKVSINEASTIKAAVDDGSAPNGVWIGGQKYKVVRPEKGFEYNDCT FDITMCARSKGGAHLIKTPNGSIVIALYDEEKEQDKGNSRTSALAFAEYLHQSGY
(SEQ ID NO:6)
Il cDNA hTERT-LTB esprime la Telomerase Reverse Transcriptase umana (hTERT) cataliticamente inattiva e fusa alla proteina LTB. L’immunogenicità di questa proteina è stata valutata nelle scimmie [16] e più recentemente in uno studio clinico nell’uomo (manoscritto in preparazione). In questo esempio i due costrutti sono stati testati dopo una singola somministrazione in gruppi di 6 topi BALB/c (Envigo, Olanda) tramite DNA-EP alla dose di 50µg. 2 settimane dopo, la risposta immunitaria contro un pool di peptidi 15meri overlappanti di 11 residui che copre la regione N-terminale (contentente gli epitopi immunodominanti) di hTERT è stata valutata tramite la tecnica dell’ICS multiparametrico, come descritto in precedenza. La Figura 11 mostra che la risposta immunitaria di tipo CD8+ indotta da hTERT-PFTG è più alta di quella indotta da hTERT-LTB, che rappresenta il costrutto più immunogenico contro la telomerasi noto agli inventori allo stato dell’arte.
ESEMPIO 4. Fusione di PFTG con neoantigeni specifici del tumore del colon.
Nel tentativo di estendere l’applicazione della fusione di PFTG ad una diversa categoria di antigeni tumorali è stato verificato l’impatto della fusione sui neoantigeni, ossia antigeni generati da mutazioni e caratteristici di un tumore individuale e non di altri. Per questo, sono stati utilizzati neoantigeni identificati in un modello tumorale murino di colon, le CT26 [23]. Su questa base, abbiamo costruito un minigene che abbiamo denominato pTK8 e la relativa proteina di fusione pTK8-PFTG, quest’ultima avente sequenza MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSLIKDKPLRRNNSYTSYIMAICGMPLDSFRAQA IVRGCSMPGPWRSGRLLVSRRWSVEPLLPFYPPDEALEIGLELNSSALPPTEEHI HRAGGLFVADAIQVGFGRIGKHFWVTSIPSVSNALNWKEFSFIQSTLGYVALHSG QNHLKEMAISVLEARACAAAGQSSRSDWDPVVKEWLVDTGYCCAGGIANAEDGVV FAAAADDDDGWSKLYKDDHEEDTIGEDGNACGKVSINEASTIKAAVDDGSAPNGV WIGGQKYKVVRPEKGFEYNDCTFDITMCARSKGGAHLIKTPNGSIVIALYDEEKE QDKGNSRTSALAFAEYLHQSGY (SEQ ID NO:7).
Gruppi di 6 topi BALB/c sono stati vaccinati per 3 volte tramite la DNA-EP usando lo stesso protocollo descritto negli esempi precedenti. Dopo due settimane dalla terza immunizzazione, la risposta immunitaria è stata misurata tramite ELISPOT. I risultati mostrano che la fusione di PFTG con il gene TK8 non modifica la risposta immunitaria contro i neoantigeni, probabilmente data la loro già elevata immunogenicità in questo modello (Fig. 12).
ESEMPIO 5. Fusione di PFTG a proteine virali e valutazione della risposta anticorpale.
Le proteine UL119 e UL132 del Citomegalovirus umano rappresentano un sistema evoluto dal virus per sfuggire all’immunità innata. Infatti queste glicoproteine ricapitolano la funzione dell’Fcγ receptor (FcγR) espresso da varie cellule del sistema immunitario. Per questo motivo ma anche per il fatto che sono altamente glicosilate, queste proteine sono molto poco immunogeniche.
Per valutare se le fusioni con PFTG fossero in grado di aumentare l’immunogenicità di un target di tipo virale, sono stati generati i costrutti pTK1-UL119opt, pTK1-UL132opt, pTK1-UL119-PFTGopt e pTK1-UL132-PFTGopt. L’espressione degli antigeni era sotto il controllo del promotore del citomegalovirus (CMV), dell’introne A e del segnale di poliadenilazione bGH. Il protocollo di immunizzazione consisteva in 4 iniezioni nel quadricipite di 50µg di spaziate di 2 settimane l’una dall’altra. Il DNA era formulato in Phosphate Buffered Saline (PBS) alla concentrazione di 1mg/ml. La DNA-EP è stata effettuata con un elettroporatore di tipo Cliniporator IGEA, ad una distanza tra le file di elettrodi di 0,4 cm (elettrodo N-10-4-B). Per la DNA-EP nel muscolo, sono state applicate le seguenti condizioni elettriche a bassa tensione (LV): 8 impulsi di 20 msec ciascuno di 110V, 8Hz, intervallo 120msec tra ciascuno di essi. Al giorno 7, 21 e 35 i topi hanno ricevuto una iniezione intraperitoneo di 50µg di CpG per aumentare il titolo anticorpale. I gruppi erano composti da 4 topi.
La Fusione di PFTG aumenta la risposta anticorpale Al giorno 60, tutti i topi BALB/c immunizzati con le versioni degli antigeni fusi con PFTG hanno risposto al vaccino con un titolo superiore a 1000 verificato tramite attività di legame in saggi di tipo cell-ELISA (Fig. 13).
Claims (17)
- RIVENDICAZIONI 1) Proteina di fusione, un polinucleotide che codifica la proteina di fusione, un vettore di espressione o plasmide comprendente il polinucleotide, detta proteina di fusione comprendendo o essendo consistente in: - una porzione ammino-terminale consistente in una sequenza antigenica che consiste in o comprende almeno un antigene o un determinante antigenico della stessa o un neoantigene; e - una porzione carbossi-terminale consistente in una sequenza amminoacidica che consiste in o comprende la proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) o un frammento funzionale da essa derivato.
- 2) Proteina di fusione, polinucleotide o vettore di espressione o plasmide secondo la rivendicazione 1, in cui detta sequenza amminoacidica comprende o consiste in SRSDWDPVVKEWLVDTGYCCAGGIANAEDGVVFAAAADDDDGWSKLYKDDHEEDT IGEDGNACGKVSINEASTIKAAVDDGSAPNGVWIGGQKYKVVRPEKGFEYNDCTF DITMCARSKGGAHLIKTPNGSIVIALYDEEKEQDKGNSRTSALAFAEYLHQSGY (SEQ ID NO:1).
- 3) Proteina di fusione, polinucleotide o vettore di espressione o plasmide, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, in cui detto antigene o determinante antigenico o neoantigene è scelto dal gruppo che consiste in un antigene di cancro, come l’antigene carcinoembrionico (CEA) o l’antigene Telomerasi (TERT), un antigene virale come un antigene dei virus HIV, HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HSV, HTLV, RSV, encefalite Giapponese, Rift Valley Fever virus, HPV, EBV, RSV, Adenovirus, CMV, come UL119 e UL132, virus dell’influenza, virus della rabbia, Leukemia Virus, parvovirus, Rubella, West Nile Virus, Coronavirus, Zika, Rotavirus, Varicella Zoster, Chikungunya, antigeni di microorganismi dei generi Aeromonas, Arthrobacter, Aspergillus, Bacillus, Borrelia, Brucella, Bordetella, Campylobacter, Candida, Chlamydia, Clostridium, Corynebacterium, E. Coli, Haemophilus, HP, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Pseudomonas, Reaplasma, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Clostridium, Treponema, Yersinia.
- 4) Proteina di fusione, polinucleotide o vettore di espressione o plasmide, come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, per l’uso come medicamento.
- 5) Proteina di fusione, un polinucleotide che codifica la proteina di fusione o un vettore di espressione o plasmide, come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, per l’uso nella vaccinazione preventiva e terapeutica.
- 6) Proteina di fusione, polinucleotide o vettore di espressione o plasmide secondo la rivendicazione 5, per l'uso secondo la rivendicazione 5, in cui detta sequenza amminoacidica comprende o consiste in SEQ ID NO:1.
- 7) Proteina di fusione, polinucleotide o vettore di espressione o plasmide, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5-6, per l'uso secondo la rivendicazione 5, in cui detto almeno un antigene o determinante antigenico o neoantigene è scelto dal gruppo che consiste in un antigene di cancro, come l’antigene carcinoembrionico (CEA) o l’antigene Telomerasi (TERT), antigene dei virus HIV, HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HSV, HTLV, RSV, encefalite Giapponese, Rift Valley Fever virus, HPV, EBV, RSV, Adenovirus, CMV, come UL119 e UL132, virus dell’influenza, virus della rabbia, Leukemia Virus, parvovirus, Rubella, West Nile Virus, Coronavirus, Zika, Rotavirus, Varicella Zoster, Chikungunya, antigeni di microorganismi dei generi Aeromonas, Arthrobacter, Aspergillus, Bacillus, Borrelia, Brucella, Bordetella, Campylobacter, Candida, Chlamydia, Clostridium, Corynebacterium, E. Coli, Haemophilus, HP, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Pseudomonas, Reaplasma, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Clostridium, Treponema, Yersinia.
- 8) Proteina di fusione, polinucleotide o vettore di espressione o plasmide, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5-7, per l'uso secondo la rivendicazione 5, in cui le vaccinazioni preventiva e terapeutica sono contro i tumori o le infezioni.
- 9) Proteina di fusione, polinucleotide o vettore di espressione o plasmide, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5-8, per l'uso secondo la rivendicazione 8, in cui i tumori sono scelti dal gruppo consistente in tumori di ghiandola adrenale, ano, nervo uditivo, dotti biliari, vescica, ossa, cervello, seno, sistema nervoso centrale, cervice, colon, orecchio, endometrio, esofago, occhio, palpebre, tuba di falloppio, tratto gastrointestinale, testa-collo, cuore, rene, laringe, fegato, polmone, mandibola, condile mandibolare, maxilla, bocca, nasofaringe, naso, cavità orale, ovaio, pancreas, ghiandola parotidea, pene, pinna, pituitaria, ghiandola prostatica, retto, retina, ghiandole salivari, pelle, intestino tenue, colonna vertebrale, stomaco, testicolo, tiroide, uretra, vagina, nervo vestibolococleare e vulva.
- 10) Composizione farmaceutica comprendente o consistente in un polinucleotide che codifica una proteina di fusione o un vettore di espressione o plasmide comprendente il polinucleotide, opzionalmente in combinazione con un potenziatore della risposta immunitaria in un mammifero e/o con uno o più antineoplastici, in associazione con uno o più eccipienti e/o adiuvanti, in cui detta proteina di fusione comprende o consiste in: - una porzione ammino-terminale consistente in una sequenza antigenica che consiste in o comprende almeno un antigene o un determinante antigenico della stessa o un neoantigene; e -una porzione carbossi-terminale consistente in una sequenza amminoacidica che consiste in o comprende la proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG).
- 11) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 10, in cui detta sequenza amminoacidica comprende o consiste in SEQ ID NO:1.
- 12) Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10-11, in cui detto almeno un antigene o determinante antigenico o neoantigene è scelto dal gruppo che consiste in un antigene di cancro, come l’antigene carcinoembrionico (CEA) o l’antigene Telomerasi (TERT), antigeni dei virus HIV, HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HSV, HTLV, RSV, encefalite Giapponese, Rift Valley Fever virus, HPV, EBV, RSV, Adenovirus, CMV, come UL119 e UL132, virus dell’influenza, virus della rabbia, Leukemia Virus, parvovirus, Rubella, West Nile Virus, Coronavirus, Zika, Rotavirus, Varicella Zoster, Chikungunya, antigeni di microorganismi dei generi Aeromonas, Arthrobacter, Aspergillus, Bacillus, Borrelia, Brucella, Bordetella, Campylobacter, Candida, Chlamydia, Clostridium, Corynebacterium, E. Coli, Haemophilus, HP, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Pseudomonas, Reaplasma, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Clostridium, Treponema, Yersinia.
- 13) Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10-12, in cui la composizione farmaceutica è un vaccino a DNA.
- 14) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 13, in cui la composizione farmaceutica viene somministrata mediante elettroporazione.
- 15) Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10-14, per l'uso nella prevenzione e nella terapia vaccinale, ad esempio contro il cancro o le infezioni.
- 16) Proteina di fusione, polinucleotide o vettore di espressione o plasmide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, per l’uso in un metodo per la generazione di anticorpi, in cui detto metodo comprende somministrare detti proteina di fusione, polinucleotide o vettore di espressione o plasmide in un animale, ad esempio il topo, in cui detto polinucleotide o vettore di espressione o plasmide è somministrato mediante elettroporazione.
- 17) Sequenza amminoacidica che consiste in o comprende la proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) per l'uso come coadiuvante nella prevenzione e nella terapia basata su vaccinazione a DNA, ad esempio contro il cancro o le infezioni.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102019000016736A IT201900016736A1 (it) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | Antigeni fusi alla proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) e loro uso nella vaccinazione preventiva e terapeutica. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102019000016736A IT201900016736A1 (it) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | Antigeni fusi alla proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) e loro uso nella vaccinazione preventiva e terapeutica. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| IT201900016736A1 true IT201900016736A1 (it) | 2021-03-19 |
Family
ID=69468996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT102019000016736A IT201900016736A1 (it) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | Antigeni fusi alla proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) e loro uso nella vaccinazione preventiva e terapeutica. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | IT201900016736A1 (it) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005077977A2 (en) * | 2004-02-11 | 2005-08-25 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa | Carcinoembryonic antigen fusions proteins and uses thereof |
| WO2007081301A2 (en) * | 2005-01-06 | 2007-07-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services, Nih | Methods and compositions related to the identification of a novel il-12 inducing protein isolated from toxoplasma gondii |
| US20080038250A1 (en) * | 2005-12-16 | 2008-02-14 | Michigan State University | Profilin and related immunomodulatory ligands |
| WO2013041966A1 (en) | 2011-09-23 | 2013-03-28 | University Of Oslo | Vaccibodies targeted to cross-presenting dendritic cells |
| US20140221628A1 (en) * | 2012-04-18 | 2014-08-07 | National Tsing Hua University | Influenza virus-like particles comprising adjuvant-fused m2 protein to enhance the immunogenicity of vaccine |
| US20150064219A1 (en) * | 2010-02-05 | 2015-03-05 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Methods and compositions for cancer immunotherapy using flagellin-tumor associated antigen fusion protein expressing tumor cells |
| CN104830850A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-08-12 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 用于弓形虫感染预防的核苷酸序列及其应用 |
-
2019
- 2019-09-19 IT IT102019000016736A patent/IT201900016736A1/it unknown
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005077977A2 (en) * | 2004-02-11 | 2005-08-25 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa | Carcinoembryonic antigen fusions proteins and uses thereof |
| WO2007081301A2 (en) * | 2005-01-06 | 2007-07-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services, Nih | Methods and compositions related to the identification of a novel il-12 inducing protein isolated from toxoplasma gondii |
| US20080038250A1 (en) * | 2005-12-16 | 2008-02-14 | Michigan State University | Profilin and related immunomodulatory ligands |
| US20150064219A1 (en) * | 2010-02-05 | 2015-03-05 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Methods and compositions for cancer immunotherapy using flagellin-tumor associated antigen fusion protein expressing tumor cells |
| WO2013041966A1 (en) | 2011-09-23 | 2013-03-28 | University Of Oslo | Vaccibodies targeted to cross-presenting dendritic cells |
| US20140221628A1 (en) * | 2012-04-18 | 2014-08-07 | National Tsing Hua University | Influenza virus-like particles comprising adjuvant-fused m2 protein to enhance the immunogenicity of vaccine |
| CN104830850A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-08-12 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 用于弓形虫感染预防的核苷酸序列及其应用 |
Non-Patent Citations (22)
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7256024B2 (ja) | ガンワクチン及びそれを用いた治療方法 | |
| JP7548902B2 (ja) | アフリカ豚熱ウイルスワクチン | |
| Leitner et al. | Alphavirus-based DNA vaccine breaks immunological tolerance by activating innate antiviral pathways | |
| KR20160105452A (ko) | Pd1 및 pdl1 항체 및 백신 조합 및 면역요법을 위한 이들의 사용 | |
| CN111533812B (zh) | 针对sars-cov-2病毒的dna疫苗及其用途 | |
| KR20170106453A (ko) | 관문 억제제 및 백신 조합 및 면역요법을 위한 이들의 사용 | |
| JP2016510989A (ja) | 改良されたポックスウイルスワクチン | |
| TW202146435A (zh) | 含有病原性抗原及免疫刺激物之組合物 | |
| JP7384896B2 (ja) | 主要組織適合遺伝子複合（ｍｈｃ）クラスｉｉ－発現癌細胞ワクチン、及び統合免疫応答を生じさせるための使用方法 | |
| US20230285540A1 (en) | Polynucleotides encoding sars-cov-2 antigens and use thereof in the medical field as vaccines | |
| JP2025147175A (ja) | Ｉｌ－６及びｃｄ１２６を標的とするｄｎａモノクローナル抗体 | |
| CN104136039A (zh) | 靶向交叉呈递的树突状细胞的疫苗体 | |
| CN102083463B (zh) | 编码甲病毒属复制酶的表达载体及其作为免疫佐剂的用途 | |
| BR112019020235A2 (pt) | molécula de ácido nucleico, composição, e, métodos para tratar uma doença num indivíduo e para induzir uma resposta imunológica num indivíduo. | |
| IT201900016736A1 (it) | Antigeni fusi alla proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) e loro uso nella vaccinazione preventiva e terapeutica. | |
| ES2546301T3 (es) | Composición que contiene Leishmania Lip2a | |
| ES2270120T3 (es) | Vacuna contra infecciones causadas por oncovirus tales como el virus de la leucemia felina. | |
| CN110167584A (zh) | 用于针对莱姆病的dna抗体构建体 | |
| KR102553857B1 (ko) | 신규 핵산 분자 | |
| US20250152687A1 (en) | Consensus sequence of the antigen telomerase and the use thereof in preventive and therapeutic vaccination | |
| EP3795593A1 (en) | Combination of immune-modulators with tumor specific neoantigens for use in prevention and treatment of tumors | |
| AU2005293218A1 (en) | Plasmids coding for p185neu protein sequence variants and therapeutic uses thereof | |
| WO2019152602A1 (en) | Structurally modified flavivirus dmabs | |
| EA006743B1 (ru) | Стимуляция тимозином генетической иммунизации | |
| HK40014682B (zh) | 新的对抗寨卡病毒的疫苗和用於对抗寨卡病毒的dna抗体构建体的组合 |