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IT201900003605A1 - Metodo per l'esecuzione di un test di citotossicità in vitro in campo oftalmico - Google Patents

Metodo per l'esecuzione di un test di citotossicità in vitro in campo oftalmico Download PDF

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IT201900003605A1
IT201900003605A1 IT102019000003605A IT201900003605A IT201900003605A1 IT 201900003605 A1 IT201900003605 A1 IT 201900003605A1 IT 102019000003605 A IT102019000003605 A IT 102019000003605A IT 201900003605 A IT201900003605 A IT 201900003605A IT 201900003605 A1 IT201900003605 A1 IT 201900003605A1
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IT
Italy
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tissue
pieces
substance
predetermined
cells
Prior art date
Application number
IT102019000003605A
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English (en)
Inventor
Mauro Beccaro
Enrico Bettini
Paolo Signori
Claudio Gatto
Original Assignee
Al Chi Mi A S R L
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Description

DESCRIZIONE
annessa a domanda di brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
METODO PER L'ESECUZIONE DI UN TEST DI CITOTOSSICITÀ IN VITRO IN CAMPO OFTALMICO
DESCRIZIONE
La presente invenzione ha per oggetto un metodo per l'esecuzione di un test di citotossicità in vitro in campo oftalmico, ed è stata concepita in particolare allo scopo di individuare un metodo affidabile, per verificare la citotossicità o meno di tutte le sostanze che possono essere utilizzate in sede di trattamenti oftalmici in generale, ma soprattutto in sede di chirurgia oftalmica.
Si noti che nel contesto della presente invenzione con la definizione sostanza si intende indicare sia sostanze pure, sia miscele o soluzioni, sia composti o composizioni, nonché tutte le sostanze che sono normalmente classificate come dispositivi medici.
A titolo di esempio, la presente invenzione è rivolta all'accertamento della citotossicità o meno di dispositivi medici quali endotamponi, ad esempio perfluoro carburi o oli di silicone, coloranti, e fluidi d’infusione.
Attualmente, il test di citotossicità comunemente adottato in questo settore, è un test in vitro disciplinato dalla norma ISO 10993-5, che prevede di testare le sostanze utilizzando una coltura cellulare.
La tossicità viene valutata dopo un periodo di incubazione della coltura cellulare a contatto con una determinata concentrazione della sostanza da testare, e la valutazione è generalmente effettuata utilizzando coloranti vitali che sono in grado di discriminare tra cellule vive e cellule morte (colorando selettivamente o le une o le altre).
In accordo con quanto previsto dalla citata norma ISO, per i dispositivi medici in campo oftalmico è previsto che la coltura cellulare da utilizzare sia una coltura di cellule derivata dall’epitelio pigmentato retinico di origine umana, quale quella commercializzata come ARPE-19 (ATCC® CRL-2302™).
Recenti indagini cliniche, hanno tuttavia dimostrato che questi test di citotossicità in vitro, se non condotti in modo adeguato, possono fornire risultati non affidabili, mancando di evidenziare la citotossicità di alcune sostanze che, utilizzate in interventi di chirurgia oftalmica, hanno invece causato seri danni ai pazienti operati (vedasi Pastor JC, Coco RM, Fernandez-Bueno I, Alonso-Alonso ML, Medina J, Sanz-Arranz A et al. ACUTE RETINAL DAMAGE AFTER USING A TOXIC PERFLUORO-OCTANE FOR VITREO-RETINAL SURGERY. Retina 2017 Jun;37(6):1140-1151). Gli autori di tali indagini hanno quindi evidenziato la necessità di trovare nuovi metodi biologici per testare la sicurezza delle sostanze da utilizzare in campo oftalmico.
In questo contesto, il compito tecnico alla base della presente invenzione è stato proprio quello di mettere a punto un nuovo metodo per l'esecuzione di un test di citotossicità in vitro, in campo oftalmico, che ponesse rimedio agli inconvenienti citati.
È stato in particolare compito tecnico della presente invenzione mettere a punto un metodo per l'esecuzione di un test di citotossicità in vitro in campo oftalmico che garantisse una maggiore affidabilità rispetto ai metodi noti. Il compito tecnico e gli scopi indicati sono sostanzialmente raggiunti da un metodo per l'esecuzione di un test di citotossicità in vitro in campo oftalmico in accordo con quanto descritto nelle unite rivendicazioni.
Ulteriori caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione appariranno maggiormente evidenti dalla descrizione dettagliata che segue di alcune forme di esecuzione preferite, ma non esclusive, di un metodo per l'esecuzione di un test di citotossicità in vitro in campo oftalmico. Quanto descritto nel seguito, dovrà sempre essere inteso come riferito non solo ad una specifica sostanza da testare ma anche ad una sua specifica concentrazione.
Un primo aspetto innovativo alla base della presente invenzione, consiste nell'aver identificato nella retina umana espiantata da un soggetto deceduto, e considerata in tutto il suo spessore (vale a dire comprensiva di tutti gli strati che la compongono), un'alternativa più affidabile della coltura cellulare derivata dall’epitelio pigmentato retinico di origine umana. Test effettuati dalla richiedente hanno infatti evidenziato come i diversi strati retinici utilizzati insieme in condizioni analoghe a quelle fisiologiche, possano rispondere in modo ben diverso alla medesima sostanza rispetto alle sole cellule dell'epitelio pigmentato retinico, nonché che una sostanza apparentemente non citotossica se testata sulle sole cellule dell’epitelio pigmentato retinico, può invece avere effetti anche estremamente tossici sulle cellule di altri strati retinici.
Un secondo aspetto innovativo alla base della presente invenzione, consiste nell'aver messo a punto una sequenza di fasi per l'esecuzione di un test di citotossicità su una retina umana espiantata.
Un ulteriore aspetto innovativo alla base della presente invenzione, consiste nell'aver identificato le modalità e le tempistiche di gestione dell'espianto della retina umana da un soggetto deceduto e della sua gestione per l'effettuazione del test di citotossicità.
In accordo con la forma attuativa più generale della presente invenzione, il metodo per l'esecuzione di un test di citotossicità in vitro in campo oftalmico, comprende innanzitutto una fase di selezione in cui viene scelta una sostanza da testare, e ne vengono scelte una o più concentrazioni di interesse (quelle previste per l'utilizzo clinico).
Prima, durante, o dopo la fase di selezione può poi essere prevista una fase di preparazione di cellule umane vive da utilizzare nelle successive fasi del metodo, fase di preparazione su cui si ritornerà nel seguito.
Il vero e proprio inizio del metodo oggetto della presente invenzione consiste in una fase di trattamento, che è eseguita in vitro ed in fase liquida, in cui la sostanza, nella concentrazione di interesse, è messa a contatto con le cellule umane vive, ed è mantenuta a contatto con le cellule umane, in condizioni di incubazione predeterminate e per un intervallo temporale di incubazione prefissato.
In accordo con la presente invenzione, come già anticipato, le cellule umane utilizzate nella fase di trattamento sono costituite da uno o più primi pezzi di tessuto ricavati da un tessuto costituito da una parte ottica di una retina umana. In particolare, inoltre, si tratta di una parte ottica di una retina umana che sia stata ottenuta da un bulbo oculare umano che sia stato espiantato da un soggetto deceduto.
Inoltre è opportuno che la fase di trattamento abbia inizio entro settantadue ore dal momento della morte del soggetto, preferibilmente entro quarantotto ore dalla stessa. In tale periodo di tempo la parte ottica della retina deve essere staccata dal resto del bulbo oculare, e da essa devono essere ottenuti gli uno o più primi pezzi di tessuto (preferibilmente secondo le modalità descritte nel seguito).
Si noti che in accordo con la presente invenzione, ciascun pezzo della parte ottica della retina utilizzato in una fase del metodo deve essere inteso come un pezzo che interessi l'intero spessore della retina e che ne comprenda quindi tutti gli strati costitutivi.
Nelle forme attuative preferite, ciascun pezzo di tessuto presenta una larghezza massima compresa tra 1 mm e 10 mm, preferibilmente tra 2 mm e 4 mm. I test effettuati sino ad oggi hanno evidenziato che pezzi di tessuto discoidali con diametro di 3 mm danno i risultati migliori.
Le condizioni di incubazione predeterminate sono, in generale, condizioni atte a favorire la sopravvivenza e/o la proliferazione cellulare. Nella forma realizzativa preferita, le condizioni di incubazione predeterminate prevedono l'immersione di ciascun pezzo di tessuto in un medium di coltura liquido. Si noti che nell'intero contesto della presente descrizione e delle rivendicazioni allegate, qualsiasi riferimento generico ad un generico "pezzo di tessuto", deve essere inteso come rivolto a ciascuno dei diversi pezzi di tessuto utilizzabili in una delle fasi del metodo (come si vedrà nel seguito possono infatti essere presenti primi pezzi di tessuto, secondi pezzi di tessuto, terzi pezzi di tessuto e quarti pezzi di tessuto). Ulteriormente, qualsiasi riferimento generico ad una "sostanza", deve essere inteso come rivolto a ciascuna delle sostanze utilizzabili in una delle fasi del metodo (come si vedrà nel seguito può infatti trattarsi della sostanza da testare, di una sostanza citotossica o di una sostanza non citotossica).
Le condizioni di incubazione predeterminate prevedono inoltre il mantenimento della temperatura in un range prefissato, generalmente un range atto a favorire la sopravvivenza e/o la proliferazione cellulare.
Nella forma realizzativa preferita, le condizioni di incubazione predeterminate prevedono l'incubazione in un incubatore con 5% ± 1% di CO2, e l'utilizzo di un medium di coltura liquido costituito almeno da DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) addizionato di:
- Bovine Calf Serum (BCS) inattivato in quantità pari al 10% volume/volume finale; e
- Soluzione di Penicillina Streptomicina in quantità pari a 1% volume/volume finale così da avere una concentrazione finale di 100 IU/ml di penicillina e di 100 μg/ml di streptomicina.
Inoltre la temperatura deve rimanere nel range 37°C ± 1°C e l'umidità maggiore del 90%.
In accordo con la presente invenzione, inoltre, l'intervallo temporale di incubazione prefissato è vantaggiosamente non inferiore a ventiquattro ore.
Una volta terminata la fase di trattamento, il metodo oggetto della presente invenzione prevede una fase di valutazione in cui è valutata la vitalità delle cellule umane che sono state sottoposte alla fase di trattamento.
Nelle forme realizzative preferite, la fase di valutazione è eseguita con una tecnica colorimetrica che prevede l'utilizzo di un colorante in grado di colorare in modo selettivo o le sole cellule vive o le sole cellule morte. Vantaggiosamente, la tecnica colorimetrica utilizza come colorante MTT (noto anche come: sale di tetrazolio; 2H-Tetrazolium, 2-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-3,5-diphenyl-, bromide; CAS NUMBER 298-93-1), Rosso Neutro, XTT (2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide), o acido bicinconinico (BCA).
In forme attuative preferite, poi, la vitalità delle cellule è valutata estraendo il colorante dalle cellule, creando una soluzione con esso e misurando un valore di assorbanza (densità ottica) di tale soluzione.
Più in dettaglio, nella forma attuativa attualmente preferita, la fase di valutazione della vitalità delle cellule di ciascun pezzo di tessuto, comprende a propria volta le seguenti fasi operative, eseguite nell'ordine indicato:
- una fase di rimozione in cui il pezzo di tessuto viene rimosso dalle condizioni di incubazione predeterminate;
- una fase di lavaggio in cui il pezzo di tessuto viene lavato con una soluzione sterile di tampone fosfato Ca++ Mg++;
- una fase di immersione in cui il pezzo di tessuto è immerso in una soluzione di immersione sterile contenente MTT, ed è lasciato in immersione in condizioni di immersione prefissate e per un intervallo temporale di immersione prefissato; vantaggiosamente, le condizioni di immersione prefissate prevedono l'immersione in una soluzione di MTT in DMEM/F-12 senza supplementi con una concentrazione di 1 mg/ml, ad una temperatura nel range 37°C ± 1°C, con una umidità maggiore del 90% e in un incubatore con 5% ± 1% di CO2.; l'intervallo temporale di immersione prefissato è invece pari ad almeno tre ore. Si deve notare che l'MTT è un sale solubile in acqua, a formare una soluzione colorata in giallo. Esso ha inoltre la proprietà che la succinato deidrogenasi mitocondriale e le deidrogenasi citoplasmatiche, lo metabolizzano in sale di formazano, un prodotto cristallino colorato di blu, che è invece insolubile in acqua. Utilizzando l'MTT nel contesto della presente invenzione, le sole cellule sopravvissute alla fase di trattamento sono in grado di metabolizzarlo, cosicché la quantità di sale di formazano che può essere rinvenuta alla fine della fase di immersione è proporzionale al numero di cellule vitali presenti nel pezzo di tessuto in esame, e può essere utilizzata per quantificare la vitalità del pezzo di tessuto.
- una fase di lavaggio in cui il pezzo di tessuto è estratto dalla soluzione di immersione sterile, ed è lavato con una soluzione sterile di tampone fosfato Ca++ Mg++ per eliminare eventuali residui di colorante;
- una fase di estrazione in cui ciascun pezzo di tessuto è immerso in isopropanolo, ed è sottoposto ad agitazione lenta (preferibilmente con un agitatore a piastre) in condizioni di estrazione prefissate e per un intervallo temporale di estrazione prefissato, per estrarre il colorante in esso contenuto e ottenere una soluzione del colorante blu (il sale di formazano) in isopropanolo. Vantaggiosamente le condizioni di estrazione prefissate prevedono l'esecuzione a temperatura ambiente (con ciò intendendo una qualsiasi temperatura compresa tra 20°C e 30°C) e l'intervallo temporale di estrazione prefissato è pari ad almeno due ore. Al termine delle due ore, il sale di formazano formatosi nelle cellule vive si è trasferito nell'isopropanolo con cui ha formato una soluzione di colore blu; l'intensità di colorazione è proporzionale al numero di cellule vive.
- infine una fase di lettura spettrofotometrica durante la quale viene misurato un valore di assorbanza della soluzione di colorante in isopropanolo. Vantaggiosamente la lettura spettrofotometrica è eseguita a 570 nm, su un campione della soluzione di isopropanolo privo del pezzo di tessuto, ed è eseguita dopo che tale campione è stato lasciato in agitazione per almeno dieci minuti.
Allo scopo di valutare se i risultati della fase di valutazione possano essere considerati attendibili, il metodo oggetto della presente invenzione prevede inoltre l'esecuzione di due controlli di attendibilità. Vantaggiosamente i due controlli possono essere eseguiti come suggerito dalla norma ISO-10993-5 vale a dire per contatto diretto.
Il primo controllo prevede una fase di controllo positivo, in cui uno o più secondi pezzi di tessuto, ottenuti dal medesimo tessuto da cui sono stati ottenuti i primi pezzi di tessuto, sono posti a contatto con una sostanza citotossica in una relativa concentrazione di interesse (tale cioè da garantire un effetto citotossico noto sulle cellule retiniche) e sono mantenuti a contatto con la sostanza citotossica in condizioni di controllo positivo predeterminate, e per un intervallo temporale di controllo positivo prefissato. Anche la fase di controllo positivo è eseguita in vitro ed in fase liquida, ed è svolta in modo indipendente per ciascun secondo pezzo di tessuto. Scopo di questa fase di controllo positivo è dimostrare la capacità delle cellule del tessuto retinico utilizzato, di fornire un'adeguata risposta se sottoposte ad una sostanza citotossica.
Il secondo controllo prevede invece una fase di controllo negativo, in cui uno o più terzi pezzi di tessuto, ottenuti dal medesimo tessuto da cui sono stati ottenuti i primi pezzi di tessuto, sono posti a contatto con una sostanza non citotossica in una relativa concentrazione di interesse (tale cioè da garantire un effetto non citotossico noto sulle cellule retiniche, vale a dire tale che la sostanza possa essere considerata sicura per l'organismo) e sono mantenuti a contatto con la sostanza non citotossica, in condizioni di controllo negativo predeterminate, e per un intervallo temporale di controllo negativo prefissato. Anche la fase di controllo negativo è eseguita in vitro e in fase liquida, ed è svolta in modo indipendente per ciascun terzo pezzo di tessuto. Scopo anche di questa fase di controllo positivo è dimostrare la capacità delle cellule del tessuto retinico utilizzato, di fornire un'adeguata risposta (nessuna) se sottoposte ad una sostanza non citotossica.
Nelle forme attuative preferite, sia la fase di controllo positivo, sia la fase di controllo negativo sono eseguite per contatto diretto tra la sostanza di controllo (citotossica o non citotossica), nella concentrazione di interesse, e, rispettivamente, i secondi ed i terzi pezzi di tessuto. A titolo di esempio, ciò può essere ottenuto comprendo ciascun pezzo di tessuto con una certa quantità della sostanza di controllo (costituita ad esempio da un liquido perfluorurato) e coprendo poi la sostanza di controllo con una diversa sostanza di minore densità (ad esempio terreno di coltura completo). Infatti, grazie alle diverse densità delle sostanze, le sostanze di controllo rimangono a contatto con il pezzo tessuto e non si spostano verso l'alto. La durata del test potrà essere di almeno 24h a 37°C±1°C in incubatore con 5%±1°C CO2, e umidità maggiore del 90%).
Eseguite le due fasi di controllo, il metodo prevede quindi che la fase di valutazione sia eseguita anche per ciascun secondo pezzo di tessuto e ciascun terzo pezzo di tessuto, per verificare che i relativi risultati in termini di vitalità, siano quelli attesi.
Dopo la fase di valutazione, il metodo prevede l'esecuzione di una fase di determinazione in cui, sulla base della vitalità precedentemente valutata per i primi pezzi di tessuto, si determina la citotossicità o meno della sostanza da testare.
In generale, la fase di determinazione è eseguita considerando la sostanza da testare citotossica se, sulla base dei risultati della fase di valutazione, si può determinare che, durante la fase di trattamento, la sostanza da testare è stata responsabile di una diminuzione di vitalità delle cellule degli uno o più primi pezzi di tessuto, superiore ad una soglia predeterminata. Preferibilmente, la soglia predeterminata è pari al 30%. Inoltre, la diminuzione di vitalità è vantaggiosamente valutata, non rispetto alla vitalità dello stesso pezzo di tessuto all'inizio del metodo, ma rispetto alla vitalità di altri pezzi di tessuto che sia stati sottoposti ad una analoga fase di trattamento, ma in assenza della sostanza da testare.
A tale scopo, nella sua forma di attuazione preferita, il metodo comprende anche una fase di definizione di un risultato di confronto, in cui uno o più quarti pezzi di tessuto, ottenuti dal medesimo tessuto da cui sono stati ottenuti i primi pezzi di tessuto, sono mantenuti immersi nel solo medium di coltura, nelle condizioni di incubazione predeterminate e per l'intervallo temporale di incubazione prefissato. Anche la fase di definizione di un risultato di confronto è eseguita in vitro ed è svolta in modo indipendente per ciascun quarto pezzo di tessuto.
Successivamente, la fase di valutazione è eseguita anche per ciascuno degli uno o più quarti pezzi di tessuto che hanno subito la fase di definizione di un risultato di confronto.
Infine, la fase di determinazione della citotossicità o meno della sostanza da testare, è eseguita come confronto tra la vitalità valutata per le cellule degli uno o più primi pezzi di tessuto, e la vitalità valutata per le cellule degli uno o più quarti pezzi di tessuto.
Vantaggiosamente, tale fase di determinazione della citotossicità o meno della sostanza da testare, è eseguita calcolando un rapporto tra un primo valore, rappresentativo della vitalità delle cellule degli uno o più primi pezzi di tessuto, ed un secondo valore, rappresentativo della vitalità delle cellule degli uno o più quarti pezzi di tessuto.
Ulteriormente, la sostanza da testare è considerata citotossica quando tale rapporto risulta essere inferiore ad un valore limite prefissato, preferibilmente pari a 0.7 (o 70% se espresso in termini percentuali).
In ogni caso, per poter considerare i risultati ottenuti attendibili, è opportuno che il valore di assorbanza misurato per i quarti pezzi di tessuto sia pari o superiore a 0.3.
Allo scopo di evitare eventuali effetti interferenti dovuti alle modalità di esecuzione delle varie fasi del processo (come ad esempio il tessuto, o il contenitore utilizzato), nella forma realizzativa preferita è previsto che le misure di vitalità vengano correte rispetto a tali possibili interferenti.
Conseguentemente, può essere prevista una ulteriore fase di definizione di un riferimento, in cui almeno un campione del solo medium di coltura è mantenuto nelle condizioni di incubazione predeterminate, per l'intervallo temporale di incubazione prefissato (preferibilmente utilizzando i medesimi contenitori utilizzati per i pezzi di tessuto). Al termine dell'intervallo temporale di incubazione prefissato, tale campione del solo medium di coltura è utilizzato per determinare la vitalità delle cellule degli uno o più primi pezzi di tessuto e delle cellule degli uno o più quarti pezzi di tessuto, più precisamente per correggere le valutazioni di vitalità eseguite per i primi ed i quarti pezzi di tessuto.
In particolare, nel caso di esecuzione di una fase di lettura spettrofotometrica per determinare la vitalità delle cellule, è previsto che un valore di assorbanza sia misurato anche per il campione del solo medium di coltura. Tale valore è poi utilizzato nel calcolo del rapporto previsto nella fase di determinazione della citotossicità o meno della sostanza da testare. In particolare esso è utilizzato sia per calcolare il primo valore del rapporto (il numeratore), che viene calcolato come differenza tra il valore di assorbanza misurato per gli uno o più primi pezzi di tessuto, e quello misurato per il campione di medium di coltura, sia per calcolare analogamente il secondo valore del rapporto (il denominatore), che viene anch'esso calcolato come differenza tra il valore di assorbanza misurato per gli uno o più quarti pezzi di tessuto, e quello misurato per il campione di medium di coltura.
Va infine ricordato che qualora sia prevista l'esecuzione delle fasi di controllo sopra descritte, nella fase di determinazione, la citotossicità o meno della sostanza da testare è valutata tenendo conto anche dei risultati della fase di valutazione eseguita sugli uno o più secondi pezzi di tessuto e sugli uno o più terzi pezzi di tessuto. In particolare, si procede all'esecuzione della fase di determinazione solo se i risultati delle fasi di controllo positivo e negativo sono stati coerenti con quanto ci sia aspettava (vale a dire se la vitalità dei secondi pezzi di tessuto – controllo positivo – è inferiore al 70% e se quella dei terzi pezzi di tessuto – controllo negativo – è superiore o pari al 70 %).
Si noti infine che laddove la fase di trattamento, le fasi di controllo e/o la fase di definizione di un risultato di confronto vengono eseguite in parallelo, ed in modo indipendente, su una pluralità di pezzi di tessuto distinti, nelle rispettive fasi di valutazione, la vitalità complessiva delle cellule è valutata tenendo conto dei risultati delle singole misure, ad esempio come valore medio della vitalità valutata per ciascun pezzo di tessuto.
A seconda delle esigenze di chi esegue il test, va infine sottolineato che, in accordo con la presente invenzione, la decisione circa la citotossicità o meno di una specifica sostanza da testare, può essere eseguita sia eseguendo un'unica volta il metodo per l'esecuzione di un test di citotossicità in vitro in campo oftalmico, sia eseguendolo più volte ogni volta utilizzando una diversa retina umana, fermo restando che tutti i pezzi di tessuto utilizzati per ciascuna esecuzione devono essere stati ottenuti dalla parte ottica di un'unica retina. Si può quindi decidere di considerare la sostanza da testare citotossica se essa risulta tale almeno una delle volte in cui è eseguito il metodo.
Sebbene quanto sin qui descritto possa essere attuato anche partendo da pezzi di tessuto precedentemente preparati da altri, come già anticipato, nella forma attuativa della presente invenzione è prevista anche una fase di preparazione dei pezzi di tessuto da utilizzare (vale a dire delle cellule umane).
In accordo con tale fase è previsto innanzitutto che il bulbo espiantato venga trasferito dal luogo di espianto al laboratorio deputato alla sua processazione, o intero o, eventualmente, privato della cornea (in caso questa possa essere destinata al trapianto). Preferibilmente, i bulbi devono essere trasferiti entro quarantotto ore dal decesso (meglio entro ventiquattro ore), devono essere trasportati a 4°C, all’interno di contenitori sterili a chiusura ermetica (vantaggiosamente da 30 ml), e devono essere conservati immersi in un terreno di coltura DMEM/F-12 medium per il trasporto a 4°C.
Una volta raggiunto il laboratorio di processazione, si deve procedere all'estrazione della retina al massimo entro ventiquattro ore, vale a dire entro settantadue ore dal decesso, preferibilmente comunque entro quarantotto ore dal decesso.
L’estrazione della retina dal bulbo avviene preferibilmente in toto, e viene eseguita in asepsi, vantaggiosamente sotto cappe a flusso laminare ISO-5 Biohazard.
Le fasi dell'estrazione sono le seguenti:
1. Lavaggio del bulbo in toto con un medium di coltura, ad esempio composto da DMEM/F-12medium, supplementato, in volume/volume finale, con il 10% di Fetal Calf Serum (FCS) e 1% di una soluzione di Penicillina streptomicina (così da avere una concentrazione finale di 100 IU/ml di penicillina e di 100 μg/ml di streptomicina).
2. Estrazione del cristallino, ad esempio mediante utilizzo di forbici a punte smusse e pinze anatomiche delicate.
3. Dissezione della sclera, ad esempio con forbici a punte smusse e pinze delicate, in modo da separare la coroide con la retina e il vitreo in toto dal tessuto sclerale.
4. Separazione della retina in toto dalla coroide e dal vitreo, ad esempio mediante utilizzo di pinze anatomiche delicate; preferibilmente si separa prima la coroide in toto da retina e vitreo, poi si stacca il vitreo in toto dalla retina (o dalla sua sola parte ottica) mediante lavaggio con il medium di coltura.
5. Preparazione dei pezzi di tessuto retinico per il test di citotossicità: il tessuto retinico viene disteso (ad esempio in una capsula Petri sterile) e viene aggiunto del medium di coltura, per mantenere idratata la retina. Si effettua quindi una punzonatura/carotatura a tutto spessore in corrispondenza della parte ottica della retina, utilizzando dei punch da biopsia, con un range di diametro da 2 mm a 10 mm, preferibilmente con diametro di 3 mm. In particolare, in questa fase si cerca di ottenere il massimo numero possibile di pezzi di tessuto.
Infine tutti i pezzi di tessuto che si sono ottenuti, possono essere inseriti, uno per pozzetto, nei pozzetti di una singola piastra, ad esempio utilizzando un pipetta gilson a spostamento positivo (in quanto molto delicata con il tessuto retinico), per non rischiare di danneggiarlo.
In questa fase può essere utile già suddividere i pezzi di tessuto in gruppi di primi pezzi di tessuto, secondi pezzi di tessuto, terzi pezzi di tessuto e quarti pezzi di tessuto in vista dell'esecuzione delle successive fasi del metodo.
Le prove sino ad ora effettuate dalla richiedente hanno evidenziato che, da una singola parte ottica di una retina, è generalmente possibile ottenere almeno ventiquattro pezzi di tessuto circolari di diametro 3 mm.
Si è inoltre constatato che tali pezzi di tessuto possono essere vantaggiosamente ripartiti come segue:
- tra 8 e 16 primi pezzi di tessuto;
- tra 8 e 16 secondi pezzi di tessuto
- tra 8 e 16 terzi pezzi di tessuto;
- tra 8 e 16 quarti pezzi di tessuto.
In ogni caso, è preferibile che ogni tipologia comprenda almeno sei pezzi di tessuto.
La presente invenzione consegue importanti vantaggi.
In particolare, grazie alla presente invenzione è stato possibile mettere a punto un metodo per l'esecuzione di un test di citotossicità in vitro in campo oftalmico, che garantisce una affidabilità molto maggiore rispetto ai metodi noti, ed in particolare rispetto al metodo noto che prevede l'utilizzo di una coltura cellulare di cellule dell'epitelio pigmentato retinico.
Allo scopo di evidenziare tale vantaggio della presente invenzione, vale a dire la maggior sensibilità del nuovo metodo rispetto al metodo noto basato sulle cellule ARPE-19, sono stati eseguiti sia test di citotossicità per contatto diretto con perfluorocarburi, sia test di citotossicità con due oli di silicone commerciali 1000 cts (nel seguito denominati genericamente OLIO SILICONE 1 e OLIO SILICONE 2).
Sono stati utilizzati come controlli positivi (indicatori di morte cellulare) i composti:
1) CONTROLLO POSITIVO 1: 1H-perfluorooctane (CAS 335-65-9) al 12.5% diluito in perfluoroottano ultrapuro;
2) CONTROLLO POSITIVO 2: Perfluorooctanoic acid (CAS 335-67-1) al 0.01% in perfluoroottano ultrapuro.
È stato invece utilizzato come CONTROLLO NEGATIVO un perfluoroottano puro 100% (HPF8, prodotto da Alchimia srl - lot P18100018).
Vantaggiosamente, i testi di citotossicità per contatto diretto sono stati eseguiti comprendo ciascun pezzo di tessuto con una quantità compresa tra 50-100 microlitri della sostanza e coprendo poi la sostanza con circa 200 microlitri di terreno di coltura completo. Grazie alle diverse densità delle sostanze e del terreno di coltura, le sostanze rimangono a contatto con il pezzo tessuto e non si spostano verso l'alto. La durata del test è stata di 24h a 37°C±1°C in incubatore con 5%±1°C CO2, e umidità maggiore del 90%).
I risultati finali del test, in termini di vitalità cellulare residua rispetto ad campioni non trattati (valutata con misure di assorbanza MTT-TEST 570nm come sopra descritto), sono riportati nella tabella che segue, ove i dati che evidenziano una citotossicità sono sottolineati:
ove N indica il numero di prove eseguite (che corrisponde al numero di pezzi di tessuto utilizzati).
I dati evidenziano la corrispondenza dei risultati dei due metodi per quanto riguarda il controllo negativo, mentre il metodo oggetto della presente invenzione risulta essere più accurato rispetto al metodo noto che utilizza cellule ARPE-19 per quanto riguarda i due controlli positivi per i quali il test svolto utilizzando ARPE-19 ha evidenziato una citotossicità molto meno marcata.
Ulteriormente, il metodo oggetto della presente invenzione ha evidenziato una citotossicità (su entrambe le retine testate) anche con riferimento ad uno dei due oli di silicone commerciali, citotossicità non evidenziata invece dal test svolto utilizzando ARPE-19 che si è quindi dimostrato molto meno sensibile.
Va infine rilevato che la presente invenzione risulta di relativamente facile realizzazione e che anche il costo connesso alla sua attuazione non risulta molto elevato.
L’invenzione così concepita è suscettibile di numerose modifiche e varianti, tutte rientranti nell’ambito del concetto inventivo che la caratterizza.
Tutti i dettagli sono rimpiazzabili da altri tecnicamente equivalenti ed i materiali impiegati, nonché le forme e le dimensioni dei vari componenti, potranno essere qualsiasi a seconda delle esigenze.

Claims (15)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per l'esecuzione di un test di citotossicità in vitro in campo oftalmico, comprendente le seguenti fasi operative: una fase di selezione in cui vengono scelte una sostanza da testare ed una sua concentrazione di interesse; una fase di trattamento, eseguita in vitro ed in fase liquida, in cui la sostanza da testare, nella concentrazione di interesse, è messa a contatto con cellule umane vive, ed è mantenuta a contatto con le cellule umane, in condizioni di incubazione predeterminate per un intervallo temporale di incubazione prefissato; una fase di valutazione in cui, trascorso l'intervallo temporale di incubazione prefissato, è valutata la vitalità delle cellule umane sottoposte alla fase di trattamento; e una fase di determinazione in cui, sulla base della vitalità precedentemente valutata, si determina la citotossicità o meno della sostanza da testare; in cui: per l'esecuzione del metodo vengono utilizzate cellule umane costituite da uno o più primi pezzi di tessuto, in cui il tessuto è una parte ottica di una retina umana; gli uno o più primi pezzi di tessuto sono ottenuti da un bulbo oculare umano e comprendono ciascuno l'intero spessore della parte ottica della retina; il bulbo oculare umano è un bulbo oculare espiantato da un soggetto deceduto; e la fase di trattamento ha inizio entro settantadue ore dalla morte del soggetto deceduto.
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui nella fase di determinazione la sostanza da testare è considerata citotossica se, sulla base dei risultati della fase di valutazione, si determina che durante la fase di trattamento è stata responsabile di una diminuzione di vitalità delle cellule umane superiore ad una soglia predeterminata, preferibilmente superiore ad una soglia predeterminata del 30%.
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2 comprendente inoltre le seguenti fasi: una fase di controllo positivo, in cui uno o più secondi pezzi di tessuto ottenuti dal medesimo tessuto, in vitro e ciascuno in modo indipendente, sono posti a contatto con una sostanza citotossica, presente in una concentrazione citotossica, e sono mantenuti a contatto con la sostanza citotossica, in condizioni di controllo positivo predeterminate, e per un intervallo temporale di controllo positivo prefissato; una fase di controllo negativo, in cui uno o più terzi pezzi di tessuto ottenuti dal medesimo tessuto, in vitro e ciascuno in modo indipendente, sono posti a contatto con una sostanza non citotossica, presente in una concentrazione non citotossica, e sono mantenuti a contatto con la sostanza non citotossica, in condizioni di controllo negativo predeterminate, e per un intervallo temporale di controllo negativo prefissato; in cui la fase di valutazione è eseguita anche per ciascun secondo pezzo di tessuto e ciascun terzo pezzo di tessuto, e in cui nella fase di determinazione la citotossicità o meno della sostanza da testare è valutata tenendo conto anche dei risultati della fase di valutazione eseguita sugli uno o più secondi pezzi di tessuto e sugli uno o più terzi pezzi di tessuto.
  4. 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui dette condizioni di incubazione predeterminate prevedono l'immersione di ciascun pezzo di tessuto in un medium di coltura liquido contenente la rispettiva sostanza nella concentrazione prevista, e il mantenimento della temperatura in un range prefissato.
  5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4 comprendente inoltre una fase di definizione di un risultato di confronto, in cui uno o più quarti pezzi di tessuto ottenuti dal medesimo tessuto, in vitro e ciascuno in modo indipendente, sono mantenuti immersi nel solo medium di coltura, nelle condizioni di incubazione predeterminate e per l'intervallo temporale di incubazione prefissato; in cui la fase di valutazione è eseguita anche per ciascuno degli uno o più quarti pezzi di tessuto; ed in cui la fase di determinazione della citotossicità o meno della sostanza da testare è eseguita come confronto tra la vitalità valutata per le cellule degli uno o più primi pezzi di tessuto e la vitalità valutata per le cellule degli uno o più quarti pezzi di tessuto.
  6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 5 in cui la fase di determinazione della citotossicità o meno della sostanza da testare, è eseguita calcolando un rapporto tra un primo valore, rappresentativo della vitalità delle cellule degli uno o più primi pezzi di tessuto, ed un secondo valore, rappresentativo della vitalità delle cellule degli uno o più quarti pezzi di tessuto, ed in cui la sostanza da testare è considerata citotossica quando tale rapporto è inferiore ad un valore limite prefissato, preferibilmente pari a 0.7.
  7. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 6 comprendente inoltre una fase di definizione di un riferimento, in cui almeno un campione del solo medium di coltura è mantenuto nelle condizioni di incubazione predeterminate per l'intervallo temporale di incubazione prefissato, ed in cui al termine dell'intervallo temporale di incubazione prefissato l'almeno un campione è utilizzato per determinare la vitalità delle cellule degli uno o più primi pezzi di tessuto e delle cellule degli uno o più quarti pezzi di tessuto.
  8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 7 in cui ciascuna fase di valutazione della vitalità prevede l'uso di una tecnica colorimetrica, ed in cui la vitalità delle cellule è misurata misurando un valore di assorbanza di una soluzione ottenuta estraendo colorante dal pezzo di tessuto da valutare, in cui un valore di assorbanza è misurato anche per il detto almeno un campione di medium di coltura, ed in cui nel calcolo del rapporto previsto nella fase di determinazione della citotossicità o meno della sostanza da testare, il primo valore è calcolato come differenza tra il valore di assorbanza misurato per gli uno o più primi pezzi di tessuto e quello misurato per il campione di medium di coltura, e il secondo valore è calcolato come differenza tra il valore di assorbanza misurato per gli uno o più quarti pezzi di tessuto e quello misurato per il campione di medium di coltura.
  9. 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 in cui ciascuna fase di valutazione della vitalità prevede l'uso di una tecnica colorimetrica.
  10. 10. Metodo secondo la rivendicazione 8 o 9 in cui la tecnica colorimetrica utilizza MTT come colorante.
  11. 11. Metodo secondo la rivendicazione 10 in cui, al termine dell'intervallo temporale di incubazione prefissato, la fase di valutazione della vitalità delle cellule di ciascun pezzo di tessuto, comprende a propria volta le seguenti fasi operative nell'ordine indicato: una fase di rimozione in cui il pezzo di tessuto viene rimosso dalle condizioni di incubazione predeterminate; una fase di lavaggio in cui il pezzo di tessuto viene lavato con una soluzione sterile di tampone fosfato Ca<++ >Mg<++>; una fase di immersione in cui il pezzo di tessuto è immerso in una soluzione di immersione sterile contenente MTT, ed è lasciato in immersione in condizioni di immersione prefissate e per un intervallo temporale di immersione prefissato; una fase di lavaggio in cui il pezzo di tessuto è estratto dalla soluzione di immersione sterile ed è lavato con una soluzione sterile di tampone fosfato Ca<++ >Mg<++ >per eliminare eventuali residui di colorante; una fase di estrazione in cui ciascun pezzo di tessuto è immerso in isopropanolo, ed è sottoposto ad agitazione lenta in condizioni di estrazione prefissate e per un intervallo temporale di estrazione prefissato, per estrarre il colorante in esso contenuto e ottenere una soluzione di colorante in isopropanolo; una fase di lettura spettrofotometrica durante la quale viene misurato un valore di assorbanza della soluzione di colorante in isopropanolo.
  12. 12. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11 in cui, nella fase di valutazione, la vitalità delle cellule umane è valutata come media della vitalità valutata per ciascun pezzo di tessuto.
  13. 13. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12 in cui ciascun pezzo di tessuto presenta una larghezza massima compresa tra 1 mm e 10 mm, preferibilmente tra 2 mm e 4 mm.
  14. 14. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13, comprendente inoltre, prima della fase di selezione, una fase di preparazione dei pezzi di tessuto che a propria volta prevede le seguenti fasi: espianto di un bulbo oculare da un soggetto deceduto; conservazione del bulbo oculare espiantato in un terreno di coltura DMEM/F-12 ad una temperatura nominale di 4°C; estrazione della parte ottica della retina dal bulbo oculare entro settantadue ore dal decesso, preferibilmente entro quarantotto ore dal decesso; ottenimento dei pezzi di tessuto retinico dalla parte ottica della retina mediante punzonatura/carotatura a tutto spessore, con un range di diametro da 2 mm a 10 mm, preferibilmente con un range di diametro da 2.5 mm a 3.5 mm.
  15. 15. Metodo per la valutazione della citotossicità di una sostanza, in cui un metodo in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14 è eseguito più volte per una medesima sostanza da testare, ogni volta utilizzando un'unica parte ottica di una diversa retina umana, ed in cui la sostanza da testare è considerata citotossica se tale è il risultato della fase di determinazione di almeno una delle volte in cui è eseguito il metodo in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14.
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