IT201900009558A1

IT201900009558A1 - Cosmetic use of extracts derived from plant cell cultures belonging to the Pelargonium capitatum species and cosmetic compositions containing such extracts

Info

Publication number: IT201900009558A1
Application number: IT102019000009558A
Authority: IT
Inventors: Annalisa Tito; Antonietta Carola; Fabio Apone; Maria Gabriella Colucci
Original assignee: Vitalab S R L
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2020-12-20

Description

DESCRIZIONE DESCRIPTION

Campo di applicazione Field of application

La presente invenzione si riferisce all’uso in campo cosmetico di estratti derivati da colture di cellule vegetali del genere Pelargonium, al metodo per la produzione di detti estratti e alle relative composizioni comprendenti tali estratti per l’uso in dermocosmesi. The present invention refers to the use in the cosmetic field of extracts derived from plant cell cultures of the genus Pelargonium, to the method for the production of said extracts and to the related compositions including these extracts for use in dermocosmetics.

Tecnica nota Known technique

L'invecchiamento cutaneo, oltre che causato da fattori endogeni, è principalmente provocato da fattori ambientali esterni, come il fumo, sostanze inquinanti e radiazioni elettromagnetiche che fanno parte della luce solare. Skin aging, in addition to being caused by endogenous factors, is mainly caused by external environmental factors, such as smoke, pollutants and electromagnetic radiation that are part of sunlight.

Benché siano già noti gli effetti delle radiazioni UV sulla pelle (Natarajan et al., 2014), meno noti sono i danni che altri tipi di radiazioni possono causare ai tessuti della pelle, come i raggi infrarossi (IR) e la luce blu (BL). Although the effects of UV radiation on the skin are already known (Natarajan et al., 2014), less known is the damage that other types of radiation can cause to skin tissues, such as infrared (IR) and blue light (BL ).

I raggi infrarossi rappresentano una parte dell’intero spettro della radiazione elettromagnetica del sole: il termine stesso “infrarosso”, cioè inferiore del rosso, sta ad indicare che la loro frequenza si trova immediatamente sotto quella del colore rosso della luce visibile. Spesso i raggi infrarossi vengono indicati come “radiazioni termiche” o “radiazioni di calore”, proprio per la loro intrinseca capacità di scaldare le superfici che colpiscono. Sulla base della specifica lunghezza d’onda, essi sono a loro volta suddivisi in lunghi, medi e corti. I raggi infrarossi lunghi sono quelli più utilizzati in campo medico, in quanto sono stati dimostrati degli effetti benefici su diversi organi umani e sono stati spesso utilizzati per terapie di riabilitazione. Nonostante i suddetti effetti positivi, è stato evidenziato da diversi studi che tali raggi possono produrre degli effetti dannosi sulla pelle, se irradiata per tempi lunghi o sottoposta ad alte intensità. Infrared rays represent a part of the entire spectrum of the electromagnetic radiation of the sun: the very term "infrared", that is lower than red, indicates that their frequency is immediately below that of the red color of visible light. Often infrared rays are referred to as "thermal radiation" or "heat radiation", precisely because of their intrinsic ability to heat the surfaces they hit. Based on the specific wavelength, they are in turn divided into long, medium and short. Long infrared rays are the most used in the medical field, as they have been shown to have beneficial effects on various human organs and have often been used for rehabilitation therapies. Despite the aforementioned positive effects, it has been shown by several studies that these rays can produce harmful effects on the skin, if irradiated for long times or subjected to high intensities.

In particolare, i raggi infrarossi inducono la produzione delle metallo-proteinasi (MMPs,), enzimi che costituiscono una famiglia di endo-peptidasi dipendenti da calcio e che sono responsabili della digestione delle proteine della matrice extracellulare, come collagene, gelatina e stromielina. Tra le MMPs, le più importanti sono le MMP-1 e -3 che vengono definite collagenasi in quanto entrambe sono capaci di degradare diversi tipi di collagene (Barolet et al., 2016). La conseguenza è la perdita da parte della pelle di elasticità e resistenza, mentre si assiste ad un graduale indebolimento generale e ad un precoce invecchiamento . In particular, infrared rays induce the production of metallo-proteinases (MMPs,), enzymes that make up a family of calcium-dependent endo-peptidases and which are responsible for the digestion of extracellular matrix proteins, such as collagen, gelatin and stromyelin. Among the MMPs, the most important are the MMP-1 and -3 which are defined as collagenases as both are capable of degrading different types of collagen (Barolet et al., 2016). The consequence is the loss by the skin of elasticity and resistance, while there is a gradual general weakening and premature aging.

A livello cellulare, i raggi infrarossi causano un significativo incremento delle specie reattive dellossigeno (ROS), in particolare all’interno dei mitocondri, compromettendo le funzioni stesse di tali organelli, come quelle respiratorie e di produzione di ATP (Schroeder et al., 2006). Inoltre, un altro effetto dannoso causato da IR sulla pelle è l’insorgenza di reazioni infiammatorie, causate da una iperproduzione di citochine infiammatorie, come l’interleuchina 6 (IL-6), a sua volta mediata dall’attivazione del recettore TRPV-1, un fattore coinvolto nell’iper- sensitività ed iper-reattività della pelle a stress esterni di varia natura (Hsu & Yoshioka, 2015). At the cellular level, infrared rays cause a significant increase in reactive oxygen species (ROS), particularly within the mitochondria, compromising the very functions of these organelles, such as respiratory and ATP production (Schroeder et al., 2006 ). Furthermore, another harmful effect caused by IR on the skin is the onset of inflammatory reactions, caused by an overproduction of inflammatory cytokines, such as interleukin 6 (IL-6), in turn mediated by the activation of the TRPV-1 receptor. , a factor involved in the hyper-sensitivity and hyper-reactivity of the skin to external stresses of various kinds (Hsu & Yoshioka, 2015).

Anche la luce blu (BL) è una componente naturale della radiazione solare; infatti fa parte dello spettro di luce visibile ed è caratterizzata da una lunghezza d'onda più lunga rispetto agli UV. Blue light (BL) is also a natural component of solar radiation; in fact it is part of the visible light spectrum and is characterized by a longer wavelength than UV.

La maggior parte degli apparecchi tecnologici, come LED, smartphone e schermi digitali, emanano importanti quantità di luce blu, la cui intensità arriva fino a 1000 volte superiore rispetto a quella contenuta nella luce visibile solare. Nonostante la luce blu sia meno pericolosa degli UV, la sua esposizione è sicuramente più frequente e costante e, in tempi più lunghi, può produrre danni significativi alla pelle. Considerando che, attualmente, una persona possiede in media quattro dispositivi elettronici a cui è esposta per un tempo di circa sei ore al giorno, in soli 4 giorni si raggiungerebbe l’esposizione ad un’energia equivalente a 20 minuti di sole di mezzogiorno. E’ stato infatti dimostrato che la luce blu causa dei danni significativi alla pelle, in quanto determina una iperproduzione di ROS nelle cellule (Nakashima et al., 2017). Most technological devices, such as LEDs, smartphones and digital screens, emit significant amounts of blue light, the intensity of which is up to 1000 times higher than that contained in visible sunlight. Although blue light is less dangerous than UV, its exposure is certainly more frequent and constant and, in longer times, it can cause significant damage to the skin. Considering that, currently, a person has on average four electronic devices to which he is exposed for about six hours a day, in just 4 days he would be exposed to an energy equivalent to 20 minutes of midday sun. In fact, it has been shown that blue light causes significant damage to the skin, as it determines an overproduction of ROS in the cells (Nakashima et al., 2017).

Ad oggi esistono in commercio alcuni prodotti cosmetici in grado di agire come filtro solare dei raggi UV, delle radiazioni infrarosse e della luce blu. To date, there are some cosmetic products on the market that can act as a solar filter for UV rays, infrared radiation and blue light.

È noto che i filtri solari sono sostanze costituite da molecole che riescono a riflettere ed assorbire le radiazioni, per poi rilasciarle sotto forma di calore, quindi raggi infrarossi. Pertanto, se da un lato il filtro solare evita che la pelle assorba troppi UV, dall’altro può determinare un ulteriore danno alle cellule degli strati più profondi a causa di una maggiore quantità di radiazioni infrarosse prodotte. Inoltre, i filtri solari possono essere instabili, irritanti, e non completamente efficaci per ogni tipo di radiazione e, soprattutto, non riparano i danni che le radiazioni stesse causano alle cellule della pelle e alle loro strutture subcellulari. It is known that sunscreens are substances made up of molecules that are able to reflect and absorb radiation, and then release it in the form of heat, hence infrared rays. Therefore, if on the one hand the sunscreen prevents the skin from absorbing too much UV, on the other it can cause further damage to the cells of the deeper layers due to a greater amount of infrared radiation produced. Furthermore, sunscreens can be unstable, irritating, and not completely effective for all types of radiation and, above all, they do not repair the damage that radiation itself causes to skin cells and their subcellular structures.

Il problema tecnico alla base della presente invenzione è quello di mettere a disposizione nuove composizioni cosmetiche da impiegarsi vantaggiosamente per il trattamento e la prevenzione del fotoinvecchiamento cutaneo indotto da raggi infrarossi, o da luce blu o luce ultravioletta, garantendo un’efficacia ad ampio spettro. The technical problem underlying the present invention is that of making available new cosmetic compositions to be used advantageously for the treatment and prevention of skin photoaging induced by infrared rays, or by blue light or ultraviolet light, ensuring broad spectrum efficacy.

Sommario dell'invenzione Summary of the invention

Gli autori della presente invenzione hanno ora individuato un estratto derivato da cellule in coltura della pianta Pelargonium capitatum, in grado di proteggere le cellule della pelle dai danni causati dalle radiazioni nell'infrarosso, dalla luce blu e dalle radiazioni ultraviolette. The authors of the present invention have now identified an extract derived from cultured cells of the Pelargonium capitatum plant, capable of protecting skin cells from damage caused by infrared radiation, blue light and ultraviolet radiation.

In un suo aspetto, la presente invenzione si riferisce dunque all’uso cosmetico di almeno un estratto derivato da colture di cellule vegetali appartenenti alla specie Pelargonium capitatum per il trattamento e/o la prevenzione del foto-invecchiamento della pelle dovuto a esposizione a luce ultravioletta, luce blu o radiazione infrarossa. In one aspect, the present invention therefore refers to the cosmetic use of at least one extract derived from plant cell cultures belonging to the Pelargonium capitatum species for the treatment and / or prevention of photo-aging of the skin due to exposure to ultraviolet light. , blue light or infrared radiation.

Con l’espressione “luce blu”, come qui utilizzata, si intende una radiazione elettromagnetica di lunghezza d’onda compresa tra 380 nm e 500 nm. With the expression "blue light", as used here, we mean an electromagnetic radiation with a wavelength between 380 nm and 500 nm.

Le piante del genere Pelargonium, appartenente alla famiglia delle geraniacee a cui fa parte il geranio comune, danno origine a estratti che sono particolarmente ricchi di molecole ad azione antiossidante, come polifenoli, tannini e flavonoli. Plants of the genus Pelargonium, belonging to the geraniacee family to which the common geranium belongs, give rise to extracts that are particularly rich in antioxidant molecules, such as polyphenols, tannins and flavonols.

Allo scopo di sviluppare un prodotto per la cura della pelle contenente un estratto derivato da Pelargonium capitatum, da utilizzare per contrastare i danni da foto-invecchiamento (detto “photo-aging”) in applicazioni cosmetiche, gli autori hanno allestito colture cellulari liquide a partire da foglie di Pelargonium capitatum. In order to develop a skin care product containing an extract derived from Pelargonium capitatum, to be used to counteract photo-aging damage (called "photo-aging") in cosmetic applications, the authors set up liquid cell cultures from from leaves of Pelargonium capitatum.

Con il termine “foto-invecchiamento”, come qui utilizzato, si intende l'invecchiamento della pelle dovuto all’esposizione alle radiazioni elettromagnetiche, sia nello spettro della radiazione ultravioletta (UV) sia nello spettro del visibile. The term "photo-aging", as used herein, refers to skin aging due to exposure to electromagnetic radiation, both in the ultraviolet (UV) and visible spectrum.

Dopo aver ottenuto le cellule indifferenziate in forma di “callo” da tessuti fogliari, sono state sviluppate colture di cellule dense, le quali sono state processate al fine di ottenere estratti idrosolubili. After obtaining the undifferentiated cells in the form of "callus" from leaf tissues, cultures of dense cells were developed, which were processed in order to obtain water-soluble extracts.

L’utilizzo di estratti derivati da cellule in coltura, invece che dalla pianta o da alcuni suoi organi, comporta vantaggi molteplici. The use of extracts derived from cultured cells, instead of from the plant or some of its organs, has multiple advantages.

Innanzitutto, gli estratti ottenuti dalle cellule in coltura sono privi di sostanze contaminanti potenzialmente tossiche (come pesticidi e fertilizzanti) e agenti patogeni ambientali a cui sono esposte le piante durante la loro crescita. Le cellule in coltura, infatti, crescono in condizioni controllate di laboratorio. First, the extracts obtained from cultured cells are free of potentially toxic contaminants (such as pesticides and fertilizers) and environmental pathogens to which plants are exposed during their growth. In fact, cultured cells grow under controlled laboratory conditions.

Inoltre, le caratteristiche degli estratti ottenuti da cellule in coltura sono standardizzate, e non dipendono dalle stagioni, condizioni ambientali e ritmi circadiani come quelli a cui sono sottoposte le piante; ciò garantisce il mantenimento delle medesime caratteristiche di qualità del prodotto ottenuto. Furthermore, the characteristics of the extracts obtained from cultured cells are standardized, and do not depend on the seasons, environmental conditions and circadian rhythms such as those to which plants are subjected; this guarantees the maintenance of the same quality characteristics of the product obtained.

Un ulteriore vantaggio è rappresentato dal fatto che le cellule in coltura sono totipotenti e nello stesso tempo estremamente versatili, perché possono essere manipolate con facilità ed indotte a produrre una maggiore quantità di sostanze desiderate, semplicemente cambiando le condizioni di crescita o aggiungendo sostanze naturali con azione stimolante. A further advantage is represented by the fact that the cells in culture are totipotent and at the same time extremely versatile, because they can be easily manipulated and induced to produce a greater quantity of desired substances, simply by changing the growth conditions or adding natural substances with action stimulating.

Inoltre, gli estratti ottenuti dalle cellule in coltura sono privi di sostanze irritanti o potenzialmente allergeniche, e pertanto il rischio di sviluppare allergie sulla pelle in seguito ad applicazione è sensibilmente ridotto. Furthermore, the extracts obtained from cultured cells are free of irritating or potentially allergenic substances, and therefore the risk of developing allergies on the skin following application is significantly reduced.

I suddetti vantaggi rendono le cellule vegetali in coltura una conveniente fonte di composti benefici, e possono quindi essere utilizzate come biofabbriche di principi attivi per combattere rinvecchiamento cutaneo. The aforementioned advantages make plant cells in culture a convenient source of beneficial compounds, and can therefore be used as bio-factories of active ingredients to combat skin aging.

In un altro suo aspetto, la presente invenzione riguarda un procedimento per la preparazione di almeno un estratto da colture di cellule vegetali appartenenti alla specie Pelargonium capitatum, comprendente le fasi di: In another aspect, the present invention relates to a process for the preparation of at least one extract from plant cell cultures belonging to the Pelargonium capitatum species, comprising the steps of:

a) coltivare dette cellule di Pelargonium capitatum in un mezzo di coltura liquido; a) culturing said Pelargonium capitatum cells in a liquid culture medium;

b) omogeneizzare le cellule in una soluzione acquosa salina, ottenendo un omogenato; b) homogenizing the cells in an aqueous saline solution, obtaining a homogenate;

c) separare la parte solida di detto omogenato dalla parte liquida, che costituisce un estratto idrosolubile. c) separating the solid part of said homogenate from the liquid part, which constitutes a water-soluble extract.

Con l’espressione “cellule vegetali di Pelargonium” , come qui utilizzata, si intendono cellule totipotenti derivate dalla proliferazione di cellule prelevate da diversi tessuti della pianta (preferibilmente da cellule della foglia) . With the expression "Pelargonium plant cells", as used here, we mean totipotent cells derived from the proliferation of cells taken from different plant tissues (preferably from leaf cells).

Le suddette colture di cellule vegetali sono ottenute prelevando tessuto vegetale da piante, inducendo la formazione di calli dal tessuto su un substrato solido, prelevando i calli e allestendo colture liquide da essi. The above plant cell cultures are obtained by taking plant tissue from plants, inducing the formation of calluses from the tissue on a solid substrate, taking calluses and setting up liquid cultures from them.

La suddetta soluzione acquosa salina è generalmente una soluzione tamponata, ad esempio un tampone salino fosfato PBS a pH 7,4. The aforementioned aqueous saline solution is generally a buffered solution, for example a PBS phosphate saline buffer at pH 7.4.

Preferibilmente la suddetta fase c) di separare la parte solida dell’omogenato dalla parte liquida è eseguita mediante centrifugazione, sedimentazione o filtrazione, e porta alla separazione di un sopranatante (parte liquida) e di un pellet (parte solida) . Preferably the aforementioned step c) of separating the solid part of the homogenate from the liquid part is performed by centrifugation, sedimentation or filtration, and leads to the separation of a supernatant (liquid part) and a pellet (solid part).

Il procedimento secondo l’invenzione può inoltre comprendere la fase ulteriore di trattare la suddetta parte solida con un solvente lipofilo, ottenendo un estratto liposolubile. The process according to the invention can also comprise the further step of treating the aforementioned solid part with a lipophilic solvent, obtaining a fat-soluble extract.

Il suddetto solvente lipofilo è un solvente organico preferibilmente scelto tra alcoli, acetone, etere, steroli e oli e convenientemente costituito da un alcool a 2-4 atomi di carbonio, vantaggiosamente etanolo. The above lipophilic solvent is an organic solvent preferably selected from alcohols, acetone, ether, sterols and oils and conveniently constituted by an alcohol with 2-4 carbon atoms, advantageously ethanol.

Alternativamente, il procedimento secondo l’invenzione può comprendere la fase ulteriore di trattare la suddetta parte solida con acidi ed enzimi proteolitici in soluzione acquosa, così da idrolizzare le proteine delle pareti cellulari, ottenendo un estratto ricco in peptidi e zuccheri. Alternatively, the process according to the invention may include the further step of treating the aforementioned solid part with acids and proteolytic enzymes in aqueous solution, so as to hydrolyze the proteins of the cell walls, obtaining an extract rich in peptides and sugars.

Preferibilmente la suddetta parte solida viene previamente trattata con acqua distillata in modo da rimuovere i residui dei componenti citoplasmatici e poi trattata con soluzione acida per l’idrolisi dei legami glucosidici, e con enzimi per idrolizzare le proteine delle pareti cellulari. Preferably, the aforementioned solid part is previously treated with distilled water in order to remove the residues of the cytoplasmic components and then treated with an acid solution for the hydrolysis of glucosidic bonds, and with enzymes to hydrolyze the proteins of the cell walls.

Preferibilmente, successivamente al trattamento con acqua distillata e prima del trattamento con soluzione acida, la parte solida viene trattata con una soluzione di EDTA (ad es. 2mM) e portata all’ebollizione. Preferably, after treatment with distilled water and before treatment with acid solution, the solid part is treated with an EDTA solution (eg. 2mM) and brought to boiling.

Gli estratti summenzionati (estratto idrosolubile, estratto liposolubile ed estratto ricco in peptidi e zuccheri) possono essere portati a secco con metodiche note (utilizzando ad esempio un liofilizzatore, un evaporatore rotante o un essiccatore spray), ottenendo, a seconda dei casi, una polvere o una pasta semisolida. The aforementioned extracts (water-soluble extract, fat-soluble extract and extract rich in peptides and sugars) can be dried with known methods (using for example a freeze dryer, a rotary evaporator or a spray dryer), obtaining, depending on the case, a powder or a semi-solid paste.

In un suo ulteriore aspetto, la presente invenzione si riferisce all’uso cosmetico come più sopra definito, in cui il suddetto almeno un estratto è scelto tra l’estratto idrosolubile, l’estratto liposolubile oppure l’estratto ricco in peptidi e zuccheri, come ottenuti mediante il procedimento sopra descritto o è una miscela di due di tali estratti o di tutti e tre. In a further aspect, the present invention refers to the cosmetic use as defined above, in which the aforesaid at least one extract is selected from the water-soluble extract, the fat-soluble extract or the extract rich in peptides and sugars, such as obtained by the procedure described above or is a mixture of two of these extracts or of all three.

Preferibilmente per l’uso cosmetico in questione, il suddetto almeno un estratto comprende almeno due degli estratti summenzionati e preferibilmente tutti e tre. Preferably for the cosmetic use in question, the aforementioned at least one extract comprises at least two of the aforementioned extracts and preferably all three.

In un suo ulteriore aspetto, la presente invenzione riguarda una composizione comprendente l’estratto idrosolubile e/o l’estratto liposolubile e/o l’estratto ricco in peptidi e zuccheri ottenuti mediante il metodo summenzionato. In a further aspect, the present invention relates to a composition comprising the water-soluble extract and / or the fat-soluble extract and / or the extract rich in peptides and sugars obtained by the aforementioned method.

Preferibilmente, la composizione contiene, per una parte in peso dell’estratto idrosolubile, da 0,01 a 100, preferibilmente 1, parti in peso dell’estratto liposolubile e, indipendentemente, da 0,01 a 100, preferibilmente 1, parti in peso dell’estratto ricco in peptidi e zuccheri. Preferably, the composition contains, for one part by weight of the water-soluble extract, from 0.01 to 100, preferably 1, parts by weight of the fat-soluble extract and, independently, from 0.01 to 100, preferably 1, parts by weight of the extract rich in peptides and sugars.

Preferibilmente, la composizione contiene, per una parte in peso dell’estratto idrosolubile, una parte in peso dell’estratto liposolubile e una parte in peso dell’estratto ricco in peptidi e zuccheri. Preferably, the composition contains, for one part by weight of the water-soluble extract, one part by weight of the fat-soluble extract and one part by weight of the extract rich in peptides and sugars.

In maniera preferita, la suddetta composizione comprende almeno un solvente idrofilo scelto dal gruppo comprendente acqua, soluzioni acquose saline, e solventi organici, preferibilmente oli, alcoli, glicerolo, acidi organici, ammidi, ammine, aldeidi e chetoni. Preferably, the above composition comprises at least one hydrophilic solvent selected from the group comprising water, aqueous saline solutions, and organic solvents, preferably oils, alcohols, glycerol, organic acids, amides, amines, aldehydes and ketones.

Preferibilmente, il solvente idrofilo è una soluzione idroalcolica, convenientemente una miscela acqua/ glicerina, e l’estratto idrosolubile è contenuto in una concentrazione di 0,1-12%, preferibilmente 0,4-5%, in peso sul peso della composizione. Preferably, the hydrophilic solvent is a hydroalcoholic solution, conveniently a water / glycerin mixture, and the water-soluble extract is contained in a concentration of 0.1-12%, preferably 0.4-5%, by weight on the weight of the composition.

Le composizioni cosmetiche a base di questo estratto hanno mostrato un effetto di protezione delle cellule della pelle dai danni indotti da IR (quali aumento del livello dei ROS mitocondriali, riduzione della produzione di ATP, aumento della produzione di MMP-1 e insorgenza di reazioni infiammatorie), da luce blu (come aumento del livello di ROS citosolici) e infine protezione da morte cellulare indotta da uv. Cosmetic compositions based on this extract have shown a protective effect of skin cells from IR-induced damage (such as an increase in the level of mitochondrial ROS, a reduction in ATP production, an increase in the production of MMP-1 and the onset of inflammatory reactions. ), by blue light (as an increase in the level of cytosolic ROS) and finally protection from UV-induced cell death.

Quindi, la presente invenzione si riferisce anche all’uso cosmetico della composizione sopra descritta per il trattamento e la prevenzione del foto-invecchiamento della pelle dovuto all’esposizione a luce blu, luce ultravioletta o radiazioni infrarosse. Therefore, the present invention also refers to the cosmetic use of the composition described above for the treatment and prevention of photo-aging of the skin due to exposure to blue light, ultraviolet light or infrared radiation.

Infine, la presente invenzione si riferisce ad una formulazione cosmetica comprendente uno degli estratti sopra descritti (estratto idrosolubile, estratto liposolubile, estratto ricco in peptidi e zuccheri) o una composizione come sopra definita e un veicolo cosmeticamente accettabile. Tale formulazione cosmetica può essere ad esempio in forma di crema, gel, lozione per applicazione cutanea, rossetto, fondotinta e make-up. Finally, the present invention relates to a cosmetic formulation comprising one of the extracts described above (water-soluble extract, fat-soluble extract, extract rich in peptides and sugars) or a composition as defined above and a cosmetically acceptable vehicle. This cosmetic formulation can be for example in the form of cream, gel, lotion for skin application, lipstick, foundation and make-up.

Breve descrizione delle figure Brief description of the figures

La figura 1 mostra il contenuto di ROS mitocondriali in fibroblasti umani adulti (HDF) in seguito al trattamento con IR (44J/cm2) e l’effetto di riduzione esercitato dall’estratto di Pelargonium, usato a 2 diverse concentrazioni. Come controllo positivo è stato usato il Coenzima Q, noto per la sua elevata azione anti-ossidante. Le barre rappresentano le deviazioni standard. Figure 1 shows the content of mitochondrial ROS in adult human fibroblasts (HDF) following treatment with IR (44J / cm2) and the reduction effect exerted by the Pelargonium extract, used at 2 different concentrations. Coenzyme Q, known for its high anti-oxidant action, was used as a positive control. The bars represent standard deviations.

La figura 2 mostra la quantità di ATP prodotta dai fibroblasti umani HDF in seguito al trattamento con IR (44J/cm2) e l’effetto di recupero esercitato dall’estratto di Pelargonium, usato a 2 diverse concentrazioni. Le barre rappresentano le deviazioni standard, mentre gli asterischi indicano differenze significative rispetto al controllo. Figure 2 shows the amount of ATP produced by human HDF fibroblasts following treatment with IR (44J / cm2) and the recovery effect exerted by the Pelargonium extract, used at 2 different concentrations. Bars represent standard deviations, while asterisks indicate significant differences from the control.

La figura 3 mostra la misura della quantità di metalloproteinasi 1 (MMP1) prodotta dai fibroblasti umani HDF in seguito al trattamento con IR (88J/cm2) e l’effetto di inibizione esercitato dall’estratto di Pelargonium, usato a 2 diverse concentrazioni. Come controllo positivo è stato usato l’idrocortisone, che ha una azione inibitoria sulla produzione di MMP1. Le barre rappresentano le deviazioni standard. Figure 3 shows the measurement of the amount of metalloproteinase 1 (MMP1) produced by human HDF fibroblasts following treatment with IR (88J / cm2) and the inhibitory effect exerted by the Pelargonium extract, used at 2 different concentrations. Hydrocortisone was used as a positive control, which has an inhibitory action on the production of MMP1. The bars represent standard deviations.

La figura 4 mostra la misura della quantità di interleuchina 6 (IL-6) prodotta dai fibroblasti umani HDF in seguito al trattamento con IR (88J/cm2) e l’effetto di inibizione sulla sua produzione esercitato dall’estratto di Pelargonium, usato a 2 diverse concentrazioni. Come controllo positivo è stato usato il TPCK (N-tosil-L- fenilalanina clorometil chetone) una potente molecola con azione antiinfiammatoria. Le barre rappresentano le deviazioni standard. Figure 4 shows the measurement of the quantity of interleukin 6 (IL-6) produced by human HDF fibroblasts following treatment with IR (88J / cm2) and the inhibiting effect on its production exerted by the Pelargonium extract, used to 2 different concentrations. TPCK (N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone), a powerful molecule with anti-inflammatory action, was used as a positive control. The bars represent standard deviations.

La figura 5 mostra l’espressione del gene del recettore TRPV1 in fibroblasti umani HDF in seguito al trattamento con IR (88J/cm2) e l’effetto di inibizione sulla sua espressione esercitato dall’estratto di Pelargonium, usato a 2 diverse concentrazioni. Come controllo positivo è stato usato il TPCK, una potente molecola con azione antiinfiammatoria. Le barre rappresentano le deviazioni standard. Figure 5 shows the expression of the TRPV1 receptor gene in human HDF fibroblasts following treatment with IR (88J / cm2) and the inhibitory effect on its expression exerted by the Pelargonium extract, used at 2 different concentrations. TPCK, a powerful anti-inflammatory molecule, was used as a positive control. The bars represent standard deviations.

La figura 6 mostra il contenuto di ROS citosolici in chertinociti umani (HaCaT) in seguito al trattamento con luce blu (7 J/cm2) e l’effetto di riduzione esercitato dall’estratto di Pelargonium, usato a concentrazione di 0,002%. Come controllo positivo è stato usato l’acido ascorbico, noto per la sua elevata azione antiossidante. Le barre rappresentano le deviazioni standard. Figure 6 shows the content of cytosolic ROS in human kertinocytes (HaCaT) following treatment with blue light (7 J / cm2) and the reduction effect exerted by the Pelargonium extract, used at a concentration of 0.002%. Ascorbic acid, known for its high antioxidant action, was used as a positive control. The bars represent standard deviations.

La figura 7 mostra l’effetto di riduzione della vitalità cellulare in cheratinociti HaCaT esercitato dai raggi UVB (80mJ/cm2), ed il recupero prodotto dal trattamento con l’estratto di Pelargonium, usato a concentrazione 0,002%. Figure 7 shows the effect of reducing cell viability in HaCaT keratinocytes exerted by UVB rays (80mJ / cm2), and the recovery produced by treatment with Pelargonium extract, used at a concentration of 0.002%.

La figura 8 mostra l’effetto dell’estratto di Pelargonium, usato a 2 diverse concentrazioni, sulla produzione di pro-collagene I e tropoelastina in fibroblasti umani HDF. Le barre rappresentano le deviazioni standard. Figure 8 shows the effect of Pelargonium extract, used at 2 different concentrations, on the production of pro-collagen I and tropoelastin in human HDF fibroblasts. The bars represent standard deviations.

Descrizione dettagliata Detailed description

Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, il procedimento secondo la presente invenzione viene eseguito secondo le seguenti modalità e condizioni: According to an embodiment of the present invention, the process according to the present invention is carried out according to the following methods and conditions:

a) Induzione dei calli da tessuti fogliari: foglie intere vengono prelevate da piante del genere Pelargonium, e sterilizzate con etanolo 70% (in acqua v/v), per 15 minuti, e 1% ipoclorito di sodio (in acqua v/v), per altri 15 minuti. Le foglie, dopo essere state lavate per 3 volte in acqua per rimuovere l'alcol e l' ipoclorito, vengono tagliate in porzioni di circa 0,5 cm<2 >ciascuno con una lama sterile. Tutti i frammenti di foglia vengono posti su un mezzo solido B5 Gamborg medium contenente: plant agar 7,5 mg/L, mio-inositolo 500 mg/L, saccarosio 30 g/L, 2,4D 1 mg/L, kinetina 0,01 mg/L, adenina 1 mg/L, pH 5,7. Dopo circa 5 settimane di incubazione a 20°C al buio, si ottengono i calli per proliferazione delle cellule della foglia. I calli vengono escissi e trasferiti su mezzo di coltura fresco ogni 3-4 settimane. a) Induction of corns from leaf tissues: whole leaves are taken from plants of the genus Pelargonium, and sterilized with 70% ethanol (in water v / v), for 15 minutes, and 1% sodium hypochlorite (in water v / v) , for another 15 minutes. The leaves, after being washed 3 times in water to remove alcohol and hypochlorite, are cut into portions of about 0.5 cm <2> each with a sterile blade. All leaf fragments are placed on a solid B5 Gamborg medium containing: plant agar 7.5 mg / L, myo-inositol 500 mg / L, sucrose 30 g / L, 2.4D 1 mg / L, kinetin 0, 01 mg / L, adenine 1 mg / L, pH 5.7. After about 5 weeks of incubation at 20 ° C in the dark, calluses are obtained by proliferation of leaf cells. Calluses are excised and transferred to fresh culture medium every 3-4 weeks.

b) Prelievo dei calli ed allestimento delle colture liquide: quando i calli hanno raggiunto un diametro di circa 1 cm (peso di circa 50 mg), essi vengono prelevati e dispersi in beute contenenti 50 ml di mezzo di coltura ABI liquido (B5 Gamborg medium contenente: mioinositolo 500 mg/L, saccarosio 30 g/L, 2,4D 1 mg/L, kinetina 0,01 mg/L, adenina 1 mg/L, pH 5,7). Le beute vengono poste al buio su uno shaker con agitazione orbitale di 120 rpm. Dopo circa 10 giorni, i calli si sono disgregati, a formare singole cellule o aggregati di cellule più piccoli, e le cellule sono proliferate in modo da formare una coltura densa. b) Removal of calluses and preparation of liquid cultures: when the calluses have reached a diameter of about 1 cm (weight of about 50 mg), they are collected and dispersed in flasks containing 50 ml of liquid ABI culture medium (B5 Gamborg medium containing: myoinositol 500 mg / L, sucrose 30 g / L, 2.4D 1 mg / L, kinetin 0.01 mg / L, adenine 1 mg / L, pH 5.7). The flasks are placed in the dark on a shaker with orbital shaking of 120 rpm. After about 10 days, the calluses have broken down to form single cells or smaller cell clusters, and the cells have proliferated to form a dense culture.

c) Crescita delle cellule di Pelargonium in coltura liquida: la crescita delle cellule ottenute da espianti di tessuto vegetale può essere condotta inoculando 100 ml di una coltura densa di cellule in 0,5 L di mezzo di coltura ABI liquido. c) Growth of Pelargonium cells in liquid culture: the growth of cells obtained from plant tissue explants can be carried out by inoculating 100 ml of a dense culture of cells in 0.5 L of liquid ABI culture medium.

d) Separazione delle cellule: può essere effettuata mediante centrifugazione a 2000 g, sedimentazione o filtrazione delle cellule per rimuovere il loro mezzo di coltura. Le cellule vengono poi lavate in acqua distillata e congelate a -80°C. d) Cell separation: this can be done by centrifugation at 2000 g, sedimentation or filtration of the cells to remove their culture medium. The cells are then washed in distilled water and frozen at -80 ° C.

e) Omogeneizzazione delle cellule: le cellule congelate vengono rotte meccanicamente (omogeneizzate) in presenza di tampone salino fosfato PBS (NaCl 390 mM, KC1 8 mM, NaH2PO4 36 mM, KH2PO4 5,28 mM, pH 7,4) in rapporto di 1: 1 volume/peso. In alternativa al PBS, possono essere utilizzati altri tamponi salini (es. carbonati, citrati), soluzioni alcoliche (es. etanolo sciolto in acqua in concentrazioni da 1 a 99%), soluzioni acide o basiche (es. acido acetico o idrossido di sodio a concentrazioni da 0,1 a 0,01%), o soluzioni di glicerina in acqua (190%). L’omogeneizzazione viene effettuata in un frullatore meccanico, precedentemente raffreddato in modo da mantenere una temperatura sotto i 10 °C. e) Homogenization of the cells: the frozen cells are mechanically broken (homogenized) in the presence of PBS phosphate buffered saline (NaCl 390 mM, KC1 8 mM, NaH2PO4 36 mM, KH2PO4 5.28 mM, pH 7.4) in a ratio of 1 : 1 volume / weight. As an alternative to PBS, other saline buffers (e.g. carbonates, citrates), alcoholic solutions (e.g. ethanol dissolved in water in concentrations from 1 to 99%), acidic or basic solutions (e.g. acetic acid or sodium hydroxide) can be used at concentrations from 0.1 to 0.01%), or glycerin solutions in water (190%). Homogenization is carried out in a mechanical blender, previously cooled in order to maintain a temperature below 10 ° C.

Questa fase può essere effettuata in un contenitore idoneo quale un mortaio di ceramica ed un pestello anch’esso di ceramica, precedentemente raffreddati, o per volumi maggiori si possono utilizzare recipienti più grandi, anche metallici, dove il materiale vegetale può essere omogeneizzato con lame metalliche, utilizzando sia frullatori da laboratorio o industriali, che presse, estrattori ad alta pressione, sonicatori o estrattori con “pulse electric field”. This phase can be carried out in a suitable container such as a ceramic mortar and a pestle, also made of ceramic, previously cooled, or for larger volumes, larger containers, even metal, can be used, where the plant material can be homogenized with metal blades. , using both laboratory or industrial blenders, presses, high pressure extractors, sonicators or extractors with "pulse electric field".

f) Ottenimento dell'estratto idrosolubile: una volta ottenuto un Usato omogeneo tramite omogeneizzazione, il campione viene centrifugato, ad esempio a 8500 rpm per circa 15 minuti a 4°C, per precipitare le componenti insolubili. Il sopranatante ottenuto dalla centrifugazione viene prelevato: esso costituisce l'estratto idrosolubile. f) Obtaining the water-soluble extract: once a homogeneous Used has been obtained through homogenization, the sample is centrifuged, for example at 8500 rpm for about 15 minutes at 4 ° C, to precipitate the insoluble components. The supernatant obtained from centrifugation is removed: it constitutes the water-soluble extract.

g) Raccolta dell’estratto e liofilizzazione: l'estratto ottenuto nella fase f) viene portato a secco in un liofilizzatore o un rotoevaporatore o una camera di essiccazione o spray-dryer per eliminare il solvente. g) Collection of the extract and freeze-drying: the extract obtained in step f) is dried in a freeze dryer or a roto-evaporator or a drying chamber or spray-dryer to eliminate the solvent.

La polvere ottenuta viene sciolta in acqua (2 mi ogni grammo di polvere) e la soluzione ulteriormente diluita in un solvente di tipo alcolico, preferibilmente in glicerolo, in modo da ottenere soluzioni idroalcoliche contenenti da 20 mg a 0,1 mg, preferibilmente da 5 mg a 0,4 mg e ancora più preferibilmente 0,4 mg di estratto ogni ml di solvente (ovvero soluzioni al 12%-0,1%, preferibilmente al 5% - 0,4% e ancora più preferibilmente allo 0,4%). Queste soluzioni rappresentano la materia prima che può essere ulteriormente diluita per la fabbricazione dei prodotti cosmetici pronti per le applicazioni. The powder obtained is dissolved in water (2 ml per gram of powder) and the solution further diluted in an alcohol-type solvent, preferably in glycerol, in order to obtain hydroalcoholic solutions containing from 20 mg to 0.1 mg, preferably from 5 mg to 0.4 mg and even more preferably 0.4 mg of extract per ml of solvent (i.e. 12% -0.1% solutions, preferably 5% - 0.4% and even more preferably 0.4% ). These solutions represent the raw material that can be further diluted for the manufacture of ready-to-use cosmetic products.

h) Ottenimento dell'estratto liposolubile: metà del residuo insolubile (pellet) ottenuto in seguito a centrifugazione, è risospeso in un solvente lipofilo, (come trigliceridi, oli, alcoli, esteri) in un rapporto 1: 10 (peso/ volume), ad una temperatura tra i 20 e 70 °C, per un tempo variabile tra 1 a 10 ore. La sospensione viene centrifugata per allontanare il materiale non disciolto e il sopranatante prelevato: esso costituisce il l’estratto lipofilo. h) Obtaining the fat-soluble extract: half of the insoluble residue (pellet) obtained after centrifugation is resuspended in a lipophilic solvent (such as triglycerides, oils, alcohols, esters) in a ratio of 1: 10 (weight / volume), at a temperature between 20 and 70 ° C, for a time ranging from 1 to 10 hours. The suspension is centrifuged to remove the undissolved material and the supernatant withdrawn: it constitutes the lipophilic extract.

i) Ottenimento dell'estratto di peptidi e zuccheri dalle pareti cellulari: l’altra metà del pellet (contenente le pareti cellulari) ottenuto in fase f) viene prima trattato con EDTA 2 mM a 100 °C, risospeso in 2 volumi di una soluzione di HC1 0,1 N e poi bollito (100°C) per 1 ora, allo scopo di idrolizzare e portare in soluzione tutti gli zuccheri delle glicoproteine delle pareti cellulari. i) Obtaining the extract of peptides and sugars from the cell walls: the other half of the pellet (containing the cell walls) obtained in step f) is first treated with 2 mM EDTA at 100 ° C, resuspended in 2 volumes of a solution of 0.1 N HCl and then boiled (100 ° C) for 1 hour, in order to hydrolyze and dissolve all the sugars of the cell wall glycoproteins.

Dopo la bollitura, il campione viene risospeso, raffreddato (in ghiaccio) e poi digerito enzimaticamente a 37°C per 16 ore con pepsina, utilizzando lmg di enzima per mi di sospensione. Al termine della digestione enzimatica, condotta per 16-24 ore a circa 37°C, la sospensione viene centrifugata in modo da ottenere una soluzione trasparente: essa costituisce l’estratto idrofilo di peptidi e zuccheri derivati dalle pareti cellulari. Tale estratto viene portato a secco mediante liofilizzazione, come descritta nella fase g). After boiling, the sample is resuspended, cooled (on ice) and then enzymatically digested at 37 ° C for 16 hours with pepsin, using 1 mg of enzyme per ml of suspension. At the end of the enzymatic digestion, carried out for 16-24 hours at about 37 ° C, the suspension is centrifuged to obtain a transparent solution: it constitutes the hydrophilic extract of peptides and sugars derived from cell walls. This extract is dried by lyophilization, as described in step g).

Gli estratti ottenuti nelle fasi h), i) e f) vengono portati a secco in un liofilizzatore, rotoevaporatore, camera di essiccazione o spraydryer per eliminare il solvente. La polvere o la pasta semisolida ottenuta viene risospesa in acqua (frazione idrosolubile e frazione peptidi/ zuccheri) o in solventi organici compatibili con le formulazioni cosmetiche (frazione liposolubile) alla concentrazione desiderata. Nel caso in cui il solvente usato in fase i) sia un olio, come un trigliceride, esso non può essere eliminato, pertanto la soluzione ottenuta costituisce già l’ingrediente attivo da utilizzare in formulazioni per applicazioni cosmetiche e dermatologiche. The extracts obtained in steps h), i) and f) are dried in a lyophilizer, roto-evaporator, drying chamber or spraydryer to eliminate the solvent. The obtained powder or semi-solid paste is resuspended in water (water-soluble fraction and peptide / sugar fraction) or in organic solvents compatible with cosmetic formulations (fat-soluble fraction) at the desired concentration. In the event that the solvent used in phase i) is an oil, such as a triglyceride, it cannot be eliminated, therefore the solution obtained is already the active ingredient to be used in formulations for cosmetic and dermatological applications.

Le soluzioni ottenute, contenenti le diverse frazioni (idrosolubile, liposolubile e quella di peptidi /zuccheri) possono essere ulteriormente disciolte in un appropriato volume di glicerolo o di altro solvente (oli, alcoli, steroli), a seconda del tipo di frazione prodotta, in modo da avere una concentrazione di frazione purificata variabile dallo 0,1 % al 20% (w/v), preferibilmente 0,4%-5%, ancor più preferibilmente 0,4%. Queste soluzioni rappresentano la materia prima che viene aggiunta ai formulati per la fabbricazione dei prodotti cosmetici o dermatologici pronti per le applicazioni. The solutions obtained, containing the different fractions (water-soluble, fat-soluble and that of peptides / sugars) can be further dissolved in an appropriate volume of glycerol or other solvent (oils, alcohols, sterols), depending on the type of fraction produced, in so as to have a concentration of purified fraction ranging from 0.1% to 20% (w / v), preferably 0.4% -5%, even more preferably 0.4%. These solutions represent the raw material that is added to the formulations for the manufacture of cosmetic or dermatological products ready for applications.

Particolarmente preferite sono le soluzioni idroalcoliche dove il solvente è glicerolo. Particularly preferred are the hydroalcoholic solutions where the solvent is glycerol.

In conclusione, costituisce oggetto della presente invenzione: l’estratto idrosolubile delle cellule vegetali in coltura, preferibilmente del genere Pelargonium capitatum ottenibile mediante il metodo a) - f), l’estratto liposolubile ottenibile mediante il metodo a) - h) e l’estratto di peptidi e zuccheri dalle pareti cellulari ottenibile mediante il metodo a) i). Inoltre, l’invenzione si riferisce anche al metodo di allestimento delle suddette colture cellulari mediante induzione con specifici trattamenti e condizioni di crescita messi a punto dalla Richiedente, che permettono di ottenere gli estratti descritti ricchi di sostanze ad azione benefica su cellule della pelle. In conclusion, the object of the present invention is: the water-soluble extract of plant cells in culture, preferably of the genus Pelargonium capitatum obtainable by the method a) - f), the fat-soluble extract obtainable by the method a) - h) and the extract of peptides and sugars from cell walls obtainable by method a) i). In addition, the invention also refers to the method of preparation of the aforementioned cell cultures by induction with specific treatments and growth conditions developed by the Applicant, which allow to obtain the described extracts rich in substances with beneficial action on skin cells.

Formano altresì oggetto dell’invenzione composizioni cosmetiche comprendenti l’estratto idrosolubile, l’estratto liposolubile e l’estratto di peptidi/ zuccheri dalle pareti cellulari, singolarmente o in combinazione. Cosmetic compositions comprising the water-soluble extract, the fat-soluble extract and the peptide / sugar extract from the cell walls, individually or in combination, are also the subject of the invention.

Nella forma di realizzazione in cui la composizione cosmetica comprende un singolo estratto, detto estratto o le sue soluzioni sono contenuti nelle composizioni cosmetiche dell’invenzione in concentrazioni variabili da 0,0001% a 10%, preferibilmente da 0,001% a 8% e ancora più preferibilmente alla concentrazione dello 0,5%, dove dette percentuali sono espresse in peso rispetto al peso totale della composizione. In the embodiment in which the cosmetic composition comprises a single extract, said extract or its solutions are contained in the cosmetic compositions of the invention in concentrations ranging from 0.0001% to 10%, preferably from 0.001% to 8% and even more preferably at a concentration of 0.5%, where said percentages are expressed by weight with respect to the total weight of the composition.

Nella forma di realizzazione in cui la composizione cosmetica comprende tutti e tre gli estratti, esse contengono, vantaggiosamente, per una parte in peso dell’estratto idrosolubile, da 0,01 a 100, preferibilmente 1, parti in peso di estratto liposolubile e da 0,01 a 100, preferibilmente 1, parti in peso di estratto ricco in peptidi e zuccheri, eventualmente insieme ad un solvente idrofilo scelto tra acqua, soluzioni acquose, solventi organici, preferibilmente oli, alcoli, glicerolo acidi organici, ammidi, ammine, aldeidi o chetoni. In the embodiment in which the cosmetic composition comprises all three extracts, they advantageously contain, for one part by weight of the water-soluble extract, from 0.01 to 100, preferably 1, parts by weight of fat-soluble extract and from 0 01 to 100, preferably 1, parts by weight of extract rich in peptides and sugars, possibly together with a hydrophilic solvent selected from water, aqueous solutions, organic solvents, preferably oils, alcohols, glycerol, organic acids, amides, amines, aldehydes or ketones.

Anche in tale forma di realizzazione la composizione cosmetica comprende ciascuno dei tre estratti ad una concentrazione variabile da 0,0001% a 10%, preferibilmente da 0,001% a 8% e ancora più preferibilmente alla concentrazione dello 0,5%, dove dette percentuali sono espresse in peso rispetto al peso totale della composizione. Also in this embodiment the cosmetic composition comprises each of the three extracts at a concentration ranging from 0.0001% to 10%, preferably from 0.001% to 8% and even more preferably at a concentration of 0.5%, where said percentages are expressed by weight with respect to the total weight of the composition.

Una composizione cosmetica particolarmente preferita comprende, per una parte in peso dell’estratto idrosolubile, una parte in peso di estratto liposolubile e 0,1 parti in peso di estratto ricco in peptidi e zuccheri eventualmente insieme ad almeno uno dei suddetti solventi organici. A particularly preferred cosmetic composition comprises, for one part by weight of the water-soluble extract, one part by weight of fat-soluble extract and 0.1 parts by weight of extract rich in peptides and sugars possibly together with at least one of the aforementioned organic solvents.

La presente invenzione riguarda inoltre l’uso cosmetico di tali composizioni per il trattamento e la prevenzione del foto-invecchiamento della pelle dovuto ad esposizione a luce blu, luce ultravioletta o radiazione infrarossa. The present invention also relates to the cosmetic use of such compositions for the treatment and prevention of photo-aging of the skin due to exposure to blue light, ultraviolet light or infrared radiation.

Infine, la presente invenzione riguarda altresì una formulazione comprendente una composizione come sopra definita e un veicolo, eccipiente e/o adiuvante cosmeticamente accettabili. Finally, the present invention also relates to a formulation comprising a composition as defined above and a cosmetically acceptable carrier, excipient and / or adjuvant.

I veicoli che possono essere impiegati sono lipidi, ovvero esteri glicerici (o trigliceridi) in forma di oli e burri (come ad esempio trigliceride caprico/ caprifico o burro di caritè), esteri non glicerici, quali esteri tra acidi grassi e alcol grassi, i sali degli acidi grassi quali gli stearati, glicoli (esempio glicole polietilenico, propilenico o butilenico), alcoli grassi (alcol cetilico), liposomi multilamellari, polisaccaridi (fibre di acacia, ciclodestrine o gomma xantana) oppure silicati. Possono essere utilizzati anche idrocarburi paraffinici, quali ad esempio olio minerale (paraffina liquida), vaselina filante o petrolato, paraffine solide come la cera microcristallina, la ceresina o lozocherite, e/o idrocarburi terpenici, quali ad esempio squalene, squalano o pristano. The vehicles that can be used are lipids, or glycerine esters (or triglycerides) in the form of oils and butters (such as capric / caprific triglyceride or charitè butter), non-glycerine esters, such as esters between fatty acids and fatty alcohol, salts of fatty acids such as stearates, glycols (for example polyethylene, propylene or butylene glycol), fatty alcohols (cetyl alcohol), multilamellar liposomes, polysaccharides (acacia fibers, cyclodextrins or xanthan gum) or silicates. Paraffinic hydrocarbons can also be used, such as mineral oil (liquid paraffin), stringy petroleum jelly or petrolatum, solid paraffins such as microcrystalline wax, ceresin or lozocherite, and / or terpene hydrocarbons, such as squalene, squalane or pristane.

Tali formulazioni possono essere sotto forma di creme, gel, lozioni cosmetiche per l’applicazione cutanea, emulsioni A/O e O/A, latti, nonché rossetti, fondotinta e trucchi. These formulations can be in the form of creams, gels, cosmetic lotions for skin application, A / O and O / A emulsions, milks, as well as lipsticks, foundations and make-up.

A titolo esemplificativo, ma non limitativo della presente invenzione, si riportano di seguito alcuni esempi relativi alla preparazione delle colture vegetali della specie Pelargonium capitatum ed esperimenti che dimostrano l’attività biologica di detti estratti in campo cosmetico. By way of non-limiting example of the present invention, some examples relating to the preparation of plant cultures of the Pelargonium capitatum species and experiments that demonstrate the biological activity of said extracts in the cosmetic field are given below.

ESEMPI ESEMPIO 1: Allestimento dei calli da piante di Pelargonium EXAMPLES EXAMPLE 1: Preparation of calluses from Pelargonium plants

A partire da pezzi di foglia di piantine giovani appartenenti alle specie Pelargonium capitatum sono state allestite colture di calli vegetali su mezzo solido. Le foglie sono state recise, private della nervatura centrale e tagliate in modo da ottenere pezzi di dimensioni 5 mm x 5 mm. Questi sono stati posti su substrato solido B5M (Gamborg B5 medium including vitamins 3,lg/l, myo-inositolo 500 mg/L, saccarosio 30g/l, microagar 7g/l, pH 5.7) addizionato con acido 2,4 Diclorofenossiacetico 1mg/1, adenina 1g/1 kinetina 0,1mg/l a 27°C al buio per circa 30 giorni quando sono comparsi i primi calli. Starting from leaf pieces of young seedlings belonging to the Pelargonium capitatum species, plant callus cultures were set up on a solid medium. The leaves were cut, deprived of the central rib and cut to obtain pieces of 5 mm x 5 mm dimensions. These were placed on solid substrate B5M (Gamborg B5 medium including vitamins 3, lg / l, myo-inositol 500 mg / L, sucrose 30g / l, microagar 7g / l, pH 5.7) added with 2,4 dichlorophenoxyacetic acid 1mg / 1, adenine 1g / 1 kinetine 0.1mg / l at 27 ° C in the dark for about 30 days when the first calluses appeared.

ESEMPIO 2: Preparazione dell’estratto idrosolubile e valutazione della sua capacità di proteggere e riparare dai danni causati da raggi infrarossi EXAMPLE 2: Preparation of the water-soluble extract and evaluation of its ability to protect and repair from damage caused by infrared rays

Materiali e metodi Materials and methods

Estrazione della miscela idrosolubile dalle cellule di Pelargonium. Extraction of the water-soluble mixture from Pelargonium cells.

100 g di cellule di Pelargonium capitatum in coltura liquida sono state sedimentate per centrifugazione e lavate in acqua distillata. 100 g of Pelargonium capitatum cells in liquid culture were sedimented by centrifugation and washed in distilled water.

Il sopranatante è stato eliminato per aspirazione ed il pellet di cellule è stato congelato a -80°C fino al suo utilizzo. Le cellule, una volta scongelate, sono state omogeneizzate in un mortaio con 200 mi di tampone PBS. L’omogeneizzato è stato centrifugato a 8.500 rpm per 15 minuti a 4°C e il sopranatante, che costituisce l'estratto idrosolubile, è stato prelevato e conservato a -80°C. L'estratto è stato successivamente liofilizzato per circa 3 giorni in modo da ottenere una polvere fine. La polvere ottenuta (2 g) è stata sciolta in acqua distillata sterile alla concentrazione del 10%, e poi ulteriormente diluita alla concentrazione richiesta da ogni tipo di saggio biologico. The supernatant was removed by aspiration and the cell pellet was frozen at -80 ° C until its use. Once thawed, the cells were homogenized in a mortar with 200 ml of PBS buffer. The homogenate was centrifuged at 8,500 rpm for 15 minutes at 4 ° C and the supernatant, which constitutes the water-soluble extract, was removed and stored at -80 ° C. The extract was subsequently lyophilized for about 3 days in order to obtain a fine powder. The powder obtained (2 g) was dissolved in sterile distilled water at a concentration of 10%, and then further diluted to the concentration required by each type of biological assay.

L'estratto è stato pre-testato su fibroblasti umani per stabilirne le dosi di utilizzo e per escludere un’eventuale citotossicità. The extract was pre-tested on human fibroblasts to establish the doses of use and to exclude any cytotoxicity.

Saggio di citotossicità Cytotoxicity test

Questo saggio si basa sull'uso del MTT [3-(4,5-dimetiltiazolil)-2,5-difeniltetrazoliobromuro] descritto da Mosmann nel 1983 per la prima volta. È basato sulla capacità dell'enzima deidrogenasi mitocondriale delle cellule vitali di idrolizzare l'anello tetrazolico del MTT (di colore giallo chiaro) e formare cristalli di formazano (di colore blu scuro). Tali cristalli sono impermeabili alle membrane cellulari e si accumulano nel citoplasma delle cellule metabolicamente attive. Il numero di cellule vive e sane è così direttamente proporzionale al livello di formazano prodotto. This assay is based on the use of the MTT [3- (4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromide] described by Mosmann in 1983 for the first time. It is based on the ability of the mitochondrial dehydrogenase enzyme of viable cells to hydrolyze the tetrazole ring of MTT (light yellow in color) and form formazan crystals (in dark blue color). These crystals are impermeable to cell membranes and accumulate in the cytoplasm of metabolically active cells. The number of living and healthy cells is thus directly proportional to the level of formazan produced.

1,5 x 10<4 >di cellule di fibroblasti umani adulti (HDF) per pozzetto sono state cresciute in piastre da 96 pozzetti in mezzo di coltura DMEM (Gibco), supplementato con il 10% di siero fetale bovino (“Fetal Bovine Serum” FBS), per circa 20 ore. Dopo il trattamento con 0,002% dell’estratto di Pelargonium per 48 ore, le cellule sono state lavate in PBS ed incubate con 100 μl/ pozzetto di “tampone di reazione” contenente: 10 mM di Hepes, 1.3 mM CaCl, 1 mM MgSO4, 5 mM di glucosio e 0,5 mg/ml di substrato colorimetrico MTT in tampone PBS a pH 7,4. Dopo 3 ore di incubazione a 37°C, 5% CO2, ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 100 μl di soluzione solubilizzante contenente 10% di Triton-X100, 0,1 N di HC1 in isopropanolo assoluto. Dopo 30 minuti, la reazione colorimetrica è stata misurata a 595 nm con il lettore di piastre Victor3. 1.5 x 10 <4> adult human fibroblast cells (HDF) per well were grown in 96-well plates in DMEM (Gibco) culture medium, supplemented with 10% fetal bovine serum (“Fetal Bovine Serum "FBS), for about 20 hours. After treatment with 0.002% of the Pelargonium extract for 48 hours, the cells were washed in PBS and incubated with 100 μl / well of "reaction buffer" containing: 10 mM of Hepes, 1.3 mM CaCl, 1 mM MgSO4, 5 mM of glucose and 0.5 mg / ml of MTT colorimetric substrate in PBS buffer at pH 7.4. After 3 hours of incubation at 37 ° C, 5% CO2, 100 μl of solubilizing solution containing 10% of Triton-X100, 0.1 N of HCl in absolute isopropanol were added to each well. After 30 minutes, the colorimetric reaction was measured at 595 nm with the Victor3 plate reader.

Saggio di misurazione dei ROS mitocondriali Mitochondrial ROS measurement assay

8 x 10<3 >di cellule HDF per pozzetto sono state cresciute in piastre da 96 pozzetti in mezzo DMEM (Gibco) supplementato con il 10% di FBS per 20 ore. Il giorno dopo le cellule sono state trattate per 24 ore con diverse concentrazioni (0,002% e 0,006%) dell’estratto di Pelargonium e con il coenzima Q10 20 μΜ come controllo positivo (il controllo negativo era rappresentato da cellule HDF non trattate). Al termine dell’incubazione, le cellule sono state lavate in PBS e incubate con il colorante Mito Sox (Molecular Probes) a 37°C per 10 minuti. Successivamente le cellule sono state irradiate in PBS con raggi infrarossi per 15’ in modo da avere un’energia pari a 44J/cm2. Al termine dell’irradiazione, le cellule sono state incubate per 30 minuti e poi la fluorescenza è stata letta a 510/580 nm, utilizzando il Victor3 (Perkin Elmer). 8 x 10 <3> HDF cells per well were grown in 96-well plates in DMEM medium (Gibco) supplemented with 10% FBS for 20 hours. The next day, the cells were treated for 24 hours with different concentrations (0.002% and 0.006%) of the Pelargonium extract and with coenzyme Q10 20 μΜ as a positive control (the negative control was represented by untreated HDF cells). At the end of the incubation, the cells were washed in PBS and incubated with the Mito Sox dye (Molecular Probes) at 37 ° C for 10 minutes. Subsequently, the cells were irradiated in PBS with infrared rays for 15 'in order to have an energy equal to 44J / cm2. At the end of the irradiation, the cells were incubated for 30 minutes and then the fluorescence was read at 510/580 nm, using the Victor3 (Perkin Elmer).

Saggio di misurazione dell’ATP ATP measurement assay

8 x 10<3 >di cellule HDF per pozzetto sono state cresciute in piastre da 96 pozzetti in mezzo di colture DMEM (Gibco), supplementato con 10% di FBS per 20 ore. Il giorno dopo le cellule sono state trattate per 6 ore con diverse concentrazioni (0,002% e 0,006%) dell’estratto di Pelargonium e con il Resveratrolo 100 μΜ come controllo positivo (il controllo negativo era rappresentato da cellule HDF non trattate). 8 x 10 <3> HDF cells per well were grown in 96-well plates in DMEM (Gibco) culture medium, supplemented with 10% FBS for 20 hours. The next day the cells were treated for 6 hours with different concentrations (0.002% and 0.006%) of the Pelargonium extract and with 100 μΜ Resveratrol as positive control (the negative control was represented by untreated HDF cells).

Le cellule sono state poi irradiate per 14’ in modo da avere un’energia pari a 44 J / cm2 . The cells were then irradiated for 14 'in order to have an energy equal to 44 J / cm2.

Dopo 24 ore, le cellule sono state lavate con PBS ed incubate per 30 minuti in 50 μl di mezzo di coltura a temperatura ambiente. Un eguale volume di CellTiter-Glo (Promega) è stato successivamente aggiunto ai campioni, e miscelato per due minuti per indurre la lisi delle cellule: il CellTiter-Glo è una miscela contenente l’enzima luciferasi che, degradando il suo substrato (la luciferina, anch’essa presente nella miscela di reazione) genera un segnale luminoso. La reazione è dipendente dalla quantità di ATP presente. Il segnale luminoso emesso dai campioni è stato misurato a 595 nm dopo 15 minuti, usando un lettore di piastre Victor 3 (PerkinElmer) . Come standard di riferimento, sono state usate diluzioni scalari di ATP, da 5000 a 5 pMoli. After 24 hours, the cells were washed with PBS and incubated for 30 minutes in 50 μl of culture medium at room temperature. An equal volume of CellTiter-Glo (Promega) was subsequently added to the samples, and mixed for two minutes to induce cell lysis: CellTiter-Glo is a mixture containing the enzyme luciferase which, by degrading its substrate (luciferin , also present in the reaction mixture) generates a light signal. The reaction is dependent on the amount of ATP present. The light signal emitted by the samples was measured at 595 nm after 15 minutes, using a Victor 3 plate reader (PerkinElmer). As a reference standard, staggered dilutions of ATP, from 5000 to 5 pMol, were used.

Analisi della sintesi della proteina IL6 Analysis of the synthesis of the IL6 protein

1 x 10<4 >di cellule HDF per pozzetto sono state cresciute in piastre da 96 pozzetti in mezzo di coltura DMEM con FBS 10%. 1 x 10 <4> HDF cells per well were grown in 96-well plates in DMEM culture medium with 10% FBS.

Dopo 20 ore, il mezzo è stato sostituito con mezzo DMEM senza FBS, e il giorno successivo sono state aggiunte diverse concentrazioni (0,002% e 0,006%) dell’estratto di Pelargonium e il TPCK 1 μΜ come controllo positivo (il controllo negativo era rappresentato da cellule HDF non trattate). After 20 hours, the medium was replaced with DMEM medium without FBS, and the next day different concentrations (0.002% and 0.006%) of the Pelargonium extract and 1 μΜ TPCK were added as a positive control (the negative control was represented from untreated HDF cells).

Dopo ulteriori 24 ore, le cellule sono state lavate con PBS e poi irradiate con raggi infrarossi per 30’ in modo da avere un’energia pari a 88 J/cm2. Dopo l’irradiazione, è stato aggiunto di nuovo il mezzo con i trattamenti (ossia, l’estratto di Pelargonium e il TPCK alle suddette concentrazioni) e le cellule sono state incubate per altre 24 ore. After a further 24 hours, the cells were washed with PBS and then irradiated with infrared rays for 30 'in order to have an energy of 88 J / cm2. After irradiation, the medium with the treatments (ie, Pelargonium extract and TPCK at the above concentrations) was added again and the cells were incubated for another 24 hours.

Al termine dell’incubazione, sono stati prelevati i surnatanti e trasferiti in un’altra piastra per la determinazione del contenuto di interleuchina 6 (IL6) . At the end of the incubation, the supernatants were removed and transferred to another plate for the determination of the interleukin 6 (IL6) content.

Dopo incubazione per 1 notte a 4°C, è stato eliminato il mezzo e sono stati effettuati tre lavaggi con “Wash buffer” (PBS lx, Tween 20 0,025%). After incubation for 1 night at 4 ° C, the medium was removed and three washes were carried out with “Wash buffer” (PBS 1x, Tween 20 0.025%).

È stato effettuato un “blocking” per 30’ con siero albumina bovina (BSA) al 3% e poi è stata aggiunta la soluzione di anticorpo primario (Ab6672 Abcam) 1: 1000 in “wash buffer” contenente BSA 1%. L’incubazione è avvenuta per 2 ore a temperatura ambiente, dopo 3 lavaggi è avvenuta l’incubazione con l’anticorpo secondario (Goat antirabbit Biorad IgG-HRP) diluito 1: 1000 in “wash buffer” contenente BSA 1%. Dopo 3 lavaggi, la reazione è stata sviluppata aggiungendo 100 μl di Buffer citrato 50 mM, OPD (O- fenilendiammina) 0,35mg/ml, H2O2 0,012%. Dopo lo sviluppo del colore, è stata letta l’assorbanza a 490nm. A "blocking" was carried out for 30 'with bovine serum albumin (BSA) at 3% and then the primary antibody solution (Ab6672 Abcam) 1: 1000 was added in a "wash buffer" containing 1% BSA. The incubation took place for 2 hours at room temperature, after 3 washes the incubation took place with the secondary antibody (Goat antirabbit Biorad IgG-HRP) diluted 1: 1000 in a "wash buffer" containing 1% BSA. After 3 washes, the reaction was developed by adding 100 μl of Buffer citrate 50 mM, OPD (O-phenylenediamine) 0.35mg / ml, H2O2 0.012%. After the color development, the absorbance at 490nm was read.

Analisi dell'espressione del gene TRPV1 TRPV1 gene expression analysis

1,2 x 10<5 >di cellule HDF per pozzetto sono state cresciute in piastre da 6 pozzetti in mezzo di coltura DMEM (Gibco), supplementato con 10% di Siero Bovino Fetale (FBS) per 20 ore. Il giorno dopo il mezzo è stato sostituito con mezzo DMEM privo di FBS e le cellule sono state incubate per altre 24 ore. 1.2 x 10 <5> HDF cells per well were grown in 6-well plates in DMEM (Gibco) culture medium, supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) for 20 hours. The next day the medium was replaced with FBS-free DMEM medium and the cells were incubated for an additional 24 hours.

Il terzo giorno sono stati aggiunti i trattamenti con le diverse concentrazioni (0,002% e 0,006%) dell’estratto di Pelargonium e il TPCK 10μΜ come controllo positivo (il controllo negativo era rappresentato da cellule HDF non trattate). Il giorno successivo, le cellule sono irradiate con raggi infrarossi in PBS per 30’ in modo da avere un’energia pari a 88 J/cm2. Al termine dell’irradiazione, è stato aggiunto di nuovo il mezzo con i trattamenti (ossia, l’estratto di Pelargonium e il TPCK alle suddette concentrazioni) e le cellule sono state incubate per altre 24 ore. On the third day, treatments with the different concentrations (0.002% and 0.006%) of the Pelargonium extract and 10μΜ TPCK as positive control were added (the negative control was represented by untreated HDF cells). The next day, the cells are irradiated with infrared rays in PBS for 30 'in order to have an energy equal to 88 J / cm2. At the end of the irradiation, the medium with the treatments (ie, Pelargonium extract and TPCK at the above concentrations) was added again and the cells were incubated for another 24 hours.

Per l’estrazione dell’RNA dai campioni di cellule è stato utilizzato il kit “GenElute™ Total RNA Purification” acquistato dalla ditta Sigma. Dopo i trattamenti indicati, le cellule sono state lavate con PBS, staccate in buffer di lisi e sottoposte alla procedura di estrazione come da protocollo del kit. I campioni di RNA sono stati sottoposti ad un trattamento con DNasi I (Ambion) per eliminare il DNA genomico contaminante, a 37°C per 30 minuti, a pH 7,5. 2 μl di ciascun campione sono stati caricati su gel di agarosio 1% in presenza di “loading dye” denaturante e quantificati utilizzando come riferimento uno specifico marker per RNA (Thermo Scientific). Per la quantificazione è stato usato il software Gene tools (Perkin Elmer). The "GenElute ™ Total RNA Purification" kit purchased from the Sigma company was used for the extraction of RNA from cell samples. After the indicated treatments, the cells were washed with PBS, separated in lysis buffer and subjected to the extraction procedure as per the kit protocol. The RNA samples were subjected to a treatment with DNase I (Ambion) to eliminate the contaminating genomic DNA, at 37 ° C for 30 minutes, at pH 7.5. 2 μl of each sample were loaded onto 1% agarose gel in the presence of denaturing loading dye and quantified using a specific RNA marker (Thermo Scientific) as reference. The software Gene tools (Perkin Elmer) was used for the quantification.

300 ng di RNA totale è stato retro-trascritto usando l’enzima Trascrittasi Inversa (Thermo Scientific). Le reazioni di RT-PCR semiquantitativa sono state condotte utilizzando come standard interni la coppia di primer universali 18S primer/competimer (Ambion) in rapporto 5:5. I prodotti di PCR sono stati separati su gel d’agarosio 1,5%, visualizzati utilizzando lo strumento Geliance (Perkin Elmer) ed analizzati per via densitometrica utilizzando il software Genetools. I valori riportati nei grafici rappresentano il rapporto tra l’intensità della banda relativa al gene in analisi e quella della banda relativa allo standard di riferimento 18S, in modo da avere un valore correlato alla reale espressione di quel gene e non dipendente dalla quantità di RNA o di reagenti di PCR presenti in quel campione. I valori sono stati poi convertiti in percentuale (%), fissando il valore ottenuto dal controllo non trattato come 100%. Le sequenze dei primers usati per l’amplificazione sono: 300 ng of total RNA was retro-transcribed using the Reverse Transcriptase enzyme (Thermo Scientific). Semiquantitative RT-PCR reactions were carried out using the 18S primer / competimer (Ambion) universal primer pair in a 5: 5 ratio as internal standards. The PCR products were separated on 1.5% agarose gel, visualized using the Geliance instrument (Perkin Elmer) and analyzed by densitometry using the Genetools software. The values shown in the graphs represent the ratio between the intensity of the band relating to the gene being analyzed and that of the band relating to the reference standard 18S, in order to have a value related to the real expression of that gene and not dependent on the amount of RNA or PCR reagents present in that sample. The values were then converted into a percentage (%), setting the value obtained from the untreated control as 100%. The sequences of the primers used for amplification are:

Hs TRPV1 for: SEQ ID NO: 1 Hs TRPV1 for: SEQ ID NO: 1

Hs TRPV1 rev: SEQ ID NO: 2. Hs TRPV1 rev: SEQ ID NO: 2.

Analisi della sintesi della proteina MMP1 Analysis of the synthesis of the MMP1 protein

1,8 x 10<4 >di cellule HDF per pozzetto sono state cresciute in piastre da 96 pozzetti in mezzo di coltura DMEM con FBS 10%. Dopo 6 ore, il mezzo è stato sostituito con mezzo DMEM senza FBS, contenente diverse concentrazioni (0,002% e 0,006%) dell’estratto di Pelargonium e l’idrocortisone 0,25% come controllo positivo (il controllo negativo era rappresentato da cellule HDF non trattate). 1.8 x 10 <4> HDF cells per well were grown in 96-well plates in DMEM culture medium with 10% FBS. After 6 hours, the medium was replaced with DMEM medium without FBS, containing different concentrations (0.002% and 0.006%) of the Pelargonium extract and 0.25% hydrocortisone as a positive control (the negative control was represented by HDF cells not treated).

Il giorno successivo le cellule sono state lavate con PBS e poi irradiate con raggi Infrarossi per 30’ in modo da avere un’energia pari a 88J/cm<2>. Dopo l’irradiazione è stato aggiunto di nuovo il mezzo con i trattamenti (ossia, l’estratto di Pelargonium e l’idrocortisone alle suddette concentrazioni) e le cellule sono state incubate per altre 72 ore. Al termine dell’incubazione, sono stati prelevati i surnatanti e trasferiti in un’altra piastra per la determinazione del contenuto di MMP1 mediante saggio ELISA. Il saggio prevede un’incubazione per 1 notte a 4°C dei surnatanti, eliminazione del mezzo di coltura e lavaggio dei pozzetti per tre volte con “Wash buffer” (PBS Ix, Tween 20 0,025%). Dopo un “blocking” per 30’ con BSA 3% e una soluzione contenente l’anticorpo primario (MMP1 polyclonal antibody Thermo Fisher) è stato aggiunto in diluizione 1:1000 in “wash buffer”, contenente BSA 1%. Dopo un incubazione di 2 ore a temperatura ambiente e 3 lavaggi con il suddetto “wash buffer”, i pozzetti sono stati incubati con l’anticorpo secondario (Goat anti-rabbit Biorad IgG-HRP) diluito 1: 1000 in “wash buffer” contenente BSA 1%. Dopo 3 lavaggi con il suddetto “wash buffer”, sono stati aggiunti 100 μΐ di buffer citrato 50 mM, OPD 0,35mg/ml, H2O2 0,012%, e la reazione colorimetrica misurata come valore di assorbanza a 490nm. The next day the cells were washed with PBS and then irradiated with infrared rays for 30 'in order to have an energy of 88J / cm <2>. After irradiation, the medium with the treatments was added again (ie, Pelargonium extract and hydrocortisone at the aforementioned concentrations) and the cells were incubated for another 72 hours. At the end of the incubation, the supernatants were taken and transferred to another plate for the determination of the MMP1 content by means of an ELISA assay. The assay involves an incubation for 1 night at 4 ° C of the supernatants, elimination of the culture medium and washing of the wells three times with "Wash buffer" (PBS Ix, Tween 20 0.025%). After a "blocking" for 30 'with BSA 3% and a solution containing the primary antibody (MMP1 polyclonal antibody Thermo Fisher) it was added in a dilution of 1: 1000 in a "wash buffer", containing 1% BSA. After an incubation of 2 hours at room temperature and 3 washes with the aforementioned "wash buffer", the wells were incubated with the secondary antibody (Goat anti-rabbit Biorad IgG-HRP) diluted 1: 1000 in a "wash buffer" containing BSA 1%. After 3 washes with the aforementioned “wash buffer”, 100 μΐ of citrate buffer 50 mM, OPD 0.35mg / ml, H2O2 0.012%, and the colorimetric reaction measured as absorbance value at 490nm were added.

Saggio di misurazione dei ROS citosolici Assay for measuring cytosolic ROS

1,8 x 10<4 >di Ccellule HaCaT per pozzetto sono state cresciute in piastre da 96 pozzetti in mezzo DMEM (Gibco) supplementato con FBS 10% per 20 ore. Il giorno dopo, le cellule sono state trattate per 2 ore con 0,002% dell’estratto di Pelargonium e con l’acido ascorbico 500 μΜ come controllo positivo (il controllo negativo era rappresentato da cellule HaCaT non trattate). Al termine dell’incubazione, le cellule sono state lavate in PBS e incubate con il colorante CM-DCFDA (Molecular Probes) a 37°C per 45 minuti. Successivamente, le cellule sono state irradiate con raggi di luce blu per 8’ in modo da avere un’energia pari a 7J/cm2. Al termine dell’irradiazione, le cellule sono state incubate per 30 minuti ed è stata misurata la fluorescenza a 485/535 nm mediante lo strumento Victor3 (Perkin Elmer). 1.8 x 10 <4> of HaCaT cells per well were grown in 96-well plates in DMEM medium (Gibco) supplemented with 10% FBS for 20 hours. The next day, the cells were treated for 2 hours with 0.002% of the Pelargonium extract and with 500 μΜ ascorbic acid as a positive control (the negative control was represented by untreated HaCaT cells). At the end of the incubation, the cells were washed in PBS and incubated with the CM-DCFDA (Molecular Probes) dye at 37 ° C for 45 minutes. Subsequently, the cells were irradiated with blue light rays for 8 'in order to have an energy equal to 7J / cm2. At the end of the irradiation, the cells were incubated for 30 minutes and the fluorescence at 485/535 nm was measured using the Victor3 instrument (Perkin Elmer).

Analisi della vitalità cellulare mediante MTT Cell viability analysis by MTT

1,2 10<4 >di cellule HaCaT per pozzetto sono state cresciute in piastre da 96 pozzetti in mezzo DMEM supplementato con FBS 10% per 20 ore. Il giorno dopo le cellule sono state trattate per 2 ore con 0,002% dell’estratto di Pelargonium (il controllo negativo era rappresentato da cellule HaCaT non trattate). 1,2 10 <4> HaCaT cells per well were grown in 96-well plates in DMEM medium supplemented with 10% FBS for 20 hours. The next day, the cells were treated for 2 hours with 0.002% of the Pelargonium extract (the negative control was represented by untreated HaCaT cells).

Dopo essere state lavate con PBS, le cellule sono state irradiate con raggi UVB in modo da avere un’energia pari a 80 mJ/cm<2>. Al termine dell’irradiazione è stato aggiunto di nuovo il mezzo con i trattamenti (ossia, l’estratto di Pelargonium alla suddetta concentrazione) e dopo 24 ore il saggio MTT è stato sviluppato come descritto precedentemente. After being washed with PBS, the cells were irradiated with UVB rays in order to have an energy equal to 80 mJ / cm <2>. At the end of the irradiation, the medium with the treatments was added again (ie, the Pelargonium extract at the aforementioned concentration) and after 24 hours the MTT assay was developed as described above.

Analisi del contenuto delle proteine ProCollagene I e Tropoelastina Analysis of the content of ProCollagen I and Tropoelastin proteins

8 x 10<4 >di cellule HDF per pozzetto sono state cresciute in piastre da 96 pozzetti in mezzo di coltura DMEM con FBS 10%. Dopo 20 ore, le cellule sono state trattate in DMEM con 2% di FBS con diverse concentrazioni (0,002% e 0,006%) dell’estratto di Pelargonium o con il TGF-β, a concentrazione di 2,5 ng/ml, usato come controllo positivo (il controllo negativo era rappresentato da cellule HDF non trattate). Il giorno successivo, i sumatanti sono stati trasferiti su un’altra piastra e sottoposti alla successiva analisi del contenuto di tropoelastina mediante saggio ELISA, mentre le cellule sono state lavate in PBS e sottoposte all’analisi del contenuto di ProCollagene I con saggio ELISA. La procedura del saggio ELISA è quella descritta precedentemente ma in questo caso gli anticorpi usati sono stati: per il ProCollagene I, il Pro-CollA2 (se- 166572 Santa Cruz) con antigoat IgG-HRP (sc-2961 Sanata Cruz), mentre per la Tropoelastina, il AB 21600 (Abcam), seguito da un secondario anti-rabbit (Biorad 1706515). 8 x 10 <4> HDF cells per well were grown in 96-well plates in DMEM culture medium with 10% FBS. After 20 hours, the cells were treated in DMEM with 2% FBS with different concentrations (0.002% and 0.006%) of the Pelargonium extract or with TGF-β, at a concentration of 2.5 ng / ml, used as positive control (the negative control was represented by untreated HDF cells). The next day, the sumpatants were transferred to another plate and subjected to the subsequent analysis of the tropoelastin content by means of an ELISA assay, while the cells were washed in PBS and subjected to analysis of the ProCollagen I content with an ELISA assay. The procedure of the ELISA assay is that described above but in this case the antibodies used were: for ProCollagen I, Pro-CollA2 (se-166572 Santa Cruz) with antigoat IgG-HRP (sc-2961 Sanata Cruz), while for Tropoelastina, AB 21600 (Abcam), followed by a secondary anti-rabbit (Biorad 1706515).

RISULTATI RESULTS

Studio della capacità dell’estratto di Pelargonium di proteggere dai danni dei raggi IR Study of the ability of Pelargonium extract to protect against damage from IR rays

Uno degli effetti delle radiazioni IR è la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nei mitocondri, che causano stress ossidativo danneggiando la cellula e la sua funzionalità. One of the effects of IR radiation is the production of reactive oxygen species (ROS) in the mitochondria, which cause oxidative stress, damaging the cell and its functionality.

Allo scopo quindi di valutare il potere protettivo dell'estratto di Pelargonium contro i raggi IR, sono stati condotti dei test di misurazione dei ROS mitocondriali e contenuto di ATP in fibroblasti umani HDF. In order to evaluate the protective power of the Pelargonium extract against IR rays, tests were conducted to measure the mitochondrial ROS and ATP content in HDF human fibroblasts.

Come si evince dalla figura 1, la produzione dei ROS mitocondriali indotta da raggi IR è stata significativamente inibita in fibroblasti umani dal trattamento con l’estratto di Pelargonium, usato a due diverse concentrazioni. Il trattamento con l’estratto ha portato ad una riduzione dei ROS di circa 12-15 %, similmente al controllo positivo Coenzima Q. Dato che l’aumento dei ROS mitocondriali porta ad una alterazione della funzionalità dei mitocondri, e pertanto ad una riduzione della produzione di ATP, abbiamo misurato l’effetto dell’estratto di Pelargonium anche sulla sintesi di nuovo ATP. As can be seen from Figure 1, the production of mitochondrial ROS induced by IR rays was significantly inhibited in human fibroblasts by treatment with Pelargonium extract, used at two different concentrations. Treatment with the extract led to a reduction in ROS of about 12-15%, similar to the positive control Coenzyme Q. Since the increase in mitochondrial ROS leads to an alteration of the functionality of the mitochondria, and therefore to a reduction in production of ATP, we measured the effect of Pelargonium extract also on the synthesis of new ATP.

In figura 2 viene mostrata la quantificazione delle molecole di ATP in fibroblasti umani trattati con l'estratto, in seguito a stress causato da raggi IR. Come si può osservare, le cellule producono una minore quantità di ATP in seguito al trattamento con IR, ma i trattamenti con l’estratto di Pelargonium, analogamente al resveratrolo usato come controllo positivo, ripristinano la produzione di ATP: un aumento variabile tra il 20 e 34 %, rispetto al campione di cellule stressate con IR ma non trattato con i composti. Figure 2 shows the quantification of ATP molecules in human fibroblasts treated with the extract, following stress caused by IR rays. As can be seen, cells produce less ATP following IR treatment, but treatments with Pelargonium extract, similar to resveratrol used as a positive control, restore ATP production: an increase ranging between 20 and 34%, compared to the sample of cells stressed with IR but not treated with the compounds.

È inoltre noto che il trattamento delle cellule della pelle con raggi IR porta ad un incremento della produzione di metallo-proteinasi, come MMP1, determinando un aumento della degradazione del collagene, principale componente di sostegno della matrice extracellulare della pelle. It is also known that the treatment of skin cells with IR rays leads to an increase in the production of metallo-proteinases, such as MMP1, causing an increase in the degradation of collagen, the main supporting component of the skin's extracellular matrix.

Come mostrato in figura 3, il trattamento con l'estratto di Pelargonium porta ad una attenuazione nella sintesi di MMP1, indotta invece dal trattamento con raggi IR. Una riduzione simile è stata osservata nel campione trattato con l’idrocortisone, noto agente protettore. Un ulteriore effetto causato dai raggi IR è la iperproduzione di interleuchine infiammatorie, come IL-6, mediata dal recettore TRPV1. In figura 4 è mostrato come l’estratto di Pelargonium, alle due diverse concentrazioni, inibisce il rilascio di IL-6 da parte dei fibroblasti, con una riduzione che va dal 14 al 25 %. In questo caso, come controllo positivo è stato usato il TPCK, una molecola nota per la sua azione antinfiammatoria. As shown in figure 3, the treatment with Pelargonium extract leads to an attenuation in the synthesis of MMP1, induced instead by the treatment with IR rays. A similar reduction was observed in the sample treated with hydrocortisone, a known protective agent. An additional effect caused by IR rays is the overproduction of inflammatory interleukins, such as IL-6, mediated by the TRPV1 receptor. Figure 4 shows how the Pelargonium extract, at two different concentrations, inhibits the release of IL-6 by fibroblasts, with a reduction ranging from 14 to 25%. In this case, TPCK, a molecule known for its anti-inflammatory action, was used as a positive control.

Inoltre, come mostrato in figura 5, l’estratto di Pelargonium produce anche un effetto significativo di riduzione sull’espressione del gene di TRPV1, una riduzione che va dal 28 al 42 %. Tutti questi risultati confermano che l'estratto idrosolubile di Pelargonium è capace di contrastare gli effetti negativi prodotti dalle radiazioni IR sulle cellule della pelle. Furthermore, as shown in Figure 5, the Pelargonium extract also produces a significant reduction effect on the expression of the TRPV1 gene, a reduction ranging from 28 to 42%. All these results confirm that the water-soluble Pelargonium extract is capable of counteracting the negative effects produced by IR radiation on skin cells.

Studio della capacità dell’estratto di Pelargonium di proteggere dai danni della luce blu Study of the ability of Pelargonium extract to protect against damage from blue light

Uno dei principali effetti dannosi prodotti dalla luce blu sulla pelle è quello di aumentare la produzione di ROS citosolici, portando ad un danno ossidativo sui componenti cellulari. One of the main damaging effects produced by blue light on the skin is to increase the production of cytosolic ROS, leading to oxidative damage on cellular components.

Per valutare la capacità dell'estratto di proteggere dall’aumento dei ROS causati dalla luce blu, cheratinociti umani sono stati trattati con l’estratto di Pelargonium e poi irraggiati con luce blu. To evaluate the extract's ability to protect against the increase in ROS caused by blue light, human keratinocytes were treated with Pelargonium extract and then irradiated with blue light.

In figura 6 è mostrato l’effetto di protezione dall’aumento dei ROS indotti da luce blu sui cheratinociti: l’estratto di Pelargonium, a concentrazione di 0,002%, ha completamento abolito l’aumento dei ROS indotti dalla luce blu, analogamente all’acido ascorbico, usato come controllo positivo del saggio. Per verificare se l’estratto avesse un effetto protettivo contro i danni causati da raggi UV, è stata misurata la vitalità dei cheratinociti dopo trattamento con raggi UVB, in presenza ed in assenza dell’estratto di Pelargonium alla concentrazione di 0,002%. Figure 6 shows the protective effect from the increase in ROS induced by blue light on keratinocytes: the Pelargonium extract, at a concentration of 0.002%, completely abolished the increase in ROS induced by blue light, similarly to ascorbic acid, used as a positive control for the assay. To check whether the extract had a protective effect against damage caused by UV rays, the vitality of the keratinocytes was measured after treatment with UVB rays, in the presence and absence of Pelargonium extract at a concentration of 0.002%.

Come mostrato in figura 7, l’estratto ha significativamente protetto le cellule dai raggi UV, determinando una attenuazione della mortalità cellulare di circa 40%. Questi risultati indicano che l'estratto idrosolubile di Pelargonium è capace di contrastare gli effetti negativi prodotti sia dalla luce blu che dai raggi UVB sulle cellule della pelle. As shown in figure 7, the extract significantly protected cells from UV rays, resulting in an attenuation of cell mortality of about 40%. These results indicate that the water-soluble Pelargonium extract is capable of counteracting the negative effects produced by both blue light and UVB rays on skin cells.

Studio deH'effetto dell'estratto di Pelargonium sulla produzione delle proteine della matrice Study of the effect of Pelargonium extract on the production of matrix proteins

Allo scopo di dimostrare se l’estratto di Pelargonium avesse un effetto di induzione della produzione delle proteine della matrice extracellulare, e quindi potesse essere utilizzato come un potenziale ingrediente attivo in applicazioni cosmetiche anti-invecchiamento, fibroblasti umani sono stati trattati con due diverse concentrazioni dell’estratto, oppure con il TGF-β usato come controllo positivo, e la produzione di pro-collagene I (forma di collagene immaturo neosintetizzato) e di tropo-elastina sono stati misurati mediate saggio ELISA. Come mostrato in figura 8, l’estratto di Pelargonium, ad entrambe le concentrazioni, ha prodotto un significativo effetto di induzione delle proteine della matrice, collagene ed elastina, suggerendo un suo potenziale utilizzo come ingrediente attivo in formulazioni ad uso cosmetico. In order to demonstrate whether Pelargonium extract had an induction effect on the production of extracellular matrix proteins, and thus could be used as a potential active ingredient in anti-aging cosmetic applications, human fibroblasts were treated with two different concentrations of the 'extract, or with TGF-β used as positive control, and the production of pro-collagen I (form of newly synthesized immature collagen) and tropo-elastin were measured by means of an ELISA assay. As shown in Figure 8, the Pelargonium extract, at both concentrations, produced a significant induction effect of the matrix proteins, collagen and elastin, suggesting its potential use as an active ingredient in cosmetic formulations.

ESEMPIO 3; Preparazione dell'estratto liposolubile da colture cellulari della specie Pelargonium capitatum EXAMPLE 3; Preparation of the fat-soluble extract from cell cultures of the Pelargonium capitatum species

Il residuo insolubile (pellet) ottenuto dopo l’estrazione delle componenti idrofile dalle cellule di Pelargonium capitatum, è stato trattato con il solvente trigliceride caprilico/ caprico in un rapporto 1: 10 (peso/ volume) (in alternativa possono essere utilizzati solventi organici come alcoli, acetone, etere o altri solventi apolari) e lasciato in agitazione per 4 ore ad una temperatura di 60 °C per portare in soluzione le componenti liposolubili. Dopo centrifugazione a 6000 rpm per 15 minuti a temperatura ambiente, la fase liquida è stata prelevata: essa costituisce l'estratto liposolubile concentrato da poter usare in formulazioni cosmetiche in percentuali variabili tra lo 0,0001 e 10%. The insoluble residue (pellet) obtained after the extraction of the hydrophilic components from the cells of Pelargonium capitatum, was treated with the caprylic / capric triglyceride solvent in a ratio of 1: 10 (weight / volume) (alternatively organic solvents such as alcohols, acetone, ether or other non-polar solvents) and left under stirring for 4 hours at a temperature of 60 ° C to bring the fat-soluble components into solution. After centrifugation at 6000 rpm for 15 minutes at room temperature, the liquid phase was taken: it constitutes the concentrated fat-soluble extract that can be used in cosmetic formulations in percentages ranging from 0.0001 to 10%.

ESEMPIO 4: Preparazione dell’estratto di zuccheri e peptidi da colture cellulari della specie Pelargonium capitatum Il residuo insolubile (pellet), ottenuto dopo l’estrazione delle componenti idrofile dalle cellule di Pelargonium capitatum, è stato trattato per 1 ora con EDTA 2 mM a 100°C in rapporto 1:3 (peso/ volume). Dopo il raffreddamento, la soluzione è stata filtrata, mentre il pellet è stato prima lavato con acqua distillata e poi trattato per un’ora con HC1 0,1 N (pH 1,0) a 100°C in rapporto 1:3 (peso/ volume) per idrolizzare gli zuccheri delle pareti cellulari. La sospensione così ottenuta è stata trattata con pepsina O/N a 37°C per staccare e digerire le proteine dalle pareti cellulari. Il sopranatante contenente la frazione glucidica e peptidica è stato recuperato in seguito a centrifugazione, il pH portato a 6,5 con aggiunta di NaOH 10 N e poi portato a secco in un liofilizzatore. Il residuo solido è stato risospeso in glicerolo, esso costituisce la preparazione di peptidi e zuccheri da utilizzare in formulazioni cosmetiche in percentuali variabili tra lo 0.0001 e 10%. EXAMPLE 4: Preparation of the extract of sugars and peptides from cell cultures of the Pelargonium capitatum species The insoluble residue (pellet), obtained after the extraction of the hydrophilic components from the cells of Pelargonium capitatum, was treated for 1 hour with 2 mM EDTA a 100 ° C in a 1: 3 ratio (weight / volume). After cooling, the solution was filtered, while the pellet was first washed with distilled water and then treated for one hour with 0.1 N HCl (pH 1.0) at 100 ° C in a ratio of 1: 3 (weight / volume) to hydrolyze the sugars of the cell walls. The suspension thus obtained was treated with pepsin O / N at 37 ° C to detach and digest the proteins from the cell walls. The supernatant containing the carbohydrate and peptide fraction was recovered following centrifugation, the pH brought to 6.5 with the addition of 10 N NaOH and then dried in a lyophilizer. The solid residue was resuspended in glycerol, it constitutes the preparation of peptides and sugars to be used in cosmetic formulations in percentages varying between 0.0001 and 10%.

Claims

CLAIMS 1. Cosmetic use of at least one extract derived from plant cell cultures belonging to the Pelargonium capitatum species for the treatment and / or prevention of photo-aging of the skin due to exposure to ultraviolet light, blue light or infrared radiation.

2. Process for the preparation of at least one extract from plant cell cultures belonging to the Pelargonium capitatum species, comprising the steps of: a) culturing said Pelargonium capitatum cells in a liquid culture medium; b) homogenizing the cells in an aqueous saline solution, obtaining a homogenate; c) separating the solid part of said homogenate from the liquid part, which constitutes a water-soluble extract.

3. Process according to claim 2, wherein said plant cell cultures are obtained by taking plant tissue from plants, inducing the formation of calluses from said tissue on a solid substrate, taking said calluses and preparing liquid cultures from them.

4. Process according to claim 2 or 3, wherein said step c) of separating the solid part of the homogenate from the liquid part is performed by centrifugation, sedimentation or filtration.

5. Process according to any one of claims 2 to 4, which further comprises a step of treating said solid part with a lipophilic solvent, obtaining a fat-soluble extract.

6. Process according to any one of claims 2 to 4, comprising a further step of treating said solid part with proteolytic acids and enzymes in aqueous solution, obtaining an extract comprising peptides and sugars.

Use according to claim 1, wherein said at least one extract is a water-soluble extract obtained by the process according to any one of claims 2-4.

Use according to claim 1, wherein said at least one extract is a fat-soluble extract obtained by the process according to claim 5.

Use according to claim 1, wherein said at least one extract is an extract rich in peptides and sugars obtained by the process according to claim 6.

Use according to claim 1, wherein said at least one extract comprises at least two of the three extracts defined in claims 7-9 and preferably all three.

11. Composition comprising a water-soluble extract obtained by the process according to any one of claims 2-4 and / or a fat-soluble extract obtained by the process according to claim 5 and / or an extract rich in peptides and sugars obtained by the process according to claim 6.

12. Composition according to claim 11, containing, for one part by weight of said water-soluble extract, from 0.01 to 100, preferably 1, parts by weight of said fat-soluble extract and, independently, from 0.01 to 100, preferably 1 , parts by weight of said extract rich in peptides and sugars.

13. Composition according to any one of claims 11 and 12, comprising at least one hydrophilic solvent selected from the group comprising water, aqueous saline solutions, and organic solvents, preferably oils, alcohols, glycerol, organic acids, amides, amines, aldehydes and ketones.

14. Composition according to claim 13, wherein said hydrophilic solvent is a hydroalcoholic solution, preferably a water / glycerin mixture, and said water-soluble extract is contained in a concentration of 0.0001-10%, preferably at a concentration of 0.4% by weight based on the weight of the composition.

Cosmetic use of a composition according to any one of claims 11-14 for the treatment of photoaging of the skin due to exposure to ultraviolet light, blue light or infrared rays.

A cosmetic formulation comprising an extract as defined in any one of claims 1, 7-9 or a composition according to any one of claims 11-14 and a cosmetically acceptable carrier.