IT201800020167A1 - Procedimento e sistema per il trattamento delle superfici di supporti o contenitori per colture neuronali bidimensionali mediante chitosano quale fattore di adesione cellulare - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'Invenzione Industriale dal titolo: “Procedimento e sistema per il trattamento delle superfici di supporti o contenitori per colture neuronali bidimensionali mediante chitosano quale fattore di adesione cellulare”

TESTO DELLA DESCRIZIONE

La presente invenzione ha per oggetto un procedimento per il trattamento delle superfici di supporti o contenitori per colture neuronali bidimensionali mediante chitosano quale fattore di adesione cellulare.

I metodi standard, tradizionalmente adottati, per la funzionalizzazione di supporti impiegati per ottenere e mantenere una coltura neuronale in monostrato prevede che la superficie di adesione del materiale biologico sia preventivamente trattata con la deposizione di proteine (fattori) di adesione.

Tale pretrattamento ha lo scopo di promuovere il processo di adesione mediato da specifiche proteine della membrana cellulare.

Una coltura cellulare è un gruppo omogeneo di cellule eucariotiche, di origine tissutale, in grado di mantenersi vitale in vitro. Le colture cellulari vengono mantenute in terreno liquido all’interno di contenitori sterili. In particolare le cellule derivate da tessuti solidi devono poter aderire al fondo del contenitore per poter svolgere correttamente le proprie funzioni vitali. Il processo di adesione è mediato da biomolecole specifiche che in vivo mediano l’adesione tra cellula ed ambiente extra-cellulare. In vitro tali biomolecole, o loro derivati, sono utilizzate per modificare la superficie del contenitore o del supporto in modo da riprodurre un ambiente favorevole all’adesione e allo sviluppo cellulare.

Tradizionalmente, i protocolli per la modifica della superficie dei contenitori/supporti si basano sull’impiego di biopolimeri naturali, quali le proteine fibronectina, laminina, collagene o di sintesi, quali la Poli-DL-ornitina, la Poli-DL-Lisina e la Poli-Etilenimmina. Tali biopolimeri hanno costi elevati ed inoltre tempi medio lunghi di trattamento.

Per quanto riguarda le colture primarie di neuroni, sia ippocampali che corticali, i protocolli standard per la modifica della superficie dei contenitori/supporti di coltura si basano sull’impiego di laminina, poliornitina o polilisina. La laminina viene conservata a -20 °C e per essere utilizzata deve essere scongelata lentamente fino a 4 °C per evitare la sua gelificazione con conseguente impossibilità d’utilizzo. La soluzione di laminina va poi diluita in soluzione salina o terreno (0.1 mg/ml) e posta a contatto con la superficie da trattare a 37°C per 8 ore, alla fine delle quali si procede con lavaggi per eliminare l’eccesso di laminina non adsorbita. La poliornitina e la polilisina vanno anche esse scongelate e diluite, generalmente, ad una concentrazione pari a 0.15 mg/ml, poste a contatto con la superficie da trattare a 37°C per 12 ore, alla fine delle quali si procede con lavaggi per eliminare l’eccesso non adsorbito.

Il principale svantaggio nell’impiego di tali fattori è relativo al loro costo elevato e alle tempistiche di preparazione dei supporti funzionalizzati.

(Letourneau, Paul C. "Cell-to-substratum adhesion and guidance of axonal elongation." Developmental biology 44.1 (1975): 92-101;

Letourneau, Paul C. "Possible roles for cell-tosubstratum adhesion in neuronal morphogenesis." Developmental biology 44.1 (1975): 77-91).

Ad esempio, la poliornitina è una catena amminoacidica di sintesi il cui costo risulta elevato soprattutto per i laboratori che fanno un uso massiccio di colture cellulari. Essa è generalmente utilizzata ad una concentrazione tra 0.15-80 µg/ml in soluzione acquosa, depositata sulla superficie di interesse per un intervallo tra le 6-12h a 37°C.

Si è ora trovato un fattore di adesione cellulare, il polisaccaride chitosano, come alternativa all’impiego di fattori standard quali quelli sopra descritti, il quale permette di avere bassi costi di prototipazione, riducendo le tempistiche di preparazione dei supporti funzionalizzati, e di avere un costo minore mantenendo le stesse caratteristiche di adesione dei fattori standard.

Il chitosano è un polisaccaride lineare e cationico derivato dalla deacetilazione della chitina. La chitina è la componente principale dell’esoscheletro dei crostacei, di alcuni insetti e delle pareti dei funghi.

Il chitosano è un biopolimero naturale che ha la capacità di sostenere l’adesione e il differenziamento di colture neuronali.

Il procedimento da noi proposto si basa sul riconoscimento delle caratteristiche tipiche di “fattore di adesione” al polisaccaride deacetilato chitosano.

Questo particolare materiale che abbiamo individuato come alternativo a fattori di adesione standard ha inoltre la virtù di presentare costi relativamente più accessibili rispetto ai prodotti commercializzati dalle principali aziende di life science.

Ad esempio la laminina venduta da Sigma-Aldrich 1mg ha un costo di 168 euro, poliornitina venduta da Sigma-Aldrich 0.01% w/v, 50 ml, ha un costo 106 euro e la poli-D-lisina venduta da Sigma-Aldrich 0.01% w/v, 50 ml, ha un costo 106 euro 5mg 80 euro. Il chitosano, a basso peso molecolare, venduto da Sigma-Aldrich 50 G ha un costo di 92 euro.

Oggetto della presente invenzione è un procedimento per il trattamento delle superfici di supporti o contenitori per la preparazione in vitro di una coltura neuronale bidimensionale mediante fattori di adesione cellulare dove il fattore di adesione cellulare è il chitosano.

Il chitosano è impiegato in soluzione preferibilmente ad una concentrazione compresa fra 0,01 e 1 % w/v.

La soluzione madre di chitosano è preferibilmente in acido acetico 0.1 M.

Preferibilmente il contenitore o supporto viene posto in contatto diretto con la soluzione di chitosano tramite deposizione per adsorbimento oppure viene trattato tramite nebulizzazione della soluzione di chitosano mediante l’uso di un aerografo.

La deposizione per adsorbimento viene effettuata preferibilmente per un tempo compreso fra 1,5 e 5 ore, più preferibilmente fra 2 e 4 ore, ad una temperatura compresa fra quella ambiente e 40°C, più preferibilmente attorno ai 37°C.

Preferibilmente l’eccesso di soluzione di chitosano depositata per adsorbimento viene rimosso e successivamente sottoposto a lavaggio o con acqua sterile o direttamente con terreno di coltura.

I substrati funzionalizzati per processo di adsorbimento non prevedono una successiva sterilizzazione perché il materiale polimerico viene preventivamente filtrato e reso sterile

La nebulizzazione viene effettuata preferibilmente ad una pressione di azoto compresa fra 2 e 3 atmosfere, maggiormente preferibilmente il valore di 2,5 atmosfere, e a temperatura ambiente.

L’aerografo può avere preferibilmente un ugello di diametro 0.2 mm.

Dopo la deposizione tramite aeropenna, il materiale, preferibilmente, viene lasciato asciugare sotto cappa chimica ed i substrati vengono sterilizzati a posteriori in etanolo 70% per un tempo compreso fra 20 min e 1 ora, lavando infine la superficie con acqua sterile o terreno di coltura. Successivamente possono essere utilizzati per la coltura cellulare.

Il procedimento con l’aerografo presenta il vantaggio di nebulizzare il materiale attraverso l’impiego di maschere in modo da generare superfici di adesione patternate che generino reti neuronali non randomiche.

Oggetto della presente invenzione è l’utilizzo di chitosano quale fattore di adesione per il trattamento delle superfici di supporti o contenitori per la preparazione in vitro di una coltura neuronale bidimensionale.

Secondo una ulteriore forma esecutiva il procedimento per il trattamento delle superfici di supporti o contenitori per la preparazione in vitro di una coltura neuronale bidimensionale mediante fattori di adesione cellulare dove il fattore di adesione cellulare è il chitosano, prevede che l’applicazione del chitosano avvenga con altri tipi di tecniche diverse dalla deposizione mediante aerografo.

In alternativa all’aerografo è possibile prevedere l’utilizzo di tecniche per il coating derivate da altri campi tecnici come la verniciatura nel campo del finishing.

Tali tecniche ed i corrispondenti impianti sono configurati per trattare un elevato numero di pezzi e possono venire impiegati per la produzione in serie di grandi numeri di parti od opportunamente riconfigurati anche per la produzione in piccole serie.

Fra le diverse tecniche utilizzate nel campo del coating è noto ad esempio l’utilizzo di ugelli di spruzzatura che sono montati su supporti aventi diversi gradi di libertà di orientamento e spostamento dei detti ugelli.

Una ulteriore variante può prevedere ad esempio l’utilizzo di tecniche di deposizione mediante stampanti del tipo a getto d’inchiostro.

In questo caso, il controllo della deposizione e dei pattern di distribuzione del chitosano possono essere facilmente modificati a seconda delle necessità semplicemente modificando il software di controllo della stampante.

Utilizzando una stampante monocromatica e utilizzando al posto dell’inchiostro la soluzione contenete il chitosano è possibile definire i pattern di distribuzione ad esempio sotto forma di elementi grafici posizionati in posizioni prestabilite con riferimento ad un’area di generazione di una immagine ed aventi la forma e le dimensioni previste per la zona su cui deve essere deposta la soluzione di chitosano. Gli elementi grafici possono venire generati su un foglio di disegno virtuale mediante un software di disegno grafico e possono venire trasmessi per la stampa alla stampante sotto forma di file immagine da stampare.

Secondo una forma esecutiva opzionale, la stampante a getto d’inchiostro può essere programmata a distribuire su una prestabilita zona una prestabilita quantità di soluzione sia in modo uniforme sull’intera zona sia in modo da generare parti della detta zona sulle quali è stata erogata una maggiore o minore quantità di soluzione.

Secondo una variante esecutiva in questo caso, la funzione di distribuzione può essere correlata ad una scala di grigi in cui la maggiore o minore gradazione di grigio rappresentano una maggiore o minore quantità di soluzione che deve essere distribuita sulla detta zona. Ciò consente di realizzare pattern di distribuzione della soluzione in maniera semplice utilizzando un software di disegno che rappresenta graficamente le zone su cui distribuire la soluzione con forme geometriche corrispondenti e dimensioni o rapporti dimensionali corrispondenti, mentre le diverse quantità di soluzione da destinare su diverse parti delle dette zone oppure una prestabilita quantità di soluzione da distribuire uniformemente sulle dette zone è definita mediante la colorazione delle dette parti di zona o dell’intera zona con una prestabilita gradazione di grigio correlata ad una prestabilita quantità di soluzione.

È quindi possibile generare file di comando dell’organo di deposizione della soluzione di chitosano utilizzando programmi di disegno o grafici come ad esempio Microsoft PowerPoint, Microsoft Word od altri. L’unità di controllo dell’organo di deposizione è in questo caso provvista dei driver di comando dell’organo di deposizione i quali comprendono le istruzioni di correlazione fra il file grafico ed i parametri di comando delle funzioni dell’organo di deposizione in relazione allo spostamento di quest’ultimo per l’erogazione della soluzione nelle aree prestabilite di un sopporto e/o in relazione alla quantità per unità di area da deporre sulle dette aree.

La stampante a getto d’inchiostro può ulteriormente venire utilizzata anche per alimentare il fluido di lavaggio nel passo successivo alla deposizione per l’eliminazione della soluzione in eccesso.

Mentre utilizzando impianti di verniciatura ad ugelli è generalmente necessario prevedere serie abbastanza grandi di substrati aventi forma e dimensioni identiche e ripetitive, l’utilizzo della stampante a getto d’inchiostro consente di generare in modo economico pezzature di substrati numericamente più piccole, offrendo al tempo stesso una notevole flessibilità di adattamento a diverse esigenze soprattutto relativamente alle diverse forme e dimensioni dei substrati sui quali la soluzione di chitosano deve essere depositata.

Oltre alla flessibilità le stampanti a getto d’inchiostro risultano di costruzione semplice, poco ingombrante e relativamente economica se paragonate ad altri tipi di dispositivi di deposizione di coating.

In relazione alle specifiche di composizione della soluzione di chitosano, in combinazione con le suddette due ulteriori forme esecutive, queste possono essere identiche a quanto descritto in precedenza in combinazione alla forma esecutiva che prevede la deposizione mediante aerografo.

La composizione della soluzione, come pure i rapporti delle varie componenti rispetto al chitosano possono variare a seconda della tecnica di deposizione utilizzata ad esempio secondo una delle suddette due varianti. Le scelte specifiche sono dettate dalle configurazioni del sistema di deposizione utilizzato e la loro determinazione rientra nell’ambito delle conoscenze tecniche di base dell’esperto del ramo e delle normali attività di progettazione.

Secondo un ulteriore aspetto, l’invenzione ha anche per oggetto un sistema per la produzione in serie di supporti o contenitori per colture neuronali bidimensionali provviste di un rivestimento di chitosano quale fattore di adesione cellulare, il quale sistema comprende

una stazione di alimentazione di almeno un substrato destinato a formare un supporto od un contenitore;

una stazione di deposizione di una soluzione di chitosano per la creazione di un fattore di adesione cellulare dove il fattore di adesione cellulare è costituito dal chitosano;

una stazione di scarico del substrato su cui è stato deposto uno strato di chitosano;

un trasportatore del detto almeno un substrato dalla detta stazione di alimentazione alla detta stazione di deposizione della soluzione di chitosano e successivamente alla detta stazione di scarico,

ed in cui la stazione di deposizione comprende un organo spruzzatore/nebulizzatore della soluzione di chitosano su almeno una parte della superficie del substrato

essendo prevista una unità di controllo del detto organo spruzzatore/nebulizzatore relativamente alla direzione di emissione del getto di soluzione di chitosano e/o alla movimentazione del detto organo conformemente ad una prestabilita dimensione e forma della detta parte di superficie del substrato su cui è prevista la deposizione della soluzione di chitosano e/o relativamente alla quantità di soluzione di chitosano per unità grandezza della detta zona di superficie.

Secondo una ulteriore caratteristica, l’organo spruzzatore/nebulizzatore può essere scelto fra almeno un ugello di spruzzatura/nebulizzazione, od almeno una testina stampa del tipo a getto d’inchiostro od una combinazione di detti ugelli e di dette testine, essendo il detto almeno un ugello o la detta almeno una testina o la combinazione di questi due elementi supportata su un meccanismo di orientamento e/o spostamento secondo almeno uno o secondo due o più assi.

Secondo una caratteristica opzionale, la stazione di deposizione e/o la stazione di alimentazione sono provviste di organi di rilevamento della presenza e/o della posizione e/o della forma e/o della dimensione del substrato i quali sono collegati all’unità di controllo, mentre la detta unità di controllo è configurata per elaborare i segnali dei detti organi di rilevamento e generare segnali di comando degli organi di deposizione corrispondentemente alla posizione, la forma e le dimensioni rilevate dei substrati.

Ancora secondo una caratteristica opzionale che può essere prevista in qualsivoglia combinazione con le precedenti caratteristiche, il sistema comprende una unità di produzione della soluzione di chitosano corrispondentemente alle esigenze di deposizione, la quale unità comprende almeno un serbatoio per il chitosano, almeno un serbatoio per almeno un solvente, un miscelatore e mezzi dosatori, alimentatori del chitosano e del detto almeno un solvente al detto miscelatore, almeno un serbatoio per la soluzione di chitosano preparata per la deposizione il quale serbatoio è collegato ed alimenta i detti organi di deposizione.

Ancora una ulteriore caratteristica, il detto sistema può comprendere opzionalmente una stazione di lavaggio della soluzione di chitosano deposta e che è in eccesso.

Tale stazione di lavaggio può essere realizzata in vari modi e dipende in parte dalla forma dei substrati.

In una configurazione generica, la stazione di lavaggio può presentare ugelli di alimentazione di getti di fluido di lavaggio sulle superfici dei substrati su cui è stata deposta la soluzione di chitosano e organi di asportazione del fluido di lavaggio e/o asciugatura dei substrati.

L’asportazione del fluido di lavaggio può richiedere una movimentazione dei substrati qualora ad esempio essi siano sotto forma di contenitori, come ad esempio il loro capovolgimento completo o parziale.

In combinazione od in alternativa l’asciugatura può avvenire mediante getti d’aria fredda e/o calda a seconda delle condizioni specifiche.

Secondo ancora una ulteriore caratteristica, fra la stazione di deposizione e la stazione lavaggio può essere prevista una stazione di asciugatura della soluzione di chitosano deposta sul substrato nella stazione di deposizione. In questa stazione possono essere previsti alternativamente o in combinazione diversi organi di asciugatura come ad esempio getti di aria calda o fredda, trattamenti termici od altri.

Secondo una variante esecutiva possibile, la stazione di asciugatura è provvista di una cappa chimica sotto cui avviene il processo di asciugatura dei substrati.

Ancora una forma esecutiva prevede una stazione di sterilizzazione dei substrati direttamente a monte della stazione di scarico.

Alternativamente la stazione di sterilizzazione oppure una o più ulteriori stazioni di sterilizzazione possono essere previste a monte od a valle di una qualsivoglia delle stazioni sopra descritte con riferimento alla forma esecutiva di base ed alle diverse forme esecutive opzionali.

La stazione di sterilizzazione può essere provvista di uno o più organi di sterilizzazione operanti ciascuna secondo una tecnica ed un processo fra quelli noti e che vengono utilizzati a seconda del caso specifico essendo il tecnico del ramo in grado di selezionare la tecnica di sterilizzazione migliore fra quelle note ed a lui disponibili allo stato dell’arte.

Una tecnica di sterilizzazione particolarmente adatta in combinazione con le forme esecutive più sopra descritte e relative ad una linea di produzione altamente automatizzata può consistere nell’irraggiamento dei substrati provvisti dello stato di deposizione di chitosano mediante raggi gamma.

Tale tecnica è di per sé nota e prevede quindi una stazione di sterilizzazione comprendente organi di generazione ed irraggiamento dei substrati in entrata alla stessa mediante raggi gamma.

Come appare evidente da quanto sopra esposto, il procedimento secondo la presente invenzione presenta il vantaggio di poter essere configurato per uno sfruttamento nell’ambito di una produzione in serie. L’impianto ed il sistema per l’attuazione del procedimento risultano semplici e facilmente realizzabili. Inoltre a seconda dei casi è possibile prevedere diverse configurazioni senza richiedere una riprogettazione del sistema stesso.

A seconda della conformazione e della dimensione dei supporti o dei contenitori è possibile trattare in parallelo un certo numero di detti supporto o contenitori. In questo caso il trasportatore può alimentare un flusso costante di più colonne fra loro parallele di supporti o contenitori le quali colonne sono disposte accostate l’una all’altra. Pertanto il sistema consente di produrre un elevato numero di supporti o contenitori contribuendo ad abbattere ulteriormente i costi ed a rendere la produzione di supporti o contenitori per la preparazione in vitro di una coltura neuronale bidimensionale mediante fattori di adesione cellulare una produzione di tipo seriale.

Le caratteristiche dell’invenzione in particolare relativamente al processo di deposizione ed alla struttura di un impianto automatizzato per la produzione in serie di supporti o contenitori per colture neuronali bidimensionali provviste di un rivestimento di chitosano quale fattore di adesione cellulare risulteranno meglio dalla seguente descrizione di alcuni esempi esecutivi non limitativi illustrati nei disegni allegati, in cui:

La figura 1 illustra un diagramma funzionale a blocchi di una prima forma esecutiva di un impianto per la produzione in serie di supporti o contenitori per colture neuronali bidimensionali provviste di un rivestimento di chitosano quale fattore di adesione cellulare.

La figura 2 mostra schematicamente una ulteriore forma esecutiva di impianto secondo la figura 1, nella sua configurazione più minimale.

La figura 3 mostra un esempio di un supporto combinato sulle cui superfici è destinato ad essere applicato mediante deposizione la soluzione di chitosano con un impianto secondo la presente invenzione.

Con riferimento alla figura 1, come già descritto in precedenza, fra le possibili alternative per la deposizione della soluzione di chitosano sulla superficie di un substrato destinato a fungere da supporto o contenitore di una cultura neuronale bidimensionale è prevista quella di un impianto automatizzato che esegue in modo automatico ed in serie le operazioni più sopra descritte in qualsivoglia delle modalità e/o combinazioni e sottocombinazioni di caratteristiche più sopra descritte.

In particolare nella figura 1 l’impianto è realizzato quale insieme di stazioni operative distribuite lungo un percorso di trasferimento del o dei substrati fra differenti stazioni, ciascuna destinata ad eseguire almeno una delle operazioni più sopra ampiamente descritte.

I substrati vengono prelevati ed alimentati in successione e/o almeno in parte in parallelo ad una linea di trasporto indicata dalle frecce in una stazione di alimentazione 100. A seconda della modalità con cui i substrati sono forniti la stazione di alimentazione 100 può prevedere diverse configurazione e diversi organi di prelevamento da un magazzino ad una estremità di entrata della linea di trasporto. Tali configurazioni e tali organi sono selezionabili dal tecnico del ramo fra una ampia scelta di soluzioni note, fra cui ad esempio anche l’utilizzo di bracci robotizzati provvisti di organi di afferramento portati dal braccio.

I substrati vengono quindi alimentati ad una stazione di deposizione, nella quale è previsto un organo di deposizione 101 che può essere costituito da uno o più ugelli o da una o più testine del tipo a getto d’inchiostro e da mezzi di spostamento ed orientamento del o dei detti ugelli o della o delle dette testine.

Queste sono alimentata con una soluzione di chitosano da un serbatoio di alimentazione non illustrato od in alternativa da una opzionale stazione di preparazione ed alimentazione della soluzione di chitosano indicata con 106 ed illustrata con linea a tratto e punto.

La preparazione della soluzione ed in particolare la composizione ed i rapporti delle singole componenti possono essere ad esempio previsti secondo una o più delle modalità più sopra descritte. Il rapporto di diluizione ed anche la composizione della soluzione può comunque variare in relazione alle caratteristiche richieste dagli ugelli e/o dalle testine a getto d’inchiostro.

La soluzione e/o il chitosano e/o i singoli componenti separatamente fra loro della detta soluzione possono essere sterilizzati prima della loro alimentazione alla stazione di deposizione come indicato con 107, con linee a tratto e punto per evidenziare il fatto che tale passo e tale stazione possono essere opzionali.

A seguito della deposizione sui substrati nella stazione di deposizione 101, questi vengono trasferiti ad una stazione di scarico e packaging 105. Questa stazione è anch’essa realizzata secondo le caratteristiche contingenti dei substrati ed inoltre può prevedere oltre ad organi manipolatori e di impacchettamento anche organi di asciugatura dello strato di materiale deposto sul substrato come evidenziato nella precedente descrizione.

Con 102, 103 e 104 vengono indicate stazioni opzionali di trattamento che si riferiscono a passi del procedimento più sopra descritti ed in particolare con 102 viene indicata una stazione di lavaggio, con 103 una stazione di asciugatura e con 104 una stazione di sterilizzazione.

La stazione 102 di lavaggio può essere prevista per eseguire il passo più sopra descritto di eliminazione della soluzione di chitosano in eccesso. Questa operazione può venire eseguita secondo una qualsivoglia delle modalità descritte in precedenza e la stazione di lavaggio 102 è quindi provvista di organi di lavaggio che sono compatibili con la modalità scelta e che il tecnico del ramo seleziona fra uno spettro di soluzioni note in funzione della detta modalità scelta.

Quanto sopra vale anche per la stazione di asciugatura 103. Infatti la selezione degli organi di asciugatura che possono essere alternativamente od in combinazione generatori di flussi di aria condizionata (riscaldata o raffreddata) e generatori di energia termica a cui vengono esposti i substrati in uscita dalla stazione di lavaggio 102, dipende dal tipo di substrato e/o dal tipo di sostanze utilizzate per il lavaggio, ovvero dalle loro caratteristiche chimico/fisiche.

Una stazione 104 di sterilizzazione può essere prevista prima dello scarico dei substrati trattati dalla linea di produzione. Anche per la stazione di sterilizzazione sono possibili alternativamente od in combinazione fra loro una o più delle varianti attualmente presenti sul mercato e note al tecnico del ramo.

In particolare una forma esecutiva può prevedere una sterilizzazione mediante raggi gamma. Questo processo di sterilizzazione che può essere impiegato in una linea automatica di produzione in cui il personale umano non deve essere presente nelle vicinanze della stazione di sterilizzazione consente di integrare in modo ottimale il passo della sterilizzazione con il moto di trasferimento dei substrati da una stazione all’altra senza richiedere manipolazioni aggiuntive dei substrati per modificarne orientamenti nello spazio e/o posizioni.

In relazione ai substrati questi possono essere sottoforma di singoli pezzi fra loro separati e ciascuno dei quali rappresenta una unità destinata a fungere da supporto o contenitore per la coltura.

Una alternativa può prevedere che due o più supporti o contenitori siano integrati in un insieme in posizione affiancata ed accostata fra loro secondo un prestabilito ordine, per cui i singoli substrati dell’insieme vengono caricati e sottoposti al processo tutti insieme.

All’atto dello scaricamento può essere previsto il passo di separazione dei singoli substrati dall’insieme oppure l’insieme di substrati viene mantenuto e sottoposto ad impacchettamento nella sua forma completa comprendente più supporti o contenitori.

La figura 3 mostra un esempio in cui l’insieme di supporti 301 sotto forma di dischetti è previsto sotto forma di una lastra rettangolare 300. I singoli dischetti 301 sono trattenuti al retante materiale della lastra mediante linee di rottura prestabilita grazie alla equali possono venire separati al termine del processo prima del loro impacchettamento.

Come già indicato è possibile prevedere di impacchettare l’intera lastra 300, solo parte di essa oppure separare i dischetti 301 ed impacchettarli separatamente l’uno dell’altro od in un gruppo di un prestabilito numero di dischetti.

La figura 2 mostra uno schema blocchi di un impianto che opera su un supporto piano sotto forma di singola unità di supporto o sotto forma di elemento lastriforme che integra più unità di prodotto come ad esempio illustrato nella figura 3.

I singoli supporti 250 vengono alimentati da un magazzino in una stazione di alimentazione 200. Uno dopo l’latro i supporti vengono posizionati su un nastro trasportatore 240 formano una successione di supporti.

Questi vengono trasferiti a una stazione di deposizione 210. Nell’esempio illustrato la stazione di deposizione 210 presenta una struttura del tipo stampante a getto d’inchiostro con una o più testine 213 montate su un meccanismo di spostamento che può operare secondo diverse direzioni di spostamento mentre è possibile prevedere anche ulteriormente organi di orientamento della o delle testine (non illustrati in dettaglio).

Solo a titolo d’esempio la testina è montata su una prima slitta 212 che scorre su una prima guida orientata trasversalmente alla direzione di trasporto del substrato 250. La prima guida può essere montata su una seconda slitta 211 che scorre in direzione parallela alla direzione del nastro trasportatore 240 su una seconda guida 214. Quest’ultima potrebbe non essere necessaria in quanto lo spostamento del substrato 250 relativamente alla testina ed in direzione parallela alla direzione di avanzamento del nastro è ottenuta già dallo spostamento del substrato 250 per mezzo del nastro 240. Tuttavia in caso si volesse fare più passate di deposizione, o si volesse variare la velocità di deposizione per unità di area della superficie da trattare lo spostamento indipendente ed ulteriore della o delle testine 213 in direzione di trasporto del nastro potrebbe risultare opportuna.

Con 220 è indicata una sorgente di alimentazione della soluzione di chitosano che può essere realizzata secondo una o più delle varianti più sopra descritte, in particolare anche con riferimento all’esempio della figura 1.

Con 230 è indicata una stazione di scarico. Questa presenta organi di manipolazione dei singoli substrati per il prelevamento degli stessi dall’estremità di uscita del nastro 240 ed indicati con 231. Gli organi di manipolazione 231 possono servire una unità di impacchettamento od un magazzino di raccolta dei substrati 250 che è indicato con 232 ed in cui i substrati trattati possono venire avviati a successive fasi di trattamento non illustrate come ad esempio una o più delle fasi di lavaggio 102, asciugatura 103 e sterilizzazione 104 ed impacchettamento finale descritte con riferimento al precedente esempio.

Il controllo delle stazioni e degli organi previsti in queste è eseguito mediante una unità di controllo 260. Questa può essere sottoforma di un elaboratore, un PC od altro sistema a microprocessore in grado di caricare ed eseguire un programma che codifica le istruzioni per configurare la detta unità e le periferiche della stessa in modo tale da eseguire le funzioni necessarie al controllo delle dette stazioni e dei detti organi operativi.

Oltre a memorie per i programmi di controllo ed i driver di comando delle stazioni e degli organi previsti nelle stesse, l’unità di controllo è prevista in combinazione con una o più interfacce di input output di comunicazione con l’utente indicate globalmente con 262 e che possono comprendere una o più delle note interfacce attualmente presenti sul mercato.

Secondo ancora una ulteriore caratteristica, l’unità di controllo 260 può essere provvista di una unità di comunicazione 263 grazie a cui essa può collegarsi ad unità remote per lo scambio di dati come ad esempio per l’upload od il download di dati e/o di programmi e/o anche per il collegamento ad una unità portatile di un utente, la quale unità costituisca lei stessa l’interfaccia utente.

Come appare evidente, la stazione di deposizione 210 può prevedere quale organo di deposizione anche una stampante di tipo inkjet che può essere costituita anche da una stampante di tipo retail a cui in luogo dell’inchiostro viene alimentata la soluzione di chitosano.

Come descritto in precedenza questa soluzione risulta particolarmente economica. Infatti il comando della stampante può avvenire grazie ad un file di testo o d’immagine in cui è rappresentata la o le sagome del supporto o dell’insieme dei supporti ed in cui la scala di grigi rappresenta la quantità di soluzione per unità di superficie da deporre sulle zone corrispondenti ai substrati.

Grazie a ciò la preparazione della stampante richiede solo la preparazione a video dell’immagine utilizzando programmi di bassa difficoltà e di uso universale, senza necessitare complesse operazioni di generazione dei comandi degli organi di deposizione.

Claims (18)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per il trattamento delle superfici di supporti o contenitori per la preparazione in vitro di una coltura neuronale bidimensionale mediante fattori di adesione cellulare caratterizzato dal fatto che il fattore di adesione cellulare è il chitosano.
2. 2. Procedimento come da rivendicazione 1 dove il chitosano è impiegato in soluzione ad una concentrazione compresa fra 0,01 e 1 % w/v.
3. 3. Procedimento come da rivendicazione 2 dove il solvente per la soluzione madre di chitosano è l’acido acetico 0.1 M e le successive diluizioni scalari possono essere eseguite nel suddetto solvente o eventualmente in acqua deionizzata.
4. 4. Procedimento come da almeno una delle rivendicazioni da 2 a 3 dove il contenitore o supporto viene posto in contatto diretto con la soluzione di chitosano tramite deposizione per adsorbimento.
5. 5. Procedimento come da rivendicazione 4 dove la deposizione per adsorbimento viene effettuata per un tempo compreso fra 1,5 e 5 ore, preferibilmente fra 2 e 4 ore, e ad una temperatura compresa fra quella ambiente e 40°C, preferibilmente attorno ai 37°C.
6. 6. Procedimento come da rivendicazione 5 dove l’eccesso di soluzione di chitosano depositato per adsorbimento viene rimosso e successivamente sottoposto a lavaggio o con acqua sterile o direttamente con terreno di coltura.
7. 7. Procedimento come da almeno una delle rivendicazioni da 2 a 3 dove il contenitore o supporto viene trattato tramite nebulizzazione della soluzione di chitosano mediante l’uso di un aerografo.
8. 8. Procedimento come da rivendicazione 7 dove la nebulizzazione viene effettuata ad una pressione di azoto compresa fra 2 e 3 atmosfere e a temperatura ambiente.
9. 9. Procedimento come da rivendicazione 7 o 8 dove i substrati vengono sterilizzati a posteriori in etanolo 70% per un tempo compreso fra 20 min e 1 ora, lavando infine la superficie con acqua sterile o terreno di coltura.
10. 10. Procedimento come da almeno una delle rivendicazioni precedenti dove il supporto o contenitore è scelto fra vetro, polistirene e nitruro di silicio.
11. 11. Procedimento secondo una o più delle precedenti rivendicazioni il quale procedimento comprende i passi di: alimentare almeno un supporto od un contenitore od una successione di uno due o più supporti o contenitori fra loro accostati ad una stazione di deposizione di una soluzione di chitosano; applicare la soluzione di chitosano mediante una tecnica a getto d’inchiostro o mediante ugelli spruzzatori/nebulizzatori su almeno alcune zone prestabilite dei detti supporti o contenitori; opzionalmente eliminare mediante lavaggio la soluzione in eccesso sui detti supporti e/o contenitori; opzionalmente sottoporre i detti supporti o contenitori a asciugatura; opzionalmente sottoporre i detti supporti o contenitori a sterilizzazione.
12. 12. Procedimento secondo una o più delle precedenti rivendicazioni, in cui la sterilizzazione dei supporti e/o contenitori avviene dopo la fase di deposizione della soluzione di chitosano e/o dopo la o le fasi opzionali di lavaggio ed asciugatura mediante irraggiamento dei detti supporti o substrati con raggi gamma.
13. 13. Sistema per la produzione in serie di supporti o contenitori per colture neuronali bidimensionali provviste di un rivestimento di chitosano quale fattore di adesione cellulare mediante il procedimento secondo una o più delle precedenti rivendicazioni 1 a 12, il quale sistema comprende almeno una stazione di alimentazione di almeno un substrato destinato a formare un supporto od un contenitore; una stazione di deposizione di una soluzione di chitosano per la creazione di un fattore di adesione cellulare dove il fattore di adesione cellulare è costituito dal chitosano; una stazione di scarico del substrato su cui è stato deposto uno strato di chitosano; un trasportatore del detto almeno un substrato dalla detta stazione di alimentazione alla detta stazione di deposizione della soluzione di chitosano e successivamente alla detta stazione di scarico, ed in cui la stazione di deposizione comprende un organo spruzzatore/nebulizzatore della soluzione di chitosano su almeno una parte della superficie del substrato essendo prevista una unità di controllo del detto organo spruzzatore/nebulizzatore relativamente alla direzione di emissione del getto di soluzione di chitosano e/o alla movimentazione del detto organo conformemente ad una prestabilita dimensione e forma della detta parte di superficie del substrato su cui è prevista la deposizione della soluzione di chitosano e/o relativamente alla quantità di soluzione di chitosano per unità grandezza della detta zona di superficie.
14. 14. Sistema secondo la rivendicazione 13, in cui l’organo spruzzatore/nebulizzatore può essere scelto fra almeno un ugello di spruzzatura/nebulizzazione, od almeno una testina stampa del tipo a getto d’inchiostro od una combinazione di detti ugelli e di dette testine, essendo il detto almeno un ugello o la detta almeno una testina o la combinazione di questi due elementi supportata su un meccanismo di orientamento e/o spostamento secondo almeno uno o secondo due o più assi.
15. 15. Sistema secondo le rivendicazioni 13 o 14, in cui la stazione di deposizione e/o la stazione di alimentazione sono provviste di organi di rilevamento della presenza e/o della posizione e/o della forma e/o della dimensione del substrato i quali sono collegati all’unità di controllo, mentre la detta unità di controllo è configurata per elaborare i segnali dei detti organi di rilevamento e generare segnali di comando degli organi di deposizione corrispondentemente alla posizione, la forma e le dimensioni rilevate dei substrati.
16. 16. Sistema secondo una o più delle rivendicazioni 13 a 15, il quale sistema comprende ulteriormente selezionata fra le seguenti: una unità di produzione della soluzione di chitosano corrispondentemente alle esigenze di deposizione, la quale unità comprende almeno un serbatoio per il chitosano, almeno un serbatoio per almeno un solvente, un miscelatore e mezzi dosatori, alimentatori del chitosano e del detto almeno un solvente al detto miscelatore, almeno un serbatoio per la soluzione di chitosano preparata per la deposizione il quale serbatoio è collegato ed alimenta i detti organi di deposizione; una stazione di lavaggio della soluzione di chitosano deposta e che è in eccesso; una stazione di sterilizzazione dei substrati; od una combinazione di dette stazioni.
17. 17. Sistema secondo la rivendicazione 16, in cui la stazione di sterilizzazione comprende organi di irraggiamento dei supporti o dei contenitori mediante raggi gamma.
18. 18. Utilizzo di chitosano quale fattore di adesione per il trattamento delle superfici di supporti o contenitori per la preparazione in vitro di una coltura neuronale bidimensionale.