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IT201800005062A1 - Modulatori dell’attività di segnale dell’indolamina 2,3-diossigenasi e loro impieghi terapeutici. - Google Patents

Modulatori dell’attività di segnale dell’indolamina 2,3-diossigenasi e loro impieghi terapeutici. Download PDF

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IT201800005062A1
IT201800005062A1 IT102018000005062A IT201800005062A IT201800005062A1 IT 201800005062 A1 IT201800005062 A1 IT 201800005062A1 IT 102018000005062 A IT102018000005062 A IT 102018000005062A IT 201800005062 A IT201800005062 A IT 201800005062A IT 201800005062 A1 IT201800005062 A1 IT 201800005062A1
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Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo: “Modulatori dell’attività di segnale dell’indolamina 2,3-diossigenasi e loro impieghi terapeutici”
DESCRIZIONE
La presente invenzione rientra nel campo dei trattamenti terapeutici delle malattie autoimmuni. Più in particolare, l’invenzione riguarda l’impiego di modulatori dell’attività di segnale dell’indolamina 2,3-diossigenasi (IDO1) per il trattamento terapeutico di malattie autoimmuni quali la sclerosi multipla (MS) e il diabete.
La sclerosi multipla (MS) è una malattia neurodegenerativa cronica e progressiva che attualmente colpisce circa 2,3 milioni di persone nel mondo. I tassi di incidenza della MS sono significativamente superiori in Europa e in altre regioni dell’emisfero settentrionale. In Europa, il numero di pazienti attualmente affetti da MS è stimato intorno ai 700.000, con tassi di incidenza variabili fra 2,3-12,2/100.000 per anno.
Da un punto di vista fisiopatologico la sclerosi multipla è caratterizzata dalla perdita dello strato isolante che circonda gli assoni dei neuroni, la guaina mielinica. Tale perdita determina un danno neuronale e la formazione di placche nel sistema nervoso centrale.
Questa patologia è distinguibile in due tipologie principali, ovvero la sclerosi multipla recidivante-remittente (SMRR), che colpisce circa l’80% dei pazienti MS, e la sclerosi multipla primaria-progressiva (SMPP), che colpisce il rimanente 20%. Le due tipologie si caratterizzano per i pattern di progressione della malattia e, finora, la maggior parte dei trattamenti terapeutici disponibili sono stati approvati solo per la SMRR.
I sintomi della MS si manifestano come deterioramento cognitivo, debolezza muscolare, perdita di coordinazione muscolare, disturbi della parola e della vista. L’elevata prevalenza della MS (2,3 milioni di persone nel mondo) determina un onere economico sostanziale (in media, € 50.000 per anno per paziente), dal momento che la MS colpisce principalmente persone relativamente giovani (l’età alla quale la malattia viene diagnosticata è spesso compresa fra i 20 e i 40 anni). Gli effetti della neurodegenerazione si accumulano nel corso del tempo ed entro i 15 anni dalla diagnosi l’80% dei pazienti diviene incapace di lavorare.
La ricerca svolta nel campo della MS ha stabilito che le cause della malattia sono immunologiche, in particolare correlate con l’autoimmunità, e per questo motivo la MS viene anche considerata la malattia autoimmune con prevalenza più elevata.
Attualmente non vi sono cure per la MS e le opzioni terapeutiche disponibili hanno principalmente lo scopo di sopprimere l’attività dei mediatori pro-infiammatori. Inoltre, a dispetto della loro sostanziale inefficacia, la maggior parte dei trattamenti ad oggi disponibili richiede somministrazioni frequenti (da una volta al giorno a una volta al mese) perché i pathways su cui essi agiscono mostrano solo effetti a breve termine. Esempi di tali farmaci includono Ocrelizumab (mAb per la deplezione di linfociti B) Zinbryta, (mAb per impedire l’attivazione dei linfociti T) Interferone beta 1a/1b (citochine antiinfiammatorie ricombinanti) Natalizumab (mAb per bloccare l’uptake dei linfociti T effettori attraverso la barriera emato-encefalica), Fingolimod (piccola molecola che sequestra i leucociti), dimetil fumarato (promozione di linfociti T regolatori o Treg), corticosteroidi e ormoni adrenocorticotropi (ACTH). Nonostante siano disponibili varie opzioni terapeutiche, la neurodegenerazione persiste progressivamente nei pazienti MS, determinando un deterioramento della qualità della vita e una riduzione dell’aspettativa di vita (5-10 anni in meno rispetto alla media).
Vi è pertanto l’urgente necessità di identificare nuovi farmaci per il trattamento della MS che siano più efficaci nel modulare gli eventi infiammatori nel sistema nervoso centrale. Tali nuovi farmaci dovrebbero inoltre essere indirizzati verso nuovi meccanismi molecolari, in modo tale da fornire effetti immunoregolatori a lungo termine, data la natura cronica della malattia.
E’ noto che in pazienti con diabete giovanile e sclerosi multipla vi è un deficit di enzima indolamina-2,3-diossigenasi 1 (IDO1). Questo enzima è un produttore di chinurenine, sostanze che impediscono una iper-attivazione delle difese immunitarie. Al contrario, IDO1 è troppo attivo nei pazienti con tumore, dove agisce spegnendo la risposta di difesa immunitaria alla crescita di cellule cancerose.
In studi precedenti, è stato osservato che IDO1 non solo produce chinurenine inibendo l’attivazione dei linfociti, ma può anche inviare segnali alle cellule immuni, riprogrammando le difese immunitarie verso funzioni di immunotolleranza a lungo termine, effetto fondamentale per la terapia di malattie croniche come quelle autoimmuni [Pallotta MT, et al. Nat. Immunol. 2011, 12(9), 870-8]. Mentre la produzione di chinurenine è legata all’attività catalitica dell’enzima, l’invio di segnali alle cellule immuni è associato a modifiche post-trascrizionali di due motivi aminoacidici della sequenza primaria di IDO1, denominati ITIM o Immune Tyrosine Inhibitory Motif [Albini E, et al. J. Cell Mol. Med. 2017, 1, 165-176].
Ad oggi, l’importanza della produzione di chinurenine attraverso l’attività catalitica dell’enzima ha generato lo sviluppo di differenti strategie aventi lo scopo di bloccare detta funzione con composti chimici in grado di inibire l’enzima. Sono note ad esempio le domande di brevetto WO2010005958, WO2016181349 e WO2012142237 concernenti inibitori di IDO1, ossia composti chimici che mirano a ridurre la produzione di chinurenine ed arrestare la crescita tumorale e che attualmente sono giunti in fase avanzata di sperimentazione clinica.
Secondo la domanda di brevetto EP0021806A1, analoghi 2,3 diidro-imidazo [2,1-b] benzotiazolici sembrerebbero esercitare attività farmacologica antidepressiva ed antiParkinson, agendo come inibitori dell’enzima monoamino ossidasi (MAO). La pubblicazione scientifica di Smith et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 20 (2012), 1354– 1363, descrive l’identificazione e caratterizzazione biologica di alcuni analoghi 2,3 diidro-imidazo [2,1-b] benzotiazolici come deboli inibitori dell’attività catalitica di IDO (IC50 per IDO1=50 µM). In questa pubblicazione, gli analoghi 2,3 diidro-imidazo [2,1-b] benzotiazolici vengono studiati come possibili inibitori della crescita tumorale.
I presenti inventori hanno ora sorprendentemente trovato che certi analoghi 2,3 diidro-imidazo [2,1-b] benzotiazolici sono in grado di legare l’enzima IDO1 e di modulare la sua funzione segnale specificatamente mediata dai motivi aminoacidici ITIM, riprogrammando così le difese immunitarie verso effetti di immunotolleranza.
Questo risultato è sorprendente in quanto né nella domanda di brevetto EP0021806A1, né nella pubblicazione scientifica di Smith et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 20 (2012), 1354– 1363, né in altre pubblicazioni è riportato alcun dato sperimentale riguardo alla possibile attività di questi composti nel modulare la funzione di segnale mediata dai motivi ITIM di IDO1 in vitro e/o in vivo. Alla luce della tecnica nota non era pertanto prevedibile la loro efficacia come agenti farmacologici contro le malattie autoimmunitarie in cui IDO1 gioca un ruolo importante.
Un aspetto della presente invenzione è rappresentato quindi dai composti di Formula (I) per l’impiego nel trattamento di malattie autoimmunitarie, preferibilmente la sclerosi multipla e il diabete giovanile. I composti di Formula (I) rappresentano un’alternativa vantaggiosa ai pochi approcci terapeutici ad oggi noti per il trattamento di queste patologie croniche.
La Formula (I) è qui di seguito illustrata:
Formula (I)
in cui:
X è scelto dal gruppo che consiste di S, O, N-R; R è scelto dal gruppo che consiste di idrogeno, alchile, cicloalchile, arile e eteroarile;
Y è C oppure N;
R1, R2, R3 e R4 sono indipendentemente scelti dal gruppo che consiste di idrogeno, alogeno, alchile, cicloalchile, idrossile, alchilossi, arilossi, αidrossiarile-metile, amino, mono e dialchile-amino, mono, di- e trialogeno alchile-amino, alchenilamino, alchinilamino, (arile alchile) amino, (mono- e di(alchil)amino-alchil)amino, alcanoil-amino, N-(alchil)-alcanoilamino, aminocarbonilamino, (1-alchil-4-piperidinil)amino, cicloalchilamino, acetamidil, sulfonoetilamino, alchil e cicloalchil sulfamidil, sulfonile;
R5 e R7 sono indipendentemente scelti fra idrogeno e alchile;
R6 e R8 sono indipendentemente scelti dal gruppo che consiste di idrogeno, alchile, arile, arilalchile, alchilossile alchile, arilossile alchile;
in cui alchile è un composto avente 1, 2, 3, o 4 atomi di carbonio; cicloalchile è un composto avente 3, 4, 5, o 6 atomi di carbonio; alchenile è un composto avente 2, 3, o 4 atomi di carbonio; alchinile è un composto avente 2, 3, o 4 atomi di carbonio; alcanoile è un composto avente 1, 2, 3, o 4 atomi di carbonio.
In una forma di realizzazione preferita, i composti per l’impiego nel trattamento di malattie autoimmunitarie, preferibilmente sclerosi multipla e diabete giovanile, sono rappresentati dalla Formula (II):
Formula (II)
in cui:
R1, R2, R3 e R4 sono indipendentemente scelti dal gruppo che consiste di idrogeno, alogeno, alchile, cicloalchile, idrossile, alchilossi, arilossi, αidrossiarile-metile, amino, mono e dialchile-amino, mono, di- and trialogeno alchile-amino, alchenilamino, alchinilamino, (arile alchile) amino, (mono- e di(alchil)amino-alchil)amino, alcanoil-amino, N-(alchil)-alcanoilamino, aminocarbonilamino, (1-alchil-4-piperidinil)amino, cicloalchilamino, acetamidil, sulfonoetilamino, alchil e cicloalchil sulfamidil, sulfonile;
R5 e R7 sono indipendentemente scelti fra idrogeno e alchile;
R6 e R8 sono indipendentemente scelti dal gruppo che consiste di idrogeno, alchile, arile, arilalchile, alchilossile alchile, arilossile alchile;
in cui alchile è un composto avente 1, 2, 3, o 4 atomi di carbonio;
cicloalchile è un composto avente 3, 4, 5, o 6 atomi di carbonio;
alchenile è un composto avente 2, 3, o 4 atomi di carbonio;
alchinile è un composto avente 2, 3, o 4 atomi di carbonio;
alcanoile è un composto avente 1, 2, 3, o 4 atomi di carbonio.
In un’altra forma di realizzazione preferita, i composti per l’impiego nel trattamento di malattie autoimmunitarie, preferibilmente sclerosi multipla e diabete giovanile, sono rappresentati dalla Formula (III):
Formula (III)
in cui:
R1, R2, R3 e R4 sono indipendentemente scelti dal gruppo che consiste di idrogeno, alogeno, alchile, cicloalchile, idrossile, alchilossi, arilossi, αidrossiarile-metile, amino, mono e dialchile-amino, mono, di- e trialogeno alchile-amino, alchenilamino, alchinilamino, (arile alchile) amino, (mono- e di(alchil)amino-alchil)amino, alcanoil-amino, N-(alchil)-alcanoilamino, aminocarbonilamino, (1-alchil-4-piperidinil)amino, cicloalchilamino, acetamidil, sulfonoetilamino, alchil e cicloalchil sulfamidil, sulfonile;
R5 e R6 sono indipendentemente scelti dal gruppo che consiste di idrogeno, alchile, arile, arilalchile, alchilossile alchile, arilossile alchile;
in cui alchile è un composto avente 1, 2, 3, o 4 atomi di carbonio;
cicloalchile è un composto avente 3, 4, 5,o 6 atomi di carbonio;
alchenile è un composto avente 2, 3, o 4 atomi di carbonio;
alchinile è un composto avente 2, 3, o 4 atomi di carbonio;
alcanoile è un composto avente 1, 2, 3, o 4 atomi di carbonio.
Un secondo aspetto dell’invenzione è una composizione farmaceutica comprendente o consistente in almeno un composto chimico della Figura (I), (II) o (III), come definiti sopra, come principio attivo, in associazione con uno o più coadiuvanti e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili, per l’impiego nel trattamento terapeutico di malattie autoimmuni, preferibilmente sclerosi multipla e diabete giovanile.
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure e tabelle allegate, in cui:
la Figura 1 mostra la formula di struttura generale (Formula (I)) dei composti chimici per l’impiego secondo la presente invenzione;
la Figura 2 mostra l’analisi computazionale di traiettorie di dinamica molecolare della struttura IDO1 che ha portato all’identificazione di due conformazioni dell’enzima (Conformazione-A e Conformazione-B) associate in maniera specifica alla sua attività catalitica (Conformazione-A) e di segnale (Conformazione-B);
la Figura 3 mostra la curva di interazione concentrazione-dipendente tra il composto 338954-DIDO rientrante nell’ambito della Formula (I) e l’enzima IDO1 ottenuta da studi di termoforesi in microscala;
la Figura 4 mostra i risultati della somministrazione del composto 338954-DIDO in un modello di ipersensibilità cutanea indotta. Il composto 338954-DIDO è in grado di esercitare un effetto immunitario tollerogenico attraverso un meccanismo IDO1 dipendente;
la Figura 5 mostra l’abilità del composto 338954-DIDO di migliorare in maniera dosedipendente lo score clinico in un modello di encefalopatia sperimentale autoimmune (EAE);
la Tabella 1 mostra i risultati di inibizione del composto 338954-DIDO sull’attività enzimatica di IDO1 wild type (adottante la conformazione-A) e IDO1 mutato sui residui ITIM (adottante preferibilmente la conformazione-B).
L’invenzione è stata conseguita mediante un’analisi computazionale condotta sulle strutture cristallizzate dell’enzima IDO1, in cui è stato possibile identificare due conformazioni dell’enzima (Conformazione-A e Conformazione-B, Figura 2) associate in maniera specifica alla sua attività catalitica (Conformazione-A) e di segnale (Conformazione-B).
Esperimenti di mutagenesi sito-diretta su aminoacidi della sequenza primaria di IDO1, importanti per la stabilità energetica di tali conformazioni, hanno quindi permesso di generare due linee cellulari esprimenti stabilmente l’enzima adottante preferibilmente la conformazione-A (IDO1 wild type), oppure l’enzima adottante preferibilmente la conformazione-B (IDO1 mutato sui residui ITIM).
Le suddette linee cellulari sono state poi impiegate per campagne di screening in vitro di librerie contenenti composti chimici a basso peso molecolare, volte all’identificazione di entità chimiche in grado di legare l’enzima adottante preferibilmente la conformazione-B (con funzione di segnale). Da tali studi è emerso come i composti chimici di Formula (I) sono in grado di interagire in maniera selettiva con la conformazione-B di IDO1.
Nella parte sperimentale che segue è riportata a titolo esemplificativo ma non limitativo la caratterizzazione biologica e farmacologica del composto 338954-DIDO, che rappresenta un composto particolarmente preferito rientrante nella Formula (I).
338954-DIDO
Parte sperimentale
Risultati
Studi biofisici attraverso la metodologia di termoforesi in microscala hanno evidenziato l’interazione diretta del suddetto composto verso l’enzima IDO, rivelando una costante di dissociazione KD=20µM (Figura 3).
Studi di inibizione dell’attività catalitica di produzione delle chinurenine da parte del composto 338954-DIDO su linee cellulari esprimenti l’enzima adottante la conformazione-A (attività catalitica) hanno evidenziato l’assenza di attività inibitoria (IC50 per IDO1 Conformazione-A>100µM, Tabella 1).
D’altra parte, studi di inibizione del composto 338954-DIDO su linee cellulari esprimenti l’enzima adottante la conformazione-B (con funzione di segnale) hanno evidenziato la presenza di attività inibitoria (IC50 per IDO Conformazione-B=5.01µM), evidenziando dunque la capacità del composto di interagire in maniera specifica con la conformazione-B di IDO1 associata alla funzione di segnale mediata dai motivi ITIM.
Sulla base di questi risultati, il composto 338954-DIDO è stato successivamente caratterizzato in saggi farmacologici in vivo di risposta immunitaria indotta (test di ipersensibilità ritardata, saggio DTH).
In dettaglio, una risposta infiammatoria è indotta in due gruppi di topi femmine di ceppo C57BL/6 attraverso la somministrazione per via endovenosa di cellule dendritiche CD8- ed un 5% di cellule dendritiche plasmacitoidi esprimenti IDO1 nel primo gruppo (IDO1+/+ pDCs), o di un 5% di cellule dendritiche plasmacitoidi prive di espressione per IDO1 nel secondo gruppo (IDO1-/-pDCs), entrambe pulsate con il peptide HY, debolmente immunogenico. Le cellule plasmacitoidi sono state inoltre incubate con il composto 338954-DIDO o il solo veicolo prima della somministrazione. A seguito di due settimane, i topi vengono inoculati nel cuscinetto plantare della zampa con il peptide HY in assenza di cellule dendritiche mentre la zampa sinistra riceve il solo veicolo. Dopo 24 ore, gli animali vengono sacrificati e la risposta immunitaria (DTH) è misurata nei due gruppi (riceventi cellule plasmacitoidi pretrattate o non pretrattate con il composto 338954-DIDO) attraverso l’aumento di peso della zampa inoculata con il solo peptide rispetto al veicolo di somministrazione. La Figura 4 mostra come il pretrattamento delle cellule dendritiche plasmacitoidi con il composto 338954-DIDO permetta di indurre una risposta di tolleranza immunitaria all’ipersensibilità cutanea indotta attraverso un meccanismo IDO1 dipendente, in quanto tale effetto è assente nel secondo gruppo di topi trattati con IDO1-/- pDCs.
Sulla base dei dati sopra menzionati, è stata quindi caratterizzata l’efficacia farmacologica del composto 338954-DIDO in un modello animale di sclerosi multipla (modello sperimentale di encefalopatia autoimmune, EAE).
Il composto 338954-DIDO è stato somministrato per via intraperitoneale alle dosi di 10 mg/kg e 30 mg/kg. I risultati riportati in Figura 5 mostrano l’efficacia del composto nel migliorare lo score clinico in maniera dose dipendente.
Materiali e metodi
Studi Computazionali. Studi di dinamica molecolare sono stati condotti tramite l’utilizzo del programma di calcolo Desmond (versione 3.8). In primo luogo intorno alla struttura cristallizzata di IDO1 (codici pdb = 4PK5, pPK6, 2D0T, 2D0U, 4U72, 4U74, 5ETW, 5EK2, 5EK3, 5EK4) è stata costruita una griglia di solvatazione acquosa utilizzando il modello SPC (Simple Point Charge) come solvente all’interno di una forma ortorombica della griglia. Ciò è stato fatto per far avvenire la simulazione in un ambiente che riproduca quello in cui l’enzima agisce in vivo. Si è dunque scelto l’algoritmo a volume e temperatura costanti (NVT), definendo una temperatura di 300,0 K. La durata della simulazione è stata impostata ad un tempo di 100 nanosecondi (ns) campionando ogni ns, ed ottenendo in questo modo 100 modelli conformazionali per ogni traiettoria. Questi modelli sono stati poi impiegati per lo studio di undici descrittori molecolari del sito di legame attraverso l’impiego del programma di calcolo SiteMap. Tali descrittori includono “SiteScore, size, Dscore, volume, exposure, enclosure, contact, phobic, philic, balance, don/acc”. I risultati sono stati analizzati tramite un approccio statistico di analisi delle componenti principali che ha permesso di indentificare due conformazioni rappresentative dell’enzima IDO1 (Conformazione-A e Conformazione-B, Figura 2).
Screening di librerie di composti chimici. Lo screening di librerie di composti chimici sulle conformazioni –A e –B di IDO1 è stato condotto tramite studi di docking molecolare e l’impiego del programma di calcolo Glide. In particolare le conformazioni –A e –B rappresentative di IDO1 sono state prima di tutto trattate con la procedura Protein Preparation Wizard (PPW) del programma; sono state eliminate le molecole di acqua residue; è stato considerato lo stato di ossidazione dell’eme con il Fe<3+>; è stata condotta una ottimizzazione dei parametri geometrici della struttura proteica.
Sulle conformazioni proteiche così ottenute è stata costruita una griglia all’interno della quale sono state ricercate le pose di legame delle molecole contenute nella libreria dei composti. La griglia è stata generata definendo come centro un punto localizzato sulla semiretta con origine sul Fe<3+ >e perpendicolare al piano del gruppo eme, e posto ad una distanza di 2 Å dall’atomo Fe<3+>. Le dimensioni totali della griglia sono state impostate a 20x20x20 Ǻ. Prima di procedere con il docking, le molecole contenute nelle librerie chimiche sono state filtrate eliminando potenziali falsi positivi o composti chimici tossici (filtri PAINS) e le restanti sono state trattate con la procedura Ligprep, dove si è scelto di generare tutte le forme tautomeriche e di ionizzazione in un intervallo di pH=7,0±0,3.
Le molecole in grado di interagire al meglio con la tasca di legame delle conformazioni –A e –B sono state identificate valutando un punteggio energetico con la funzione Gscore-SP (Standard Precision). I composti presentanti un punteggio Gscore-SP<-7,5 kcal/mol sono stati selezionati, acquistati e/o sintetizzati, e quindi testati in un saggio biofisico di termoforesi in microscala. Questo saggio si basa sul fenomeno fisico della termoforesi su scala microscopica.
Si è proceduto con il marcare la proteina ricombinante umana di IDO1 tramite l’utilizzo di un fluoroforo che emette nell’intervallo del rosso (Monolith NT Protein Labeling Kit RED, eccitazione 605–645 nm, emissione 680–685 nm), fornito dalla NanoTemper Technologies; una volta marcato, l’enzima è stato solubilizzato in un buffer con aggiunta di 0,025 % di Tween20, ed è stata preparata una soluzione diluita con concentrazione pari a 100 nM. I composti chimici selezionati sono stati utilizzati alla stessa concentrazione iniziale di 100 µM, in accordo con i valori di KD attesi dai relativi punteggi energetici ottenuti nello studio di docking. La percentuale di solvente DMSO utilizzato è stata ridotta al minimo, in base alla solubilità delle singole molecole.
Per effettuare l’analisi sono state preparate 16 aliquote contenenti 10 µl di IDO1 umano (hIDO1; 50 nM concentrazione finale) e 10 µl della soluzione di composto chimico non marcato; quest’ultimo è stato posto nella prima aliquota alla concentrazione finale suddetta, eseguendo poi diluizioni seriali 1:1 nelle altre quindici aliquote. Per l’analisi di termoforesi sono stati impiegati kit di capillari idrofilici venduti dalla ditta Nanotemper, in cui sono state caricate le sedici aliquote. L’analisi di interazione ligando/proteina nei sedici capillari è stata quindi effettuata tramite lo strumento Monolith NT.115, impostando un LED Power del 20% e un MST Power del 80% (Figura 3).
Saggi cellulari. Le procedure di purificazione per cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC) e cellule dendritiche CD8- (CD8- DC) da topi C57/BL6 sono state riportate precedentemente in letteratura (Grohmann U, et al. J. Exp. Med. 2003; 198: 153–60; Pallotta MT, et al. Nat. Immunol. 2011; 12: 870–8).
Cellule pDCs purificate sono state esposte per 24 ore a 37°C ai composti chimici selezionati dagli studi biofisici di termoforesi in microscala, alla concentrazione di 0,3 µM e 30 µM. Il solo veicolo è stato utilizzato come controllo. Topi C57BL/6 knockout per IDO1 sono stati utilizzati per valutare la IDO1-dipendenza degli effetti dei composti.
L'attività funzionale in cellule tumorali di mastocitoma murino P815 (P1-HTR) di IDO1 è stata misurata in termini di capacità di metabolizzare il triptofano in L-chinurenina, la cui concentrazione è stata misurata mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) in supernatanti di coltura a 16 ore dopo l'aggiunta di 100 µM di triptofano per le ultime 8 ore (Grohmann U., et al. Nat. Immunol. 2002; 3: 1097–101). Nello specifico, cellule P1-HTR sono state coltivate nel mezzo di coltura di Dulbecco modificato da Iscove, con l’integrazione del 10% di FCS. Due linee cellulari di P1-HTR sono state rispettivamente trasfettate mediante elettroporazione con costrutti plasmidici codificanti per IDO1 murino wild type e per il mutante IDO1-Y111F/Y249F murino. Due linee cellulari trasfettate stabili sono state poi ottenute con la selezione di puromicina. Le due linee cellulari alla concentrazione di 0,1 × 10<6 >cellule/ml sono state incubate con diluizioni seriali dei composti chimici, a partire da una concentrazione di 30 μM per 16 ore. Dopo l'incubazione, i supernatanti di colture cellulari sono stati recuperati e la concentrazione di chinurenina è stata rilevata mediante HPLC. Sono state quindi costruite curve dose-risposta da cui è stato ricavato il parametro IC50 per i composti chimici verso IDO1 wild type ed il mutante IDO1-Y111F/Y249F (Tabella 1). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato e ripetuti due volte.
Tabella 1
Saggio di ipersensibilità cutanea indotta (DTH).
Topi femmina C57BL/6, di età compresa tra 8 e 12 settimane, sono stati acquistati da Charles River Breeding Laboratories (Calco, Milano, Italia). Gli animali sono stati alloggiati e nutriti in condizioni specifiche prive di agenti patogeni. Tutti gli studi nei modelli animali sono stati eseguiti conformemente alle linee guida nazionali (A-3143-01) ed alle linee guida del Comitato Etico per l'uso e la cura degli animali dell'Università di Perugia.
Un saggio di test cutaneo è stato usato per misurare l'ipersensibilità di tipo ritardato del complesso maggiore di istocompatibilità di classe I-ristretto in risposta ad una sollecitazione di risposta immunitaria indotta da sensibilizzazione con combinazioni di DCs pulsate con il peptide sintetico HY, come precedentemente descritto (Pallotta MT, et al. Nat. Immunol. 2011; 12: 870– 8), con la componente minoritaria di pDCs pretrattata o non pretrattate per 24 ore con il composto 338954-DIDO, e sfida dopo due 2 settimane con il solo peptide nel cuscinetto plantare della zampa posteriore sinistra mentre la zampa destra riceveva il solo veicolo. Come controllo positivo di stimolo tollerogenico è stata usata la citochina TGF-β a 20 ng/ml al posto del composto 338954-DIDO (Pallotta MT, et al. Nat. Immunol. 2011; 12: 870– 8). Il peptide HY ristretto H-2D<b >(sequenza aminoacidica WMHHNMDLI) contiene l'epitopo immunodominante dell'antigene di trapianto minore specifico per il topo maschio ed è quindi riconosciuto dalle cellule T CD8+ nei topi femmina C57BL/6. La risposta alla sollecitazione di risposta immunitaria nella zampa dei topi trattati con il peptide rispetto a quella con veicolo è stata misurata in termini ponderali dopo 24 ore, ed i risultati sono presentati come il peso della zampa trattata con peptide rispetto a quello della controparte iniettata dal veicolo (Figura 4).
Nel saggio di test di ipersensibilità ritardata, il test di Student è stato utilizzato per l'analisi statistica dei risultati mediante confronto del peso medio delle zampe sperimentali con quello del loro controllo trattate con iniezione di soluzione salina. Sono stati utilizzati almeno sei topi per gruppo di esperimento, come calcolati dall'analisi di potenza per ottenere una potenza di almeno l'80% con un valore di significatività statistica α=0,05.
Modello di encefalopatia autoimmune (EAE). Il modello EAE è stato ottenuto somministrando per via sottocutanea 200 μg di peptide murino di glicoproteina MielinOligoDendrocita (MOG; sequenza MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) emulsionato in 100 μl di adiuvante completo di Freund in topi C57BL/6, di età compresa tra 8 e 12 settimane, come precedentemente descritto (Fallarino F. et al., Nat. Med. 2010; 16, 897-902; Mendel I. et al, Eur. J. Immunol. 1995, 25, 1951-1959. Gli animali sono stati acquistati da Charles River Breeding Laboratories (Calco, Milano, Italia), ed alloggiati e nutriti in condizioni specifiche prive di agenti patogeni. Tutti gli studi nei modelli animali EAE sono stati eseguiti conformemente alle linee guida nazionali (A-3143-01) ed alle linee guida del Comitato Etico per l'uso e la cura degli animali dell'Università di Perugia. Una dose di 200 ng di tossina della pertosse è stata somministrata in 100 ml di soluzione fisiologica di tampone fosfato (PBS) per via intraperitoneale il giorno della vaccinazione (giorno 0) e due giorni dopo. I segni neurologici (paralisi ascendente dalla coda agli arti anteriori) sono durati perlomeno 2 mesi ed hanno infine portato a morte gli animali. Il composto 335984-DIDO è stato sciolto in acqua e somministrato quotidianamente alla dose di 10 mg/kg a partire dal giorno 1. Per valutare la dosedipendenza dell'effetto, il composto 335984-DIDO è stato anche somministrato alla dose di 30 mg/kg. Topi di controllo hanno ricevuto soltanto il veicolo acquoso in assenza di composto 335984-DIDO.

Claims (9)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composto di Formula (I), per l’impiego nel trattamento terapeutico di malattie autoimmunitarie:
    Formula (I) in cui: X è scelto dal gruppo che consiste di S, O, N-R; R è scelto dal gruppo che consiste di idrogeno, alchile, cicloalchile, arile e eteroarile; Y è C oppure N; R1, R2, R3 e R4 sono indipendentemente scelti dal gruppo che consiste di idrogeno, alogeno, alchile, cicloalchile, idrossile, alchilossi, arilossi, αidrossiarile-metile, amino, mono e dialchile-amino, mono, di- e trialogeno alchile-amino, alchenilamino, alchinilamino, (arile alchile) amino, (mono- e di(alchil)amino-alchil)amino, alcanoil-amino, N-(alchil)-alcanoilamino, aminocarbonilamino, (1-alchil-4-piperidinil)amino, cicloalchilamino, acetamidil, sulfonoetilamino, alchil e cicloalchil sulfamidil, sulfonile; R5 e R7 sono indipendentemente scelti fra idrogeno e alchile; R6 e R8 sono indipendentemente scelti dal gruppo che consiste di idrogeno, alchile, arile, arilalchile, alchilossile alchile, arilossile alchile; in cui alchile è un composto avente 1, 2, 3, o 4 atomi di carbonio; cicloalchile è un composto avente 3, 4, 5, o 6 atomi di carbonio; alchenile è un composto avente 2, 3, o 4 atomi di carbonio; alchinile è un composto avente 2, 3, o 4 atomi di carbonio; alcanoile è un composto avente 1, 2, 3, o 4 atomi di carbonio.
  2. 2. Composto per l’impiego secondo la rivendicazione 1, in cui il composto ha la Formula (II):
    Formula (II) in cui: R1, R2, R3 e R4 sono indipendentemente scelti dal gruppo che consiste di idrogeno, alogeno, alchile, cicloalchile, idrossile, alchilossi, arilossi, αidrossiarile-metile, amino, mono e dialchile-amino, mono, di- and trialogeno alchile-amino, alchenilamino, alchinilamino, (arile alchile) amino, (mono- e di(alchil)amino-alchil)amino, alcanoil-amino, N-(alchil)-alcanoilamino, aminocarbonilamino, (1-alchil-4-piperidinil)amino, cicloalchilamino, acetamidil, sulfonoetilamino, alchil e cicloalchil sulfamidil, sulfonile; R5 e R7 sono indipendentemente scelti fra idrogeno e alchile; R6 e R8 sono indipendentemente sclti dal gruppo che consiste di idrogeno, alchile, arile, arilalchile, alchilossile alchile, arilossile alchile; in cui alchile è un composto avente 1, 2, 3, o 4 atomi di carbonio; cicloalchile è un composto avente 3, 4, 5, o 6 atomi di carbonio; alchenile è un composto avente 2, 3, o 4 atomi di carbonio; alchinile è un composto avente 2, 3, o 4 atomi di carbonio; alcanoile è un composto avente 1, 2, 3, o 4 atomi di carbonio.
  3. 3. Composto per l’impiego secondo la rivendicazione 1, in cui il composto ha la Formula (III):
    Formula (III) in cui: R1, R2, R3 e R4 sono indipendentemente scelti dal gruppo che consiste di idrogeno, alogeno, alchile, cicloalchile, idrossile, alchilossi, arilossi, αidrossiarile-metile, amino, mono e dialchile-amino, mono, di- e trialogeno alchile-amino, alchenilamino, alchinilamino, (arile alchile) amino, (mono- e di(alchil)amino-alchil)amino, alcanoil-amino, N-(alchil)-alcanoilamino, aminocarbonilamino, (1-alchil-4-piperidinil)amino, cicloalchilamino, acetamidil, sulfonoetilamino, alchil e cicloalchil sulfamidil, sulfonile; R5 e R6 sono indipendentemente scelti dal gruppo che consiste di idrogeno, alchile, arile, arilalchile, alchilossile alchile, arilossile alchile; in cui alchile è un composto avente 1, 2, 3, o 4 atomi di carbonio; cicloalchile è un composto avente 3, 4, 5,o 6 atomi di carbonio; alchenile è un composto avente 2, 3, o 4 atomi di carbonio; alchinile è un composto avente 2, 3, o 4 atomi di carbonio; alcanoile è un composto avente 1, 2, 3, o 4 atomi di carbonio.
  4. 4. Composto per l’impiego secondo la rivendicazione 1, in cui il composto è
    338954-DIDO
  5. 5. Composto secondo una qualsiasi della rivendicazioni 1 a 4, per l’impiego nel trattamento terapeutico della sclerosi multipla.
  6. 6. Composto secondo una qualsiasi della rivendicazioni 1 a 4, per l’impiego nel trattamento terapeutico del diabete giovanile.
  7. 7. Composizione farmaceutica comprendente almeno un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4 come principio attivo, in associazione con uno o più coadiuvanti e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili, per l’impiego nel trattamento terapeutico di malattie autoimmunitarie.
  8. 8. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 7, per l’impiego nel trattamento terapeutico della sclerosi multipla.
  9. 9. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 7, per l’impiego nel trattamento terapeutico del diabete giovanile.
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