IT201600117339A1

IT201600117339A1 - Apparato a super-risoluzione spaziale per l’analisi in fluorescenza del fondo dell’occhio

Info

Publication number: IT201600117339A1
Application number: IT102016000117339A
Authority: IT
Inventors: Vincenzo Ricco; Raino Ceccarelli; Andrea Latini
Original assignee: Crestoptics S P A
Priority date: 2016-11-21
Filing date: 2016-11-21
Publication date: 2018-05-21
Also published as: WO2018092109A1; US20190320894A1; US10905324B2; EP3541266A1; JP7016361B2; JP2019537486A

Description

APPARATO A SUPER-RISOLUZIONE SPAZIALE PER L’ANALISI IN FLUORESCENZA

DEL FONDO DELL’OCCHIO

La presente invenzione concerne la microscopia in fluorescenza per l’analisi del fondo dell’occhio a fini diagnostici, e riguarda un apparato di microscopia basato sull’uso di un fascio Bessel. Tale apparato di microscopia in fluorescenza consente di eccitare il fondo dell’occhio e di rilevare in super-risoluzione spaziale i segnali di fluorescenza sul fondo dell’occhio, di non limitare l’apertura numerica del fascio di scansione e di ridurre grandemente il rumore presente nelle immagini acquisite, in particolare il livello del rumore di fondo dovuto all’auto-fluorescenza propria dei tessuti intra-oculari rispetto al segnale associato a marcatori utilizzabili per l’identificazione di proteine, o altre specifiche molecole da ricercare nella retina dell’occhio, aumentando di conseguenza la risoluzione delle immagini acquisite in modo semplice, efficiente, affidabile, ed economico.

Negli ultimi decenni la microscopia a fluorescenza, chiamata anche microscopia a campo scuro, è diventata uno strumento fondamentale per l’attività di ricerca in campo biologico. L’uso di coloranti sintetici e, successivamente, delle proteine fluorescenti verdi o GFP (Green Fluorescent Protein) ha permesso di visualizzare con estrema risoluzione l’interno delle cellule sia per analisi morfologiche che funzionali, in quanto le GFP permettono la microscopia in fluorescenza anche in vivo.

Le tecniche confocali, principalmente microscopia confocale a scansione laser (CLSM: Confocal Laser Scanning Microscopy) e microscopia confocale a disco rotante (SDCM: Spinning Disk Confocal Microscopy), e le tecniche di superrisoluzione, quali la microscopia a luce strutturata e le tecniche basate sulla ridotta popolazione di cellule fluorescenti, come ad esempio la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM: Photo-Activated Localization Microscopy) e la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM: Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), hanno permesso un ulteriore passo avanti, dando la possibilità di migliorare la risoluzione laterale “x-y” (nel piano ortogonale all’asse ottico, per cui si assume che gli assi x e y giacciono nel piano del campione) e la risoluzione assiale “z” (lungo l’asse ottico che è ortogonale al piano del campione), e quindi hanno offerto la possibilità di effettuare delle ricostruzioni 3D della cellula con un elevatissimo dettaglio (con risoluzioni che possono arrivare sino a decine di nanometri).

Tuttavia tali tecniche confocali e di super-risoluzione presentano alcuni inconvenienti.

Innanzitutto, lo spessore del campione è limitato (generalmente è difficile effettuare misure su campioni spessi più di 20 micrometri) a causa degli effetti di diffusione dovuti alla torbidità del campione ed al fondo di fluorescenza dovuto ai piani fuori fuoco.

Inoltre, la capacità di risoluzione di entrambe le tecniche è limitata dal rapporto segnale/rumore o S/N, in cui al rumore totale contribuiscono sia il rumore proprio della strumentazione di acquisizione del segnale e del rumore dell’ambiente al contorno, sia il rumore del fondo di fluorescenza dovuto ai piani fuori fuoco ed alla torbidità del campione. In particolare, questo rapporto limita l’utilizzazione di ordini elevati nelle polinomiali che costituiscono l’algoritmo di deconvoluzione utilizzato nei metodi di super-risoluzione in luce strutturata.

Inoltre, poiché il segnale della fluorescenza dei piani fuori fuoco ha la stessa dipendenza del segnale di interesse dalla luce di eccitazione, l’aumento dell’intensità dell’eccitazione o del tempo di esposizione non può migliorare le prestazioni oltre il limite dovuto alla saturazione del sensore di acquisizione, e.g. un sensore a CCD o sCMOS (scientific CMOS).

In questo contesto, viene ad inserirsi la soluzione proposta secondo la presente invenzione che consente di risolvere i succitati problemi delle soluzioni della tecnica anteriore.

Scopo della presente invenzione è, pertanto, quello di aumentare la capacità di penetrazione di un apparato di microscopia in fluorescenza per esaminare un campione spesso quale l’occhio, di aumentare la risoluzione spaziale e di migliorare il rapporto segnale-rumore in modo semplice, efficiente, affidabile, ed economico.

Forma oggetto specifico della presente invenzione un apparato di microscopia in fluorescenza per l’analisi di un fondo di un occhio campione che comprendente:

- un gruppo ottico di generazione configurato per ricevere un fascio luminoso di base da una prima sorgente luminosa e per generare un fascio luminoso di eccitazione;

- un sistema di scansione configurato per ricevere il fascio luminoso di eccitazione dal gruppo ottico di generazione e per far scansionare al fascio luminoso di eccitazione una porzione del fondo dell’occhio campione;

- un gruppo ottico di lancio configurato per ricevere il fascio luminoso di eccitazione dal sistema di scansione e per inviare il fascio luminoso di eccitazione in detta porzione del fondo dell’occhio campione e per collimare almeno parzialmente una radiazione isotropica di molecole fluorescenti dell’occhio campione in un fascio di fluorescenza;

- un dispositivo rivelatore configurato per rilevare il fascio di fluorescenza proveniente dal gruppo ottico di lancio;

- mezzi ottici configurati per trasmettere detto fascio luminoso di eccitazione proveniente dal gruppo ottico di generazione al sistema di scansione e per trasmettere detto fascio di fluorescenza dal gruppo ottico di lancio e proveniente dal sistema di scansione al dispositivo rivelatore;

in cui il gruppo ottico di generazione è configurato per generare un fascio luminoso di eccitazione avente rapporti di fase configurati per comporre detto fascio luminoso di eccitazione, dopo aver attraversato il gruppo ottico di lancio, in un fascio Bessel all’interno dell’occhio campione in corrispondenza di un piano ortogonale ad un asse ottico di propagazione, il gruppo ottico di lancio comprendendo un obiettivo ad una o più componenti ottiche ed essendo configurato per aumentare l’apertura numerica NA dell’occhio campione ad un valore non inferiore a 0,9.

Secondo un altro aspetto dell’invenzione, detto apparato di microscopia in fluorescenza può includere almeno un primo filtro di pulizia a banda stretta configurato per eliminare un fondo di fluorescenza spurio dal fascio luminoso di eccitazione.

Secondo un ulteriore aspetto dell’invenzione, detto obiettivo può essere una lente adattiva singola o doppia, opzionalmente una lente adattiva a contatto.

Secondo un aspetto aggiuntivo dell’invenzione, detto apparato di microscopia in fluorescenza può comprendere un gruppo ottico per formazione di immagini configurato per focalizzare detto fascio di fluorescenza sul dispositivo rivelatore.

Secondo un altro aspetto dell’invenzione, detto dispositivo rivelatore può includere una pluralità di singoli elementi di rilevazione selezionati nel gruppo comprendente fotomoltiplicatori, diodi avalanche, CCD, o SCMOS.

Secondo un ulteriore aspetto dell’invenzione, detto apparato di microscopia in fluorescenza può includere una pluralità di microlenti posizionata a monte del dispositivo rivelatore ognuna delle quali è biunivocamente accoppiata ad un singolo elemento della pluralità di elementi di rilevazione del dispositivo rivelatore.

Secondo un aspetto aggiuntivo dell’invenzione, detto apparato di microscopia in fluorescenza può includere una seconda sorgente luminosa generante un fascio luminoso di eccitazione addizionale configurato per eccitare una porzione addizionale dell’occhio campione, che internamente include detta porzione dell’occhio campione scansionata con il fascio luminoso di eccitazione generato dal gruppo ottico di generazione, detto fascio luminoso di eccitazione addizionale potendo essere configurato per saturare un’auto-fluorescenza di tessuti intraoculari dell’occhio campione.

Secondo un altro aspetto dell’invenzione, detto gruppo ottico di generazione può includere un filtro ottico statico di fase posto nel piano di Fourier del gruppo ottico di lancio, opzionalmente un grating bidimensionale realizzato con strati dielettrici multipli, più opzionalmente una lente axicon, ancora più opzionalmente una maschera di fase.

Secondo un ulteriore aspetto dell’invenzione, detto gruppo ottico di generazione può includere un modulatore spaziale di luce, opzionalmente un modulatore spaziale di luce di fase oppure un modulatore spaziale di luce di ampiezza seguito da una lente di Fourier.

Secondo un aspetto aggiuntivo dell’invenzione, detto gruppo di scansione può includere un primo ed un secondo wedge configurati per ruotare in modo indipendente mediante due motori separati, configurati per essere comandati in modo sincrono, in cui i due wedge hanno opzionalmente una risoluzione di posizione angolare pari ad almeno 1/50 di grado, per cui una risoluzione di scansione è pari ad almeno un microradiante su un campo di ± 1°.

Secondo un altro aspetto dell’invenzione, detto apparato di microscopia in fluorescenza può includere un sistema di formazione dell’immagine a campo largo operante nel vicino infrarosso (NIR, near infrared) per formare immagini di strutture sub-retinali dell’occhio campione ed un mezzo ottico addizionale, posizionato tra il sistema di scansione ed il gruppo ottico di lancio, detto mezzo ottico addizionale essendo configurato per essere trasparente a radiazione nel vicino infrarosso e per riflettere il fascio luminoso di eccitazione dal sistema di scansione verso il gruppo ottico di lancio ed il fascio luminoso di fluorescenza dal gruppo ottico di lancio verso il sistema di scansione, il sistema comprendendo altresì:

- una terza sorgente luminosa configurata per generare un primo fascio luminoso NIR da inviare a detto mezzo ottico addizionale;

- un dispositivo rivelatore NIR configurato per rilevare un secondo fascio luminoso NIR riflesso da strutture sub-retinali dell’occhio campione e proveniente dal mezzo ottico addizionale, opzionalmente un sensore a CCD od un sensore a SCMOS, il dispositivo rivelatore NIR essendo opzionalmente configurato per operare ad una frequenza non inferiore a 100 frame/sec;

- mezzi ottici NIR configurati per trasmettere detto primo fascio luminoso NIR dalla terza sorgente luminosa a detto mezzo ottico addizionale e detto secondo fascio luminoso NIR riflesso proveniente da detto mezzo ottico addizionale al dispositivo rivelatore NIR.

Secondo un ulteriore aspetto dell’invenzione, detto sistema di formazione dell’immagine può includere un gruppo ottico per la formazione di immagini configurato per focalizzare il secondo fascio luminoso NIR sul dispositivo rivelatore NIR.

Secondo un aspetto aggiuntivo dell’invenzione, detto apparato può includere almeno un secondo filtro di pulizia a banda stretta configurato per eliminare un fondo di fluorescenza spurio da detto primo fascio luminoso NIR.

L’invenzione è basata sull’utilizzazione di un’ottica per la generazione di un fascio Bessel posta dietro un obiettivo configurato per aumentare l’apertura numerica di un assieme “obiettivo – cornea – cristallino” mediante la riduzione della focale complessiva dell’apparato di microscopia in fluorescenza.

Caratteristiche fondamentali di un fascio Bessel sono la sua propagazione priva di divergenza (almeno per il percorso interno all’occhio umano pari a circa 24 mm), il diametro del fascio che può essere contenuto in λ/2 (dipende dall’apertura numerica del sistema ottico che lo genera), dove λ è la lunghezza d'onda del fascio, la capacità di rigenerarsi dopo l’eventuale interferenza con elementi scatteranti come quelli presenti in un fluido torbido. Ciò consente di ottenere significativi vantaggi rispetto alla tecnica anteriore, e.g. permettendo all’apparato della presente invenzione di avere un’elevata risoluzione spaziale angolare con cui può essere scansionato il fondo dell’occhio e con cui può essere risolta angolarmente la presenza di un area di fluorescenza. Un’ulteriore vantaggio della presente invenzione è quello di consentire la realizzazione di una mappatura di aree di fluorescenza e di misurare la dimensione di dette aree di fluorescenza, se tali aree sono maggiori del diametro del fascio di Bessel, o di definirle come sub-diffrazione, i.e. pari o minori al diametro del fascio. Ancora un altro vantaggio della presente invenzione è quello di consentire una scansione angolare di un intero fondo oculare o di un’area pari a 2-3 volte quella della fovea centrale.

La presente invenzione verrà ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue preferite forme di realizzazione, con particolare riferimento alle Figure dei disegni allegati, in cui:

la Figura 1 mostra uno schema di una prima forma di realizzazione dell’apparato di microscopia in fluorescenza per l’analisi del fondo dell’occhio secondo l’invenzione;

la Figura 2 mostra uno schema di una seconda forma di realizzazione dell’apparato di microscopia in fluorescenza per l’analisi del fondo dell’occhio secondo l’invenzione;

la Figura 3 mostra uno schema di una terza forma di realizzazione dell’apparato di microscopia in fluorescenza per l’analisi del fondo dell’occhio secondo l’invenzione;

la Figura 4 mostra uno schema di una quarta forma di realizzazione dell’apparato di microscopia in fluorescenza per l’analisi del fondo dell’occhio secondo l’invenzione;

le Figure 5 e 6 mostrano schemi di gruppi ottici di generazione di alcune forme di realizzazione dell’apparato di microscopia in fluorescenza per l’analisi del fondo dell’occhio secondo l’invenzione;

la Figura 7 mostra schemi di sistemi di scansione angolari di alcune forme di realizzazione dell’apparato di microscopia in fluorescenza per l’analisi del fondo dell’occhio secondo l’invenzione.

Nelle Figure numeri di riferimento identici saranno utilizzati per elementi analoghi.

La Figura 1 mostra schematicamente una prima forma di realizzazione dell’apparato di microscopia in fluorescenza per l’analisi del fondo dell’occhio secondo l’invenzione, indicata in generale con il numero di riferimento 100. L’apparato 100 di microscopia in fluorescenza comprende una prima sorgente luminosa 1, a laser, di lunghezza d’onda λ tale da eccitare eventuali molecole fluorescenti presenti in un fondo di un occhio campione 7. Tale prima sorgente luminosa 1 invia, tramite aria o fibra ottica, un fascio luminoso di base ad un gruppo ottico 2 di generazione di un fascio Bessel configurato per generare un fascio luminoso di eccitazione della fluorescenza con rapporti di fase tali che, attraversando un opportuno gruppo ottico 19 di lancio, dopo alcuni millimetri dal cristallino 8 dell’occhio campione 7 detto fascio luminoso di eccitazione si comporrà in un fascio Bessel (almeno all’interno di un intervallo spaziale, lungo l’asse ottico, che comprende il fondo dell’occhio campione 7), i.e. un fascio che si propaga senza diffrangere e diffondere e che ha la proprietà di autorigenerarsi dopo l’interferenza con elementi scatteranti, come quelli che possono essere incontrati in un fluido torbido dell’occhio campione 7. In particolare, il fascio luminoso di eccitazione si comporrà in un fascio Bessel su distanze lungo l’asse di propagazione del fascio (asse z) maggiori di almeno 10 ·zR, dove zR è la lunghezza di Rayleigh che è inversamente proporzionale all’apertura numerica (NA - Numerical Aperture) del sistema:

zR∝ λ/(pi·NA<2>)

Il fascio luminoso di eccitazione attraversa (almeno) un primo filtro 3 di pulizia a banda stretta, configurato per eliminare dal fascio luminoso di eccitazione lunghezze d’onda dovuta ad altre sorgenti ed un fondo di fluorescenza spurio che può essere generato dalla luce laser nei componenti ottici attraversati (fibre ottiche, lenti o altro), e prosegue fino ad un primo filtro dicroico 4 configurato per riflettere il fascio luminoso di eccitazione verso un sistema 5 di scansione configurato per variare la posizione del fascio luminoso di eccitazione su un piano “x-y” ortogonale all’asse ottico di propagazione del fascio luminoso di eccitazione (asse z) ed effettuare in tal modo una scansione di un piano del fondo dell’occhio campione (7) .

Il fascio luminoso di eccitazione emerge dal sistema 5 di scansione ed attraversa il gruppo ottico 19 di lancio che include un obiettivo ad una o più componenti ottiche, configurate per minimizzare le aberrazioni ottiche, e che include altresì (durante il funzionamento dell’apparato secondo l’invenzione, ovvero quando l’apparato secondo l’invenzione è applicato all’occhio campione 7) la cornea ed il cristallino 8 dell’occhio campione 7. Nella preferita forma di realizzazione, l’obiettivo è una lente adattiva che può essere una lente singola o doppia (come quella indicata con il numero di riferimento 6 in Figura 1), opzionalmente una lente adattiva a contatto con l’occhio campione 7 (come quella indicata con il numero di riferimento 6’ in Figura 2). Tale gruppo ottico 19 di lancio è configurato per comporre il fascio luminoso di eccitazione in un fascio Bessel all’interno dell’occhio campione 7 in corrispondenza di un piano A parallelo al piano “x-y” ortogonale all’asse ottico “z” posizionato tra il cristallino 8 ed il fondo dell’occhio campione 7, opzionalmente posizionato sul fondo dell’occhio campione 7.

L’obiettivo 6 (o 6’) è posto in prossimità dell’occhio ed è configurato per aumentare l’apertura numerica NA dell’occhio da NA pari a circa 0,2 (NA ~ 0,2) a NA maggiore di 0,9 (NA > 0,9). L’apertura numerica è infatti definita come NA=n·sin(r/f)

dove n è l’indice di rifrazione del mezzo, r è il raggio del fascio incidente e f è la lunghezza focale effettiva del gruppo ottico 19 di lancio. Tale configurazione dell’obiettivo 6 (o 6’) è fondamentale per aumentare la risoluzione spaziale del sistema che dipende dal diametro del fascio luminoso di eccitazione ed è quindi funzione dell’apertura numerica del sistema ottico 2 che genera tale fascio, poiché il sistema deve fornire potenzialmente una risoluzione pari a λ/2, dove λ è la lunghezza d’onda della prima sorgente luminosa 1, opzionalmente pari a λ/4 utilizzando tecniche di sovra-campionamento di una scansione e utilizzando algoritmi quali quelli di deconvolunzione applicati al sovra-campionamento. Un fascio Bessel ha una dimensione trasversale rispetto alla direzione di propagazione pari a circa λ/(2·NA), per cui con un NA=1 si ha un diametro di circa λ/2. Poiché un fascio Bessel si propaga senza divergenza e permette di raggiungere un diametro pari a λ/2, tale valore risulta essere anche la risoluzione angolare α/β nel piano “x-y” con cui può essere scansionato un piano del fondo dell’occhio campione 7.

In presenza di sorgenti contenute nel fondo dell’occhio, quali ad esempio proteine, marcate con molecole fluorescenti, quali ad esempio la curcumina qui indicata a puro titolo esplicativo, la molecola fluorescente emette una radiazione isotropica, di lunghezza d’onda maggiore di quella del fascio luminoso di eccitazione, che attraverserà in parte il gruppo ottico 19 emergendone come un fascio luminoso di fluorescenza. Il primo filtro dicroico 4 è configurato per trasmettere il fascio luminoso di fluorescenza, verso un filtro 9 di emissione interferenziale che consente di massimizzare la sensibilità dell’apparato rispetto alla lunghezza d’onda della fluorescenza dovuta a specifici marcatori rispetto all’autofluorescenza dei tessuti intraoculari e al fondo residuo dovuto allo scattering e/o alle riflessioni del fascio luminoso di eccitazione.

Dopo aver attraversato il filtro 9 di emissione interferenziale, il fascio di fluorescenza attraversa un gruppo ottico 10 per la formazione dell’immagine (indicato nelle Figure 1-3 per semplicità come una singola lente) configurato per compensare gli effetti del gruppo ottico 19 e focalizzare il fascio di fluorescenza su un dispositivo rivelatore 11, che è configurato per rilevare l’intensità del fascio di fluorescenza per ogni posizione angolare α/β in cui il fascio luminoso di eccitazione emerge dal sistema 5 di scansione corrispondente ad una posizione x/y sulla retina dell’occhio campione 7. Si ottiene quindi un immagine per composizione dei segnali ottenuti su ogni singola posizione del sistema 5 di scansione e quindi è un immagine calcolata numericamente (per ogni posizione α/β, corrispondente ad una posizione x/y della retina, si legge il segnale di intensità della fluorescenza e quindi si esegue una mappatura delle posizioni x/y e dell’intensità così da ricostruire un immagine bidimensionale). Tale dispositivo rivelatore 11 può includere un singolo elemento di rivelazione, come ad esempio un singolo fotomoltiplicatore o un singolo diodo avalanche, o in alternativa una pluralità di elementi di rivelazione, come ad esempio una pluralità di fotomoltiplicatori o una pluralità di diodi avalanche, configurata per ottenere informazioni sulla distribuzione spaziale del fascio di fluorescenza atte a migliorar la risoluzione in un piano “x-y” e a definire la posizione longitudinale (asse “z”) della molecola che ha emesso la fluorescenza attraverso l’utilizzo di algoritmi mutuati dalla microscopia confocale.

La Figura 3 mostra schematicamente una terza forma di realizzazione dell’apparato di microscopia in fluorescenza secondo l’invenzione, in cui il rivelatore 11 per la formazione dell’immagine include una pluralità di elementi di rivelazione ognuno dei quali è biunivocamente accoppiato ad una singola microlente di una pluralità 13 di microlenti che costituiscono una maschera di filtraggio spaziale. Opzionalmente, il rivelatore 11 per la formazione dell’immagine della terza forma di realizzazione schematizzata in Figura 3 è realizzato utilizzando un sensore a matrice tipo CCD o SCMOS. Detta terza forma di realizzazione è configurata per rilevare segnali di fluorescenza emessi da marcatori posti nell’occhio campione 7 in corrispondenza di specifiche posizioni dell’asse “z”. La distribuzione del campo luminoso nel piano di Fourier intercettato dalla pluralità di microlenti o in un piano intermedio tra il piano di Fourier e quello focale (i.e. piano immagine), permette, attraverso l’analisi di Fourier delle frequenze spaziali o altri algoritmi che mettono in relazione tra loro le intensità di segnale tra i singoli rivelatori o i pixel della matrice CCD o SCMOS, di ricavare non solo l’informazione di intensità della fluorescenza, ma anche quella relativa alla posizione in “z” della sorgente, per cui l’apparato della presente invenzione permette di ricostruire una mappatura 3D delle molecole fluorescenti.

Opzionalmente, le forme di realizzazione fin qui descritte possono prevedere una seconda sorgente luminosa (non mostrata nelle Figure) in parallelo alla prima sorgente luminosa 1, generante un fascio luminoso di eccitazione addizionale configurato per eccitare una porzione addizionale dell’occhio campione 7 più grande rispetto a quella scansionata con il fascio luminoso di eccitazione che si compone nel fascio Bessel (ad esempio 100x100 volte più grande) e che include tale porzione scansionata, in modo da saturare l’auto-fluorescenza dei tessuti intraoculari. Infatti, l’auto-fluorescenza dei tessuti intraoculari ha un tempo di decadimento molto rapido rispetto a quello della fluorescenza di marcatori utilizzabili per l’identificazione di proteine, o altre specifiche molecole da ricercare nella retina, per cui è possibile utilizzare una prima esposizione con campo più largo per saturare l’auto-fluorescenza di una determinata porzione di scansione e poi analizzare la porzione con un fascio Bessel di eccitazione al fine di farne una mappatura super-risolta (i.e. λ /2, opzionalmente λ/4). In altre parole, l’autofluorescenza una volta eccitata si satura e richiede un tempo di rigenerazione molto più lungo di quello di decadimento di un marcatore, per cui è possibile eccitare una porzione con un singolo impulso di luce non focalizzato e poi scansionare la porzione saturata priva di auto-fluorescenza con un fascio Bessel. In una preferita forma di realizzazione della presente invenzione, la seconda sorgente luminosa parallela alla prima sorgente luminosa 1 è attivata periodicamente con un singolo impulso con un periodo pari al tempo di decadimento dell’autofluorescenza dei tessuti intraoculari.

La Figura 4 mostra schematicamente una quarta forma di realizzazione dell’apparato di microscopia in fluorescenza secondo l’invenzione, in cui l’apparato 100’ comprende un sistema 400 di formazione dell’immagine a campo largo operante nel vicino infrarosso (NIR, near infrared) per la formazione dell’immagine di strutture sub-retinali dell’occhio campione 7, che è configurato per ottenere un riferimento spaziale per il sistema 5 di scansione, riferendo la posizione del fascio luminoso di eccitazione ad un punto notevole, quale la posizione del nervo ottico o di una struttura identificabile dei vasi sanguinei dell’occhio campione 7. In questa quarta forma di realizzazione della presente invenzione, il fascio luminoso di eccitazione emergente dal sistema 5 di scansione prosegue fino ad un secondo filtro dicroico 12 configurato per riflettere il fascio luminoso di eccitazione verso il gruppo ottico 19 di lancio e per riflettere il fascio luminoso di fluorescenza emergente dal gruppo ottico 19 di lancio verso il sistema 5 di scansione. Il secondo filtro dicroico 12 è altresì configurato per trasmettere un primo fascio di luce NIR (i.e., nella banda del vicino infrarosso - Near Infrared – avente lunghezza d’onda variabile da 0,78 a 3 micrometri) emergente dal sistema 400 verso l’occhio campione 7 attraverso il gruppo ottico 19 di lancio ed un secondo fascio di luce NIR riflesso da strutture sub-retinali dell’occhio campione 7 e passante attraverso il gruppo ottico 19 di lancio verso il sistema 400.

Il sistema 400 di formazione dell’immagine a campo largo operante nel vicino infrarosso include una terza sorgente luminosa 29 che genera il primo fascio di luce NIR che attraversa un secondo filtro 14 di pulizia e prosegue fino ad un terzo filtro dicroico 15 configurato per riflettere il primo fascio di luce NIR, attraverso il secondo filtro dicroico 12 ed il gruppo ottico 19 di lancio, verso l’occhio campione 7. Strutture sub-retinali dell’occhio campione 7 riflettono la luce NIR in modo tale che un secondo fascio di luce NIR riflesso torna indietro, attraversando il gruppo ottico 19 di lancio, verso il secondo filtro dicroico 12, che lo trasmette al terzo filtro dicroico 15, che è a sua volta configurato per trasmettere detto secondo fascio di luce NIR riflesso verso un secondo filtro 16 di emissione interferenziale, che consente di massimizzare la sensibilità del dispositivo rispetto alla lunghezza d’onda del secondo fascio di luce NIR riflesso. Dopo aver attraversato il secondo filtro 16 di emissione interferenziale, il secondo fascio di luce NIR riflesso attraversa una terza lente 17 per la formazione dell’immagine che lo focalizza su un dispositivo rivelatore NIR 18 per la formazione dell’immagine, opzionalmente un sensore a CCD od un sensore a SCMOS.

Opzionalmente, il dispositivo rivelatore NIR 18 è fatto funzionare ad una frequenza per la formazione dell’immagine di almeno 100 frame/sec al fine di fornire un’indicazione numerica della deriva della posizione dell’occhio e quindi di calcolare dalla sequenza delle immagini un inseguimento dell’area sotto osservazione, così da compensare i dati di posizione angolare del fascio luminoso di eccitazione.

Il gruppo ottico 2 di generazione di un fascio Bessel dell’apparato secondo l’invenzione può vantaggiosamente includere un filtro ottico statico di fase posto nel piano di Fourier del gruppo ottico 19 di lancio quale un grating bidimensionale realizzato con strati dielettrici multipli, opzionalmente una lente axicon 21, ancora più opzionalmente una maschera 22 di fase come mostrato schematicamente in Figura 5A e 5B rispettivamente.

Alternativamente, il gruppo ottico 2 di generazione di un fascio Bessel dell’apparato secondo l’invenzione può vantaggiosamente includere un filtro ottico dinamico posto nel piano di Fourier del gruppo ottico 19 di lancio quale un modulatore spaziale di luce (SLM, Spatial Light Modulator) che può essere un modulatore SLM 23 di fase del fascio emesso dalla prima sorgente luminosa 1 o un modulatore SLM 24 di ampiezza del fascio emesso dalla prima sorgente luminosa 1 seguito da (ovvero posizionato a monte di) una lente 25 di Fourier che consente di fare la trasformata di Fourier del campo del fascio luminoso uscente dal modulatore SLM 24, come mostrato schematicamente nelle Figura 6A e 6B rispettivamente.

Le Figure 5 e 6 mostrano schematicamente la composizione del fascio luminoso di eccitazione in un fascio Bessel in corrispondenza di un piano A posizionato tra il cristallino 8 ed il fondo dell’occhio campione 7, opzionalmente posizionato sul fondo di un occhio campione 7, essendo il piano A ortogonale alla direzione del fascio luminoso di eccitazione (i.e., ortogonale all’asse ottico, indicato anche come asse z).

Il sistema 5 di scansione dell’apparato secondo l’invenzione può essere di tipo standard, quale ad esempio un sistema di scansione con specchi galvanometrici 26 di cui la Fig. 7A mostra schematicamente un esempio. Nella preferita forma di realizzazione, il sistema 5 di scansione del fascio Bessel, mostrato schematicamente in Fig. 7B, include un primo ed un secondo wedge (filtri a cuneo, indicati con i numeri di riferimento 27 e 28) configurati per ruotare in modo indipendente in modo che lo sfasamento reciproco della rotazione permetta differenti figure di scansione dell’occhio campione 7. In particolare, la proprietà dei due wedge 27 e 28 del sistema 5 di scansione di ruotare indipendentemente fa sì che la loro posizione reciproca e l’eventuale differenza nella loro velocità di rotazione (in modo continuo o a scatti) permettono di realizzare figure di scansione differenti, quali ad esempio a spirale, a cerchi concentrici o pseudo casuali. Nella preferita forma di realizzazione, il movimento dei due wedge 27 e 28 è generato mediante due motori separati, comandati in modo sincrono con una risoluzione sulla posizione angolare dei due wedge 27 e 28 pari ad almeno 1/50 di grado, per cui la risoluzione della scansione è pari ad almeno un microradiante su un campo di ± 1°. Tale sistema 5 di scansione permette di minimizzare la distanza tra il sistema ottico 2 di generazione del fascio Bessel e la superficie esterna dell’occhio campione 7 (i.e. la superficie esterna della cornea) senza limitare l’apertura numerica del sistema ottico 2 di generazione di un fascio Bessel e in particolare permette di realizzare scansioni estremamente precise per piccoli angoli in quanto dipendenti dall’angolo dei wedge 27 e 28, dall’indice di rifrazione del vetro usato e dall’angolo di rotazione; infine, la mancanza di moto alterno (presente nei sistemi di scansione con specchi galvanometrici) elimina vibrazioni che possono ridurre la qualità e la precisione dell’immagine ottenuta come risultato della scansione.

In quel che precede sono state descritte le preferite forme di realizzazione e sono state suggerite delle varianti della presente invenzione, ma è da intendersi che gli esperti del ramo potranno apportare modificazioni e cambiamenti senza con ciò uscire dal relativo ambito di protezione, come definito dalle rivendicazioni allegate.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Apparato (100; 100’) di microscopia in fluorescenza per l’analisi di un fondo di un occhio campione (7) comprendente: - un gruppo ottico (2) di generazione configurato per ricevere un fascio luminoso di base da una prima sorgente luminosa (1) e per generare un fascio luminoso di eccitazione; - un sistema (5) di scansione configurato per ricevere il fascio luminoso di eccitazione dal gruppo ottico (2) di generazione e per far scansionare al fascio luminoso di eccitazione una porzione del fondo dell’occhio campione (7); - un gruppo ottico (19) di lancio configurato per ricevere il fascio luminoso di eccitazione dal sistema (5) di scansione e per inviare il fascio luminoso di eccitazione in detta porzione del fondo dell’occhio campione (7) e per collimare almeno parzialmente una radiazione isotropica di molecole fluorescenti dell’occhio campione (7) in un fascio di fluorescenza; - un dispositivo rivelatore (11) configurato per rilevare il fascio di fluorescenza proveniente dal gruppo ottico (19) di lancio; - mezzi ottici (4, 9) configurati per trasmettere detto fascio luminoso di eccitazione proveniente dal gruppo ottico (2) di generazione al sistema (5) di scansione e per trasmettere detto fascio di fluorescenza dal gruppo ottico (19) di lancio e proveniente dal sistema (5) di scansione al dispositivo rivelatore (11); in cui il gruppo ottico (2) di generazione è configurato per generare un fascio luminoso di eccitazione avente rapporti di fase configurati per comporre detto fascio luminoso di eccitazione, dopo aver attraversato il gruppo ottico (19) di lancio, in un fascio Bessel all’interno dell’occhio campione (7) in corrispondenza di un piano (A) ortogonale ad un asse ottico di propagazione, il gruppo ottico (19) di lancio comprendendo un obiettivo (6; 6’) ad una o più componenti ottiche ed essendo configurato per aumentare l’apertura numerica NA dell’occhio campione (7) ad un valore non inferiore a 0,9.
2. Apparato (100; 100’) secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fat to di includere altresì almeno un primo filtro (3) di pulizia a banda stretta configurato per eliminare un fondo di fluorescenza spurio dal fascio luminoso di eccitazione.
3. Apparato (100; 100’) secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che l’obiettivo (6) è una lente adattiva singola o doppia, opzionalmente una lente adattiva (6’) a contatto.
4. Apparato (100; 100’) secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto di comprendere altresì un gruppo ottico (10) per formazione di immagini configurato per focalizzare detto fascio di fluorescenza sul dispositivo rivelatore (11).
5. Apparato (100; 100’) secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che il dispositivo rivelatore (11) include una pluralità di singoli elementi di rilevazione selezionati nel gruppo comprendente fotomoltiplicatori, diodi avalanche, CCD, o SCMOS.
6. Apparato (100; 100’) secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto di includere una pluralità di microlenti (13) posizionata a monte del dispositivo rivelatore (11) ognuna delle quali è biunivocamente accoppiata ad un singolo elemento della pluralità di elementi di rilevazione del dispositivo rivelatore (11).
7. Apparato (100; 100’) secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto di includere una seconda sorgente luminosa generante un fascio luminoso di eccitazione addizionale configurato per eccitare una porzione addizionale dell’occhio campione (7), che internamente include detta porzione dell’occhio campione (7) scansionata con il fascio luminoso di eccitazione generato dal gruppo ottico (2) di generazione, detto fascio luminoso di eccitazione addizionale essendo configurato per saturare un’auto-fluorescenza di tessuti intraoculari dell’occhio campione (7).
8. Apparato (100; 100’) secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che il gruppo ottico (2) di generazione include un filtro ottico statico (21; 22) di fase posto nel piano di Fourier del gruppo ottico (19) di lancio, opzionalmente un grating bidimensionale realizzato con strati dielettrici multipli, più opzionalmente una lente axicon (21), ancora più opzionalmente una maschera (22) di fase.
9. Apparato (100; 100’) secondo una delle precedenti rivendicazioni da 1 a 7 caratterizzato dal fatto che il gruppo ottico (2) di generazione include un modulatore spaziale di luce, opzionalmente un modulatore spaziale di luce di fase (23) oppure un modulatore spaziale di luce di ampiezza (24) seguito da una lente (25) di Fourier.
10. Apparato (100; 100’) secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che il gruppo (5) di scansione include un primo ed un secondo wedge (27, 28) configurati per ruotare in modo indipendente mediante due motori separati, configurati per essere comandati in modo sincrono, in cui i due wedge (27, 28) hanno opzionalmente una risoluzione di posizione angolare pari ad almeno 1/50 di grado, per cui una risoluzione di scansione è pari ad almeno un microradiante su un campo di ± 1°.
11. Apparato (100; 100’) secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto di includere un sistema (400) di formazione dell’immagine a campo largo operante nel vicino infrarosso (NIR, near infrared) per formare immagini di strutture sub-retinali dell’occhio campione (7) ed un mezzo ottico (12) addizionale, posizionato tra il sistema (5) di scansione ed il gruppo ottico (19) di lancio, detto mezzo ottico (12) addizionale essendo configurato per essere trasparente a radiazione nel vicino infrarosso e per riflettere il fascio luminoso di eccitazione dal sistema (5) di scansione verso il gruppo ottico (19) di lancio ed il fascio luminoso di fluorescenza dal gruppo ottico (19) di lancio verso il sistema (5) di scansione, il sistema (400) comprendendo altresì: - una terza sorgente luminosa (29) configurata per generare un primo fascio luminoso NIR da inviare a detto mezzo ottico (12) addizionale; - un dispositivo rivelatore NIR (18) configurato per rilevare un secondo fascio luminoso NIR riflesso da strutture sub-retinali dell’occhio campione (7) e proveniente dal mezzo ottico (12) addizionale, opzionalmente un sensore a CCD od un sensore a SCMOS, il dispositivo rivelatore NIR (18) essendo opzionalmente configurato per operare ad una frequenza non inferiore a 100 frame/sec; - mezzi ottici NIR (15, 16) configurati per trasmettere detto primo fascio luminoso NIR dalla terza sorgente luminosa (29) a detto mezzo ottico (12) addizionale e detto secondo fascio luminoso NIR riflesso proveniente da detto mezzo ottico (12) addizionale al dispositivo rivelatore NIR (18).
12. Apparato (100; 100’) secondo la rivendicazione 11, caratterizzato dal fatto che il sistema (400) altresì include un gruppo ottico (17) per la formazione di immagini configurato per focalizzare il secondo fascio luminoso NIR sul dispositivo rivelatore NIR (18).
13. Apparato (100; 100’) secondo la rivendicazione 11 o 12, caratterizzato dal fatto di includere almeno un secondo filtro (14) di pulizia a banda stretta configurato per eliminare un fondo di fluorescenza spurio da detto primo fascio luminoso NIR.