HU201118B - Process for producing amphotericin b crystals in fermentation medium - Google Patents
Process for producing amphotericin b crystals in fermentation medium Download PDFInfo
- Publication number
- HU201118B HU201118B HU881079A HU107988A HU201118B HU 201118 B HU201118 B HU 201118B HU 881079 A HU881079 A HU 881079A HU 107988 A HU107988 A HU 107988A HU 201118 B HU201118 B HU 201118B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- amphotericin
- crystals
- fermentation
- fermentation broth
- added
- Prior art date
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 77
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 title claims abstract description 47
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 title claims abstract description 47
- 239000013078 crystal Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 10
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241000122969 Streptomyces nodosus Species 0.000 claims abstract description 4
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 2
- -1 glucanase Proteins 0.000 claims abstract 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims abstract 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 claims description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 4
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract 1
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 41
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 7
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 7
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 7
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 7
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 7
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 5
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 150000004291 polyenes Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGGFZZLFKABGNL-MOISJGEISA-N (1s,3r,4e,6e,8e,10e,14e,16e,18s,19r,20r,21s,25r,27r,30r,31r,33s,35r,37s,38r)-3-[(2r,3s,4s,5s,6r)-4-amino-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-19,25,27,30,31,33,35,37-octahydroxy-18,20,21-trimethyl-23-oxo-22,39-dioxabicyclo[33.3.1]nonatriaconta-4,6,8,10,14, Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 QGGFZZLFKABGNL-MOISJGEISA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 244000024675 Eruca sativa Species 0.000 description 1
- 235000014755 Eruca sativa Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical group 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000013081 microcrystal Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
A jelen találmány tárgya amfotericin B magas kitermeléssel való előállítására adaptált fermentációs eljárás, pontosabban amfotericin B kristályoknak közvetlenül a fermentlében való előállítására szolgáló eljárás. 5The present invention relates to a fermentation process adapted to produce amphotericin B in high yield, more particularly to a process for the preparation of amphotericin B crystals directly in the fermentation broth. 5
Az amfotericin B a Stereptomyces nodosus által termelt, laktongyűrűbe zárt hosszú polién-láncot tartalmazó gombaöló hatású antibiotikum. Pontos szerkezetét, amely a polién-láncot tartalmazó gyűrűn lévő egyik híd- 10 roxilcsoporthoz glikozidosan kapcsolódó aminocukrot is tartalmaz, csak az 1970-es évek elején, feltalálását kővetően 15-20 évvel tisztázták [Mechlinski és mtsai. Tetrahedron Letters 1970, 3873; Borowski és mtsai., u. ott 15 3909; R.C.Pandey and K.L.Rinehart, J. Antibiot., 29, 1035 (1976)]. Részletes leírására vonatkozólag utalunk I.M.Asher és mtsai. összefoglalójára a K.Florey szerkesztésével készült Analytical Profiles of Drug Substances (Aca- 20 demic Press, New York, 1977) 6. kötetének 1-42. oldalain.Amphotericin B is an antifungal antibiotic produced by Stereptomyces nodosus containing a long polyene chain encapsulated in a lactone ring. Its exact structure, which also contains glycosidically linked amino sugars that are glycosidically linked to one of the bridging groups on the ring containing the polyene chain, was only clarified in the early 1970s, after its invention [Mechlinski et al. Tetrahedron Letters 1970, 3873; Borowski et al., U. there 15,390; Pandey and K.L. Rinehart, J. Antibiot., 29, 1035 (1976)]. For a detailed description, see I.M. Asher et al. For more information, see Analytical Profiles of Drug Substances, edited by K. Florey (Acad demic Press, New York, 1977), Volumes 1-42. pages.
A tiszta amfotericin B 170 °C-ig stabil. Vízben gyakorlatilag nem oldódik, savas (pH 2) vagy lúgos (pH 11) vizes oldata is 25 csak körülbelül 0,01 tömegX-os. Az általában igen jó oldószernek tekinthető dimetil-formamid és dimetil-szulfoxid is csak 0,5-1 tömeg%-os oldat készítésére alkalmas.Pure amphotericin B is stable up to 170 ° C. It is practically insoluble in water, and acidic (pH 2) or alkaline (pH 11) aqueous solutions are only about 0.01% by weight. Both dimethylformamide and dimethylsulfoxide, which are generally considered to be very good solvents, are suitable for preparing only 0.5-1% by weight of the solution.
Az amfotericin B-t terápiásán szisztéma- 30 tikus mikózisok kezelésére használják.Amphotericin B is therapeutically used to treat systemic mycoses.
Mostanáig amfotericin B kristályokat fermentléböl körülményes kinyerési eljárásokkal állítottuk elő, ami költséges szűrést, oldószeres extrakciót és kristályosítási műve- 35 leteket jelentett.Up to now, amphotericin B crystals have been prepared from fermentation broth by laborious extraction procedures which involved expensive filtration, solvent extraction and crystallization operations.
A jelen találány szerint az amfotericin B kristályosodását közvetlenül a fermentlében idézzük elő, amely valamilyen vízoldható vagy vízben oldhatatlan fermentációs tápta- 40 laj, amilyen például a 2,908.611. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt, és amely fermentációs táptalaj valamilyen nitrogénforrást, valamilyen szén-/energiaforrást és adott esetben a folyamat szabá- 45 lyozására szolgáló egy vagy több szervetlen sót tartalmaz.According to the present invention, crystallization of amphotericin B is directly induced in the fermentation broth, which is from a water-soluble or water-insoluble fermentation medium, such as 2,908,611. s. U.S. Pat. No. 4,600,198, which contains a nitrogen source, a carbon / energy source and optionally one or more inorganic salts for controlling the process.
A jelen találmány továbbá amfotericin B kristályok közvetlenül fermentlében való képzésére egy olyan eljárást biztosit, amely 50 eljárásnak része az előbb leírtak szerinti fermentációs táptalaj, Streptomyces nodosus ilyen fermentációs táptalajban történő tenyésztése és az amfotericin B kristályosodásának és kívánt eseben a mikrobiális sejt 55 autolizisének előidézése. A kristályosítás és autolizis a fermentlé megfelelő, legalább 50 °C-on és előnyösen 70 °C-tól 130 °C-ig terjedő hőmérsékleten megfelelő időtartamig, vagyis 1 perctől körülbelül 10 óráig és elő- GO nyösen 10-töl 45 percig tartó melegítésével végezhető amfotericin B kristályok képződésének előidézése céljából.The present invention further provides a process for directly forming amphotericin B crystals in a fermentation broth comprising culturing a fermentation broth as described above, culturing Streptomyces nodosus in such a fermentation broth, and, if desired, autolysis of the microbial cell 55. Crystallization and autolysis can be accomplished by heating the fermentation broth at a suitable temperature of at least 50 ° C and preferably from 70 ° C to 130 ° C for a suitable period of time, i.e. from 1 minute to about 10 hours and preferably from 10 minutes to 45 minutes. amphotericin B crystals.
A kristályosodás úgy is beindítható, hogy a fermentáció során amfotericin B kris- 65 tályokkal oltjuk be a fermentlevet, előnyösen a fermentáció kezdete után körülbelül 10-40 órával.Crystallization can also be initiated by inoculating the fermentation broth with amphotericin B crystals during fermentation, preferably about 10-40 hours after the start of fermentation.
Autolizis végrehajtható enzimek, például lizozitn vagy más olyan hasonló enzimek segítségével is, amelyek oldó hatásúak a sejtfalra.Autolysis can also be accomplished using enzymes, such as lysosite or other similar enzymes that are soluble in the cell wall.
Amennyiben valamilyen enzimet vagy beoltást alkalmazunk, enyhébb hőkezelésre van szükség.If an enzyme or inoculum is used, milder heat treatment is required.
A jelen eljárásban használt fermentáció táptalajok körülbelül 0,1-től körülbelül 20, előnyösen körülbelül 0,5-tól körülbelül 5 tömeg%-ig terjedő mennyiségű nitrogénforrást tartalmaznak. Megfelelő nitrogénforrásokra példaként kazeinhidrolizátum, gyapotmag vagy származékai, kukoricalekvár, szójaliszt vagy valamilyen más hasonló szerves vagy szervetlen nitrogénforrós vagy ezek oldható származékai említhetők.The fermentation broths used in the present process contain from about 0.1 to about 20, preferably from about 0.5 to about 5% by weight nitrogen sources. Suitable nitrogen sources include, for example, casein hydrolyzate, cottonseed or derivatives thereof, corn jam, soybean meal or other similar organic or inorganic nitrogen sources or soluble derivatives thereof.
A szénhidrát-forrás körülbelül 0,5-tól körülbelül 20, előnyösen körülbelül 0,5-tól körülbelül 10 töinegX-ig terjedő mennyiségben van jelen a fermentációs táptalajban. Megfelelő szénhidrát-forrásokra példaként keményítő, dextrin, cukrok, igy maltóz, laktóz és glükóz, glicerin és hasonlók említhetők.The carbohydrate source is present in the fermentation broth in an amount of from about 0.5 to about 20, preferably from about 0.5 to about 10% by weight. Examples of suitable carbohydrate sources include starch, dextrin, sugars such as maltose, lactose and glucose, glycerol and the like.
A találmány szerinti eljárásban használt fermentációs táptalajok adott esetben más hagyományos fermentációs táptalaj komponenseket, például egy vagy több szervetlen sót is tartalmazhatnak, amelyek a folyamat szabályozását segítik. Ilyen szervetlen sókra az oltalmi kört semmiképp sem korlátozó példaként kalcium-karbonát, kálium-dihidrogén-foszfát, ammónium-szulfót, magnézium-szulfát, mangán-szulfát vagy dinátrium-hidrogén-foszfát említhető.The fermentation broths used in the process of the invention may optionally contain other conventional fermentation broth components, such as one or more inorganic salts, which aid in the control of the process. Such inorganic salts include, but are not limited to, calcium carbonate, potassium dihydrogen phosphate, ammonium sulfate, magnesium sulfate, manganese sulfate or disodium hydrogen phosphate.
A fermentációs táptalaj tartalmazhat egy vagy több habzásgátló szert is, például szilikon habzásgátlót.The fermentation broth may also contain one or more antifoaming agents, for example silicone antifoaming agents.
Egy előnyös összetételű fermentációs táptalaj körülbelül 1-től körülbelül 6 tömegX-ig terjedő mennyiségű szerves nitrogénforrást, előnyösen szójalisztet, körülbelül 2-től körülbelül 10 tömeg%-ig terjedő mennyiségű glükózt, mint szénhidrótforróst, adott esetben körülbelül 0,01 tömegX-tól körülbelül 0,2 tömegX-ig terjedő mennyiségű egy - vagy többfajta szervetlen sót, előnyösen kalcium-karbonótot és kálium-dihidrogén-foszfátot és adott esetben körülbelül 0,05 tömegX-tól körülbelül 2 tömegX-ig terjedő mennyiségű szilikon habzásgátlót tartalmaz.A preferred fermentation medium comprises from about 1 to about 6% by weight of organic nitrogen sources, preferably soybean meal, from about 2 to about 10% by weight of glucose as a carbohydrate, optionally from about 0.01% to about 0% by weight. Up to 2% by weight of one or more inorganic salts, preferably calcium carbonate and potassium dihydrogen phosphate, and optionally from about 0.05% to about 2% silicone antifoam.
A fermentációs termék (amfotericin B) elkülöníthető kristályainak a fermentlében való képzésére szolgáló jelen találmány szerinti módszer egy előnyős megvalósítási formájában a fermentációs táptalaj lehet tökéletesen vízoldható. A fermentációs táptalajt az amfotericin fermentációnál a 2,908.611. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírt eljárás szerint használjuk fel.In a preferred embodiment of the method of forming the separable crystals of the fermentation product (amphotericin B) in the fermentation broth, the fermentation broth may be completely water soluble. The fermentation broth for amphotericin fermentation is described in 2,908,611. U.S. Pat.
HU 201118 ΒHU 201118 Β
A kész fermentlevet utána legalább 50 °C hőmérsékleten megfelelő ideig, például 10 - 15 percig melegítjük a mikrobiális sejt autolízis kiváltása céljából, ami az amfotericin B kristályok képződését eredményezi. Egy másik megvalósítási formában lizomziniot vagy más proteolitikus enzimet (például proleázokat, glukanázt, papaint, tripszint vagy pepszint) adunk a fermentléhez feldolgozáskor 5 - 7,5 pH-tartományban, és körülbelül °C-tól 80 °C-ig terjedő hőmérsékleten körülbelül 30 perctől körülbelül 5 óráig terjedő időtartamig inkubáljuk. Utána a hőmérsékletet a kristályképzódés tökéletessé tételére 30 percig 90 °C-ra vagy magasabbra emeljük.The finished fermentation broth is then heated at a temperature of at least 50 ° C for a suitable period of time, for example 10 to 15 minutes, to induce microbial cell autolysis, resulting in the formation of amphotericin B crystals. In another embodiment, the lysozyme or other proteolytic enzyme (e.g., proleeases, glucanase, papain, trypsin or pepsin) is added to the fermentation broth during processing at a pH in the range of 5 to 7.5 and from about 30 to about 80 for about 30 minutes. incubate for about 5 hours. The temperature is then raised to 90 ° C or higher for 30 minutes to complete crystallization.
A kristályosodás előidézésére szolgáló másik előnyös eljárásban a fermentáció során (a fermentlé térfogatára számítva) körülbelül 0,01-től körülbelül 0,1 tömeg/térfogat%-ig terjedő mennyiségű steril amfotericin B kristályt juttatunk be a fermentorba a fermentálás 10 - 40. órájában; utána a fermentációt az előbb leírtak szerint folytatjuk (az előbb az autolízis műveletre leírt) melegítéssel vagy melegítés nélkül. A fermentáció végén amfotericin B mikrokristélyok vannak jelen a fermentlében, amely kristályok elkülöníthetők. A beoltási eljárás mellett előnyös a melegítés alkalmazása is.In another preferred method of inducing crystallization, from about 0.01 to about 0.1% (w / v) of sterile amphotericin B crystals (based on the volume of the fermentation broth) is introduced into the fermentor during 10 to 40 hours of fermentation; the fermentation is then continued as described above (previously described for the autolysis step) with or without heating. At the end of the fermentation, microcrystals of amphotericin B are present in the fermentation broth, which crystals can be separated. In addition to the inoculation process, heating is preferred.
Az amfotericin kristályok könnyen elkülöníthetők a fermentléből bármilyen szilárd/folyadék elválasztási művelettel, beleértve flotációs technikát is.The amphotericin crystals can be readily separated from the fermentation broth by any solid / liquid separation process, including flotation techniques.
A következő példák a jelen találmány előnyösen megvalósításait szemléltetik.The following examples illustrate preferred embodiments of the present invention.
1. példaExample 1
Amfotericin B kristályokat az alábbiakban leírtak szerint állítunk elő.Amphotericin B crystals were prepared as described below.
Egy 20 literes adag Steptomyces nodosus ATCC 14899-et fermentálunk amfotericin B termelésére az alább megadott inokulum-képzés és fermentációs feltételek mellett:A 20 liter batch of Steptomyces nodosus ATCC 14899 is fermented to produce amphotericin B under the following inoculum formation and fermentation conditions:
Inokulum-képzés:Inoculum training:
A. Első szakasz.A. First stage.
Inokulum-forrás: fiolában lefagyasztottInoculum source: frozen in a vial
Streptomyces nodosus ATCC 14899 tenyészet.Streptomyces nodosus ATCC 14899 culture.
Táptalaj:medium:
pH 6,8 - 7,0-re állítva.pH adjusted to 6.8 - 7.0.
Térfogat: 100 ml 500 ml-es lombikban. Sterilizálás: 30 perc 121 °C-on. Hőmérséklet: 25 °C.Volume: 100 ml in a 500 ml flask. Sterilization: 30 minutes at 121 ° C. Temperature: 25 ° C.
Inkubálás: 48 óra oda-vissza lengő rázógépen 220 ford/perc-nél.Incubation: 48 hours on a rotating shaker at 220 rpm.
B. Második szakasz.B. Second stage.
Inokulum-forrás: 10% az első szakaszból,Inoculum source: 10% of the first stage,
Táptalaj: ugyanaz, mint az első szakaszban.Media: Same as in the first stage.
Sterilizálás: 30 perc 121 °C-on.Sterilization: 30 minutes at 121 ° C.
Térfogat: 100 ml 500 ml-es palackban.Volume: 100 ml in a 500 ml bottle.
Sterilizálás: 40 perc 121 °C-on. Hőmérséklet: 28 °C.Sterilization: 40 minutes at 121 ° C. Temperature: 28 ° C.
Keverés: 1,4 Kur/m3.Mixing: 1.4 Kur / m 3 .
Levegőztetés: 1 térf./térf. x perc. Szaporítási ciklus: 28 óra.Aeration: 1 vol / vol x min. Propagation cycle: 28 hours.
Inokulum méret: 100 ml a második lombikos szakaszból,Inoculum size: 100 ml from the second flask stage,
500 ml-es lombikban.In a 500 ml flask.
Fermentációs körülmények:Fermentation conditions:
Táptalaj:medium:
Sterilizálás: 45 perc 121 °C-on.Sterilization: 45 minutes at 121 ° C.
Hőmérséklet: 25 °C.Temperature: 25 ° C.
Keverés: 7 Kur/m3.Mixing: 7 Kur / m 3 .
Levegőztetés: 1 térf./térf. x perc.Aeration: 1 vol / vol x min.
Fermentációs ciklus: 136 óra.Fermentation cycle: 136 hours.
Inokulum méret; 14% a szaporítási szakaszból.Inoculum size; 14% of the propagation period.
A kapott kész fermentlé 2050 pg/ml amfotericin B-t és 390 Mg/ml amfotericin A-t tartalmaz.The resulting fermentation broth contains 2050 pg / ml amphotericin B and 390 mg / ml amphotericin A.
A fermentlé mikroszkópos vizsgálata nem mutat ki kristályokat a fermentlében. A fermentlevet 60 °C-on 15 percig melegítjük. Mikroszkópos vizsgálat utón a fermentlében bőségesen találunk amfotericin kristályokat, amelyek könnyen elkülöníthetők a fermentléból flotócióval vagy más nem költséges elválasztási művelettel.Microscopic examination of the fermentation broth does not detect crystals in the fermentation broth. The fermentation broth is heated at 60 ° C for 15 minutes. After microscopic examination, amphotericin crystals are abundant in the fermentation broth and can be easily separated from the fermentation broth by flotation or other inexpensive separation operations.
2. PéldaExample 2
Amfotericin por kinyerése fermentléből.Recovery of amphotericin powder from fermentation broth.
A példa fermentációs részletei azonosak az 1. példáéval kivéve, hogy a fermentlevet a fel nem használt szójabab maradékok eltávolítására pamutszövettel bélelt Sparkler-szűrőn megszűrjük. A kapott szűrletet utána ismét sterilizáljuk, és fermentációs táptalajként felhasználjuk. A kapott kész fermentlé 960 Mg/ml amfotericin B-t tartalmaz 112 óra fermentálás után. A fermentlét azután néhány percig 120 °C-on kezeljük az amfotericin kristály-képződés beindítása cél-3HU 201118 Η jából. Szobahőmérsékletre való lehűtés után az amfotericin kristályokat centrifugálással elkülönítjük, és 2 kPa nyomáson 25 °C-on 3 óra hosszat szárítjuk. Az igy kinyert kristályok milligrammonként 79 pg amfotericin B-t tartalmaznak, ami 95%-os összesített kitermelés.The fermentation details of this example are identical to those of Example 1 except that the fermentation broth is filtered through a Sparkler filter lined with cotton cloth to remove unused soybean residues. The resulting filtrate was then sterilized again and used as a fermentation broth. The resulting fermentation broth contains 960 mg / ml of amphotericin B after 112 hours of fermentation. The fermentation broth is then treated for several minutes at 120 ° C from the target for induction of amphotericin crystal formation. After cooling to room temperature, the amphotericin crystals were collected by centrifugation and dried at 2 kPa for 3 hours at 25 ° C. The crystals thus obtained contain 79 pg amphotericin B per milligram, 95% overall yield.
3. PéldaExample 3
Enzimes kezelés és hőkezelés.Enzyme treatment and heat treatment.
A 2. példa szerinti eljárást követve a fermentlének az amfotericin B kristályosodását kiváltó néhány percig 120 °C-on való kezelése után a fermentlevet lehűtjük, és 35 °C-on és körülbelül 7,0 pH-η tartjuk; ezután lizozimot adunk a ferinentléhez, és 2 óra hosszat reagáltatjuk a micélium sejtek részleges oldása céljából. A lizozimot 4000 egység‘/ml fermentlé koncentrációban adagoljuk. (+ Egy egységnyi az az enzim-aktivitás, amely 6,24 pH-nál 26 °C-on percenként 0,001 AA<50-et abszorpcióváltozás 450 nm-nél eredményez.) Az amfotericin B kristályokat utána centrifugálással különítjük el a fermentléből, és acetonnal szárítjuk. Az ilyen por még a 2. példa termékénél is magasabb amfotericin B tartalmú, azaz 110 pg amfotericin B-t tartalmaz 1 mg kristályban.Following the procedure of Example 2, after treating the fermentation broth for a few minutes at 120 ° C, which causes crystallization of amphotericin B, the fermentation broth is cooled and maintained at 35 ° C and a pH of about 7.0; lysozyme is then added to the ferritic juice and reacted for 2 hours to partially dissolve mycelial cells. Lysozyme is added at a concentration of 4000 units / ml fermentation broth. (+ One unit is the enzyme activity that results in a change of absorbance at 450 nm at 450 nm per minute at pH 6.24 at 26 ° C.) The amphotericin B crystals are then separated from the fermentation broth by centrifugation and acetone. dried. Such a powder, even with the product of Example 2, has a higher amphotericin B content, i.e. 110 pg amphotericin B in 1 mg of crystal.
4. PéldaExample 4
Beoltásinoculation
A 2. példa szerinti eljárást követjük azzal a kivétellel, hogy 0,1 g/lit. amfotericin B kristályt adunk a fermentléhez a fermentáció kezdete után 40 órával.The procedure of Example 2 was followed except that 0.1 g / l. amphotericin B crystal was added to the fermentation broth 40 hours after the start of fermentation.
A hökezelési művelet végén (a fermentáció után, nyerjük ki az amfotericin B kristályokat.At the end of the heat treatment step (after fermentation), recover the amphotericin B crystals.
5. PéldaExample 5
Amfotericin B kristályok előállítása oldható fermentációs táptalajban.Preparation of amphotericin B crystals in soluble fermentation broth.
A fermentáció szempontjából ez a példa azonos az 1. példával kivéve, hogy a fermentációs táptalajban 2,5% szójaolaj helyett 1,25% oldható formájú porlasztva szárított kukoricalekvárt (szállítója a Roquette Corporation) használunk.For fermentation, this example is identical to Example 1 except that 1.25% soluble spray spray dried corn jam (supplied by Roquette Corporation) is used in the fermentation broth instead of 2.5% soy oil.
A fermentlevet körülbelül 75 °C-on 15 percig melegítjük. A hőkezelés után a fermentlé amfotericin B kristályokat és részben oldott micéliumot tartalmaz. Az amfotericin B kristályokat ezután centrifugálással különítjük el a folyadéktól, és 2 kPa nyomáson és 25 °C-on 3 óra hosszat szárítjuk. Az összesített amfotericin kitermelés 95%,The fermentation broth is heated at about 75 ° C for 15 minutes. After heat treatment, the fermentation broth contains amphotericin B crystals and partially dissolved mycelium. The amphotericin B crystals were then separated from the liquid by centrifugation and dried at 2 kPa and 25 ° C for 3 hours. The overall yield of amphotericin is 95%,
A találmány szerinti eljárással kapott amfotericin B-t autentikus amfotericin B mintával összehasonlítva metanolban felvett UV-spektrum alapján azonosítottuk, amelynek jellemző maximuma 381 nm, minimuma 372 és 396 nm.The amphotericin B obtained by the process of the present invention was identified by comparison with an authentic sample of amphotericin B using a UV spectrum in methanol with a typical maximum of 381 nm, a minimum of 372 and 396 nm.
-4HU 201118 B-4EN 201118 B
Claims (13)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU881079A HU201118B (en) | 1986-04-16 | 1988-03-04 | Process for producing amphotericin b crystals in fermentation medium |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/852,591 US4748117A (en) | 1983-09-01 | 1986-04-16 | Method for forming amphotericin B crystals in fermentation broth |
| HU881079A HU201118B (en) | 1986-04-16 | 1988-03-04 | Process for producing amphotericin b crystals in fermentation medium |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT49647A HUT49647A (en) | 1989-10-30 |
| HU201118B true HU201118B (en) | 1990-09-28 |
Family
ID=26317317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU881079A HU201118B (en) | 1986-04-16 | 1988-03-04 | Process for producing amphotericin b crystals in fermentation medium |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU201118B (en) |
-
1988
- 1988-03-04 HU HU881079A patent/HU201118B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT49647A (en) | 1989-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3932671A (en) | Process for producing protein hydrolyzate | |
| US4309505A (en) | Process for the production of fructose transferase enzyme | |
| KR20000053547A (en) | Method for producing xylitol or d-xylulose | |
| HU201118B (en) | Process for producing amphotericin b crystals in fermentation medium | |
| US4689296A (en) | Method of preparing novel thermostable transglucosidase | |
| EP0522428A1 (en) | Prolyl endopeptidase and production thereof | |
| US4748117A (en) | Method for forming amphotericin B crystals in fermentation broth | |
| EP1437050B1 (en) | Process for producing brewer's yeast or brewer's yeast extract with improved flavour | |
| US4737461A (en) | Novel bacteriolytic enzyme and process for preparing the same | |
| JP2525529B2 (en) | Method for increasing riboflavin content in spray-dried products from riboflavin fermentation | |
| EP0330706B1 (en) | Method for forming amphotericin b crystals in fermentation broth | |
| US4013515A (en) | Process for the preparation of the antibiotic 20.798 R.P. | |
| JPH022589B2 (en) | ||
| JP2675047B2 (en) | Method for forming amphotericin B crystals in fermentation medium | |
| US3616244A (en) | Production of lincomycin sulfoxide | |
| EP0383248B1 (en) | Process for the production of mevalonic acid | |
| US4296101A (en) | Antibiotic kristenin | |
| JP2759394B2 (en) | Method for producing purified xanthan gum | |
| US3772151A (en) | Preparation of 2-chloro-7-hydroxy-11-(4-methyl-1-piperazinyl)- di benz(b,f)-oxazepine | |
| FI92938C (en) | Process for forming crystals of amphotericin B in the fermentation medium | |
| US6190888B1 (en) | Process for making riboflavin glucoside | |
| US3549502A (en) | Process for the production of neutramycin | |
| US4879235A (en) | Process for producing protease by cultivating a protease-producing mold in a liquid medium | |
| SU763463A1 (en) | Method of preparing dehydrogenases | |
| JPH01296992A (en) | Substance fr-900493, production thereof and drug composition containing the same substance |