HU206617B

HU206617B - Process for producing taxol derivatives and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HU206617B
Application number: HU902854A
Authority: HU
Inventors: Valentino J Stella; Abraham E Mathew
Original assignee: Univ Kansas
Priority date: 1989-03-09
Filing date: 1990-03-09
Publication date: 1992-12-28
Also published as: OA09458A; HU902854D0; GR900100523A; CN1058018A; CA2028096A1; WO1990010443A1; KR920700208A; AU5271590A; EP0419653A1; GR1000684B; HUT56270A; AU628161B2; JPH04504845A; US4960790A; EP0419653A4

Description

Találmányunk tárgya eljárás taxol-származékok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.

A taxol-származékok vízben való oldhatósága a taxolhoz képest igen jó és kiváló antitumor-hatással rendelkezik. A találmány szerinti vegyületek ugyanazon rákbetegségek kezelésére alkalmazhatók, amelyek ellen a taxol is hatékonynak mutatkozik, ilyen a tüdőrák, melanóma, leukémia, mellrákok és vastagbélrák.

A taxol egy (I) képletű ismert diterpenoid, szeszkiterpén, amelyet a nyugati tiszafa (Taxus bresifolia) fakérgéből izoláltak.

A taxol igen hatásosnak bizonyult számos tumor-betegség ellen. Ez a vegyület azonban csak nagyon kevéssé oldódik vízben és ez a körülmény a humán gyógyászati készítmények kifejlesztésekor számos problémát okozott. A taxolból készített gyógyszerformák, így az injekciós vagy intravénás infúziós oldatok előállításakor a taxol csekély vízoldékonysági problémájának megoldására vivöanyagként cremophore EL^R anyagot alkalmaztak, A cremophore azonban toxikus sajátságokat mutat, ugyanis idiosyncrasiás (egyéni) hisztamin-felszabadulást és anaphylaktoid jelenséget idéz elő, így ennek a vivőanyagnak az alkalmazása a taxol jobb formulálhatóságának elősegítésére nem a kívánt megoldás.

Történtek már kísérletek a taxol gyógyászati célra előnyösebben felhasználható származékainak az előállítására. így W. Mellado és munkatársai [Biochemical and Biopysical Research Communication 124 (2), 329-336. (1984)] a 2’-acetil-taxol és 7-acetil-taxol szintéziséről és biológiai aktivitásáról, valamint a vízben való oldódási tulajdonságairól számoltak be.

N. F. Magri és D. G. I. Kingston [J. Org. Chem. 51 (6), 797-802. (1986)] oxidált taxolok, mint 7-oxo-taxol, 2’,7-dioxo-taxol és 2’-oxo-7-acetil-taxol előállítását írták le.

J. Pamess és munkatársai [Biochemical and Biophysical Research Communications 105 (3), (1982)] a természetes taxol és félszintetikus származékai, különösen a 2’-acetil- és 7-acetil-taxol közötti struktúra-aktivitás összefüggéseket ismertették.

Η. M. Deutsch és munkatársai [Journal of Medicinái Chemistry 32 (4), 698-702. (1989)] tumorellenes taxol-származékok tumorellenes hatásáról és előállításuk nehézségeiről tudósítottak.

Az említett szerzők által előállított egyes taxol-származékok mutattak ugyan előnyt a vízben való oldhatóság szempontjából, de ugyanakkor hátrányokat is mutattak, amelyek vagy a hatás elégtelenségében, vagy a hidrolízisre való hajlam miatt csökkent stabilitásban, vagy pedig az előállítás nehéz voltában nyilvánultak meg. Ezért meglepődnek és a technika ismert állásához képest számottevő haladásnak mondható az a jelen találmány alapját képező felismerés, hogy a csatolt rajz szerinti (I) általános képletű új, helyettesítetlen vagy N-alkilezett aminosavakkal észterezett taxol-származékok a taxolénál lényegesen jobb vízoldhatóságuk mellett tumorellenes hatás szempontjából sem maradnak el a taxol mögött, és ugyanakkor a találmány szerinti módon könnyen elő is állíthatók.

Találmányunk tehát olyan taxol-származékok előállítására irányul, amelyek kedvező tumorellenes hatásúak és vízben oldódnak.

Találmányunk oltalmi köre kiterjed továbbá hatóanyagként a fenti taxol-származékok valamelyikét tartalmazó olyan gyógyszerkészítmények előállítására is, amelyek nem-toxikus vivőanyagot tartalmaznak, s így elkerülhető a toxikus vivőanyagok, például a cremophor alkalmazása.

Találmányunk oltalmi körébe tartozik olyan taxolszármazékok kifejlesztése, amelyek a gyógyászati készítmények előállításához alkalmas pH-értékeken (pH = 3 és 4 között) igen stabilak, de in vivő körülmények között a fiziológiás pH-értéken (pH = 7,4) gyorsan lebomlanak, így tulajdonképpen a taxol előgyógyszereként viselkednek.

A találmány szerint előállított új taxol származékok az (I) képletű taxol (II) általános képletű, a 2’- és/vagy 7-helyzetben mono-, illetőleg diszubsztituált aminosav-észterei; a (II) általános képletben R és R¹ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy alanin-, glicin-, leucin-, izoleucin-, valin vagy lizin-maradék, vagy pedig (III) általános képletű csoport, ahol

R² és R³ jelentése 1-3 szénatomos alkilcsoport, és n jelentése 1,2 vagy 3, azzal a megszorítással, hogy ha valamely (II) általános képletű vegyületben R és R¹ közül az egyiknek a helyén hidrogénatom áll, akkor a másiknak a jelentése valamely hidrogénatomtól különböző, fent megadott szubsztituens; továbbá, hogy a 2’-(3-alanil)-taxol nem tartozik a találmány szerint előállítandó (II) általános képletű vegyületek körébe.

Az R² és/vagy R³ helyén hidrogénatomtól eltérő jelentésű szubsztituenseket tartalmazó (III) általános képletű csoportot tartalmazó vegyületeket néha „alkilezett aminosavaknak” nevezzük a leírásban. A (II) általános képletű vegyületeket szélesebb értelemben a taxolnak aminosavakkal képezett 2’- és/vagy 7-helyzetben helyettesített észtereiként is értelmezhetjük.

A találmány szerinti vegyületek közé tartoznak az alábbi vegyület-csoportok:

a) a taxol 2’-helyzetű hidroxilcsoportján észterezett származékok;

b) a taxol 7-helyzetű hidroxilcsoportján észterezett származékok és

c) a taxol 2’- és 7-helyzetű mindkét hidroxilcsoportján észterezett származékok.

A találmányunk szerinti (II) általános képletű vegyületek közül különösen előnyösek az alábbiak:

1.2’-(N,N-dietil-amino-propionil)-taxol

2. 2’-(N,N-dimetil-glicil)-taxoI

3. 7-(N,N-dimetil-gliciI)-taxol

4. 2’,7-di-(N,N-dimetil-glicil)-taxol

5. 7-(N,N-dietil-amino-propionil)-taxol

6. 2’,7-di-(N,N-dietil-amino-propionil)-taxol

7. 2’-(L-glicil)-taxol

8. 7-(L-glicil)-taxol

9. 2’,7-di-(L-glicil)-taxol

10. 2’-(L-alanil)-taxol

HU 206 617 Β

11. 7-(L-alanil)-taxol

12. 2’,7-di-(L-alanil)-taxol 13.2’-(L-leucil)-taxol 14. 7-(L-leucil)-taxol 15.2’7-di-(L-leucil)-taxol 16.2’-(L-izoleucil)-taxol

17.7- (L-izoleucil)-taxol 18.2’,7-di-(L-izoleucil)-taxol 19.2’-(L-valil)-taxol

20.7- (L-valil)-taxol 21.2’,7-di-(L-valil)-taxol 22.2’-(L-lizil)-taxol

23.7- (L-lizil)-taxol 24.2’,7-di-(L-lizil)-taxol

Azt találtuk, hogy a taxol 2’- és 7-helyzetű hidr- 15 oxilcsoportjai kémiailag reakcióképesek és hogy a 2’helyzetű hidroxilcsoport reakcióképesebb a 7-helyzetű hidroxilcsoportnál. Ezt a megfigyelést hasznosítottuk a találmány szerinti előállítási eljárások során.

A) 2’-észter-származékok előállítása 5 A 2’-észter-származékokat a két előállítási eljárás valamelyike szerint készíthetjük, attól függően, hogy aminosavas vagy alkilezett aminosavas származékról van szó.

Alkilezett aminosav-származékok előállítása az (A) 10 reakcióvázlat szerint történik, vagyis valamely (IV) általános képletű alkilezett aminosavat (I) képletű taxollal reagáltatunk, így a taxol (V) általános képletű 2’-észter-származékát kapjuk, amely képletekben n, R²és R³ jelentése egyezik a fent megadottakkal.

Az aminosavak észtereinek előállítása az alábbi (B) reakcióvázlat szerint történik:

N-védett aminosav + taxol taxol 2’-N-védett aminosav-származéka védőcsoportot lehasítjuk taxol 2’-aminosavészter-származéka

Az (A) és a (B) reakcióvázlatban is az alkilezett vagy a védett aminosav reakcióját egy kondenzálószer jelenlétében és katalizátor jelenlétében vagy anélkül 25 hajtjuk végre, előnyösen szobahőmérsékleten.

Alkalmas kondenzálószerek a karbodiimidek, például a diciklohexil-karbodiimid (DCC).

Alkalmas katalizátorok a 4-dimetil-amino-piridin (DMAP) és a piridin.

A (B) reakcióvázlat szerinti eljárásban számos ismert amino-védőcsoportot lehet alkalmazni, illetőleg kiindulási anyagként a kereskedelemben hozzáférhető védett aminosavakat lehet alkalmazni. Megemlítjük például a terc-butil-oxi-karbonil-csoporttal (t-BOC), a difenil-me- 35 til-oxi-karbonil-csoporttal (FMOC) és a karbobenzil-oxicsoporttal (CBZ) védett aminosavakat. Előnyösek a tBOC vagy FMOC csoporttal védett aminosavak. A 2’észterek t-BOC védőcsoportjának lehasítása vizes hangyasavval és más szerves savval a termék bomlásához és 40 sztereokémiái változáshoz is vezet; a 99%-os hangyasav alkalmazása jobb eredményekhez vezet. Az FMOC-csoporttal védett aminosav-észterek esetén a termék visszanyerése a reakciókörülményektől függ. így az utolsó lépésben, a védőcsoport lehasításakor a t-BOC-csoport el- 45 távolításának körülményei a taxol molekula 7-helyzetű szabad hidroxilcsoportján nemkívánatos változtatásokat okozhat. Ezek a nemkívánatos változtatások a molekula sztereokémiái módosításait okozhatják.

A (VI) és (VII) képletnek N-védett alanin-vegyületeket ábrázolnak; a (VI) képletű vegyület védőcsoportja t-BOC-csoport és a (VII) képletű vegyület védőcsoportja FMOC-csoport.

Azt találtuk, hogy a taxol 2’-helyzetű hidroxilcsoportja reakcióképesebb a 7-helyzetű hidroxilcsoportnál. így az (A) és a (B) reakcióvázlat szerin30 ti eljárások során is a helyettesítés és az észterifikálás is a 2’-helyzetben történik oly módon, hogy az alkilezett vagy N-védett aminosavat taxollal reagáltatjuk 1; 1 vagy ennél valamivel nagyobb mólarányban. Az ekvimoláris mennyiségekben történő reakció esetén a taxol 2’-észter-származéka keletkezik túlnyomó többségben, bár kis mennyiségben melléktermékként a taxol 7-észter-származéka is keletkezik.

B) 7-helyzetű észterek előállítása (C) reakcióvázlat:

Tekintettel arra, hogy a taxol 2’-helyzetű hidroxilcsoportja lényegesen reakcióképesebb, mint a 7-helyzetű hidroxilcsoport, így ennek a hidroxilcsoportnak az észterifikálásához más eljárást kell alkalmazni, mint a 2’-hidroxilcsoport esetében. A 7-helyzetű hidroxilcsoport észterifikálásához először is a 2’-hidroxilcsoportot kell megvédeni vagy blokkolni, ezután a 7-helyzetű hidroxilcsoportot észterifikáljuk, végül a 2’-helyzetű védőcsoportot vagy blokkolócsoportot eltávolítjuk:

taxol + védőcsoportot tartalmazd vegyület

2’-védett taxol alkilezett aminosav

2’-helyzetben védett, 7-helyzetben alkilezett aminosavval helyettesített taxol

2’-helyzetű védőcsoport eltávolítása

7-észterezett taxol

HU 206 617 Β

A taxol 2’-helyzetű blokkolására számos, a szakember számára ismert blokkoló csoport ismert. A (C) reakcióvázlat egy blokkoló csoport és egy alkilezett aminosav példáját szemlélteti.

(C) reakcióvázlat:

taxol + 2,2,2-triklór-etil-kloroformiát (Troc)

2’-(Troc)-taxol

Ν,Ν-dimetil-glicin kondenzálószer, katalizátor

2’-(Troc)-7-(N,N-dimetil-glicil)-taxol

2’-helyzetű védőcsoport eltávolítása

7-(N,N-dimetil-glicil)-taxol

A (C) reakcióvázlat szerinti eljárásban a 2’-troc-taxol és az alkilezett aminosav reakcióját egy kondenzálószer és egy katalizátor jelenlétében hajtjuk végre. Alkalmas kondenzálószerek és katalizátorok ugyanazok, mint amelyeket az (A) és (B) reakcióvázlat szerinti eljárásokban használunk.

A 2’-(Troc)-taxolban a 2’-helyzetű védőcsoport eltávolítását például cink és ecetsav elegyével folytathatjuk le.

(D) reakcióvázlat:

A 7-szubsztituált taxol-származékok úgy is előállíthatok, hogy először a taxolt 2-3 mólekvivalens mennyiségű N-blokkolt aminosavval reagáltatjuk, így 2’- és 7-helyzetben diszubsztituált taxolt kapunk, majd mind a 2’-helyzetben, mind a 7-helyzetben lévő aminosav-szubsztituensről a védőcsoportot eltávolítjuk, majd a 2’-helyzetű aminosavat lehasítjuk. Az alábbi példában t-BOC csoporttal védett alanint használunk blokkolt aminosavként:

taxol + N-t-BOC-alanin (2 mólekvivalens)

2’,7-di-(t- BOC-L- alanil)-taxol aminosav védőcsoportjának eltávolítása

2’,7-di(L-alanil)-taxol

2’-alanil-lehasítása

7-(L-alanil)-taxol

A fenti (D) reakcióvázlat szerinti eljárásban a (C) reakcióvázlat szerinti eljáráshoz hasonlóan a taxol és a védett aminosav reakcióját egy kondenzálószer és egy katalizátor jelenlétében folytatjuk le. Az aminosavak 35 védőcsoportjainak eltávolítását ismert módszerekkel hajthatjuk végre, például egy gyenge savval, így hangyasavval történő reakció útján.

A 2’-aminosav lehasítását úgy folytatjuk le, hogy a 2’,7-(aminosav)-taxol-oldat pH-ját 7-7,4-re állítjuk be, 40 például úgy, hogy a 2’,7-di-(aminosav)-taxolt egy foszfát-pufferrel elegyítjük, amelynek pH-ja 7-7,4. Ilyen pH-érték mellett a 2’-aminosav lehasad és a kívánt 7-(aminosav)-taxol keletkezik.

A fentiek szerint például a taxolt 2-3 mólekvivalens 45 mennyiségű N-védett aminosavval (például t-BOC, CBZ vagy FMOC csoporttal védett aminosavval) DCC és katalitikus mennyiségű 4-dimetil-amino-piridin jelenlétében metil-kloridban reagáltatjuk. Ilyen módon a védett aminosavat a 2’- és a 7-helyzetbe is bevisszük. A védőcsoportokat alkalmas szerrel, például savval, gyenge bázissal történő reakció útján eltávolítjuk. A taxol 2’,7-biszaminosav-származék semleges pH-jú foszfát-pufferben 24-48 óra hosszat állni hagyjuk, miközben a 2’-helyzetű védőcsoport szelektív módon lehasad és így a taxol 7-helyettesített származékát kapjuk.

Hasonló reakcióban állíthatunk elő 7-szubsztituált taxol-származékokat alkilezett aminosavakkal. Ez a reakció hasonló a fent ismertetett eljáráshoz, azzal a különbséggel, hogy az N-védett aminosav helyett kívánt alkilezett aminosavat használunk és így a védőcsoport eltávolítási lépés elmarad. Ezt az eljárást az (C) reakcióvázlat szemlélteti:

taxol + alkilezett aminosav (2 mólekvivalens)

2’,7-(diszubsztituált)taxol

2’-alkilezett aminosav lehasítása

7-(szubsztituált)-taxol

C) 2’,7-diszubsztituált taxol-származékok előállítása (F) reakcióvázlat: alkilezett aminosavakkal történő

A diszubsztituált származékokat a fenti eljárás sze- szubsztitúció rint vagy annak egy része szerint állíthatjuk elő. Az eljárást az alábbi reakcióvázlatok szemléltetik: 60

J . '

HU 206 617 Β

taxol + alkilezett aminosav (2-3 mólekvivalens)		2’,7-(diszubsztituált alkilezett aminosav)-taxol

(G) reakcióvázlat: aminosavakkal történő szubsztitúció

taxol + N-védett aminosav (2-3 mólekvivalens)

2’,7-(diszubsztituált védett aminosav)-taxol

aminosav védőcsoportjának eltávolítása

2’,7-(diszubsztituált aminosav)-taxol

Az (F) reakcióvázlat szerinti eljárás alapvetően ugyanaz, mint az (A) reakcióvázlat szerinti eljárás, azzal az eltéréssel, hogy 2 mólekvivalens alkilezett aminosavval végezzük el a reakciót. Továbbá az (A) reakcióvázlat szerinti eljárást kivitelezhetjük katalizátor jelenlétében vagy anélkül, míg a (G) reakcióvázlat szerinti eljárást katalizátor jelenlétében folytatjuk le, tekintettel arra, hogy a taxol 7-helyzetű hidroxilcsoportja csekély kémiai reakcióképességgel rendelkezik.

A (G) reakcióvázlat szerinti eljárás lényegében ugyanaz, mint a (B) reakcióvázlat szerinti eljárás, azonban a (B) reakcióvázlatnál megemlítettük, hogy az FMOC az előnyös védőcsoport arra a célra, hogy a 7-helyzetű térbeli módosulást elkerüljük a védőcsoport eltávolítási reakció során. A (G) reakcióvázlat szerinti folyamat során ez a probléma nem áll fent, mert a 7-helyzetű hidroxilcsoport nem szabad. Ezért számos ismert védőcsoport alkalmazására van lehetőség, beleértve a t-BOC és FMOC alkalmazását is.

Úgy véljük, hogy a találmány fenti módon történő ismertetése elegendőnek látszik a szakember számára, hogy a találmány oltalmi körébe tartozó valamennyi vegyület előállítását elvégezhesse. A továbbiakban mégis konkrét példákkal szemléltetjük a találmány szerinti eljárásokat, anélkül azonban, hogy találmányunkat ezen példákra korlátoznánk.

1. példa (Vili) általános képletű2'-(Ν,Ν-dimetil-glicil)-taxol vagy valamely sójának előállítása

a) 1. vegyület: 2’-(N,N-dimetil-glicil)-taxol előállítása

0,21 g (0,246 mmól) és 0,0254 g (0,246 mmól) Ν,Ν-dimetil-glicil 12 ml vízmentes metilén-kloriddal készített oldatához 0,15 g (0,72 mmól) 1,3-diciklo-hexil-karbodiimidet és 0,025 g (0,2 mmól) 4-dimetilamino-piridint adunk. A kapott reakcióelegyet vízmentes körülmények között 1 napig keverjük. Ezután újabb 50 mg DCC-t adunk az elegyhez és a keverést további 6 óra hosszat folytatjuk. A reakcióelegyet leszűrjük és a szűrletet nitrogén-áramban bepároljuk. A kapott maradékot szilános szilikagélen (35 g, 26 cm) kromatografáljuk, miközben eluálószerként egymás után etil-acetát és petróleum-éter 1:1 arányú elegyét, majd etil-acetátot alkalmazunk. Az etil-acetát és petróleum-éter frakciókat bepároljuk, majd a kapott szilárd maradékot leszűrjük. Az anyalúgot besűrítjük, majd petróleum-étert adunk hozzá mindaddig, amíg zava15 rossá nem válik és így további terméket kapunk. A teljes hozam 0,14 g, 61%. Op.: 168-171 °C, bomlik.

A 2. vegyület NMR-spektrumjában (300 MHz, CDC1₃) a taxolban a 2’-proton rezonanciája a 4,71 ppm-ről 5,59 ppm-re tolódik el. Ez összhangban áll a 2’-helyzetű észterifikálással. A spektrum valamennyi többi rezonanciája az adott szerkezettel összhangban van. A HPLC-vel mért tisztaság 98-99%. Tömegspektrum: (FAB) m/e = 939. (M + H)⁺.

Elemi analízis a C_5IH₅₈N₂O₁₅ összegképlet alapján:

számított: C 65,26%, H6,22%, N2,98%;

talált: C 65,16%, H6,28%, N3,13%.

b) 2. vegyület: 2’-(N,N-dimetil-glicil)-taxol metánszulfonsavas sójának előállítása

0,06 g (0,064 mmól) 2’-(N,N-dimetil-glicil)-taxolt

2 ml terc-butanolban és 1,5 ml vízben eloszlatunk. A kapott elegyet -5 °C-ra lehűtjük és 3,1 ml 2 mg/ml, 0,0645 mmól metánszulfonsavat csepegtetünk hozzá, majd az elegyet 0-5 °C-on keverjük egy percig és ezt követően 20 μτη-os milliporusos szűrön leszűrjük egy jeges-izopropanolos eleggyel hűtött lombikba. Az oldatot liofilizáljuk, így 0,058 g terméket kapunk. Hozam: 88%. Op.: 170-173 °C.

Elemi analízis a C₅₂H₆₂N₂SO₁₈x2 H₂O összegképlet alapján:

számított: C 57,83%, H6,27%, N2,6%;

talált: C 57,49%, H6,06%, N2,73%.

Fizikai tulajdonságok:

Molekulatömeg: 1035

Op.: 170-173 °C (bomlik)

Oldékonyság: 15 mg/ml (gyengén zavaros) mg/ml (tiszta)

Kémiai oldékonysági vizsgálatok:

A vegyület stabilitási tulajdonságait az alábbi vizsgálatokkal határoztuk meg:

A származékok stabilitását 25 és 37 °C-on vizsgáltuk különböző pH-értékek mellett. A plazma-vizsgálatokat patkányokon és humán plazmában végeztük el 37 °C-0n. A humán plazmát a Watkins kórház bocsátotta rendelkezésünkre és a patkány plazmát a Kansas Egyetem Allat55 gondozó Intézetétől (Animál Care Unit of the University of Kansas) szereztük be. A származékok koncentrációja 20-25 pg/ml közötti érték volt. A vegyületböl készített törzsoldat koncentrációja 0,8-1,0 mg/ml volt, amelyet a plazmához adva a kívánt 20-25 pg/ml koncentrációt ér60 tűk el. Egy század mikről iter mintát vettünk, amelyhez

HU 206 617 Β

250 μΐ acetonitrilt adtunk és az ezt követő centrifugálással kicsaptuk a plazma proteineket, A bomlás kinetikáját HPLC módszerrel mértük és a csúcs alatti területet ábrázoltuk az idő függvényében. A {₉₀ és a ^l50 értékeket kiszámítottuk. A kémiai és a plazma meghatározásokat nagy nyomású folyadékkromatográfiás módszerekkel végeztük el RP-8 oszlop (15 cm) és 5 cm-es előoszlop alkalmazásával. A detektort 227 nm-nél helyeztük el. Eluálószerként 0,02 mólos acetát (pH = 5) és acetonitril 50:50 vagy 35:65 arányú elegyét alkalmaztuk, miközben az áramlás sebessége 1-15 ml/perc volt, vagy pedig eluálószerként ugyanezeket az oldószereket alkalmaztuk, azonban 0,001 mól tetrabutil-ammónium-hidrogén-szulfátot is tartalmaztak, miközben az áramlás sebessége 1 ml/perc volt.

A stabilitási vizsgálat során a vegyület csúcsának eltűnését a taxol retenciós idejével megegyező csúcs megjelenése követte. Ennek a csúcsnak az azonosságát később az új származékok lebomlási reakciójának vizsgálata igazolta. így a 2’-(N,N-dimetil-glicil)-taxolt 37 °C-on vízzel inkubáltuk és a terméket besűrítettük, majd vékonyrétegkromatográfiás módszerrel tisztítottuk. A tisztítás után kapott terméket nagy nyomású folyadékkromatográfiás és spektroszkópos módszerrel elemeztük. A termék m/e = 860-nál molekula-ionos csúcsot mutat (M + Li)⁺, jelezve, hogy a termék taxolnak felel meg.

Nagy nyomású folyadékkromatográfiás meghatározás paraméterei:

Oszlop: RP-8, 150 mm hosszú, 4,6 mm id (átmérő)

Eluálószer: 0,02 mólos acetát (pH = 5) és acetonitril 50:50 arányú elegye

Detektor: Kratos spektrométer 757

Áramlás sebessége: 1 ml/perc Retenciós térfogat; 11,2 ml 2. vegyület

5,5 ml taxol

Kémiai stabilitási eredmények:

körülmények	t_1/2 (óra)
0,02 mólos acetát	(0,1 mg/ml)
(pH 3,5,25 °C)	96,2
(pH 4,5, 25 °C)	55,4
víz (2 mg/ml)
(pH 3,8, 37 °C)	89,8
Plazma stabilitása 37	°C-on:
körülmények	ti/2 (perc)
patkány plazma
(20 gg/ml)	3,05
kutya plazma
(20 gg/ml)	121,6
humán plazma
(20 gg/ml)	198,6

2. példa

A (IX) általános képletű 2’-[3-(N,N-dimetil-amino)propionil]-taxol sóinak előállítása

a) 3. vegyület: 2’-[3-(N,N-dimetil-amino)-propionilj-taxol sósav-sójának előállítása

0,12 g (0,14 mmól) taxol 12 ml diklór-metánnal készített, 0,025 g (0,145 mmól) 3-(N,N-dietil-amino)-propionsavat tartalmazó oldatához 0,08 g (0,38 mmól) 1,3-diciklohexil-karbo-diimidet és 0,01 g (0,081 mmól) 4-dimetil-amino-piridint adunk. A kapott elegyet 24 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük, majd szűrjük és a kapott szűrletet nitrogénáramban bepároljuk. A nyers terméket szilános szilikagéllel töltött oszlopon (18 g, 22 cm) kromatografáljuk, miközben eluálószerként egymás után etilacetát és petróleum-éter 1:2 arányú elegyét, etil-acetát és petróleum-éter 1: 1 arányú elegyét és etil-acetátot alkalmazunk. Az etil-acetát és petróleum-éter frakciókat lassan bepároljuk, így szilárd csapadék válik ki, amelyet leszűrünk. A terméket tartalmazó anyalúgokat egyesítjük, besűrítjük és petróleum-étert adunk hozzá, míg zavarossá nem válik. A terméket leszűrjük, így 0,068 g anyagot kapunk. Hozam: 48%. Op.: 188-191 °C.

Tömegspektrométer (FAB): m/e = 981 (M + H)⁺.

NMR (300 Hz, CDC1₃) azt mutatja, hogy a taxol 2’-proton rezonanciája 4,71 ppm-ről 5,53 ppm-be tolódik el. Az N-etil-csoportok metil-rezonanciát mutattak 1,0 ppm-nél és metilén-rezonanciát 2,52 ppm-nél. A várt vegyület valamennyi rezonancia-jellemzői megtalálhatók a spektrumban.

Elemi analízis a C₅₄H₆₅C1N₂O|₅ összegképlet alapján:

számított: C 63,73%, H 6,43%, N2,75%;

talált: C 64,84%, H 6,84%, N2,89%.

A 3. vegyület fizikai jellemzői:

Molekulatömeg: 1017,56

Op.: 186-189 °C (bomlik)

Oldékonyság: ~ 0,8 mg/ml

Nagy nyomású folyadékkromatográfiás módszer paraméterei:

Oszlop: RP-8, 150 mm hosszú,

4,6 mm i.d.

Eluálószerek: 0,02 mólos acetát (pH = 5) és acetonitril 35: 65 arányú elegye

Detektor: Kratos spektrométer 757

Áramlás sebessége: 1,5 ml/perc Retenciós térfogat: 16,71 ml 3. vegyület

Kémiai stabilitás:

Körülmények: t_1/2 (óra)

0,02 mólos acetát (0,01 mg/ml pH = 3,5, 25 °C) 438,6

0,02 mólos foszfát (0,02 mg/ml, pH = 7,4,25 °C) 0,25

Plazma stabilitás, 37 °C körülmények t,_/2 (perc) humán plazma 4,2

b) 4. vegyület: 2’-[3-(N,N-dietil-amino)-propionil]taxol metánszulfonsav-sójának előállítása A 3-(N,N-dietil-amino)-propionsav metánszulfonsav-sójának előállítása céljából 10 g QAE-sephadexet (Pharmacia) 0,L mólos vizes nátrium-klorid-oldattal 75 óra hosszat nedvesítünk, majd ennek 75%-át egy

HU 206 617 Β oszlopba öntjük. Az oszlopot 700 ml desztillált vízzel mossuk. Az oszlopot ezután 0,5 mólos metánszulfonsavból és 0,5 mólos nátrium-hidroxidból pH = 6-ig történő titrálás útján előállított metánszulfonsavas-nátriummal semlegesítjük. A klorid-ion teljes eltűnését úgy állapítjuk meg, hogy az eluátumokat összegyűjtjük, majd néhány csepp 1%-os ezüst-nitrátot tartalmazó kevés salétromsav hozzáadásával meghatározzuk a klorid-ion-tartalmat. Az oszlopot desztillált vízzel addig mossuk, amíg semleges nem lesz.

2,5 g Ν,Ν-dietil-amino-propionsav sósavas só 15 ml vízzel készített oldatát kromatografáló oszlopba öntjük és vízzel eluálunk. Négy 500 ml-es frakciót összegyűjtünk. Az első néhány frakció tartalmazza a terméket. Ezeket a frakciókat egyesítjük és az oldószert eltávolítjuk. A maradékot metilén-klorid és etanol elegyében eloszlatjuk és magnézium-szulfáttal szárítjuk, majd az oldószer elpárologtatósa után 3,1 g terméket kapunk. Etanol és éter hozzáadásával a terméket kicsapjuk és így 2,6 g Ν,Ν-dietil-amino-propionsav-metánszulfonsavas sót kapunk.

0,05 g (0,058 mmól) taxol és 0,014 g (0,058 mmól) Ν,Ν-dietil-amino-propionsav-metánszulfonsavas sójának 10 ml metilén-kloriddal készített oldatához 0,061 g (0,3 mmól) 1,3-diciklohexil-karbodiimidet adunk. A kapott elegyet 24 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük. A reakcióelegyet szűrjük, majd a szűrletet nitrogén-áramban bepároljuk. A maradékot szilánox szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk, miközben etil-acetát és petróleum-éter 1:1 arányú elegyével, majd etil-acetáttal eluálunk. Az etil-acetát és petróleum-éter frakciókat lepároljuk, így 0,048 g terméket ka-

púnk. Hozam: 74%. Op.:	170-174 °C.
Fizikai tulajdonságok:
Molekulatömeg:	1077,12
Op.:	170-174°C
Oldékonyság:	>10 mg/ml
HPLC tisztaság:	>99%
Kémiai stabilitás:
Körülmények	ti/2 (óra)
0,02 mólos acetát
(pH = 4,5,25 °C)	305
0,02 mólos acetát
(pH = 5,5,25 °C)	20,7

3. példa (X) általános képletű 7-(N,N-dimetil-glicil)-taxol vagy valamely sójának előállítása

a) 5. vegyület: 2’-(Troc)-taxol előállítása

0,27 g (0,316 mmól) taxolt 10 ml metilén-kloridban és 1,5 ml piridinben oldunk. A reakcióelegyet -20 (-25) °C-ra lehűtjük és 80 μΐ 2,2,2-triklór-etil-kloroformiátot adunk hozzá. A reakcióelegyet ezen a hőmérsékleten 3 óra hosszat keverjük. Ezután további 25 μΐ kloroformiátot adunk az elegyhez és a kapott elegyet éjszakán át keverjük. Ezt követően az elegyet 50 ml metilén-kloriddal hígítjuk, majd egymás után 25-25 ml 0,1 n sósav-oldattal kétszer, 25 ml 0,05 mólos hideg nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és vízzel mossuk. A szerves extraktumot vízmentes magnézium-szulfáttal szárítjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk. A nyers terméket szilános szilikagélen történő preparatív vékonyrétegkromatográfiás eljárással tisztítjuk, miközben előhívószerként etil-acetát és petróleum-éter 1:3 arányú elegyét alkalmazzuk, majd a taxol feletti csíkot levágjuk és etil-acetáttal eluálunk, majd az oldószert eltávolítjuk, így 0,32 g terméket kapunk. Hozam: 97%. Op.: 221-226 °C (bomlik, 160 °C-on lágyul).

b) 6. vegyület: 2’-(Troc)-7-(N,N-dimetil-glicil)-taxol előállítása

0(27 g (0,262 mmól) 2’-(Troc)-taxolt és 0,054 g (0,524 mmól) Ν,Ν-dimetil-glicint 15 ml metilén-kloridban eloszlatunk. A kapott oldathoz 0,215 g (1,04 mmól) 1,3-diciklohexil-karbo-diimidet és 0,025 g (0,2 mmól) 4dimetil-amino-piridint adunk, majd az elegyet két napig szobahőmérsékleten keverjük. A reakcióelegyet szűrjük és az oldószert eltávolítjuk. A nyers terméket vékonyrétegkromatográfiásan tisztítjuk, miközben eluálószerként etil-acetát és petróleum-éter 1:1 arányú elegyét alkalmazzuk. A taxol alatti csíkot (Rf = 0,47, etil-acetát és petróleum-éter 1:1 arányú elegye) levágjuk, majd az oldószert eltávolítjuk, így 0,26 g terméket kapunk. Hozam: 89%. Op.: (bomlik).

Elemi analízis a C^H^Cl^Op összegképlet alapján:

számított: C 58,12%, H5,42%, N2,51%;

talált: C 58,68%, H6,00%, N3,13%.

c) 7. vegyület: 7-(N,N-dimetil-glicil)-taxol előállítása

0,335 g (0,3 mmól) 2’-(Troc)-7-(N,N-dimetil-glicil)-taxol 12 ml metanol és ecetsav 9 :1 arányú elegyével készített oldatához 0,275 g cink-reszeléket adunk, majd az elegyet 25 percig szobahőmérsékleten keverjük és szűrjük. A szűrletet 1 ml-re besűrítjük és 35 ml metilén-kloriddal hígítjuk, majd egymás után 20-20 ml 0,01 mólos sósav-oldattal kétszer, 0,01 mólos hideg nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és végül vízzel mossuk. A szerves extraktumot vízmentes nátriumszulfáttal szárítjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk, így 0,24 g terméket kapunk. A vegyületet szilános szilikagélen vékonyrétegkromatografálás útján tisztítjuk (20x30, 3 Nos), miközben előhívószerként metilénklorid és etil-acetát 7:1 arányú elegyét alkalmazzuk. A 7-(DMG)-taxolnak megfelelő csíkot (Rf = 0,35) levágjuk, majd etil-acetát és etanol elegyével eluálunk, utána az oldószert elpárologtatjuk, így 0,19 g nyers terméket kapunk. Hozam: 68%. Op.: 180-185 °C (bomlik, 140 °C körül lágyul).

Tömegspektrométer (FAB) m/e =-939 (M + H)⁺.

NMR spektrum (300 MHz, CDC1₃): a 7-helyzetű proton rezonanciája 4,33 ppm-nél a taxolban kettős dublettként jelenik meg 5,65 ppm-nél. Az N-(CH₃)₂rezonancia szingulettként jelenik meg 2,35 ppm-nél. A glicinát metiléncsoportja 3,16 ppm-nél található.

d) 8. vegyület: 7-(dimetil-glicil)-taxol metánszulfonsavas sójának előállítása

0,65 g (0,069 mmól) 7-(dimetil-glicil)-taxolt 2,5 ml terc-butil-alkoholban és 1 ml vízben oldunk. A kapott oldatot 5-10 °C-ra lehűtjük, majd 3,36 ml, 2 mg/ml, (0,0697 mmól) metánszulfonsavat adunk hozzá. Az

HU 206 617 Β elegyet 2 percig keverjük, majd milliporusos szűrőn leszűrjük egy jéggel hűtött lombikba. A szűrletet liofilizáljuk, így 0,066 g terméket kapunk. Hozam: 94%. Op.: 164-168 °C (bomlik).

Elemi analízis a C₅₂H₆₂N₂O₁₈Sx2H₂O összegképlet

alapján:
számított: C 58,29%, H6,19%, N2,6%;
talált: C 58,05%, H6,00%, N 1,72%.
Fizikai tulajdonságok:
Molekulatömeg:	1035
Op.:	164-168°C
Oldékonyság:	2 mg/ml
HPLC paraméterek:
Oszlop:	RP-8, 150 mm hosszú, 4,6 mm i.d.
Eluálószer:	0,02 mólos acetát (pH = 5) és acetonitril 35 :65 arányú elegye
Detektor:	Kratos spektrométer 757
Áramlás sebessége:	1,5 ml/perc
Retenciós térfogat:	15,07 ml (8. vegyület)
Kémiai stabilitás:
Körülmények	t,_/2 (óra)
0,02 mólos acetát
(pH = 3,5, 25 °C)	3397
0,02 mólos acetát
(pH = 4,5, 25 °C)	1719
0,02 mólos foszfát
(pH = 7,4, 25 °C)	33,8 óra
Plazma stabilitása, 37	°C-on
Körülmények:	t,_/2 (óra)

Patkány plazma (20 pg/ml): 17,3 Humán plazma (20 pg/ml): 27,7 Humán plazma (10 pg/ml): 24,4

4. példa

2’,7-Bisz(dlmetil-gUcÍl)-taxol előállítása

0,06 g (0,0702 mmól) taxolt 5 ml vízmentes metilén-kloridban oldunk, majd 0,015 g (0,145 mmól) N,Ndimetil-glicint adunk hozzá. A kapott elegyhez 0,08 g (0,388 mmól) 1,3-diciklohexil-karbodiimidet és 0,008 g (0,065 mmól) 4-dimetil-amino-piridint adunk. A kapott reakcióelegyet 24 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük, majd szűrjük. Az oldószert elpárologtatjuk és a maradékot szilános szilikagélt tartalmazó lapokon preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel tisztítjuk, előhívószerként etil-acetát és petróleum-éter 1:1 arányú elegyét alkalmazzuk. A dimetilamino-piridin feletti csíkot (Rf=0,17) levágjuk és etilacetát és etanol elegyéveí eluálunk, majd az oldószert elpárologtatjuk. A maradékot etil-acetát és petróleuméter elegyéből átkristályosítjuk, így 0,046 g terméket kapunk. Hozam: 64%.

Op.: 194-198 °C.

Tömegspektrum: m/e = 1024 (M⁺).

NMR spektrum (300 MHz, CDC1₃): a C’₂-proton (4,71 ppm) és a C₇-proton (4,33 ppm) eltolódik 5,5 ppm, illetőleg 5,6 ppm-re, jelezve ezzel, hogy a 2’- és a 7-helyzetben észterifikálás történt. Az N-CH₃ proton is megjelenik szingulettként a

2,33 ppm-nél.

Elemi analízis a C₅₅H₆₆N₃O₁₆ összegképlet alapján: számított: C 63,39%, H 6,48%, N 4,03%;

talált: C63,0%, H6,98%, N3,98%.

2’,7-(N,N-dimetil-glicil)-taxol dimetánszulfonsavsójának előállítása mg (0,0585 mmól) 2’,7-(dimetil-glicil)-taxol 2 ml terc-butanollal és 1 ml vízzel készített, 0-5 °C-ra lehűtött oldatához 11,37 g (3,79 ml, 0,117 mmól) metánszulfonsavat adunk. Az elegyet 0-5 °C-on 2 percig keverjük, majd milliporeszűrőn (0,2 pm) szűrjük és a szűrletet liofilizáljuk, így 62 mg terméket kapunk. Op.: 160-163 °C.

Fizikai tulajdonságok:

Molekulatömeg: 1217

Op.: 160-163 °C

Oldékonyság: >10 mg/ml

HPLC tisztaság: -96%

A HPLC paraméterei:

Oszlop: RP-8, 150 mm, 4,6 mm i.d.

Eluálószer: 0,02 mólos acetát (pH = 5) és acetonitril 50:50 arányú elegye, amely 0,005 m TBA-t tartalmaz

Detektor: Kratos spektrométer 757

Áramlás sebessége: 1 ml/perc Retenciós térfogat: 6,64 ml

5,8 ml (taxol)

5. példa

7-(L-alanil)-taxol vagy valamely sójának előállítása

a) 2’,7-Bisz(Boc-L-alanil)-taxol előállítása

0,21 g (0,246 mmól) taxol és 0,14 g (0,739 mmól) N-terc-Boc-L-alanin 15 ml metilén-kloriddal készített oldatához 0,25 g (1,21 mmól) 1,3-diciklohexil-karbodiimidet és 0,025 g (0,20 mmól) dimetil-amino-piridint adunk. A kapott elegyet 24 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük, majd szűrjük. A maradékot szilános szilikagéllel töltött oszlopon (20 g, 14 cm) kromatografáljuk, miközben eluálószerként etil-acetát és petróleum-éter 1:1 arányú elegyét, majd etil-acetátot alkalmazunk. Az etil-acetát és petróleum-éter frakciókat, amelyek a diszubsztituált származékot tartalmazzák, egyesítjük, majd az oldószert eltávolítjuk, így 0,27 g terméket kapunk. Hozam: 92%. Op.: 158-161 °C (bomlik).

b) 7-(L-alanil)-taxol előállítása

0,29 g 0,242 mmól 2’,7-bisz-(Boc-L-alanil)-taxolt 2 ml hangyasavban elkeverünk, majd a kapott elegyet szobahőmérsékleten 40 percig keverjük, végül a feleslegben lévő hangyasavat nitrogén-áramban eltávolítjuk. A maradékot etanolban eloszlatjuk és petróleumétert adunk az elegyhez. A szilárd anyagot leszűrjük, így 0,27 g 2’,7-di(alanil)-taxolt kapunk.

A nyers dialanil-származékot 4 ml acetonitrilben eloszlatjuk és 50 ml 0,02 mólos (pH = 7,4) foszfát-puffért adunk hozzá, majd a kapott elegyet szobahőmérsékleten 12 óra hosszat keverjük. Az oldat pH-ját néhány ml 5%-os dinátrium-hidrogén-foszfát-oldat hozzáadásával 6,8-ra állítjuk be. A zavaros oldatot szöba1

HU 206 617 Β hőmérsékleten további 8 óra hosszat keverjük. A reakcióelegyet 50 ml metilén-kloriddal hígítjuk és 50 ml 0,05 mólos nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot adunk hozzá. A kapott elegyet azonnal 50-50 ml metilén-kloriddal háromszor extraháljuk és a szerves extraktumot vízzel egyszer mossuk, majd nátrium-szulfáttal szárítjuk. Az oldószert elpárologtatjuk, így 0,24 g terméket kapunk. A kapott vegyületet oszlopkromatográfiás módszerei szilános szilikagéllel töltött oszlopon tisztítjuk, így 0,135 g terméket kapunk. Hozam: 63%. Tisztaság >95%. Op.: 159-163 °C.

Tömegspektrum (FAB) m/e - 925 (M+H)⁺,

NMR spektrum (300 MHz, CDC1₃): a 7-helyzetű hidrogénatom 4,33 ppm-nél a taxolban kettős dublettként jelenik meg 5,65 ppm-nél. A metilcsoport az alanin-részben dublettként jelenik meg 1,27 ppm-nél.

Elemi analízis a C₅₀H₅₈N₂Oi₆x2,5 H₂O összegképlet alapján:

számított: C 61,91%, H6,54%, N2,89%;

talált: C 61,41%, H6,59%, N2,78%.

c) 7-(alanil)-taxol metánszulfonsav-sójának előállítása mg (0,0658 mmól) 7-(alaníl)-taxol 2 ml terc-butanollal és 1 ml vízzel készített, 0 °C-ra lehűtött oldatához 6,39 mg (2,13 ml, 3 mg/ml) metánszulfonsavat adunk és az elegyet ezen a hőmérsékleten 2 percig keverjük, majd millipor szűrőn (0,2 μτη) leszűrjük. A szűrletet liofilizáljuk, így 66 mg terméket kapunk. Op.: 180-184 °C.

Fizikai tulajdonság:

Molekulatömeg: 1021

Op.: 180-184 °C (bomlik)

Oldékonyság: >2 mg/ml

HPCL kromatografálás paraméterei:

Oszlop: RP-8, 150 mm hosszú,

4,6 mm i.d.

Eluálószer: 0,02 mólos acetát (pH = 5) és acetonitril 50:50 arányú elegye, amely 0,001 m tetrabutil-ammónium-hidrogén-szulfátot tartalmaz

Detektor Kratos spektrométer 757

Áramlás sebessége: 1 ml/perc Retenciós térfogat: 8,7 ml

7,3 (taxol)

Plazma stabilitás, 37 °C:

Körülmények t_1/2 (óra)

Humán plazma (20 pg/ml) 11,9

6. példa

2’-(alanil)-taxol előállítása

a) 2’-(CBZ-L-alanil)-taxol előállítása mg (0,0036 mmól) taxol és 8,5 mg (0,036 mmól)

CBZ-L-alanin 5 ml metilén-kloriddal készített oldatához 45 mg DCC-t és 4 mg 4-dimetil-amino-piridint adunk, majd a kapott elegyet szobahőmérsékleten 3 napig keverjük. Ezután az elegyet leszűrjük és az oldószert elpárologtatjuk a szűrletből. A maradékot preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel szilános szilikagélen tisztítjuk, előhívószerként etil-acetát és petróleum-éter 1:1 arányú elegyét alkalmazzuk, majd a taxolt tartalmazó csíkot levágjuk és etil-acetáttal eluálunk. Az oldószert elpárologtatjuk, így 28 mg 2’(CBZ-L-alanil)-taxolt kapunk.

b) 2’-(alanil)-taxol előállítása 2’(CBZ-L-alanil)-taxolból a védőcsoport eltávolítása útján 2’-(CBZ-L-alanil)-taxolt etanolban eloszlatunk valamilyen szerves sav, például ecetsav vagy hangyasav jelenlétében, majd a kapott elegyet szobahőmérsékleten 2 óra hosszat keverjük 5% palládiumot tartalmazó szén jelenlétében. A reakcióelegyet szűrjük, így a katalizátort eltávolítjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk. A nyers terméket etanolban eloszlatjuk, majd petróleum-étert adunk hozzá, így 2’-(alanil)-taxolt kapunk formiát- vagy acetát-só alakjában mérsékelt hozammal.

7. példa

2'-(lizil)-taxol előállítása

a) 2’-(N-di-Boc-lizil)-taxol előállítása mg (0,035 mmól) taxol és 19 mg (0,0368 mmól) N-di-Boc-L-lizin 10 ml diklór-metánnal készített elegyéhez 100 mg DCC-t és 10 mg 4-dimetil-amino-piridint adunk, majd a kapott elegyet szobahőmérsékleten 2 napig keverjük, utána szűrjük. Az oldószert elpárologtatjuk a szűrletből. A maradékot preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel szilános szilikagélen tisztítjuk, előhívószerként etil-acetát és petróleum-éter 1:1 arányú elegyét alkalmazzuk, majd a taxol feletti csíkot levágjuk és etil-acetáttal eluálunk. Az oldószert ezután elpárologtatjuk, így 20 mg terméket kapunk.

b) 2’-(lizil)-taxol előállítása a Boc-csoport eltávolítása útján

A taxol N-Boc-csoporttal védett aminosav-származékát szobahőmérsékleten 99%-os hangyasavval (Sigma) 30-40 percig reagáltatjuk. A feleslegben lévő hangyasavat nitrogén-áramban történő bepárlással eltávolítjuk. A nyers terméket kristályosítással vagy kromatografálással tisztítjuk, így a taxol aminosav-származékát kapjuk formiát alakjában, amely a nitrogénatomon védőcsoportot nem tartalmaz.

8. példa

2' -(L-alanil)-taxol előállítása

a) 2’-(FMOC-L-alanil)-taxol előállítása mg (0,072 mmól) taxol és 22,4 mg N-FMOC-Lalanin 6 ml metilén-kloriddal készített oldatához 60 mg DCC-t és 2 mg 4-dimetil-amino-piridint adunk, majd a kapott elegyet szobahőmérsékleten 2 napig keverjük, utána szűrjük. A szűrletből az oldószert elpárologtatjuk. A nyers terméket szilánkos szilikagéles vékonyrétegkromatográfiával tisztítjuk, előhívószericént etil-acetát és petróleum-éter 1:2 arányú elegyét alkalmazzuk. A taxol feletti csíkot levágjuk és metilén-kloriddal eluálunk. Az oldószert elpárologtatjuk, így 48 mg tennéket kapunk, amely 2’-(FMOC-L-alanil)taxolból áll. Op.: 162-164 °C (bomlik).

b) A taxol védett aminosav-származékából az

FMOC védőcsoport eltávolítása

HU 206 617 Β

A taxol N-FMOC-csoporttal védett aminosav-származékát piperidinnek metilén-kloriddal készített elegyével reagáltatjuk 2 óra hosszat, majd az oldószert eltávolítjuk. A maradékot kromatográfiásan tisztítjuk, így a taxol védőcsoportot nem tartalmazó aminosav-származékát kapjuk.

Gyógyszerkészítmények előállítása

A találmány szerinti vegyűleteket önmagukban is, de ezen vegyületek gyógyászatilag elfogadható sóit, előnyösen a nem-toxikus, gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóit vagy bázikus sóit is alkalmazhatjuk hatóanyagként gyógyászati készítmények előállítására. Ezeket a sókat a találmány szerinti vegyületekből szokásos kémiai módszerekkel elő lehet állítani.

Általában ezen sókat úgy állítjuk elő, hogy a szabad bázist vagy savat sztöchiometrikus mennyiségű vagy feleslegben vett, a kívánt só képzésére alkalmas szervetlen vagy szerves savval reagáltatjuk alkalmas oldószerben vagy különböző oldószerek kombinációjában. így például a szabad bázist a megfelelő sav vizes oldatában eloszlatjuk, majd a keletkezett sót ismert módon, például az oldószer elpárologtatása útján nyerjük ki. Egy másik módszer szerint a szabad bázist egy szerves oldószerben, például rövid szénláncú alkanoilokban, éterekben, alkil-észterekben vagy ezek elegyeiben, így metanolban, etanolban, éterben, etil-acetátban, etil-acetát és éter elegyében és hasonlókban eloszlatjuk, majd a megfelelő savat hozzáadjuk és így a kívánt só képződik. A keletkezett sót ismert módon, például szűréssel, vagy az oldatból történő szétválasztással kinyerjük, vagy kicsaphatjuk a sót oly módon, hogy olyan oldószert adunk az elegyhez, amelyben a só nem oldódik.

A találmány szerinti taxol-származékokat citotoxikus hatásuk, antitumoros aktivitásuk miatt rákos megbetegedések kezelésére használhatjuk. Az új vegyületeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények lehetnek tabletták, pirulák, por-keverékek, kapszulák, injekciók, oldatok, végbélkúpok, emulziók, diszperziók, táp-premixek vagy más megfelelő formák. A gyógyszerkészítmények előállításakor a hatóanyagot nem-toxikus, gyógyszerészeti szempontból elfogadható szerves vagy szervetlen vivőanyagokkal és segédanyagokkal összekeverjük. Adagolási egységenként 0,01 mg-2500 mg mennyiségű, előnyösen 50-500 mg mennyiségű hatóanyagot alkalmazunk. Szokásos gyógyszerészeti vivőanyagok például a mannit, karbamid, dextránok, laktóz, burgonyakeményítő, kukoricakeményítő, magnézium-sztearát, talkum, növényi olajok, polialkilén-glikolok, etil-cellulóz, polivinii-pirrolidon, kalcium-karbonát, etil-oleát, izopropil-mirisztát, benzil-benzoát, nátrium-karbonát, zselatin, káliumkarbonát, kovasav és más szokásosan alkalmazott, gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyagok. A gyógyszerkészítmények tartalmazhatnak nem-toxikus segédanyagokat is, például emulzifikáló, tartósító, nedvesítő szereket, ilyenek például a szorbitánmonolaurát, trietanol-amin-oleát, polioxi-etilén-monosztearát, gliceril-tripalmitát, dioktil-nátrium-szulfoszukcinát és hasonlók.

A hatóanyagot tartalmazó tabletták előállítására szolgáló általános módszer szerint a hatóanyagot először nem-toxikus kötőanyaggal, például zselatinnal, gumiarábikummal, etil-cellulózzal vagy hasonlókkal összekeverjük. A keverést általában egy standard keverőkészülékkel végezzük, többnyire vízmentes körülmények között. Az így elkészített keveréket szokásos tablettázó gépen engedjük keresztül és így tablettákká formulázzuk. A frissen elkészített tablettákat bevonattal láthatjuk el vagy pedig bevonat nélkül hagyjuk. Alkalmas bevonószerek lehetnek a shellac, metil-cellulóz, camauba-viasz, sztirén és maleinsav kopolimer és hasonlók. Orális kezelés céljára 0,01 mg, 5 mg, 25 mg, 50 mg, 500 mg stb., egészen 2500 mg hatóanyagot tartalmazó tablettákat a fenti előállítási módszerekkel készíthetünk vagy a szakember számára ismert és a Reminton’s Pharmaceutical Science kézikönyv 39. fejezetében (Mack Publishing Co., 1965) leírt módszerek szerint járhatunk el.

A tabletták készítésekor a hatóanyagot, kukoricakeményítőt, laktózt, dikalcium-foszfátot és kalcium-karbonátot vízmentes körülmények között egy szokásos keverőkészülékben egyenletesen keverjük mindaddig, amíg a hatóanyagok egyenletesen el nem keverednek. Ezután a kukoricakeményítő-pasztát készítjük el 10%os paszta formájában és hozzákeverjük a frissen elkészített keverékhez mindaddig, amíg egyenletes keveréket nem kapunk. Az így kapott keveréket ezután szárítjuk, majd kalcium-sztearáttal összekeverjük és tablettákká préseljük, majd szükséges esetben bevonattal látjuk el.

A 10, 50, 100, 150 mg-os stb. tablettákat hasonlóképpen készítjük.

Az 1. gyógyszerformulázási példa a hatóanyagként valamely találmány szerinti vegyületet tartalmazó tabletta formulálását szemlélteti.

1. gyógyszerformulázási példa

Összetétel	Tablettánkéiul mennyiség (mg)
Hatóanyag	50,0
Kukoricakeményítö	15,0
Kukoricakemény ítö-paszta	4,5
Kalcium-karbonát	15,0
Laktóz	67,0
Kalcium-sztearát	2,0
Dikalcium-foszfát	50,0

Orális kezelésre alkalmas, 10 mg - 2500 mg hatóanyagot tartalmazó kapszulákat úgy készítünk, hogy a hatóanyagot nem-toxikus vivőanyaggal összekeverjük és a keveréket egy polimer tokba, rendszerint zselatinból vagy hasonló anyagból készült tokba tesszük. A kapszula lehet lágy kapszula, amikor is a hatóanyagot diszperzió alakjában ehető, kompatibilis vivőanyagba töltjük, vagy lehet kemény kapszula, amikor is az új. vegyületet nem-toxikus szilárd anyaggal, például tal10

HU 206617 Β kummal, kalcium-sztearáttal, kalcium-karbonáttal vagy hasonlókkal keverjük össze. A 25 mg, 75 mg, 125 mg stb. új vegyületet, vagy két vagy több vegyületet tartalmazó kapszulákat például az alábbi 2. gyógyszerformulázási példa szerinti módon készíthetjük el:

2. gyógyszerformulázási példa

Összetétel	Kapszulánként] mennyiség (mg)
Hatóanyag	50,0
Kalcium-karbonát	100,0
Laktóz, U. S. P.	200,0
Keményítő	130,0
Magnézium-sztearát	4,5

A fenti komponenseket egy szokásos keverőgépben összekeverjük, majd a kereskedelemben hozzáférhető kapszulákba töltjük. Ha nagyobb koncentrációjú hatóanyagra van szükség, akkor a laktóz mennyiségét ennek megfelelően csökkentjük.

A találmány szerinti vegyületeket liofílizálhatjuk, ha szükséges, vagy összekeverhetjük más, gyógyszerészeti szempontból elfogadható segédanyagokkal és így parenterális vagy injekciózásra alkalmas gyógyszerkészítményeket állíthatunk elő. Ilyen kezelések céljára a gyógyszerkészítmény készülhet vízzel, azaz normál vízzel vagy só-oldattal, vagy víz és egy szerves oldószer elegyével, például propilén-glikollal, etanollal és hasonlókkal.

Az adagolási egységek egy vagy több, vagy a napi adag a találmány szerinti adott vegyülettől függően változhat, mivel a vegyületek hatékonysága különbözik, függ továbbá a választott kezelés módjától, a beteg állapotának természetétől. A kezeléshez alkalmazandó adag nem egy megszabott mennyiség, hanem általában egy olyan hatékony mennyiség vagy molárisán ekvivalens mennyiség a farmakológiailag hatásos szabad formával, amely az adagolási formából keletkezik a hatóanyag metabolizálódása során, mint amennyi a kívánt farmakológiai vagy fiziológiai hatás eléréséhez szükséges. A kezeléshez alkalmazni kívánt adag általában 0,8-8 mg/kg testtömeg vagy 50-275 mg/m², előnyösen 230-275 mg/m² testfelület.

Biológiai hatékonyság

A taxol-származékok - ahogy ezt a fentiekben említettük - tumorellenes hatással rendelkeznek. Ezek a vegyületek különösen hasznosak ugyanazon rákbetegségek kezelésére, mint amelyeknél a taxol hatásosnak bizonyult, így a humán tüdőtumorok, melanóma, leukémia, emlőrák és vastagbélrák.

A taxol-származékok biológiai aktivitását az alábbi tesztekben vizsgáltuk:

A) in vitro vizsgálatokban a mikrotubulus rendszer kialakulásának kinetikáját mértük,

B) in vitro vizsgálatokban a B 16 melanóma sejt-kultúra kinetikájának mérése,

C) in vivő vizsgálatok MX-1 vesetok xenografton.

A) A mikrotubulusos rendszer kialakulásának in vitro vizsgálata

A mikrotubulusok az eukariota sejtek nélkülözhetetlen részei és a mikrotubulusos rendszer kialakulása alapvetően összefügg a sejtosztódással és szaporodással. Kimutattuk, hogy a mikrotubulusos polimerizáció nagyon érzékeny a kalciumra; a kalcium gátolhatja a tubulusok összekapcsolódását és depolimerizálhatja a kezdeti összekapcsolódás állapotában lévő mikrotubulusokat. Ismert tumorgátlóknak a mikrotubulusos rendszerre kifejtett hatását vizsgáltuk.

A vinka-alkaloidokról, így a vinblasztinról és a vinkrisztinről kimutatták, hogy szétszakítják a sejtben lévő mikrotubulusokat, vagyis in vitro körülmények között gátolják a mikrotubulusok összekapcsolódását és depolimerizálják a kialakult mikrotubulusokat.

Hasonló módon a colchinin is depolimerizálja a sejtekben a mikrotubulusokat.

A taxol azonban nagyon különleges módon fejti ki hatását, amennyiben a mikrotubulusok kialakulását elősegíti, ugyanakkor gátolja a kialakult mikrotubulusok szétesését, miközben megzavarja a sejtciklus és osztódás G₂ és M fázisait. In vitro vizsgálatok bizonyították, hogy az egyszer már polimerizált mikrotubulusok taxol jelenlétében ellenállnak a depolimerizációnak, amit bizonyos szerek, így kalcium-klorid vagy a hideg hőmérséklet váltanak ki.

A találmány szerint a taxol-származékoknak a mikrotubulusos rendszer kialakulására kifejtett hatását vizsgáltuk. A mikrotubulusos rendszer vizsgálatát elvégeztük a 2’- és a 7-származékkal is in vitro körülmények között, például a Mellado és munkatársai; Biochemical and Biophysical Research Communications, 124, 2. szám 329-336. oldalak (1984); Magri és munkatársai: J. Org. Chem., 57,797-802. (1986) és Pamess és munkatársai: Biochemical and Biophysical Research Communications, 705, 3. szám 1082-1091. oldalak (1982) közleményekben ismertetett módon. Ezeknek a vegyületeknek a mikrotubulusokra kifejtett hatásának képessége az alábbi sorrendet követi: taxol >7(N,N-dimetil-glicil)-taxol (11) >2’-(N,N-dietil-aminopropionil)-taxol (8) >2’-(N,N-dimetil-glicil)-taxol (2). Ez a vizsgálat azt mutatja, hogy a mikrotubulusok kialakulásában a szabad 2’-hidroxil-csoportnak alapvető szerepe van. A 2’-származék csak abban az esetben aktív, ha a 2’-hidroxilcsoport a kísérlet során szabad állapotban volt. A 7-származékok szabad 2’-hidroxilcsoporttal rendelkeznek, ezért aktívak. Ez az eredmény összhangban van a 2’- és 7-acetil-taxol-származékoknak a szakirodalomban ismertetett aktivitásával.

B) In vitro B-16 sejtkultúra vizsgálatok

A találmány szerinti taxol-származékok hatásának bizonyítására B-16 melanoma-sejtekkel in vitro sejtvizsgálatokat végeztünk. Ezeket a vizsgálatokat standard leírások szerint végeztük el.

A B-16 melanóma sejt-proliferációs vizsgálatokban a hatékonyság sorrendje az alábbi volt: taxol >2’-(N,Ndimetil-glicil)-taxol >2’-(N,N-dietil-amino-propionil)taxol >7-(N,N-dimetil-glicil)-taxol. Ezek a vizsgálatok és más kinetikai vizsgálatok azt jelzik, hogy a 2’-szár11

HU 206 617 Β mazékok taxollá visszaalakulnak és így fejtik ki hatásukat, ily módon feltehetően a taxol előgyógyszerének tekinthetők. Másrészt a 7-származékok saját maguk bizonyultak hatásosnak, vagyis nem tekinthetők előgyógyszemek.

C) In vivő vizsgálatok

A kísérletek harmadik típusa szerint a taxol-származékok biológiai aktivitását in vivő kísérletekben egereken vizsgáltuk meg MX-1 vesetokban, humán emlőrákos tumorsejteken. A kísérlet során a ΝΙΗ Publication No. 84-2635, In Vivő Cancer Model (1984. február) 23-24. oldalán ismertetett módszert alkalmaztuk.

A vizsgálat során vizsgálati csoportonként 6 egeret, továbbá egy 12 egérből álló kontroli-csoportot alkalmaztunk. A tumor-fregmentumot (humán MX-1 emlőrák) a vesét borító membrán alá implantáltuk mindegyik egérben.

A kísérlet menete:

0. nap: Anesztetizált állatok. Testtömeg mérése (első napi mérés). Tumor implantálása, mérés és adatok feljegyzése. Altatásból felébredt állatok randomizálása. Baktérium-kultúrák készítése. A tesztanyag oldékonyságának vizsgálata. Elhullás napi feljegyzése.

1. nap: Kultúrák ellenőrzése. Fertőzés esetén a kísérlet megszakítása. Tesztanyagok készítése. Kezdeti tesztanyag-injekció a nyakszirtbe az egyéni testtömeg alapján. A kezelés az 1., 5. és 9. napon történik (Q4D). A tesztanyagot mindegyik injekciózási napon frissen készítjük el és a kezelés az aznapi testtömeg alapján történik.

2. nap: Kultúrák ismételt ellenőrzése. Fertőzés esetén a kísérlet megszakítása és ennek megfelelő jelentés készítése.

5. és 9. nap: Tesztanyagot frissen elkészítjük mindegyik injekciózási napon és az esedékes napi testtömeg alapján történik a kezelés.

11. nap: A kísérlet befejezése és kiértékelése.

A testtömeg mérése (2. tömeg-mérés). A tumor mérése OMU-ban (Ocular Micrometer Unit - 10 OMU = 1 mm) és feljegyzése.

a T/C értékeket számoljuk ki valamennyi tesztcsoportra, amelyek all. napon 65%-nál nagyobb túlélést mutattak. A toxicitás kiértékelésében a kiemelkedően magas testtömeg-változást (tesztből levonjuk a kontrollt) is figyelem5 be vehetjük. A dimenziókat OMU-ban (Ocular Micrometer Unit-ban) mérjük és jegyezzük fel. A számítógépet az alábbiak szerint alkalmazzuk:

1) OMU-t milliméterbe számítjuk át (mm)

2) a tumor tömegét (mg) a tumor méreteiből (mmxmm) az alábbi képlet szerint számítjuk ki egy nyújtott ellipszoidra vonatkozóan:

Lxw²

2 ’ ebben a képletben L jelentése a két méret közül a hosszabbik.

3) A közepes tumor-tömeg változását számítjuk ki 20 mindegyik egér-csoportra vonatkozóan:

Közepes tumor-tömeg változása =

Közepes tumor-tömeg_végs(5 - közepes tumor-tömegkczdcti

4) a teszt-csoport (T) és a kontroli-csoport (C) közepes tumor-tömeg változásának kiszámítása

5) A T/C % kiszámítása valamennyi teszt-csoportra, amelyek 65%-nál nagyobb túlélést mutattak az utolsó kiértékelési napon:

T/C % =

AWtT

AWtC xlOO ha a A WtT pozitív

T/C % = __AWtT_

Teszt átlagos tumortömege_kczdcti

X100

Kiértékelés:

Mérjük az átlagos tumor-tömeg változását a tumor hosszának és szélességének mérése alapján mm-ben. Az állatok közepes testtömegének mérése az 1. és 11. napon, ha a AWtT negatív

A hatásosság kritériumai:

Csekély aktivitás jelzésére kezdeti T/C < 20% szükséges. Reprodukálható T/C < 10% szignifikáns aktivitásnak tekintendő.

A taxol-származékokkal végzett vizsgálatok eredményeit az 1. és 2. táblázatok tartalmazzák.

/. táblázat

Humán emlőrák-tesztek

Kezelés GRP szám	Vegyület	Adag mg/kg	T/C %	Átlagos tumor-tömeg
Kezdeti (mg)	Végső (mg)	Tömeg- változás	Túlélők %	Testtö- meg	Testtö- meg változás
0001	kontroll	,00	kontroll	,75	,1	12,79	2,4	12,04	11/12
0102	taxol	22,40	tox^b	,60	,1	,00	,0		3/6	-2,6	-,9
0103	taxol	15,00	CR^C	,81	,1	,00	,0	- ,81	6/6	-4,2	-2,5
0104	taxol	10,00	-84	,58	,1	,09	,1	- ,49	6/6	-2,0	-.3
0105	taxol	6,67	CR	,74	,1	,00	,0	.-,74	5/5	-1,5	/ ,2

HU 206 617 Β

Kezelés GRP szám	Vegyület	Adag mg/kg	T/C %	Átlagos tumor-tömeg
Kezdeti (mg)	Végső (mg)	Tömeg- változás	Túlélők %	Testtö- meg	Testtö- meg változás
0106	taxol	4,45	CR	,79	,1	,00	,0	-.79	5/5	-1,2	,5
0207	vegyület 1®	30,00	Tox	,68	,1	,00			1/6	-3,8	-2,1
0208	vegyület l^a	20,00	CR	,56	,0	,00	,0	-,56	4/6	-2,2	-,5
0209	vegyület 1®	13,30	CR	,64	,1	,00	,0	-.64	4/6	-2,3	-,6
0210	vegyület 1®	8,90	-53	,77	,1	,36	,4	-,41	5/6	-,9	,8
0211	vegyület 1®	5,90	-78	,61	,1	,13	,1	-.48	6/6	-2,2	-,5

a - Vegyület 1 - 2’-(N,N-dimetil-glicil)-taxol b - Tox - toxikus hatást jelzi c - CR - a tumor teljes visszahúzódását jelzi (complete remission)

2. táblázat

Humán emlőrák-tesztek

Kezelés GRP szám	Vegyület	Adag mg/kg	T/C%	Átlagos tumor-tömeg
Kezdeti (mg)	Végső (mg)	Tömeg- változás	Túlélők %	Testtö- meg	Testtö- meg változás
0310	taxol	15,00	TOX^C	,80	,1				0/5
0311	taxol	7,50	TOX	,82	,1	,00	,0		3/5	-1,7	2,3
0312	taxol	3,75	CR^d	,71	,1	,00	,0	-.71	4/5	-2,9	1,1
0313	taxol	1,88	5	,80	,1	1,51	1,5	,71	4/5	-1,0	3,0
0001	kontroll	,00	kontroll	,77	,1	15,38	2,2	14,61	10/11
0102	vegyület 7®	33,00	CR	,74	,1	,00	,0	-.74	4/5	-2,7	1,3
0103	vegyület 7®	16,50	-93	,59	,1	,04	,0	-,55	3/4	-5,7	-1,7
0104	vegyület 7®	8,25	23	,81	,1	4,19	1,5	3,38	4/4	-3,9	,1
0105	vegyület 7®	4,13	34	,74	,1	5,66	1,3	4,92	4/5	-4,5	-,5
0206	vegyület 3^b	36,00	TOX	,75	,1				0/5
0207	vegyület 3^b	18,00	CR	,82	,1	,00	,0	-,82	3/4	-3,3	,7
0208	vegyület 3^b	9,00	CR	,87	,1	,00	,0	-.87	5/5	-2,7	1,3
0209	vegyület 3^b	4,50	CR	,78	,1	,00	,0	-,78	5/5	-2,8	1,2

a vegyület 7 - 7-(N,N-dimetil-glicil)-taxol b vegyület 3 - 2’-[3-(N,N-dietil-amino)-propionil]-taxol c TOX - toxikus hatást jelzi d CR - a tumor teljes visszahúzódását jelzi (complete remission)

A fentiekből látható, hogy a találmány szerinti taxolszármazékok kiváló tumorellenes hatással rendelkeznek. Ezek a vegyületek tehát biológiai hatásuknál fogva és a taxolhoz képest kedvezőbb vízoldékonyságuk miatt tumorellenes szerként hasznosíthatók.

A találmány fenti leírásából nyilvánvaló, hogy a találmányt sokféleképpen lehet változtatni. Ezek a vál- 55 tozatok nem tekinthetők a találmány szellemétől és oltalmi körétől való lényeges eltérésnek, továbbá mindezek a változtatások nyilvánvalóak a szakember számára és így a találmány szabadalmi igénypontok által meghatározott oltalmi körébe tartoznak. 60

Claims

1. Eljárás a (Π) általános képletű taxol-aminosav-észterek ebben a képletben

R és R’jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy alanin-, glicin-, leucin-, izoleucin-, valinvagy lizin-maradék, vagy pedig (III) általános képletű csoport, ahol

R² és R³jelentése 1-3 szénatomos alkilcsoport, és n jelentése 1,2 vagy 3 azzal a megszorítással, hogy R és R¹ jelentése ugyanabban a vegyületben nem lehet egyaránt hidrogénatom,

HU 206 617 Β továbbá hogy a 2’-(P-aIanil)-taxol nem tartozik az előállítandó (II) általános képletű vegyületek körébe és savaddíciós sóik előállítására, azzal.jellemezve, hogy

a) az R és R¹ szubsztituensek legalább egyike helyén (III) általános képletű csoportot - ahol R², R³ és n jelentése egyezik a tárgyi körben megadottal, és ha R és R* közül csak az egyiknek a helyén áll (III) általános képletű csoport, akkor a másiknak a helyén hidrogénatomot - tartalmazó (II) általános képletű vegyületek előállítása esetén a taxolt valamely (IV) általános képletű vegyülettel - ahol R², R³ és n jelentése egyezik a fent megadottal - reagáltatjuk és kívánt esetben egy kapott, R és R¹helyén egyaránt (III) általános képletű csoportot tartalmazó (II) általános képletű taxol-diészterből a 2’-helyzetű (III) általános képletű csoportot lehasítjuk; vagy

b) az R és R¹ szubsztituensek legalább egyike helyén alanin-, glicin-, leucin-, izoleucin, valin- vagy lizin-maradékot - és ha R és R¹ közül csak az egyiknek a helyén áll ilyen aminosav-maradék, akkor a másiknak a helyén hidrogénatomot - tartalmazó (II) általános képletű vegyületek előállítása esetén a taxolt a bevinni kívánt aminosav-maradékoknak megfelelő, adott esetben a nitrogénatomon védett, aminosavval reagáltatjuk, és adott esetben a termékben jelen levő védó'csoportot lehasítjuk, és kívánt esetben egy kapott, R és Rl helyén egyaránt aminosav-maradékot tartalmazó (II) általános képletű vegyületből a 2’-helyzetű aminosav-maradékot lehasítjuk; vagy

c) az R helyén hidrogénatomot és R* helyén (III) általános képletű csoportot - ahol R², R³ és n jelentése egyezik a tárgyi körben megadottal - vagy valamely a tárgyi körben megadott aminosav maradékot tartalmazó (II) általános képletű vegyületek előállítása esetén

- a taxolt egy hidroxil-védőcsoport kialakítására alkalmas vegyülettel reagáltatva a 2-helyzetben védett származékká alakítjuk; majd

- a kapott, 2-helyzetben védett taxolt alaninnal, glicinnel, leucinnal, izoleucinnal, valinnal vagy lizinnel, vagy pedig valamely (IV) általános képletű vegyülettel - ahol R², R³ és n jelentése egyezik a fent megadottal - reagáltatjuk; és

- a 2’-helyzetű védó'csoportot lehasítjuk;

és kívánt esetben a fenti eljárások bármelyike szerint kapott (II) általános képletű vegyületet ismert módon savaddíciós sóvá alakítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti a) vagy b) eljárás az R¹helyén hidrogénatomot tartalmazó (II) általános képletű vegyületek - ahol R hidrogénatom kivételével egyezik az 1. igénypont tárgyi körében megadottal - előállítására, azzal jellemezve, hogy a taxolt és a (IV) általános képletű vegyületet - ahol R² és R³ jelentése egyezik a fent megadottal - illetőleg az R fenti meghatározásában megadott egyéb, adott esetben védett aminosavat 1:1 mól-ekvivalens arányban reagáltatjuk egymással.

3. Az 1. igénypont szerinti a) vagy b) eljárás az R és

R¹ helyén egyaránt a fenti meghatározásnak megfelelő, hidrogénatomtól különböző szubsztituenst tartalmazó (II) általános képletű vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy 1 mól-ekvivalens taxolt 2 mól-ekvivalens (IV) általános képletű vegyülettel - ahol R² és R³jelentése egyezik a fenti meghatározás szerintivel -, illetőleg az R és R¹ fenti meghatározásában megadott egyéb, adott esetben védett aminosavval reagáltatunk.

4. Az 1. igénypont szerinti a) vagy b) eljárás az R helyén hidrogénatomot és R¹ helyén a fenti meghatározásnak megfelelő, hidrogénatomból különböző szubsztituens tartalmazó (II) általános képletű vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy kapott, a 7-helyzetben a kívánt R¹ szubsztituenst tartalmazó 2’,7-diszubsztituált (II) általános képletű vegyületből a 2’helyzetű szubsztituenst lehasítjuk.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2’-szubsztituens lehasítását 7 - 7,4 pH-értékben folytatjuk le.

6. Az 1. igénypont szerinti bármelyik eljárás, azzal jellemezve, hogy a taxolnak a (IV) általános képletű vegyülettel - ahol R² és R³ jelentése egyezik a fenti meghatározás szerintivel illetőleg az R és R¹ fenti meghatározásának megfelelő, adott esetben védett egyéb aminosavval való reagáltatását kondenzálószer és valamely alkalmas katalizátor jelenlétében vagy katalizátorjelenléte nélkül folytatjuk le.

7. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy a védőcsoport lehasítását enyhe sav alkalmazásával folytatjuk le.

8. Az 1. igénypont szerinti c) eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2’-helyzetben védett 7-szubsztituált taxol 2’-védőcsoportjának lehasítását a vegyület cinkkel és ecetsavval való kezelése útján folytatjuk le.

9. Az 1. igénypont szerinti a) vagy c) eljárás 2’-(N,Ndimetil-glicil)-taxol előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk az eljárásban.

10. Az 1. igénypont szerinti a) vagy c) eljárás 2’(N,M-dietil-amino-propionil)-taxol előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk az eljárásban.

11. Az 1. igénypont szerinti a) vagy c) eljárás 7-(N,Ndimetil-glicil)-taxol vagy savaddíciós sója előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk az eljárásban.

12. Az 1. igénypont szerinti a) vagy c) eljárás, 2’,7di-(N,N-dimetil-glicil)-taxol vagy savaddíciós sójának előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk az eljárásban.

13. Az 1. igénypont szerinti b) vagy c) eljárás 7-(alanil)-taxol vagy savaddíciós sójának előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk az eljárásban.

14. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az előző igénypontok bármelyike szerint előállított (II) általános képletű vegyületet - ebben a képletben

R és R‘jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy alanin-, glicin-, leucin-, izoleucin-, valin14

HU 206 617 Β vagy lizin-maradék, vagy pedig (III) általános képletű csoport, ahol

R² és R³jelentése 1-3 szénatomos alkilcsoport és n jelentése 1,2 vagy 3 azzal a megszorítással, hogy R és R¹ jelentése ugyan- 5 abban a vegyületben nem lehet egyaránt hidrogénatom, továbbá, hogy a 2’-(P-alanil)-taxol nem tartozik az előállítandó (II) általános képletű vegyületek körébe vagy gyógyászatilag elfogadható sóját gyógyszerészeti vivőanyaggal és/vagy egyéb segédanyaggal való öszszekeverés útján gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

15. A14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 2’-(N,N-dimetil-glicil)-taxolt alkalmazunk.

16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 2’-(N,N-dietil-amino-propionil)taxolt alkalmazunk.