HK40113645A - 癌症疗法 - Google Patents

Description

癌症疗法

本申请是申请日为2019年3月19日的PCT国际专利申请PCT/EP2019/056770进入中国国家阶段的中国专利申请号201980033607.0、发明名称为“癌症疗法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种修饰的溶瘤腺病毒；包含其的药物组合物；和使用其治疗癌症的方法。

背景技术

在过去的十年期间，随着免疫疗法和刺激患者自身的免疫系统靶向和攻击癌症已经得到普及，对溶瘤病毒在癌症治疗中的作用的认识已经发生了显著的变化。在本世纪初，溶瘤病毒被认为是在癌症治疗中仅通过它们通过溶瘤作用溶解肿瘤细胞的固有能力而起作用的活性剂。近来，它们作为癌症疫苗的用途已经受到关注，并且它们在溶瘤时从癌细胞中释放肿瘤抗原以激活免疫系统的能力被认为是设计对抗癌症的最终免疫疗法中的重要特征。

腺病毒是在对抗感染性疾病的各种疫苗方法中通常用作载体的高免疫原性病毒。重要的是，它们具有出色的引发和加强免疫应答的能力。此外，肿瘤内溶瘤腺病毒的存在以及它所引起的免疫原性细胞死亡可能通过引起TH1型免疫调节因子，如IFNγ的表达来使不利的肿瘤微环境朝向更易感的状态发展而发生临床相关的抗肿瘤免疫。然而，溶瘤腺病毒的免疫原性是一把双刃剑；抗病毒免疫通常是如此压倒性的，以至于它超越了针对由肿瘤表达的自身抗原而引发的弱得多的免疫应答。

肽疫苗在癌症的免疫疗法中一直是一个有吸引力的概念，但是传统的肽疫苗方法的临床功效一般被认为是不佳的。癌症疫苗递送癌症抗原与佐剂的组合，所述佐剂应当提供必要的炎症信号以发动抗肿瘤免疫应答。然而，中枢和外周耐受性以及在肿瘤进展时免疫编辑的过程通常会导致T细胞反应性的丧失，这在选择用于肽疫苗的候选肽时在体外被观察到。即使肿瘤表达所选的抗原，当前的疫苗佐剂也根本不够强效而无法破坏免疫抑制的肿瘤中的耐受性。此外，许多肽疫苗方法是基于与结合MHC I类的CD8+T细胞表位的精确的最小序列匹配的短肽。尽管在临床前肿瘤模型中获得了令人鼓舞的结果，但是短肽已经被证实会引起患者的全身性外周耐受性，推测这是由于肽被缺乏重要的共刺激信号的非专职性APC或未成熟的DC提呈所致。

本发明以这样的方式结合了上述两种疫苗方法，所述方式利用了这两者的优点。将溶瘤腺病毒和癌症抗原组合的物理实体解决了以下问题：a)对于免疫细胞，病毒特异性靶标压倒性地强而没有充足的肿瘤特异性靶标；b)佐剂弱的问题；和c)短肽疫苗引发中枢耐受性的问题。因此，本发明涉及肽包被的条件复制型腺病毒(PeptiCRAd)，它是以下两种临床证明的癌症免疫疗法以创新且独特的方式相结合：溶瘤腺病毒和肽疫苗。PeptiCRAd使用免疫原性病毒作为肿瘤特异性肽的活性载体以引导免疫系统特异性地靶向并杀死癌细胞。此外，与遗传编码肿瘤抗原的溶瘤病毒疫苗相反，用免疫原性肽包被腺病毒使得PeptiCRAd技术高度适应于所有癌症；可以使用相同的载体病毒来治疗所有癌症并且只需通过用不同的多聚赖氨酸延伸肽包被所述病毒即可进行适应。这种独特的技术利用了腺病毒的显著的免疫原性并且同时将CD8+T细胞应答引导到肿瘤组织。

发明内容

根据本发明的第一个方面，提供了一种修饰的腺病毒或载体，其包含：

以下多肽中的至少一种，所述多肽共价或非共价连接到病毒衣壳上，而并非由所述腺病毒载体遗传编码：

i)VFGIELMEVDPIGHLYIFAT[SEQ ID NO:1]MAGE-A3 161-180；

ii)YLAMPFATPMEAELARRSLA[SEQ ID NO:2]NY-ESO-1 91-110；

iii)RGPESRLLEFYLAMPFATPM[SEQ ID NO:3]NY-ESO-1 81-100；或

iv)与其至少60％同一的多肽。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述腺病毒能够在靶细胞中复制并且具有溶解活性。

还更优选地，部分iv)的所述多肽与部分1)或部分ii)或部分iii)的多肽具有61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

有利的是，所述多肽可以在受试者中刺激肽特异性免疫应答，并且还更有利的是，由于所述多肽并非由所述腺病毒载体遗传编码，而是已经共价或非共价连接到衣壳上，因此这种连接可以快速且有效地执行，即无需等待在宿主细胞中病毒复制发生。通常，为了促进至少一种或两种或三种多肽的连接，使用至少4个，理想地5个、6个、7个、8个或9个赖氨酸将所述一种或多种多肽进行多聚赖氨酸延伸。最通常，使用6个或9个赖氨酸并且最优选地连接在多肽的氨基末端处。

因此，连接到腺病毒上的肽是：

KKKK(KKKKK)-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT[SEQ ID NO:7]；和/或

KKKK(KKKKK)-YLAMPFATPMEAELARRSLA[SEQ ID NO:8]；和/或

KKKK(KKKKK)-RGPESRLLEFYLAMPFATPM[SEQ ID NO:9]；或者是：

KKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT[SEQ ID NO:4]；和/或

KKKKKK-YLAMPFATPMEAELARRSLA[SEQ ID NO:5]；和/或

KKKKKK-RGPESRLLEFYLAMPFATPM[SEQ ID NO:6]。

在本发明的又一个优选的实施方案中，所述腺病毒可以是腺病毒科(adenoviridae)中的任何类型和物种，例如不限于人类腺病毒，但是最通常是人类腺病毒。最有利的是，所述腺病毒能够复制和杀死癌细胞，同时将抗病毒免疫应答转向肿瘤，因此所述修饰的腺病毒或载体是复制型的并且具有溶瘤作用。

可以使本发明中使用的腺病毒或载体在复制方面具有肿瘤特异性，例如，所述腺病毒载体可以在E1、E3、E4和/或L3基因中包含修饰，如肿瘤特异性启动子的插入、基因缺失和转基因的插入。

理想地，所述腺病毒或载体具有溶瘤作用，即能够通过相对于正常细胞在肿瘤细胞中选择性复制而感染和杀死癌细胞。

所述腺病毒或载体的骨架可以是任何血清型。在本发明的一个实施方案中，所述腺病毒或载体骨架的血清型选自血清3型或血清5型。如本文所用的“腺病毒血清5型(Ad5)核酸骨架”指的是Ad5的基因组并且“腺病毒血清3型(Ad3)核酸骨架”指的是Ad3的基因组。

此外，所述病毒或载体可以是嵌合的，例如Ad5/3、Ad3/5或Ad5/35载体。例如，“Ad5/3载体”指的是具有Ad5载体和Ad3载体这两者的部分的嵌合病毒或载体。

腺病毒或载体的“衣壳”指的是病毒的蛋白质壳。衣壳由几个低聚结构亚基组成，所述亚基由被称作原聚体的蛋白质制成。

最优选地，所述腺病毒或载体是血清5型，选择它是因为它对于引发和加强T细胞应答是最佳的；它触发杀死肿瘤所需的CD8+T细胞；针对溶瘤病毒的任何预先存在的免疫都可以增强肿瘤内治疗的功效并且它具有良好的临床安全性记录。

在本发明的再一个优选的实施方案中，所述腺病毒或载体被进一步修饰以包括以下特征中的任一个或多个，包括其任何和所有组合。

Ad5/3嵌合取代，即用血清3型腺病毒纤突结区置换血清5型腺病毒纤突结区；这允许所述病毒或载体规避Ad5天然受体柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)，而改为使用Ad3天然受体桥粒芯蛋白2(DSG2)进行内化。DSG2大量存在于癌细胞中。

腺病毒感染是从借助于病毒表面上的特化蛋白识别宿主细胞受体开始的，所述特化蛋白即腺病毒纤突蛋白，特别是腺病毒纤突蛋白的球形羧基末端结构域，被称作羧基末端突结结构域。因此，在本文中提到腺病毒纤突蛋白的突结时，指的是腺病毒纤突蛋白的球形羧基末端结构域。

E1A基因缺失，其中缺失是编码氨基酸122-129(LTCHEACF)的核苷酸；这种缺失是一种安全措施，这是因为病毒或载体E1A蛋白不能与成视网膜细胞瘤(Rb)分子结合并且从Rb释放转录因子E2F进行病毒基因转录。因此，腺病毒或载体依赖于宿主细胞中游离E2F的存在并且可以在分裂的正常细胞或癌细胞中复制它的基因组，在这些细胞中游离E2F持续可用。因此，所述修饰相对地保护了非分裂细胞并且靶向分裂细胞或癌细胞。

E3基因的部分缺失，鉴于这种基因产物的免疫抑制作用，这会增强免疫原性。理想地，14.7K基因部分缺失或全部缺失。

在一个优选的实施方案中，所述修饰的腺病毒或载体包含编码共刺激分子的至少一个转基因的插入，并且理想地，包含两个转基因的插入，其中所述基因之一引起先天免疫系统的激活，而另一个引起适应性免疫系统的激活。优选的转基因包括通过使用APC驱动CD8+T细胞应答来激活先天免疫系统的CD40L和通过增加CD8+T细胞的克隆扩增、存活以及大的记忆T细胞池的形成来激活适应性免疫系统的OX40L。

许多转基因可以被置于腺病毒或载体的不同位置处。一个转基因可以例如被置于部分或全部缺失的E3区域中，处于E3启动子或外源性启动子下；或被置于部分或全部缺失的E1区域中，处于E1启动子或外源性启动子下；或被置于部分或全部缺失的L3区域中，处于L3启动子或外源性启动子下。

最优选地，OX40L，理想地是人类OX40L，位于E3B区域中，替代了基因14.7K缺失。

同样最优选地，CD40L，理想地是人类CD40L，被插入病毒的晚期区域中，特别是晚期区域3(L3)中，理想地处于23K基因下游。

在一个优选的实施方案中，这两个转基因都被插入到所述病毒中，即OX40L和CD40L。

在替代方案中，可以使用已知的遗传工程技术，如使用内部核糖体进入位点(IRES)或更优选地通过使用自切割2A肽，将编码OX40L的DNA和编码CD40L的DNA连接并且作为融合分子插入，所述自切割2A肽具有尺寸小并且在2A肽上游和下游的基因之间具有高切割效率的优势。通常，CD40L被插入到紧邻OX40L的下游，但是有可能使用相反的构型来实施本发明。

本发明中利用的病毒或载体还可以包含除上述以外的其它修饰。可以任选地使用任何另外的组分或修饰，但是对于本发明不是必须的。

由上文可知，本发明的腺病毒或载体已经被工程化以刺激对抗癌症的免疫应答，特别是在其中通常，免疫系统受到由癌细胞利用的逃避机制的损害的肿瘤环境中。

惊人的是，我们的数据表明，当与骨架病毒Ad5/3D24或具有替代缺失的gp19K/7.1K基因的例如人类GM-CSF的免疫刺激性转基因的病毒相比时，将免疫刺激性转基因人类OX40L和人类CD40L添加到14.7K基因座中不会损害本发明的病毒的溶瘤功效。这是惊人的，因为由于所述转基因的尺寸和所述转基因对受感染细胞的直接作用，因此所述转基因可能会显著影响病毒复制。此外，14.7K基因的缺失没有像gp19K/7.1K基因的缺失那样被广泛地研究，并且因此可能会对病毒的复制机制产生出乎意料的后果，特别是在将转基因掺入14.7K缺失位点中的情况下。

我们还证实了本申请的病毒能够从14.7K基因座产生有功能的人类转基因。这是出乎意料的，因为我们有点不寻常地使用了在两个转基因之间具有病毒2A加工位点的转录盒。

此外，我们证实了本发明的病毒能够引发MAGE-A3和NY-ESO-1特异性免疫应答。

因此，本发明延伸到一种药物组合物，其包含本发明的至少一种修饰的腺病毒或载体和合适的载剂。在本发明的一个优选的实施方案中，所述药物组合物被配制用于肿瘤内、肌内、动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、腔内或腹膜注射或口服施用。

因此，在又一个方面，本发明涉及一种在个体中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种根据本发明的腺病毒或载体。

另外地或可选地，本发明涉及至少一种根据本发明的腺病毒或载体或组合物，其用于治疗癌症。

另外地或可选地，本发明涉及至少一种根据本发明的腺病毒或载体或组合物用于治疗癌症的用途。

另外地或可选地，本发明涉及至少一种根据本发明的腺病毒或载体用于制造用于治疗癌症的药物的用途。

鉴于肿瘤已经进化出若干种免疫抑制机制来抵消身体的免疫细胞，本发明的疗法还结合使用检查点分子来实施。最佳表征的检查点途径是细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白1途径(PD-1/PD-L1)。因此，本发明的腺病毒或载体可以与诸如抗PD1分子、抗PD-L1分子或抗CTLA-4分子的检查点调节剂组合使用以抵消免疫抑制性肿瘤环境并且引起强烈的抗免疫应答。

修饰的腺病毒或载体用作活性佐剂，这是因为它提供了针对靶肽的最佳免疫应答所需的危险信号，而且在复制型腺病毒或载体的情况下，它保留了它溶解它所感染的癌细胞并且在其中复制它的基因组的能力。溶瘤细胞杀伤在性质上是免疫原性的，其引起肿瘤微环境的变化，所述变化可能会增强对肽/肿瘤的免疫应答。因此，当与单独的肽疫苗或溶瘤疫苗相比时，使用我们的修饰的腺病毒与长肽(20个氨基酸，不含多聚赖氨酸尾)物理复合产生了优越的抗肿瘤免疫应答。

最优选地，本文提到的癌症包括以下癌症中的任一种或多种：鼻咽癌、滑膜癌、肝细胞癌、肾癌、结缔组织癌、黑色素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、脑癌、喉癌、口腔癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、泌乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、希林二氏病(von Hippel-Lindau disease)、卓艾二氏综合征(Zollinger-Ellison syndrome)、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、输尿管癌、少突胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、原发部位未知的癌症、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌、佩吉特氏病(Paget's disease)、宫颈癌、癌症、食道癌、胆囊癌、头癌、眼癌、颈癌、肾癌、肾母细胞瘤(Wilms'tumor)、肝癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、前列腺癌、睾丸癌、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、软组织肉瘤、成视网膜细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞癌、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样真菌病、胰岛素瘤、类癌综合征、生长抑素瘤、牙龈癌、心脏癌、唇癌、脑膜癌、口腔癌、神经癌、上腭癌、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌和扁桃体癌。

在所附的权利要求书和本发明的先前描述中，除非上下文由于表达语言或必要的暗示而另外需要，否则词语“包含(comprises)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变体以包括性意义使用，即用于指定所述特征的存在，但不排除在本发明的各种实施方案中存在或添加另外的特征。

本说明书中引用的所有参考文献，包括任何专利或专利申请，在此以引用的方式并入本文。不承认任何参考文献构成了现有技术。此外，不承认任何现有技术构成了本领域公知常识的一部分。

本发明的每一个方面的优选特征可以结合任何其它方面来描述。

根据以下实施例，本发明的其它特征将变得显而易见。一般来说，本发明延伸到本说明书(包括所附权利要求书和附图)中公开的特征中的任何新颖的特征或任何新颖的组合。因此，结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物或化学部分应当被理解为适用于本文所述的任何其它方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。

此外，除非另外说明，否则本文公开的任何特征可以被用于相同或相似目的的替代特征代替。

在本说明书的整个说明和权利要求书中，除非上下文另外要求，否则单数形式包括复数形式。特别是，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另外要求，否则本说明书应当被理解为考虑复数以及单数。

附图说明

现在将参考以下内容仅以举例的方式描述本发明的实施方案，其中：

图1示出了根据本发明的修饰的腺病毒的示意图。腺病毒血淸5型，其在引发和加强T细胞应答方面最佳，主要触发CD8+T细胞应答：为杀死肿瘤细胞所需，预先存在的针对溶瘤病毒的免疫增强了肿瘤内治疗的功效，并具有良好的临床安全件记录。它具有以下遗传修饰：(1)嵌合Ad5/3衣壳，用于增加肿瘤细胞转导；(2)E1A中的D24缺失，用于肿瘤特异性病毒复制；(3)E3的部分缺失，用于增加免疫原性。作为转基因的两个共刺激分子，用于最佳激活免疫系统的先天分支和适应性分支这两者：先天分支：CD40，用于许可APC驱动CD8+T细胞应答；适应性分支：OX40L，用于增加CD8+T细胞的克隆扩增和存活以及形成更大的记忆T细胞池。具体地，Ad5腺病毒被修饰以包括血清3型纤突结蛋白，即Ad3纤突结，并且通过使用多聚赖氨酸尾，将本发明的至少一种多肽，并且理想地两种或三种多肽连接到病毒衣壳上。这些多肽不形成病毒基因组的一部分，而是共价或非共价连接到衣壳上。这种创新在本文中被称作PeptiCRAd-1，因此，其利用了免疫系统的所有主要分支来攻击癌症。

图2示出了所选肽中的两种。它们不直接结合MHC I类分子，而是需要通过APC提呈进行抗原加工。因此，所述肽不能结合非专职性APC上的MHC I类分子，并且因此不会引起CD8+T细胞的瞬时激活和后续的无反应性。只有激活的专职性APC(其可以接受来自存在于进一步修饰的腺病毒中的病毒编码的CD40L的进一步的共刺激)才可以将这些肽提呈给T细胞，从而引起肽特异性CD8+T细胞的稳健激活和增殖(由存在于进一步修饰的腺病毒中的病毒编码的OX40L提供进一步的共刺激和增强的记忆T细胞应答)。

图3示出了当与在癌症患者中具有已知的免疫激活能力的临床上使用的未修饰的肽相比时，图2的肽的N末端处的多聚赖氨酸尾不会改变所述肽的免疫学特性。

图4示出了在不同的肽浓度下在水和生理盐中两种NY-ESO-1肽-病毒复合物的平均流体动力学直径。

图5示出了当用包含含有5/3衣壳的表达OX40L和CD40L的病毒的根据本发明的NYESO-1和MAGE-A3肽包被的修饰的病毒(PeptiCRAd-1)或没有NYESO-1和MAGE-A3肽包被物的相同病毒(VALO-C1)或单独的肽处理时经过处理的肿瘤和对侧未处理的肿瘤中T细胞的频率。在每一个处理组中CD3+T细胞(A)、CD4+T细胞(B)和CD8+T细胞(C)的数量被描绘为每克肿瘤组织的细胞数。与假处理组相比，在所有组中处理均引起更高的T细胞频率。在用VALO-C1或PeptiCRAd处理的肿瘤中看到最高的数量。

图6示出了当用PeptiCRAd-1或没有肽包被物的相同病毒(VALO-C1)或单独的肽处理时经过处理的肿瘤和对侧未处理的肿瘤中所有免疫细胞(CD45+细胞)的频率。在所有组中频率相似，在假处理的动物中数量略低。

图7示出了PeptiCRAd和VALO-C1处理降低了经过处理的肿瘤中的所有TIL中调节性T细胞的百分比。

图8示出了当用PeptiCRAd-1或没有肽包被物的相同病毒(VALO-C1)或单独的肽处理时血液肿瘤中NY-ESO-1特异性CD8+T细胞(A)和MAGE-A3特异性CD8+T细胞(B)的百分比。所述百分比是由每1ml血液中的所有CD8+T细胞计算出的。当与假处理或肽处理的动物相比时，PeptiCRAd处理产生最高的NY-ESO-I特异性CD8+T细胞的百分比，并且VALO-C1处理和PeptiCRAd处理均产生更高的MAGE-A3特异性CD8+T细胞的百分比。

图9示出了当用PeptiCRAd-1或没有肽包被物的相同病毒(VALO-C1)或单独的肽处理时经过处理的肿瘤或对侧未处理的肿瘤中NY-ESO-1特异性CD8+T细胞或MAGE-A3特异性CD8+T细胞的百分比。所述百分比是由每克肿瘤组织中的所有CD8+T细胞计算出的。VALO-C1和PeptiCRAd在将肽特异性CD8+TIL募集到肿瘤方面同样有效。

图10示出了即使针对大的已经充分形成的肿瘤开始处理，包被有NY-ESO-1蛋白和MAGE-A3蛋白的PeptiCRAd仍能够在人源化小鼠黑色素瘤模型中阻止肿瘤生长。实验设计：在第1天，将2×10⁶个SK-MEL-2细胞皮下植入(每只动物一个肿瘤)到NOD/Shi-scid/IL-2Rγ敲除免疫缺陷小鼠的侧腹中。在第13天，静脉内注射5×10⁶个PBMC。在第16天，肿瘤内注射5×10⁴个浆细胞样和髓样树突状细胞。在第16天、第17天、第18天(引发)和第25天(加强)给予1×10⁹个VP剂量的肿瘤内PeptiCRAd处理。在DC注射后立即给予首次PeptiCRad剂量。追踪肿瘤生长。在第32天将动物处死。PeptiCRAd＝Ad5/3-D24-OX40L-CD40L，即包被有NY-ESO-1肽和MAGE-A3肽的具有E1A中的24bp缺失、5/3嵌合衣壳以及由14.7K基因座表达的CD40L和OX40L转基因的溶瘤腺病毒；OX40L PeptiCRAd＝Ad5/3-D24-OX40L，即包被有NY-ESO-1肽和MAGE-A3肽的具有E1A中的24bp缺失、5/3嵌合衣壳以及由14.7K基因座表达的OX40L转基因的溶瘤腺病毒。

图11示出了与假处理的动物相比，OX40L-PeptiCRAd增加了外周血中MAGE-A3特异性CD8+T细胞的数量。用PeptiCRAd处理的两只动物也显示出血液中MAGE-A3特异性CD8+T细胞的数量增加。在第32天在之前提到的肿瘤生长研究结束时，通过流式细胞术(五聚体分析)评估抗MAGE-A3 T细胞。

图12(A)在无菌水中稀释的AdV制剂以及使用无菌水作为运行缓冲液固定在APTES传感器上期间的三个单独的SPR响应。浓度C＝约1.93×10¹¹个VP/毫升。(B)在以下3种不同的肽包被物时的SPR响应：PEP1455＝KKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT(SEQ ID NO:4)；PEP1456＝KKKKKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT(SEQ ID NO:7)；PEP1508＝KKKKKK-YLAMPFATPMEAELARRSLA(SEQ ID NO:5)。使具有递增浓度的原液(于无菌水中5mg/ml)与固定的AdV粒子相互作用。使用无菌水作为运行缓冲液。箭头指示相应浓度的肽样品注射的时间点并且星号指示开始用运行缓冲液冲洗的时间点。图中标记的Δ_最大值和Δ_最小值对应于用于计算每一种情况下用于每一个病毒粒子相互作用的肽的数量的SPR响应(在溶液中存在100μM的肽(Δ_最大)和在溶液中不存在肽(Δ_最小))。

图13在使在A195缓冲液中稀释的递增浓度的肽包被物PEP1455、PEP1456和PEP1508样品与固定的AdV粒子相互作用时的SPR响应。箭头指示相应浓度的肽样品注射的时间点并且星号指示开始用运行缓冲液(A195介质)冲洗的时间点。图中标记的Δ_最大值和Δ_最小值对应于用于计算每一种情况下与每一个病毒粒子相互作用的肽的数量的SPR响应(在溶液中存在100μM的肽(Δ_最大)和在溶液中不存在肽(Δ_最小))。下标“最小，中值”和“最大，中值”指的是由相应的测量计算出的两个单独的测量值的中值。

具体实施方式

本申请涉及以下编号的具体实施方式。

1.一种修饰的腺病毒或载体，其包含：

以下多肽中的至少一种，所述多肽共价或非共价连接到病毒衣壳上，

未由所述腺病毒载体遗传编码：

i)VFGIELMEVDPIGHLYIFAT[SEQ ID NO:1]；

ii)YLAMPFATPMEAELARRSLA[SEQ ID NO:2]；

iii)RGPESRLLEFYLAMPFATPM[SEQ ID NO:3]；或

iv)与其至少60％同一的多肽。

2.根据编号1所述的修饰的腺病毒或载体，其中使用至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个赖氨酸对所述多肽进行多聚赖氨酸延伸。

3.根据编号2所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述赖氨酸连接在所述多肽的氨基末端处。

4.根据前述编号中任一项所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述多肽是：

KKKKKK(KKK)-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT[SEQ ID NO:7]；和/或

KKKKKK(KKK)-YLAMPFATPMEAELARRSLA[SEQ ID NO:8]；和/

或

KKKKKK(KKK)-RGPESRLLEFYLAMPFATPM[SEQ ID NO:9]；或者

是：

KKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT[SEQ ID NO:4]；和/或

KKKKKK-YLAMPFATPMEAELARRSLA[SEQ ID NO:5]；和/或

KKKKKK-RGPESRLLEFYLAMPFATPM[SEQ ID NO:6]。

5.根据前述编号中任一项所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述腺病毒是人类腺病毒。

6.根据前述编号中任一项所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述腺病毒在E1和/或E3和/或E4和/或L3基因中包含修饰，所述修饰包括肿瘤特异性启动子的插入、至少一个基因缺失和至少一个转基因的插入。

7.根据前述编号中任一项所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述腺病毒是血清5型。

8.根据前述编号中任一项所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述腺病毒被进一步修饰以包括Ad5/3嵌合取代，即用血清3型腺病毒纤突结区置换血清5型腺病毒纤突结区。

9.根据前述编号中任一项所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述腺病毒被进一步修饰以包括E1A基因缺失，其中所述缺失至少是编码氨基酸122-129的那些核苷酸。

10.根据前述编号中任一项所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述腺病毒被进一步修饰以包括14.7k基因的部分或完全缺失。

11.根据前述编号中任一项所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述腺病毒被进一步修饰以包括编码共刺激分子的至少一个转基因的插入。

12.根据编号11所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述病毒包括至少两个转基因，其中所述转基因之一引起先天免疫系统的激活，而另一个引起适应性免疫系统的激活。

13.根据编号12所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述病毒包括编码CD40L和/或OX40L的转基因。

14.根据编号13所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述转基因是人类的。

15.根据编号13或14所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述OX40L位于E3B区域中，替代了基因14.7K缺失。

16.根据编号13-14中任一项所述的修饰的腺病毒或载体，其中使用2A加工位点将所述CD40L分子插入紧邻OX40L的下游。

17.根据前述编号中任一项所述的修饰的腺病毒或载体，其中所述肽与病毒的比例在每3E+9个病毒粒子1ug至5ug的范围内。

18.一种药物组合物，其包含至少一种根据编号1-17中任一项所述的修饰的腺病毒或载体与合适的载剂的组合。

19.根据编号18所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于肿瘤内、肌内、动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、真皮内、腔内或腹膜注射或口服施用。

20.至少一种根据编号1-17中任一项所述的腺病毒或载体或根据编号18-19中任一项所述的药物组合物，其用于治疗癌症。

21.至少一种根据编号1-17中任一项所述的腺病毒或载体在制造用于治疗癌症的药物中的用途。

22.一种在患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用有效量的至少一种根据编号1-17中任一项所述的腺病毒或载体或根据编号18或19所述的组合物。

23.根据编号22所述的治疗癌症的方法，其中至少一种根据编号1-17中任一项所述的腺病毒或载体或根据编号18或19所述的组合物与细胞检查点调节剂一起施用。

24.根据编号23所述的治疗癌症的方法，其中所述检查点调节剂是抗PD1分子、抗PD-L1分子或抗CTLA-4分子。

25.根据编号20或21所述的腺病毒或载体或用途或根据编号22-24所述的方法，其中所述癌症包括以下癌症中的任一种或多种：鼻咽癌、滑膜癌、肝细胞癌、肾癌、结缔组织癌、黑色素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、脑癌、喉癌、口腔癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、泌乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、希林二氏病、卓艾二氏综合征、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、输尿管癌、少突胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨癌、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、原发部位未知的癌症、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌、佩吉特氏病、宫颈癌、食道癌、胆囊癌、头癌、眼癌、颈癌、肾癌、肾母细胞瘤、肝癌、卡波西氏肉瘤、前列腺癌、睾丸癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、软组织肉瘤、成视网膜细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞癌、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样真菌病、胰岛素瘤、类癌综合征、生长抑素瘤、牙龈癌、心脏癌、唇癌、脑膜癌、口腔癌、神经癌、上腭癌、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌和扁桃体癌。

方法和材料

肽：

肽被选择为带有乙酸根抗衡离子，这是对于人类患者来说合适的盐形式。所述肽由PepScan公司制造。

PeptiCRAd中意图用于临床用途的特定肽来自：

-MAGE-A3蛋白(氨基酸161-180，序列KKKKKK(KKK)-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT)，具有从氨基末端延伸的6(SEQ ID NO:4)或9(SEQ ID NO:7)赖氨酸尾的20聚体肽；

-NY-ESO-1蛋白(氨基酸91-110，序列KKKKKK(KKK)-YLAMPFATPMEAELARRSLA)，具有从氨基末端延伸的6(SEQ ID NO:5)或9(SEQ ID NO:8)赖氨酸尾的20聚体肽；

-NY-ESO-1蛋白(氨基酸81-100，序列KKKKKK(KKK)-RGPESRLLEFYLAMPFATPM)，具有从氨基末端延伸的6(SEQ ID NO:6)或9(SEQ ID NO:9)赖氨酸尾的20聚体肽。

PeptiCRAd制剂中使用的腺病毒：

具有来自血清3型腺病毒的修饰的纤突结的腺病毒delta 24血清5型病毒(AdV 5/3)。这种模型病毒并不完全是意图用于临床用途的病毒，但是它具有相同的病毒衣壳。该模型病毒与临床病毒之间的区别在于临床病毒将理想地包括编码CD40L和OX40L的基因插入序列，所述插入序列对病毒衣壳和本文研究的属性没有影响。

PeptiCRAd复合物形成：

将单独的肽在水或0.5％盐水中稀释以达到5ug/μl的肽原液浓度。将于A195缓冲液中的病毒原液(1,45E+12个VP/ml)在水中稀释以达到1E+9个VP/μl的浓度。通过将1μl或3μl的病毒稀释液(相当于1E+9个VP或3E+9个VP)与可变体积的肽混合以达到目标的肽与病毒的比例来制备病毒-肽复合物。

(PeptiCRAd，单独肽)；将两个单独的病毒等分试样分别用单一的肽包被。然后在即将进行肿瘤注射之前将这两种单独的单一肽包被的PeptiCRAd(NY-ESO-1复合物和MAGE-A3复合物)组合。分开包被的病毒也可以单独注射的形式给予。或者，首先将NY-ESO-1肽和MAGE-A3肽混合在一起，然后将该肽混合物用于形成PeptiCRAd复合物。

复合物的尺寸和电荷的ζ电位粒度分析仪(zetasizer)测量：

在复合物形成后立即、在将组分混合后15分钟时或在将复合物在室温(RT)下静置约1.5小时后进行ζ电位粒度分析仪测量。首先通过将700μl的水添加到样品中来稀释病毒-肽复合物，然后将其转移到测量比色皿中。测量流体动力学直径(nm)，继而测量ζ电位(mV)。将这些参数测量三次并且记录平均尺寸和ζ电位。

PeptiCRAd-1肽的免疫效力：

用未修饰的肽(SEQ ID NO:2NY-ESO-1 91-110：YLAMPFATPMEAELARRSLA；或SEQ IDNO:1MAGE-A3 161-180：VFGIELMEVDPIGHLYIFAT)预刺激具有已知的NY-ESO-1和MAGE-A3 T细胞活性的来自黑色素瘤患者的CD8+T细胞。通过标准的IFN-γELISPOT方法来研究对多聚赖氨酸延伸的肽(SEQ ID NO:5NY-ESO-191-110：KKKKKKYLAMPFATPMEAELARRSLA；或SEQ IDNO:4MAGE-A3 161-180：KKKKKKVFGIELMEVDPIGHLYIFAT)的识别。在实验中使用以下ELISPOT方案：将用细胞分离柱(瑞典隆德的美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech,Lund,Sweden))纯化的CD4+/CD8+T细胞用去除了CD4+和CD8+T细胞的肽脉冲(10ug/ml)的经过辐照的自体PBMC(25000个细胞/孔)预致敏。在IFNγELISPOT测定中在第10-12天测试预致敏的CD4+/CD8+T细胞对肽脉冲(1ug/ml)的自体抗原提呈细胞(EBV转化的B细胞或DC)的识别。在孵育(37℃)16小时之后，使用AID EliSpot Reader Classic ELR 07(德国施特拉斯堡的AID有限公司(Autoimmun Diagnostika GmbH,Strassberg,Germany))评价产生细胞因子的抗原特异性T细胞的数量。

体内免疫接种

使用从人类脐带血中分离的造血干细胞(CD34+、HLA-B35+)将NOD/Shi-scid/IL-2Rγ敲除免疫缺陷小鼠人源化。皮下植入A375人类黑色素瘤肿瘤(每100μl 2×10⁶个细胞)并且基于人源化率和肿瘤尺寸将动物随机分组。将动物用PeptiCRAd-1或没有肽包被物的相同病毒(VALO-C1)处理(这两组的病毒剂量均为1×10⁸；对于PeptiCRAd还测试了1×10⁷的次优剂量)。真皮内给予肽疫苗(0.12ug或30ug)，使用聚肌胞苷酸(Poly-IC)作为佐剂。

在随机化后25天(第0天)，通过大剂量的环磷酰胺(1毫克/小鼠，静脉内)开始处理。在第1天、第2天、第3天和第12天肿瘤内(假处理组、病毒组和PeptiCRAd组)或真皮内(肽对照组)给予处理。在第三次处理后2天(第5天)将继发性肿瘤植入到对侧侧腹中。对于继发性肿瘤不给予处理。

使用dextramer分析，通过流式细胞术针对NY-ESO-1YLAMPFATPMEAELARRSLA SEQID NO:2和MAGE-A3VFGIELMEVDPIGHLYIFAT SEQ ID NO:1特异性CD8+T细胞分析外周血单核细胞(PBMC)和肿瘤浸润性CD8+淋巴细胞(TIL)。评估了PBMC和TIL中不同的免疫细胞亚群。在Attune NxT流式细胞仪(Life Technologies公司)上进行流式细胞分析。

PBMC小鼠模型免疫接种

将2.10⁶个SKMEL-2肿瘤细胞(HLA-B35+)植入到35只8周大的NOD-Prkdcem26Cd52/IL-2Rγem26Cd22/NjuCrl免疫缺陷小鼠(NCG)的右侧腹上(第0天)。在第13天，静脉内注射5×10⁶个来自两个不同供体的HLA-B35+人类外周血单核细胞(PBMC)。在第16天，用与每一种肽复合的1×10⁹个VP的病毒剂量开始用以下各项进行肿瘤内处理：与NYESO-1(SEQ ID NO:2)和MAGE-A3(SEQ ID NO:1)复合的含有5/3衣壳的表达OX40L的病毒(“OX40L PeptiCRAd”)或与NYESO-1(SEQ ID NO:2)和MAGE-A3(SEQ ID NO:1)复合的含有5/3衣壳的表达OX40L和CD40L的病毒(“PeptiCRAd”)。在第一次PeptiCRAd处理的同时，肿瘤内注射50'000个自体浆细胞样和髓样树突状细胞。在第17天、第18天(通过第一次处理引发)和第25天(加强)，在不添加树突状细胞的情况下使用肿瘤内PeptiCRAd注射来处理肿瘤。处理方案示于图10中。追踪肿瘤生长。在第32天将动物处死。OX40L-PeptiCRAd和PeptiCRad含有E1A中的24bp缺失、缺失的gp19k/7.1K区、由14.7K基因座表达的人类OX40L转基因和5/3嵌合纤突。

病毒-肽复合

使用配备有2通道聚二甲基硅氧烷(PDMS)流动通道和96孔板自动进样器组件(MP-SPR 220A)的多参数表面等离激元共振(SPR)仪器测量病毒粒子的固定以及肽包被物与固定在APTES功能化的二氧化硅传感器表面上的病毒粒子之间的相互作用。肽包被物如下：PEP1455＝KKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT(SEQ ID NO:4)；PEP1456＝KKKKKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT(SEQ ID NO:7)；PEP1508＝KKKKKK-YLAMPFATPMEAELARRSLA(SEQ IDNO:5)。用于所有SPR测量的温度、流速和激光波长分别是+20℃、20微升/分钟和680nm。

对于在水中的测量，将在无菌水中稀释的具有5/3嵌合纤突的腺病毒(约1.93×10¹¹个VP/毫升)在APTES传感器上固定12分钟，并且对每一个样品进行三次重复测量。还使用无菌水作为运行缓冲液。对于在A195缓冲液中的测量，首先将腺病毒在PBS中稀释并且在APTES传感器上固定12分钟。在固定后，用A195代替PBS作为运行缓冲液，并且按一式三份进行测量。

对于在无菌水中的测量，通过将5mg的肽溶解在1ml的水中(5mg/ml)而产生1.65mM的6K-MAGE-A3(PEP1455)、1.46mM的9K-MAGE-A3(PEP1456)和1.66mM的6K-NY-ESO(PEP1508)的相应浓度来制备肽原液。将肽样品以递增浓度依次注射6分钟，之后在每一个样品浓度之间有8分钟的运行缓冲液冲洗期。所用的肽浓度是0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM和100μM。

对于在A195缓冲液中的测量，通过将340ug相应的肽溶解在A195介质中以形成100μM的样品溶液，然后将其用作用于制备具有更低浓度的肽样品溶液的原液来制备肽原液。将肽样品以递增浓度依次注射10分钟，之后在每一个样品浓度之间有15分钟的运行缓冲液冲洗期。所用的肽浓度是3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM和100μM。

用于估计每个病毒粒子结合的肽数量的计算是基于利用通过SPR测量确定的固定在SPR传感器表面上的病毒粒子的估计数量和最大吸附肽数量的几何计算。

结果与讨论

肽的净电荷对复合物形成的影响

MAGE-A3肽在没有赖氨酸尾的情况下具有-3、9的净电荷。呈现负电荷的三个酸性氨基酸位于氨基末端附近(氨基酸5、氨基酸8和氨基酸10)。我们研究了是否必须用更长的带正电荷的赖氨酸尾(9个赖氨酸而不是6个赖氨酸)补偿该肽的负净电荷以实现肽在病毒表面上的适当结合。通过确定含有与20ug或40ug的任一种肽复合的1E+9个病毒粒子的肽包被的病毒样品的ζ电位和平均复合物尺寸来评价赖氨酸尾长度对复合物的复合物形成和稳定性的影响。在复合物形成后立即、在将组分混合后15分钟时以及在将复合物在室温(RT)下静置约1.5小时后进行ζ电位粒度分析仪测量。结果示于表1中。

尺寸和ζ电位结果显示无论赖氨酸尾的长度如何，都形成了与MAGE-A3肽的复合物，这表明至少在肽链的特定位置处带负电荷的氨基酸不会损害复合物的形成。与具有更短的赖氨酸尾的相应肽相比，更长的赖氨酸尾使得复合物具有大了约10％的尺寸和略低的ζ电位。基于新鲜制备的样品和在将样品在室温下保持1.5小时后的复合物的尺寸，具有任一种赖氨酸尾的复合物均是稳定的。在新鲜制备的复合物中，尺寸不受用于复合物形成的肽量的影响，但是在保持1.5小时的样品中，结果有点不相干。总之，决定在后续的ζ电位粒度分析仪研究中使用六赖氨酸尾肽。

6K-MAGE-A3肽与病毒的比例对复合物的尺寸和ζ电位的影响

准备每3E+9个病毒粒子15ug、30ug、45ug和60ug肽的肽与病毒粒子的比例以基于复合物的尺寸和ζ电位的确定来评价比例对复合物形成和稳定性的影响(新鲜制备的复合物与在室温下保持2小时的复合物)。

表2中的结果显示了以下趋势，即在测试范围内肽与病毒的比例越低，复合物的尺寸越小，这表明可以确定最佳比例，所述最佳比例产生由单个病毒构成或由几个病毒形成的小聚集体构成的肽-病毒复合物。复合物还至少在2小时内相当稳定，ζ电位是约+30mV。

尝试使用6K-MAGE-A3肽确定最佳的肽与病毒的比例，如表3中所示。复合物尺寸结果表明每3E+9个病毒粒子低至1ug-5ug的6K-MAGE-A3肽(相当于6.6E+4至3.3E+5的摩尔比范围)产生稳定的复合物。但是在更低的比例下，复合物倾向于聚集。

用6K-MAGE-A3肽包被病毒对感染性的影响

复合的病毒感染肿瘤细胞的能力是PeptiCRAd的作用机制的一个重要的方面。这就是为什么通过制备具有不同的肽与病毒的比例的复合物并且通过基于免疫细胞化学测定(ICC)确定复合物对A549细胞的感染性来评价肽包被对病毒感染性的影响的原因。表4中的结果显示使用约1ug的相关肽与病毒的比例，保留了仅病毒样品的感染性的62％，这表明病毒包被不会显著地影响感染性。

在不同温度下6K-MAGE-A3-PeptiCRAd的稳定性

为了评价在不同温度下6K-MAGE-A3-PeptiCRAd的稳定性，通过每3E+9个VP混合15ug或30ug的6K-MAGE-A3肽并且通过在不同条件下储存样品来制备复合物。通过ζ电位粒度分析仪从在室温、+5℃、-20℃、-80℃下储存18小时-20小时的样品测试稳定性。结果示于表5中。在不同温度下储存期间平均流体动力学直径在165nm至276nm范围内保持相当稳定，这表明在所测试的任何温度下均没有发生明显的聚集。在每一个样品中ζ电位都高于+30mV的水平，这表明良好的稳定性。在-20℃下储存后获得最小的粒度，但在+4℃下储存似乎也有利于防止聚集。

6K-NY-ESO-1肽(p81-100)与病毒的比例对在水中制备的复合物的尺寸和ζ电位的影响

在通过ζ电位粒度分析仪测量确定的复合物形成属性(尺寸和ζ电位)方面研究另一种有临床意义的肽NY-ESO-1肽。结果示于表6a中。关于复合物的尺寸，这种特定的肽似乎遵循正弦波状曲线，从小的肽与病毒的比例处较小的复合物尺寸开始，之后随着所述比例变大，复合物尺寸增加，在1ug肽处达到局部最大值，之后复合物尺寸开始减小直到60ug为止，在60ug处复合物尺寸达到180nm的最小值。关于复合物的稳定性，ζ电位结果表明与6K-MAGE-A3相比，更高的肽与病毒的比例是有利的。NY-ESO-1肽具有-1的天然电荷，在氨基末端附近具有两个带负电荷的氨基酸和两个带正电荷的氨基酸(酸性氨基酸位于肽序列的位置4和位置9处并且碱性氨基酸位于肽序列的位置1和位置6处)。NY-ESO-1的序列的其余部分是相当疏水的，MAGE-A3肽也是如此。

6K-NY-ESO-1肽(p91-110)与病毒的比例对在水中制备的复合物的尺寸和ζ电位的影响

还在通过ζ电位粒度分析仪测量确定的复合物形成属性(尺寸和ζ电位)方面研究了6K-NY-ESO-1肽(p91-110)。结果示于表6b中。关于复合物的尺寸，0.5ug至1ug的肽范围仅产生中度聚集的复合物，这表明与这种肽的最佳比例存在于每3E+9个VP 1ug与5ug之间的某处。相应的ζ电位值仍接近于零，这表明该复合物的稳定性可能不是最佳的而有聚集的趋势。

NY-ESO-1肽(p91-110)具有-1的天然电荷，在羧基末端附近具有两个带负电荷的氨基酸和两个带正电荷的氨基酸(酸性氨基酸位于肽序列的位置11和位置13处并且碱性氨基酸位于肽序列的位置16和位置17处)。NY-ESO-1的序列的其余部分是相当疏水的。靠近C末端的正电荷的位置也可能使得C末端能够结合到病毒表面。

包被有6K-MAGE-A3肽和6K-NY-ESO-1肽这两者的PeptiCRAd

基于ζ电位粒度分析仪测量在复合物形成属性方面以混合物的形式研究了两种有临床意义的肽，即NY-ESO-1肽和MAGE-A3肽。在水和生理NaCl(0.9％)中均制备了复合物。结果示于表7a和表7b中。通过将等量的每一种肽与病毒混合而制备的复合物的平均尺寸大于由单独的6K-MAGE-A3肽制备的复合物的平均尺寸而小于由单独的6K-NY-ESO-1肽(p81-100)制备的复合物的尺寸。小于300nm的平均尺寸表明了在复合物形成期间仅发生中度聚集。该复合物可以在水和0.9％ NaCl中制备而具有相当的复合物尺寸。

通过将等量的6K-MAGE-A3和6K-NY-ESO-1肽(p91-110)与病毒混合而制备的复合物的平均尺寸大于由6K-MAGE-A3和6K-NY-ESO-1肽(p81-100)制备的复合物的平均尺寸。在水中，复合物的平均尺寸差异是约1.8倍，但是在生理NaCl中降低到1.3倍。400nm-500nm的平均尺寸表明了在复合物形成期间仅发生中度聚集。

NY-ESO-1肽与病毒的比例对在生理NaCl中制备的复合物的尺寸和ζ电位的影响

由于在水中与NY-ESO-1肽(p81-100)形成的复合物的ζ电位粒度分析仪尺寸结果表明了随肽浓度而变化的正弦样行为，因此我们研究了在生理盐溶液中进行复合物形成步骤是否将防止可能的非特异性相互作用。结果示于表8a中。结果显示随肽浓度递增而变化的复合物尺寸遵循与在水中制备的复合物非常相似的趋势。在肽与病毒的比例在5ug至60ug的范围时，复合物尺寸是更大的，但是无论如何是相当一致的。结果表明最佳的肽与病毒的比例可以在每3E+9个VP 1ug至5ug的范围内找到。

在水中与NY-ESO-1肽(p91-110)形成的复合物的ζ电位粒度分析仪平均尺寸结果表明在肽与病毒的比例高于1ug时，聚集增加，从而导致复合物尺寸大于3000nm。我们研究了在生理盐溶液中进行复合物形成步骤是否将防止聚集。结果示于表8b中并且显示随肽浓度递增而变化的复合物尺寸在200nm-400nm的范围内相当恒定。因此，在复合物形成期间液相中的生理NaCl可以相当显著地防止聚集，如可以在图1中看出的那样，图1示出了在水和生理盐中两种NY-ESO-1肽-病毒复合物的数据。在相关的肽与病毒的比例是每3E+9个VP1ug-5ug时，复合物尺寸保持在217nm-245nm内。

PeptiCRAd-1肽的免疫效力

在体外刺激时多聚赖氨酸延伸的NY-ESO-1肽和MAGE-A3肽像未修饰的肽一样有效地触发了癌症患者来源的抗原特异性CD8+T细胞中的IFN-γ产生(图3)，这表明了多聚赖氨酸修饰不会影响功能。

PeptiCRAd在人源化小鼠模型中引发肽特异性免疫应答

与假处理的动物相比，所有的主动处理(单独的肽、没有肽包被物的病毒[VALO-C1]以及具有NY-ESO-1和MAGE-A3肽包被物的病毒[PeptiCRAd])均增加了原发性肿瘤中免疫细胞的数量。在处理后与肽疫苗或假处理的动物相比，VALO-C1和PeptiCRAd-1处理的动物在原发性肿瘤中均显示出更多的T细胞(CD3、CD4、CD8)，而总浸润性免疫细胞(CD45)的数量在所有组中均相似(分别是图5和图6)。

此外，与来自肽疫苗或假处理的动物的原发性肿瘤相比，在VALO-C1和PeptiCRAd-1处理的原发性肿瘤中T调节性细胞(CD3+/CD4+/FoxP3+)的数量更少(图7)。这表明了肿瘤内施用的免疫原性腺病毒(裸病毒VALO-C1或PeptiCRAd-1)通过减少局部免疫抑制来调节肿瘤微环境。

与VALO-C1处理的动物不同，PeptiCRAd-1处理的动物在未处理的继发性肿瘤中比在经过处理的原发性肿瘤中显示出更多的CD4+和CD8+T细胞，这表明通过病毒的肽包被物靶向肿瘤对于在远处未治疗的肿瘤中诱导作用是至关重要的(表9)。此外，与OV处理(平均值＝0.6％)或肽疫苗处理(平均值＝0.6％)的动物相比，PeptiCRAd-1处理的动物在引发后在血液中具有更多的NYESO特异性CD8+T细胞(平均值＝占总CD8+细胞的4.3％)(图8)。在经过处理和未处理的肿瘤中，PeptiCRAd和VALOC1处理的动物中MAGE特异性CD8+TIL的频率高于肽处理的动物中MAGE特异性CD8+T细胞的频率(图9)。有趣的是，与NY-ESO-1特异性CD8+T细胞相比，在VALOC1和PeptiCRAd处理的肿瘤中看到更高频率的MAGE特异性CD8+T细胞，而在血液中则相反。

PeptiCRAd在PBMC小鼠模型中引发肽特异性免疫应答

即使当针对大的已经充分形成的肿瘤开始处理时，使用与NY-ESO-1和MAGE-A3复合的PeptiCRAd处理仍在人源化小鼠黑色素瘤模型中引起了肿瘤生长停滞(图10)。与假处理的小鼠相比，用OX40L-PeptiCRAd处理的小鼠在PBMC中的所有CD8+T细胞当中显示出显著更多的MAGE-A3特异性CD8+T细胞，这表明PeptiCRAd处理能够在人源化小鼠中引发肽特异性应答(图11)。

具有5/3嵌合衣壳的腺病毒可以在最佳复合条件下与NY-ESO-I肽和MAGE-A3肽复合

使用表面等离激元共振(SPR)技术研究了肽包被物与腺病毒粒子(AdV)之间的相互作用。主要目的是1)确定NY-ESO-1肽和MAGE-A3肽与病毒在不同介质(无菌水和A195介质(用于病毒制剂的常用介质))中的结合动力学；2)估计一个病毒粒子在每一种介质中可以结合多少个肽分子；和3)评估肽-病毒复合物的稳定性。肽包被物如下：PEP1455＝KKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT(SEQ ID NO:4)；PEP1456＝KKKKKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT(SEQID NO:7)；PEP1508＝KKKKKK-YLAMPFATPMEAELARRSLA(SEQ ID NO:5)。

在无菌水中AdV粒子的SPR响应是约0.7°，其对应于覆盖检测区的病毒的50％(1.4°对应于100％覆盖率)(表10)，从而得到在检测区内吸附有5×10⁷个病毒粒子的估计值。当将AdV粒子在A195缓冲液中运行时，SPR响应是约1.2°，其对应于检测表面的86％的覆盖率(图12)。这些结果给出了在检测区内吸附有8.6×10⁷个病毒粒子的估计值。这些结果可能表明病毒的结构在A195缓冲液中比在无菌水中保存得更好，或A195缓冲液有助于病毒吸附到APTES表面。

与在A195介质中相比，肽1455和肽1508在无菌水中似乎更好地吸附在固定的病毒粒子上(图12中的(B)和图13)。肽1456则相反，与在水中相比，肽1456在A195介质中显著更好地吸附在固定的病毒粒子上。在表10中计算了每个病毒吸附的肽的数量。

基于所述结果，PEP1455不完全可溶于A195缓冲液中并且如根据在A195缓冲液中肽与病毒的比例所判断，就溶解度和包被效率而言，PEP1456似乎是更具潜力的修饰。结果表明可以在适当的缓冲环境中使用具有5/3嵌合衣壳的腺病毒构建体和6/9K-肽制备肽病毒复合物。如由SPR结果所示，复合物相当稳定而没有游离肽环境。此外，肽与病毒粒子的比例是肽序列特异性因素，并且还取决于复合物形成的最佳条件的存在。

总结

对于三种测试的肽(一种6K-MAGE-A3和两种6K-NY-ESO-1)，复合物尺寸似乎取决于肽与病毒的比例并且似乎是肽特异性特性，必须针对每一种肽以及肽和病毒的每一种组合确定。在6K-NY-ESO-1(p91-110)的情况下，通过在生理盐溶液而不是水中制备复合物，可以在一定程度上防止复合物形成期间的聚集和可能的非特异性相互作用，但是对于6K-NY-ESO-1(p81-100)，情况并非如此，这表明了肽特异性行为。

当使用相关的肽与病毒的比例时，与6K-MAGE-A3肽形成复合物并没有显著降低病毒的感染性而仍保留62％的感染性。

基于MAGE-A3复合物的稳定性结果，所述复合物的最佳储存条件似乎是+4℃或-20℃。

具有肽包被物的PeptiCRAd在触发全身性靶向肿瘤的CD8+T细胞应答以及CD8+TIL浸润到未治疗的远处肿瘤方面优于裸溶瘤腺病毒(VALO-C1)或标准肽疫苗接种。数据表明PeptiCRAd提高了标准溶瘤病毒的肿瘤靶向特异性。

表1：通过将病毒和肽以1E+9个病毒粒子与20ug或40ug具有6或9赖氨酸尾的MAGE-A3肽的比例混合而制备的肽-病毒复合物的平均直径和ζ电位。

表2：在通过将3E+9个病毒粒子与如表中所示的不同量的6K-MAGE-A3肽混合进行制备后立即或2小时后测量的肽-病毒复合物的平均流体动力学直径和ζ电位。

表3：通过将3E+9个病毒粒子与不同量的6K-MAGE-A3肽混合而制备的肽-病毒复合物的平均流体动力学直径和ζ电位结果。

表4：使用不同的MAGE-A3肽与病毒(3E+9个vp)的比例制备的PeptiCRAd复合物的感染性。

表5：通过将3E+9个病毒粒子与15ug或30ug的6K-MAGE-A3肽混合而制备的肽-病毒复合物在不同温度下保持18小时-20小时后的平均流体动力学直径和ζ电位结果。

表6a：通过将3E+9个病毒粒子与不同量的6K-NY-ESO-1肽(p81-100)混合而制备的肽-病毒复合物的平均流体动力学直径和ζ电位。

表6b：通过将3E+9个病毒粒子与不同量的6K-NY-ESO-1肽(p91-110)混合而制备的肽-病毒复合物的平均流体动力学直径和ζ电位。

表7a：通过在水或生理NaCl(0.9％)中将3E+9个病毒粒子与1ug的6K-NY-ESO-1肽(p81-100)和MAGE-A3肽混合而制备的肽-病毒复合物的平均流体动力学直径和ζ电位。

表7b：通过在水或生理NaCl(0.9％)中将3E+9个病毒粒子与1ug的6K-NY-ESO-1肽(p91-110)和6K-MAGE-A3肽二者混合而制备的肽-病毒复合物的平均流体动力学直径和ζ电位。

表8a：通过在生理NaCl(0.9％)中将3E+9个病毒粒子与不同量的6K-NY-ESO-1肽(p81-100)混合而制备的肽-病毒复合物的平均流体动力学直径和ζ电位。

表8b：通过在生理NaCl(0.9％)中将3E+9个病毒粒子与不同量的6K-NY-ESO-1肽(p91-110)混合而制备的肽-病毒复合物的平均流体动力学直径和ζ电位。

表9：用PeptiCRAd处理的动物在未处理的远处肿瘤中比在经过处理的原发性肿瘤中显示出更多的CD8+和CD4+T细胞，这表明与OV相比，PeptiCRAd处理实现了更有效的抗原提呈和后续的T细胞向远处肿瘤的归巢。结果被描述为未处理的肿瘤与经过处理的肿瘤中的肿瘤浸润性淋巴细胞的数量的比例±SEM。

表10:病毒和病毒-肽复合物的基于SPR测量的结果。

Claims (18)

1.至少一种修饰的腺病毒或包含所述至少一种修饰的腺病毒与合适的载剂的组合的药物组合物在制备一种用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述修饰的腺病毒包含：

以下多肽中的至少一种，所述多肽共价或非共价连接到病毒衣壳上，所述多肽不是由所述腺病毒遗传编码：

i)VFGIELMEVDPIGHLYIFAT[SEQ ID NO:1]；或

ii)YLAMPFATPMEAELARRSLA[SEQ ID NO:2]；

其中所述腺病毒包括编码OX40L，或者CD40L和OX40L的转基因；

并且其中所述癌症选自：鼻咽癌、肝细胞癌、肾癌、结缔组织癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、脑癌、喉癌、口腔癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、泌乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、希林二氏病、卓艾二氏综合征、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、输尿管癌、少突胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、原发部位未知的癌症、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、佩吉特氏病、宫颈癌、食道癌、胆囊癌、头癌、眼癌、颈癌、肾癌、肾母细胞瘤、卡波西氏肉瘤、前列腺癌、睾丸癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、软组织肉瘤、成视网膜细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞癌、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样真菌病、胰岛素瘤、类癌综合征、生长抑素瘤、牙龈癌、心脏癌、唇癌、脑膜癌、口腔癌、神经癌、上腭癌、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌和扁桃体癌。

2.根据权利要求1所述的用途，其中使用3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个赖氨酸对所述多肽进行多聚赖氨酸延伸。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述赖氨酸连接在所述多肽的氨基末端处。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述多肽是：

KKKKKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT[SEQ ID NO:7]；和/或

KKKKKKKKK-YLAMPFATPMEAELARRSLA[SEQ ID NO:8]；或者是：

KKKKKK-VFGIELMEVDPIGHLYIFAT[SEQ ID NO:4]；和/或

KKKKKK-YLAMPFATPMEAELARRSLA[SEQ ID NO:5]。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述腺病毒是人类腺病毒。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述腺病毒在E1和/或E3和/或E4和/或L3基因中包含修饰，所述修饰包括肿瘤特异性启动子的插入、至少一个基因缺失和至少一个转基因的插入。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述腺病毒是血清5型。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述腺病毒被进一步修饰以包括Ad5/3嵌合取代，即用血清3型腺病毒纤突结区置换血清5型腺病毒纤突结区。

9.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述腺病毒被进一步修饰以包括E1A基因缺失，其中所述缺失至少是编码氨基酸122-129的那些核苷酸。

10.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述腺病毒被进一步修饰以包括14.7k基因的部分或完全缺失。

11.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述腺病毒被进一步修饰以包括编码共刺激分子的至少一个转基因的插入。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述病毒包括至少两个转基因，其中所述转基因之一编码激活先天免疫系统的共刺激分子，而另一个编码激活适应性免疫系统的共刺激分子。

13.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述转基因是人类的。

14.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述OX40L位于E3B区域中，替代了基因14.7K缺失。

15.根据权利要求14所述的用途，其中使用2A加工位点将所述CD40L分子插入紧邻OX40L的下游。

16.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述肽与病毒的比例在每3E+9个病毒粒子1ug至5ug的范围内。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的用途，其中所述至少一种腺病毒或所述药物组合物被配制为与细胞检查点调节剂一起施用。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述检查点调节剂是抗PD1分子、抗PD-L1分子或抗CTLA-4分子。