HK40081213B - 一种稳定的多西他赛白蛋白纳米粒组合物 - Google Patents

Description

一种稳定的多西他赛白蛋白纳米粒组合物

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物。

背景技术

多西他赛是由红豆杉的针叶中提取的非细胞毒性前体(10-去乙酰浆果赤霉素Ⅲ)半合成生产所得，是紫杉醇类似物，其作用于细胞微管，可促进微管蛋白聚合，同时抑制微管解聚，使细胞停滞于G2/M期，抑制有丝分裂，从而杀死肿瘤细胞，较紫杉醇有更强的抗肿瘤活性。

多西他赛水溶性较差，目前市售制剂为其普通注射液，最早由赛诺菲开发，商品名为常规给药剂量为每3周给药一次，静脉输注1h，剂量为75m/m²。然而以为代表的多西他赛注射液，由于处方中使用乙醇和吐温80，具有以下缺点：

①严重的过敏反应，需要地塞米松预处理，患者顺应性差。Tween-80会引起严重过敏反应及体液潴留，需要提前服用抗过敏药物。如在滴注前一天起，每天服用16mg地塞米松，持续至少3天，以预防过敏反应和体液潴留；即使提前服用地塞米松仍有严重过敏反应报道。说明书中明确提到“在接受了3天的地塞米松预防治疗的患者中有6.5％(6/92)报道严重的体液潴留”。

②乙醇会影响中枢神经系统，需要降低输液速度来减缓中毒症状。2014年，FDA发表了“有关静脉注射含乙醇化疗多西他赛与中毒风险的药物安全通讯”，认为多西他赛注射液中的乙醇可能会影响中枢神经系统，降低输液速度可能会减缓乙醇中毒症状，并呼吁开发不含乙醇的多西他赛制剂。

③Tween-80引起过敏反应，只能低浓度给药，患者顺应性差。Tween-80会引起过敏反应，且浓度过高时会引起溶血反应，因此，只能稀释至较低浓度给药，延长输液时间，患者顺应性差。

④产品配伍稳定性差，且需要使用不含PVC材质的输液装置，临床使用不便。说明书中提及“多西他赛预注射液(10mg/ml)应于配制后立即使用。然而其理化特性表明不论是在2～8℃或室温保存，预注射液的稳定性为8小时。注射液(不超过0.74mg/ml)室温条件下应于4小时内使用，静脉滴注1小时”，临床使用不方便；说明书中明确提到不建议使用PVC输液装置，与PVC输液装置接触会使PVC输液装置中的二-(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯浸出，存在安全隐患。

为改善普通制剂的诸多缺点，Development of docetaxel-loaded intravenousformulation,Nanoxel-PM^TMusing polymer-based delivery syste(Sa-Won Lee,Min-HyukYun,Seung Wei Jeong，Journal of Controlled Release，155(2011)262–271)一文，公开了韩国三洋公司开发的Nanoxel-PM^TM(已在韩国上市，商品名：M)，该产品选择聚乙二醇-聚丙交酯(mPEG-PDLLA)聚合物作为载体，制备多西他赛胶束，平均粒径为10-50nm，粒度分布均匀。其官网上公开了临床使用方式，为了最大限度降低过敏反应，预处理是必要的，例如，从给药前一天起每天口服16mg地塞米松，连续服用3天(https://www.samyangbiopharm.com/eng/ProductIntroduce/injection03)。虽然该产品处方中未使用乙醇和吐温80，但临床上仍需要预处理。

人血白蛋白(Human Serum Albumin，简称HSA)是人血浆中的蛋白质，其包含585个氨基酸，分子量为66kD。在血浆中其浓度为42g/L，约占血浆总蛋白的60％。在体液中人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等；同时能够维持血液正常的渗透压、生理pH值。

蛋白质是多种氨基酸构成的高分子化合物，其中各氨基酸通过肽键及二硫键结合成具有一定顺序的肽链称为一级结构；同一多肽链或不同肽链中的氨基和酰基之间可以形成氢键，使得多肽链的主链具有一定的有规则构象，包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和Ω-环等，这些称为蛋白质的二级结构；肽链在二级结构的基础上进一步盘曲折叠，形成一个完整的空间构象，称为三级结构；多条肽链通过非共价键聚集而成的空间结构称为四级结构，其中一条肽链叫一个亚基。

蛋白质的变性是指蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其分子内部结构和性质的作用。一般认为蛋白质的二级结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结果。蛋白质变性的方法主要分为化学方法和物理方法，其中化学方法包括加强酸、强碱、重金属盐、尿素、丙酮等；物理方法包括加热、紫外线及X射线照射、超声波、剧烈振荡或搅拌等。

Michael Dockal,Daniel C.Carter,Florian Rüker.ConformationalTransitions of the Three Recombinant Domains ofHuman Serum Albumin Dependingon pH.(J Biol Chem,2000,275(5):3042-3050)一文报道人血白蛋白在不同pH条件下，会发生构象的转变(如酸性条件N-F和F-E转化，碱性条件N-B转化)，引发蛋白质的变性。在本发明中我们将加酸导致变性的白蛋白定义为“酸变性白蛋白”，此时的白蛋白溶液pH小于5.5。

无论进口还是国产的人血白蛋白生产工艺基本相同，均是健康人血浆经低温乙醇蛋白分离法提纯，并经60℃10小时加温灭活病毒后制成。市售白蛋白通常加入辛酸钠作为热保护剂，例如每1g白蛋白加入0.16mmol的辛酸钠。

由于人血白蛋白是人体内源性物质，具有很好的生物相容性，可作为疏水性药物的天然载体，增加难溶性药物溶解度。美国Abraxis公司以人血白蛋白作为辅料，采用乳化法开发的注射用紫杉醇(白蛋白结合型)(商品名)于2005年经FDA批准上市，用于治疗联合化疗失败的转移性乳腺癌或辅助化疗6个月内复发的乳腺癌，之后相继获批用于治疗非小细胞肺癌、胰腺癌及胃癌(日本)。

与紫杉醇注射液相比，由于处方中不含可导致严重过敏反应的溶剂聚氧乙烯蓖麻油，因此不需要预先给予抗过敏药物，并且可以高浓度快速给药，将输液时间缩短至30分钟以内，显著提高了患者的顺应性；由于安全性的提高，紫杉醇的给药剂量从175mg/m²可提高到260～300mg/m²；中的聚氧乙烯蓖麻油会抑制紫杉醇与白蛋白的结合，处方中不含有聚氧乙烯蓖麻油，可以更充分利用白蛋白独特的“gp60-窖蛋白-SPARC”通道使药物向肿瘤区富集，从而增加疗效。目前各国科研人员正在尝试使用人血白蛋白开发其他药物的白蛋白纳米粒，如多西他赛等。

其中，Neil P.Desai等人的专利US2005/0004002A1公开了一种乳化法制备多西他赛白蛋白纳米粒，其处方仅包括多西他赛和人血白蛋白，粒度在50-220nm，冻干前后粒度基本无变化，但无论冻干前还是冻干后悬浮液，稳定时间较短，无法满足临床需求。

中国专利CN103054798A先尝试在处方中加入大豆油、磷脂、胆固醇、苯甲酸等作为稳定剂以提高悬浮液稳定性，均未成功。经过大量试验摸索，最终确定加入柠檬酸钠或柠檬酸钠与氯化钠组合物可显著提高悬浮液稳定性。但是，大量盐的使用导致重建悬浮液的渗透压很高，刺激性强，注射时会带来明显痛感，甚至导致注射局部组织细胞渗透性损伤，临床使用不便。

该发明同时指出多西他赛无水形式较结合水形式(如多西他赛三水合物或半水合物)所制备的纳米粒悬浮液稳定性更好。实施例28记载了在不含稳定剂的情况下，当活性成分为无水多西紫杉醇(即多西他赛)时，在4℃放置的第一天，纳米颗粒滤液发生沉降，半水合物和三水合物的沉降在更短的时间内即发生；在含有稳定剂的情况下，当活性成分为无水多西紫杉醇(即多西他赛)时，在4℃，纳米颗粒滤液没有沉降达2天，半水合物和三水合物的沉降在更短的时间内即发生。因此，该专利限定以无水型多西他赛制备白蛋白纳米粒，极大地限制了多西他赛的原料选择范围。

该专利还对制剂pH进行了考察，发现“pH增加超过6，增加了在纳米颗粒大小和制剂沉降方面所测定的物理稳定性，同时，增加了室温下多西他赛降解为7-表多西他赛的量。因此，物理稳定性和化学稳定性都可接受的pH范围是6-8.5之间，更优选的pH范围是6.5-8，并且发现最优的范围是pH7.25至7.75。”

虽然CN103054798A认为加入柠檬酸钠或柠檬酸钠与氯化钠组合物有利于改善多西他赛白蛋白纳米粒制剂的物理稳定性，但是中国专利CN106137969A指出在多西他赛白蛋白组合物中加入酒石酸、柠檬酸和抗坏血酸及其他pKa为2.5-4.5的有机酸等并不能有效抑制7-表多西他赛增长，甚至出现7-表多西他赛的增多，导致组合物化学稳定性差，影响制剂安全性。然而，氨基酸类物质的选择性加入能够使得多西他赛白蛋白长时间稳定，显著抑制了7-表多西他赛的生成。特别的，当氨基酸为精氨酸时，在30个月后，7-表多西他赛的含量仅为0.72％。所制备产品复溶后悬浮液室温可稳定8小时以上。该专利限定在所述的多西他赛白蛋白纳米粒药物组合物中，氨基酸与多西他赛的质量比不小于0.5，优选不小于1。

WO2018/059304A1也公开了提高白蛋白药物组合物产品质量的方法，其中，该药物组合物包含白蛋白和至少一种相对分子量为145-175的氨基酸或其盐，所述氨基酸可选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸中的一种或几种，优选精氨酸和/或组氨酸，更优选精氨酸；所述氨基酸或其盐与白蛋白的重量比为0.1：1～10：1，所述氨基酸或其盐在药物组合物的制备、储存和使用中抑制白蛋白二聚体的生成或含量增加。该白蛋白药物组合物可有效降低临床使用因白蛋白多聚体和二聚体引起的人体内不期望的响应，如疹子、荨麻疹、过敏反应和可能的免疫应答，进一步保证临床用药安全。

综上所述，提高多西他赛白蛋白产品质量，需要同时考虑其物理稳定性(悬浮液稳定性)和化学稳定性(多西他赛降解情况和白蛋白多聚体增加情况)。现有技术公开的多西他赛白蛋白组合物，一种是加入大量螯合剂作为稳定剂，以提高产品的物理稳定性，但是未考察对其化学稳定性的影响；另外，大量的螯合剂提高稳定性的同时形成高渗溶液，临床使用不便。另外一种是需要在产品中加入大量的氨基酸，可以抑制多西他赛的降解及白蛋白多聚体的增加，但未对物理稳定性的影响进行深入研究，仅提及复溶后悬浮液室温可稳定8小时以上。

因此，找到可以同时保证多西他赛白蛋白组合物的物理稳定性和化学稳定性的方法是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供一种含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物，所述组合物包含多西他赛和酸变性白蛋白。

或者，本发明提供一种含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物，所述组合物由多西他赛和酸变性白蛋白制成。

或者，本发明提供一种含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物，所述组合物由多西他赛和酸变性白蛋白制成，任选地包含渗透压调节剂、或者pH调节剂。

其中，所述多西他赛优选无水型多西他赛、多西他赛半水合物或多西他赛三水合物。

所述酸变性白蛋白由人血白蛋白加酸调至适当的pH值后变性得到，优选地：

(1)所述酸选自酸性氨基酸或酸性多肽、有机酸、无机酸。所述酸性氨基酸或酸性多肽包括但不仅限于盐酸半胱氨酸、谷胱甘肽等；所述有机酸包括但不仅限于柠檬酸、酒石酸等；所述无机酸包括但不仅限于盐酸、硫酸等。所述酸优选盐酸半胱氨酸、谷胱甘肽、盐酸，更优选盐酸半胱氨酸；和/或

(2)所述适当的pH值优选3.5～5.5，优选3.5～5.0，更优选3.8-4.7，更优选4.0～4.5；和/或

(3)以无水多西他赛计，多西他赛和人血白蛋白的质量比为1:(2.0～10.0)，优选1:(3.0～7.0)，更优选1：(4.0～6.0)；和/或

(4)所述人血白蛋白中辛酸钠的含量不高于0.08mmol/g蛋白，优选0.03-0.08mmol/g蛋白，进一步优选0.04-0.08mmol/g蛋白，更优选0.04-0.07mmol/g蛋白。

在一些实施方案中，所述多西他赛白蛋白纳米粒的粒径为约60-200nm，优选90-150nm，更优选90-135nm。

本发明所述的含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物，任选的包含渗透压调节剂，以便将渗透压调节在适当的范围内。所述渗透压调节剂的类型并不受特别限制，例如可选自氯化钠、葡萄糖、磷酸盐或枸橼酸盐等，优选氯化钠。其种类、用量可以由本领域技术人员根据临床使用的稀释剂或复溶介质的种类、用量等具体情况确定。在一些实施方案中，所述渗透压调节剂为氯化钠，氯化钠与多西他赛的重量比为(0.75-9):1，优选(1-7):1，优选(1.5-4.5):1，最优选2.25:1。

任选的，本发明所述的组合物包含pH调节剂，以便将pH值调节在适当的范围内，使制备本发明所述组合物的悬浮液和/或本发明组合物的重建悬浮液在25℃条件下至少稳定24小时，优选至少稳定30小时；和/或在2～8℃下至少稳定7天，优选至少稳定10天。此处所述的“稳定”，是指没有发生纳米粒沉降或悬浮液浑浊。所述pH调节剂的种类并不受特别的限制。优选地，所述pH值范围为3.4-5.8；优选3.6-5.6、或者3.8-5.0、更优选3.9-4.8。

在一些实施方案中，本发明所述组合物为悬浮液。其中，所述悬浮液的pH值为3.4-5.8，优选3.6-5.6，或者3.8-5.0，更优选3.9-4.8。所述悬浮液中多西他赛白蛋白纳米粒的粒径约60-200nm，优选90-150nm，更优选90-135nm。所述悬浮液含氯化钠0-1.8％(w/v)，优选0.45％-1.8％(w/v)，更优选0.9％-1.8％(w/v)。在一些实施例中，所述悬浮液含多西他赛2-10mg/ml，优选2-8mg/ml。所述悬浮液25℃条件下至少稳定24小时，优选至少稳定30小时；在2～8℃下至少稳定7天，优选至少稳定10天。

在另一些实施方案中，本发明所述组合物为冻干粉。所述多西他赛白蛋白纳米粒的粒径约60-200nm，优选90-150nm，更优选90-135nm。在一些实施方案中，所述冻干粉含氯化钠，氯化钠：多西他赛的重量比为(0.75-9):1，优选(1-7):1，优选(1.5-4.5):1，最优选2.25:1。

所述冻干粉由含多西他赛白蛋白纳米粒的悬浮液冻干而成。其中，所述悬浮液的pH值为3.4-5.8，优选3.6-5.6，或者3.8-5.0，更优选3.9-4.8。所述悬浮液中多西他赛白蛋白纳米粒的粒径约60-200nm，优选90-150nm，更优选90-135nm。所述悬浮液含氯化钠0-1.8％(w/v)，优选0.45％-1.8％(w/v)，更优选0.9％-1.8％(w/v)。所述悬浮液25℃条件下至少稳定24小时，优选至少稳定30小时；在2～8℃下至少稳定7天，优选至少稳定10天。

所述冻干粉使用复溶介质重建悬浮液。所述复溶介质选自注射用水、氯化钠溶液或葡萄糖溶液，优选注射用水。所述重建悬浮液的pH值为3.4-5.8，优选3.6-5.6，或者3.8-5.0，更优选3.9-4.8。重建悬浮液中多西他赛白蛋白纳米粒的粒径约60-200nm，优选90-150nm，更优选90-135nm。所述重建悬浮液含氯化钠0-1.8％(w/v)，优选0.45％-1.8％(w/v)，更优选0.9％-1.8％(w/v)。重建的等渗悬浮液25℃条件下至少稳定24小时，优选至少稳定30小时；在2～8℃下至少稳定7天，优选至少稳定10天。

在一些实施方案中，本发明所述的含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物冻干后在25℃条件下至少稳定36个月。此处所述的“稳定”包括但不仅限于多西他赛无明显降解，蛋白纳米粒未发生明显聚合，粒度未明显增大，多西他赛含量、水分、酸度、渗透压或者摩尔浓度等无明显变化。所述“稳定”可以是上述列举的情形中的一种或多种。在一些实施方案中，所述“稳定”表现为7-表多西他赛和/或白蛋白多聚体的含量无明显变化。

另一方面，本发明还提供了一种药物，其由上述含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物制成。所述药物为临床可接受的剂型，优选注射剂，进一步优选液体注射剂或冻干粉针剂。

当所述注射剂为液体注射剂时，所述液体注射剂的pH值为3.4-5.8，优选3.6-5.6，或者3.8-5.0，更优选3.9-4.8。所述液体注射剂中多西他赛白蛋白纳米粒的粒径约60-200nm，优选90-150nm，更优选90-135nm；所述液体注射剂含氯化钠0-1.8％(w/v)，优选0.45％-1.8％(w/v)，更优选0.9％-1.8％(w/v)，更优选0.9％(w/v)。在一些实施方案中，所述液体注射剂含多西他赛2-10mg/ml，优选2-8mg/ml。所述液体注射剂25℃条件下至少稳定24小时，优选至少稳定30小时；在2～8℃下至少稳定7天，优选至少稳定10天。此处所述的“稳定”，是指没有发生纳米粒沉降或液体注射剂浑浊。

当所述注射剂为冻干粉针剂时，所述冻干粉针剂含氯化钠，氯化钠：多西他赛的重量比为(0.75-9):1，优选(1-7)：1；优选(1.5-4.5):1，最优选2.25:1。多西他赛白蛋白纳米粒的粒径约60-200nm，优选90-150nm，更优选90-135nm。制备所述冻干粉针剂的悬浮液在冻干前的pH为3.4-5.8，优选3.6-5.6，或者3.8-5.0，更优选3.9-4.8。所述悬浮液25℃条件下至少稳定24小时，在2～8℃下至少稳定10天。

所述冻干粉针剂使用复溶介质重建悬浮液。所述复溶介质选自注射用水、氯化钠溶液或葡萄糖溶液，优选注射用水。所得重建悬浮液的pH值为3.4-5.8，优选3.6-5.6，或者3.8-5.0，更优选3.9-4.8。重建悬浮液中多西他赛白蛋白纳米粒的粒径约60-200nm，优选90-150nm，更优选90-135nm。所述重建悬浮液含0-1.8％(w/v)氯化钠，优选0.45％-1.8％(w/v)，更优选0.9％-1.8％(w/v)，更优选0.9％。在一些实施方案中，所述重建悬浮液含多西他赛2-10mg/ml，优选2-8mg/ml。重建悬浮液25℃条件下至少稳定24小时，优选至少稳定30小时；在2～8℃下至少稳定7天，优选至少稳定10天。

本发明还提供所述组合物的制备方法，含有如下步骤：

(1)多西他赛溶解于有机溶剂中，溶解后得到有机相溶液；

(2)取人血白蛋白溶液，加酸调节pH值，得酸变性白蛋白水相溶液；另取一种盐溶液；

(3)将有机相溶液、水相溶液及盐溶液混合载药，得到载药液；

(4)透析，得到透析后悬浮液；

其中，步骤(2)在加酸调节pH值前，任选地包含用注射用水稀释人血白蛋白溶液得白蛋白稀释液的步骤。

其中，步骤(2)在加酸调节pH值后，任选地包含孵育步骤。

其中，步骤(3)在混合载药后，任选地包含降温步骤。

其中，步骤(4)在透析前，任选地包含，将步骤(3)所得载药液浓缩得到浓缩液。

其中，步骤(4)透析后，任选地包含浓缩或稀释步骤，以调节透析后悬浮液中多西他赛的浓度。

其中，步骤(4)后任选地含有步骤(5)除菌过滤。

其中，步骤(5)后任选地含有步骤(6)冻干。

其中，步骤(1)中所述多西他赛为任意形式，优选为无水型多西他赛、多西他赛半水合物或多西他赛三水合物。以无水多西他赛计，多西他赛和人血白蛋白的质量比为1：(2.0～10.0)，优选1:(3.0～7.0)，更优选1:(4.0～6.0)。

其中，步骤(1)中所述有机溶剂选自可与水互溶的溶剂，例如乙醇、甲醇、丙酮、DMSO等，优选乙醇。以无水多西他赛计，所述有机相溶液含多西他赛45-90mg/ml，优选45-70mg/ml。

其中，步骤(2)中所述人血白蛋白溶液中辛酸钠的含量为不高于0.12mmol/g蛋白，优选不高于0.08mmol/g蛋白，优选0.045-0.08mmol/g蛋白。

其中，步骤(2)中，白蛋白稀释液含白蛋白6-25mg/ml，优选10-20mg/ml，更优选12-18mg/ml，更优选15mg/ml。

其中，步骤(2)中，所述酸选自酸性氨基酸或酸性多肽、有机酸、无机酸。所述酸性氨基酸或酸性多肽包括但不仅限于盐酸半胱氨酸、谷胱甘肽等；所述有机酸包括但不仅限于柠檬酸、酒石酸等；所述无机酸包括但不仅限于盐酸、硫酸等。所述酸优选盐酸半胱氨酸、谷胱甘肽、盐酸，更优选盐酸半胱氨酸。所述pH值优选3.5～5.5，优选3.5～5.0，更优选3.8-4.7，更优选4.0～4.5。

其中，步骤(2)中，所述孵育是指在加酸调节pH值后，升温至35℃-42℃，优选38℃-42℃；孵育30min以上，优选30min-60min。

其中，步骤(2)中所述的盐溶液选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠或硫酸镁的水溶液，优选氯化钠的水溶液；盐溶液浓度不低于2％，优选2％～35％，更优选10％～20％。

其中，步骤(3)中，载药条件为将有机相溶液、水相溶液升温至35℃-42℃，优选38℃-42℃，将三者混合载药。

其中，步骤(3)中所述降温，指降温至低于室温，优选0-20℃，更优选7-15℃。

其中，步骤(4)中所述浓缩液含多西他赛约4-10mg/ml，优选6-10mg/ml，更优选7-9mg/ml，更优选8mg/ml。

其中，步骤(4)透析以去除多余的小分子化合物，对于透析液的种类和用量、透析膜的截留分子量没有特别限制，本领域技术人员可以根据普通技术知识或经验作出选择。为方便进一步制剂和临床使用，透析液优选临床可接受的渗透压调节剂的水溶液，例如氯化钠、葡萄糖、磷酸盐或枸橼酸盐的水溶液。在一些实施方案中，步骤(4)中使用氯化钠溶液作为透析液进行透析。透析膜的截留分子量为10-50KDa，优选10-30KDa，更优选10KDa或者30KDa。透析液体积不低于载药液或浓缩液的3倍，优选3-10倍，更优选3-6倍。所述氯化钠溶液的浓度不高于1.8％(w/v)，优选0.45％-1.8％(w/v)，更优选0.9％-1.8％(w/v)。

在一些实施方案中，步骤(2)使用的人血白蛋白溶液，需事先调整所含辛酸钠的含量。本领域技术人员可以根据普通技术知识或经验选取适宜的方法调节人血白蛋白溶液中辛酸钠的含量，包括但不仅限于透析。

在一些实施例中，调节人血白蛋白溶液中辛酸钠的含量的方法为：

取市售的人血白蛋白溶液，用注射用水或者生理盐水稀释，得到稀释的白蛋白溶液；用注射用水或者生理盐水作为透析液对稀释的白蛋白溶液进行透析，以部分去除辛酸钠，得到低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液。

在一些实施方案中，人血白蛋白溶液的稀释倍数不低于4倍，优选4-7倍。所述透析，透析膜的截留分子量为10-50KDa，优选10-30KDa，更优选10KDa或者30KDa。透析液的体积是本领域技术人员根据需要的辛酸钠含量通过常规试验可以确定的。优选的，透析液的体积约为稀释的白蛋白溶液的体积的3倍以上，优选3-10倍，更优选3-6倍。

所述低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液含辛酸钠低于0.16mmol/g蛋白，优选低于0.12mmol/g蛋白，优选低于0.10mmol/g蛋白，优选低于0.08mmol/g蛋白。所述低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液可以直接用于制备本发明所述的多西他赛白蛋白纳米粒组合物，也可与其它辛酸钠含量的人血白蛋白溶液按比例混合得到期望含量后，再用于制备多西他赛白蛋白纳米粒组合物。

另一方面，本发明还提供了一种含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物，其由上述方法制备得到。

在所述制备方法中，透析步骤将去除载药液或浓缩液中多余的小分子化合物。例如，在一些实施方案中，步骤(2)使用酸性氨基酸或酸性多肽调节pH来制备酸变性白蛋白；透析步骤基本去除了多余的酸性氨基酸或酸性多肽；所述组合物几乎不含有游离的酸性氨基酸或酸性多肽。所述“几乎不含有游离的酸性氨基酸或酸性多肽”是指游离的酸性氨基酸或酸性多肽在组合物中的含量低于多西他赛的0.25％(w/w)。例如，在一些实施方案中，使用盐酸半胱氨酸或谷胱甘肽调节pH以制备酸变性白蛋白，所述组合物中游离的半胱氨酸或谷胱甘肽的含量低于多西他赛的0.25％(w/w)。

进一步的，本发明还提供一种药物，其由上述方法制得的含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物制备得到。所述药物为临床可接受的剂型，优选注射剂，进一步优选液体注射剂或冻干粉针剂。

另一方面，本发明还提供了一种调节人血白蛋白溶液中辛酸钠的含量的方法，包含以下步骤：

取市售的人血白蛋白溶液，用注射用水或者生理盐水稀释，得到稀释的白蛋白溶液；用注射用水或者生理盐水作为透析液对稀释的白蛋白溶液进行透析，以部分去除辛酸钠，得到低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液。

在一些实施方案中，人血白蛋白溶液的稀释倍数不低于4倍，优选4-7倍。所述透析，透析膜的截留分子量为10-50KDa，优选10-30KDa，更优选10KDa或者30KDa。透析液的体积是本领域技术人员根据需要的辛酸钠含量通过常规试验可以确定的。优选的，透析液的体积约为稀释的白蛋白溶液的体积的3倍以上，优选3-10倍，更优选3-6倍。

所述低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液含辛酸钠低于0.16mmol/g蛋白，优选低于0.12mmol/g蛋白，优选低于0.10mmol/g蛋白，优选低于0.08mmol/g蛋白。

所述低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液可以直接用于制备本发明所述的多西他赛白蛋白纳米粒组合物，也可与其它辛酸钠含量的人血白蛋白溶液按比例混合得到期望含量后，再用于制备多西他赛白蛋白纳米粒组合物。

本发明所述的多西他赛，其含量均以无水多西他赛计。

本发明所述的数值或数值范围，在不影响本发明实施的前提下，可在本领域技术人员理解的范围内上下浮动，所述浮动范围例如±20％，或±17％，或±15％，或±12％，±10％，或±9％，或±8％，或±7％，或±6％，或±5％，或±4％，或±3％，或±2％，或±1％。

本发明所述的“由……制成”为开放式表述，其并未排除其他任选成分的存在，例如，所述“所述组合物由多西他赛和酸变性白蛋白制成”，应当被理解为“所述组合物由包含多西他赛和酸变性白蛋白为原料的原料组合物制成”或者“所述组合物由以多西他赛和酸变性白蛋白为主成分的原料制成”。

本发明令人惊讶的发现，白蛋白中的热稳定剂辛酸钠对产品的物理稳定性影响较大。其原因是辛酸钠可以与药物竞争性结合白蛋白的疏水位点，降低药物与蛋白的结合力，导致纳米悬浮液不稳定。当直接使用市售的人血白蛋白溶液作为辅料时(含辛酸钠0.16mmol/g蛋白)，10h小时内纳米粒即发生沉降；然而，当采用透析手段降低白蛋白溶液中的辛酸钠含量，使其低于0.08mmol/g蛋白时，制得的纳米粒稳定性大大提高，在25℃条件下至少可保持稳定24h以上，在2-8℃至少可稳定放置10天以上。

其次，pH值也是影响多西他赛白蛋白纳米粒物理稳定性的重要因素。现有技术制备的多西他赛白蛋白纳米粒悬浮液pH值均在白蛋白等电点以上，为维持悬浮液的稳定性，需加入大量的有机酸或其盐作为稳定剂，导致药物渗透压较高，临床使用时会引起明显的疼痛，并引起注射局部细胞和组织的渗透性损伤。而本申请以酸变性白蛋白制备多西他赛白蛋白纳米粒，并控制白蛋白溶液中辛酸钠的含量，无需额外加入其它盐类稳定剂，重建得稳定的等渗悬浮液，对血管刺激小。

此外，CN103054798A教导无水型多西他赛制备的纳米粒稳定性明显优于多西他赛三水合物和半水合物。然而，在本发明技术方案中，多西他赛的结晶水情况，即无水型、半水合物、三水合物对所制备的多西他赛白蛋白纳米粒组合物稳定性无影响。这大大拓展了多西他赛使用形式的选择范围，有极大的产业应用价值。

本发明提供了一种物理和化学均稳定的多西他赛白蛋白组合物。本发明提供的组合物，加速及长期稳定性考察显示，7-表多西他赛、蛋白多聚体变化很少，已完成的加速稳定性试验显示冻干粉可在30℃和25℃条件稳定储存18个月，根据现有数据预测可在30℃条件下稳定储存至少20个月，25℃以下的条件下稳定储存至少36个月。已完成的静置稳定性观察试验显示，本发明提供的组合物不论是冻干前悬浮液，还是冻干后重建悬浮液，在室温条件下可稳定至少24小时，冷藏条件下可稳定至少10天，不会出现悬浮液浑浊或纳米粒沉降；放置更长时间的稳定性考察正在进行中。相对于市售产品重建悬浮液仅稳定8h的情况相比，本发明产品大大减轻了临床使用限制。此外，本发明提供的多西他赛白蛋白组合物与市售多西他赛注射液(泰索帝，TAXOTERE)相比，最大耐受剂量(MTD)更高，毒性更小。因此，预期本发明提供的多西他赛白蛋白组合物可以提高多西他赛的临床使用剂量，并且提高临床使用安全性。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的具体说明，不应对本发明的范围构成限制。

除特别说明，实施例中所述的“稳定”，是指没有发生纳米粒沉降或悬浮液浑浊。

除特别说明，实施例中所述的“重建悬浮液”是等渗悬浮液。

实施例1多西他赛和白蛋白的组合物的制备

多西他赛白蛋白纳米粒组合物的处方如下：

表1多西他赛白蛋白纳米粒组合物的处方

处方号	1-1	1-2	1-3	1-4
					无水多西他赛	8g	8g	8g	8g
人血白蛋白	36g	36g	36g	80g
					<![CDATA[氯化钠<sup>a</sup>]]>	18g	36g	9g	18g

注：a经换算，冻干前悬浮液中氯化钠的含量。相应透析液中氯化钠的浓度(w/v)分别为：处方1-10.9％；处方1-21.8％；处方1-30.45％；处方1-40.9％。

(1)称取8g无水多西他赛溶解于120ml乙醇中，溶解后得到有机相溶液；

(2)取处方量的人血白蛋白溶液(辛酸钠的含量为0.08mmol/g蛋白)，用注射用水将其稀释为含白蛋白15mg/ml的溶液，再加入适量盐酸半胱氨酸调节pH至4.1，42℃孵育30min，得酸变性白蛋白水相溶液；氯化钠用注射用水配制浓度为20％的盐溶液。

(3)将有机相溶液和水相溶液升温至42℃，有机相、水相及盐溶液混合载药，所得物料置于冰水浴中降温至15℃，得到载药液；

(4)将载药溶液浓缩至含多西他赛浓度约8mg/ml，得浓缩液；使用氯化钠溶液作为透析液对浓缩液进行5倍透析，透析膜截留分子量为30KDa，得到透析后悬浮液；然后，加适量透析液调整悬浮液浓度至含多西他赛4mg/ml；

(5)经0.45μm+0.2μm膜片进行除菌过滤，得冻干前悬浮液；

(6)取步骤(5)所得冻干前悬浮液，冻干，得冻干粉。

结果显示，透析步骤会降低辛酸钠的含量。在透析步骤结束时，透析后悬浮液中氯化钠的浓度与透析液中氯化钠的初始浓度基本相同。使用动态光散射法方法检测悬浮液中纳米粒的粒径，并静置悬浮液观察沉降现象。表2结果显示，透析液中氯化钠的含量对冻干前悬浮液、重建悬浮液中多西他赛白蛋白纳米粒的粒径无显著影响。将各处方的冻干前悬浮液、重建悬浮液在25℃条件下静置24小时，未见溶液浑浊或沉淀出现；在2～8℃下静置10天，也未见溶液浑浊或沉淀出现。提示，各处方的冻干前悬浮液、重建悬浮液在25℃条件下至少稳定24小时，在2～8℃下至少稳定10天。冻干前后稳定性无显著变化。

比较处方1-1和1-4的结果可见，调整多西他赛与白蛋白的用量比例，也未对纳米粒的粒径、悬浮液的稳定性产生显著影响。

此外，发明人还参照中国药典2020年版四部通则0512，使用高效液相色谱法检测透析后悬浮液中半胱氨酸的含量。结果显示透析后悬浮液中几乎不含有游离的半胱氨酸(含量低于多西他赛的0.25％(w/w))。

发明人还检测了透析前后悬浮液的pH值，发现透析前后悬浮液的pH值基本不变。

表2不同处方多西他赛白蛋白纳米粒的粒径与稳定性

注：a冻干粉使用注射用水重建悬浮液(等渗混悬液)。处方1-1重建为含多西他赛4mg/ml的等渗悬浮液；处方1-2重建为含多西他赛2mg/ml的等渗悬浮液；处方1-3重建为含多西他赛8mg/ml的等渗悬浮液；处方1-4重建为含多西他赛4mg/ml的等渗悬浮液。

实施例2

称取多西他赛三水合物(以无水多西他赛计为8g)溶解于160ml无水乙醇中，溶解后得到有机相溶液；取含16g白蛋白的人血白蛋白溶液(辛酸钠的含量为0.08mmol/g蛋白)，用注射用水稀释成含白蛋白10mg/ml的溶液，再加入适量盐酸半胱氨酸调节pH至4.5，40℃孵育1小时,得酸变性白蛋白水相溶液；氯化钠用注射用水配制浓度为10％的盐溶液；将有机相溶液和水相溶液升温至40℃，有机相、水相及盐溶液混合载药，所得物料置于冰水浴中降温至18℃，得到载药液；将载药液浓缩至含多西他赛浓度约10mg/ml，得浓缩液；使用等渗氯化钠(0.9％，w/v)溶液作为透析液对浓缩液进行6倍透析，透析膜截留分子量为30KDa，得到透析后悬浮液；经0.45μm+0.2μm膜片进行除菌过滤，得到冻干前悬浮液；冻干，得冻干粉。

冻干前悬浮液中，多西他赛白蛋白纳米粒的粒径为101.3nm，在25℃条件下静置24小时，在2～8℃下静置10天，均未见溶液浑浊或沉淀出现。使用注射用水复溶冻干粉得到重建悬浮液(等渗悬浮液)，多西他赛白蛋白纳米粒的粒径无明显变化，为103.5nm；重建悬浮液在25℃条件下静置24小时，在2～8℃下静置10天，均未见溶液浑浊或沉淀出现。提示，冻干前悬浮液、重建悬浮液在25℃条件下至少稳定24小时，在2～8℃下至少稳定10天。

高效液相色谱法检测显示，透析后悬浮液中几乎不含有游离的半胱氨酸(含量约为多西他赛的0.13％(w/w))。透析前后悬浮液的pH值基本不变。

实施例3

称取多西他赛半水合物(以无水多西他赛计为8g)溶解于80ml 96％乙醇中，溶解后得到有机相溶液；取含50g白蛋白的人血白蛋白溶液(辛酸钠的含量为0.08mmol/g蛋白)，用注射用水稀释成含白蛋白20mg/ml溶液，再加入适量盐酸半胱氨酸调节pH至3.9，得酸变性白蛋白水相溶液；氯化钠用注射用水配制浓度为2％的盐溶液；将有机相溶液和水相溶液升温至35℃，将有机相溶液和水相溶液及盐溶液混合载药，所得物料置于冰水浴中降温至12℃，得到载药液；将载药液浓缩至含多西他赛浓度约7mg/ml，得浓缩液，使用等渗氯化钠溶液(0.9％，w/v)作为透析液对浓缩液进行5倍透析，透析膜截留分子量为10KDa，得到透析后悬浮液；经0.45μm+0.2μm膜片进行除菌过滤，得冻干前悬浮液；冻干，得冻干粉。

冻干前悬浮液和冻干粉经注射用水复溶后所得重建悬浮液(等渗悬浮液)，多西他赛白蛋白纳米粒的粒径无明显差异，冻干前为119.7nm，重建后为121.3nm；在25℃条件下静置24小时，或者在2～8℃下静置10天，冻干前悬浮液、重建悬浮液均未见溶液浑浊或沉淀出现。提示，冻干前悬浮液、重建悬浮液在25℃条件下至少稳定24小时，在2～8℃下至少稳定10天。高效液相色谱法检测显示，透析后悬浮液中几乎不含有游离的半胱氨酸(含量约为多西他赛的0.21％(w/w))。透析前后悬浮液的pH值基本不变。

实施例4多西他赛的使用形式对组合物稳定性的影响

称取无水多西他赛、多西他赛半水合物、多西他赛三水合物(以无水多西他赛计，均为8g)溶解于120ml乙醇中，溶解后得到有机相溶液；取含36g白蛋白的人血白蛋白溶液(辛酸钠的含量为0.08mmol/g蛋白)，用注射用水稀释成含白蛋白20mg/ml的溶液，再加入适量盐酸半胱氨酸调节pH至4.3，42℃孵育60min，得酸变性白蛋白水相溶液；氯化钠用注射用水配制浓度为10％的盐溶液；有机相溶液和水相溶液升温至42℃，将有机相溶液和水相溶液及盐溶液混合载药，所得物料置于冰水浴中降温至12℃，得到载药液；将载药液浓缩至含多西他赛浓度约7mg/ml，得浓缩液；使用等渗氯化钠溶液作为透析液对浓缩液进行5倍透析，透析膜截留分子量为30KDa，得透析后悬浮液；经0.45μm+0.2μm膜片进行除菌过滤，得冻干前悬浮液；冻干，得冻干粉。

由下表3结果可以看出，分别以无水多西他赛、多西他赛半水合物、多西他赛三水合物作为原料，使用相同方法制备多西他赛白蛋白纳米粒，所得纳米粒的粒径无明显差异，均在110nm左右，且冻干前后无明显变化。并且，冻干前悬浮液、冻干粉经注射用水复溶的重建悬浮液(含多西他赛4mg/ml)的稳定性也无明显差异，在25℃条件下静置24小时，在2～8℃下静置10天，均未见溶液浑浊或沉淀出现。提示，上述冻干前悬浮液、重建悬浮液可在25℃条件下至少稳定24小时，在2～8℃下至少稳定10天。可见，多西他赛是否含有结晶水不影响本发明的实施。

高效液相色谱法检测显示，透析后悬浮液中几乎不含有游离的半胱氨酸(含量低于多西他赛的0.25％(w/w))。

表3多西他赛的使用形式对组合物稳定性的影响

实施例5化学稳定性考察

将实施例1中处方1-1所得的含多西他赛白蛋白纳米粒的冻干粉置于西林瓶中，压上胶塞和铝盖，在不同储存条件下储存18个月，考察产品中7-表多西他赛的百分比含量及蛋白多聚体含量与时间的关系，结果见表4。

表4实施例1处方1-1产品的稳定性

注：用于定义药物组合物稳定性的可接受极限是“7-表多西他赛的百分比含量≤1.0％”。

N/A*表示实验尚未达到该时间点，因此暂无数据。

表4结果表明，7-表多西他赛的产生与储存温度相关，储存温度越高，7-表多西他赛的含量增长越快。本发明产品可有效控制7-表多西他赛的生成。表4结果显示，在上述三种试验条件下，本发明产品中7-表多西他赛含量均在可控范围内(含量≤1.0％)，且蛋白多聚体含量无明显变化。根据现有数据预测，本发明产品可以在30℃条件下稳定储存至少20个月，25℃以下的条件下稳定储存至少36个月。

当API原料为多西他赛的其他形式，如半水合物和三水合物时，在上述试验条件下，其化学稳定性(7-表多西他赛的百分比含量及蛋白多聚体含量)的变化情况与以无水多西他赛为原料时类似。

中国专利CN106137969A在处方中加入精氨酸、脯氨酸等作为抑制剂，认为采用精氨酸作为抑制剂的效果最佳，可以在2～8℃的条件下贮存至少24个月，甚至可达30个月。该专利提供的数据显示所述产品在2～8℃的条件下贮存12个月时，7-表多西他赛的含量在0.5-0.61％之间；而本发明在25℃条件下储存12个月，7-表多西他赛的含量仅约为0.41％，在2～8℃的条件下贮存12个月时，7-表多西他赛的含量仅0.14％，足以说明本发明相较于CN106137969A，可更有效保证多西他赛的化学稳定性。

实施例6辛酸钠的含量对组合物稳定性的影响

称取8g无水多西他赛溶解于120ml乙醇中，溶解后得到有机相溶液；

取含不同浓度辛酸钠的人血白蛋白溶液(含人血白蛋白36克)，用注射用水稀释至含白蛋白15mg/ml，再加入适量盐酸半胱氨酸调节pH至4.2，42℃孵育30min，得酸变性白蛋白水相溶液；氯化钠用注射用水配制浓度为15％的盐溶液；

将有机相溶液和水相溶液升温至42℃，将有机相溶液和水相溶液及盐溶液混合载药，所得物料置于冰水浴中降温至15℃，得到载药液；将载药液浓缩至含多西他赛浓度约8mg/ml，得浓缩液；使用等渗氯化钠溶液作为透析液对浓缩液进行5倍透析(透析膜截留分子量30KDa)，得到透析后悬浮液；经0.45μm+0.2μm膜片进行除菌过滤，得冻干前悬浮液；冻干，得冻干粉。

由表5结果可知，原料中辛酸钠的含量对多西他赛白蛋白纳米粒的粒径无明显影响。但直接以市售人血白蛋白溶液(含辛酸钠0.16mmol/g蛋白)为原料制备多西他赛白蛋白纳米粒，25℃放置10h即出现浑浊，冻干前悬浮液和重建等渗悬浮液的物理稳定性不佳。降低人血白蛋白溶液中辛酸钠的含量有助于改善纳米粒悬浮液的物理稳定性。当人血白蛋白溶液中辛酸钠含量低于0.08mmol/g蛋白时，可在25℃保持稳定悬浮状态24h以上，稳定时间是含辛酸钠0.16mmol/g蛋白所得样品的2倍以上。当人血白蛋白溶液中辛酸钠含量低于0.08mmol/g蛋白时，所述冻干前悬浮液和重建等渗悬浮液可在2-8℃至少稳定放置10天以上。

表5辛酸钠的含量对组合物稳定性的影响

注：a冻干粉经注射用水复溶得到重建悬浮液(等渗悬浮液)。

实施例7水相溶液pH值对稳定性影响

比较水相溶液pH值对产品稳定性的影响。工艺处方和制备方法参照实施例1处方1-1，仅在步骤(2)中使用盐酸半胱氨酸将水相溶液的pH分别调至7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.7、4.1、3.8、3.5。观察冻干前悬浮液、重建悬浮液中纳米粒粒径及悬浮液稳定性的变化。

研究发现，水相溶液pH在3.5-5.5范围内，所得纳米粒的粒径随pH增高略有增加，但冻干复溶对粒径无明显影响。水相溶液pH在3.5-5.5范围内，所得冻干前悬浮液、重建悬浮液均可在25℃保持稳定悬浮状态20h以上，在2-8℃至少保持7天的稳定悬浮状态。进一步的，当水相溶液pH在3.8-4.7范围内时，冻干前悬浮液、重建悬浮液在25℃静置30h，在2-8℃静置10天，仍能保持稳定的悬浮状态。冻干复溶对稳定性无明显影响。

但当水相溶液pH为6.0以上时，所得纳米粒的粒径显著增加，pH6.0时纳米粒的粒径增至180nm。并且，当水相溶液pH高于6.0时，悬浮液的稳定性明显下降，1h以内即出现浑浊，不能保持纳米粒稳定悬浮的状态。

表6水相蛋白pH对多西他赛白蛋白纳米粒的影响

注：a冻干粉用注射用水复溶得到重建悬浮液(等渗悬浮液)。

实施例8制备低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液

实施例8-1

取市售的人血白蛋白溶液(辛酸钠的含量为0.16mmol/g蛋白)，用注射用水稀释成含白蛋白15mg/ml溶液，得到白蛋白稀释液；用注射用水作为透析液对白蛋白稀释液进行透析(膜包截留分子量为30KDa)，透析倍数6倍，部分去除蛋白中的辛酸钠，得到低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液。

参照中国药典收录的人血白蛋白溶液中辛酸钠的测定方法(中国药典2020年版四部3111)检测所得蛋白溶液中辛酸钠的含量，结果显示处理后的蛋白溶液中含辛酸钠约0.045mmol/g蛋白。

实施例8-2

取市售的人血白蛋白溶液(辛酸钠的含量为0.16mmol/g蛋白)，用生理盐水稀释成含白蛋白12mg/ml溶液，得到白蛋白稀释液；用生理盐水作为透析液对白蛋白稀释液进行透析(膜包截留分子量为10KDa)，透析倍数5倍，部分去除蛋白中的辛酸钠，得到低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液。经检测，所得低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液中含辛酸钠约0.060mmol/g蛋白。

实施例8-3

取市售的人血白蛋白溶液(辛酸钠的含量为0.16mmol/g蛋白)，用注射用水稀释成含白蛋白20mg/ml溶液，得到白蛋白稀释液；用注射用水作为透析液对白蛋白稀释液进行透析(膜包截留分子量为30KDa)，透析倍数3倍，部分去除蛋白中的辛酸钠，得到低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液。经检测，所得低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液中含辛酸钠约0.080mmol/g蛋白。

为保存方便或使用需要，以上实施例8-1至8-3的低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液可进一步进行浓缩处理。

实施例9工艺过程对蛋白二级结构的影响

按照实施例1-1的处方和制备方法，制备载药纳米悬浮液和空白悬浮液(步骤(1)不加药物多西他赛)，采用圆二色谱法考察人血白蛋白溶液、空白悬浮液和载药纳米悬浮液中蛋白各二级结构的占比，结果见表7。

结果表明，经过整个工艺流程制备的空白悬浮液和载药纳米悬浮液，从蛋白二级结构α-螺旋、β-折叠、转角及无规卷曲上看与人血白蛋白溶液相比，存在差异，说明该工艺改变了白蛋白的二级结构。

研究结果提示，本发明即使在透析步骤中除去酸，酸变性白蛋白的二级结构仍不能恢复至变性前的状态。并且，结合多西他赛之后，载药白蛋白的二级结构相对于未载药的酸变性白蛋白又进一步发生了变化。

表7蛋白各二级结构占比

	人血白蛋白溶液	<![CDATA[空白悬浮液<sup>a</sup>]]>	<![CDATA[载药纳米悬浮液<sup>a</sup>]]>
				α-螺旋(％)	39.5	23.9	27.9
β-折叠(％)	15.1	11.7	4.4
				转角(％)	16.8	26.2	30.1
无规卷曲(％)	28.6	38.2	37.6

注：a：实施例9所述的空白悬浮液和载药纳米悬浮液均为冻干后重建的等渗悬浮液。

实施例10参考CN 106137969 B(201510157393.1)专利实施例1进行制备

称取无水多西他赛1.5g溶解于100ml无水乙醇中，超声溶解后得到油相溶液；取含7.5g白蛋白的人血白蛋白溶液(浓度为200mg/ml)，用注射用水稀释成含白蛋白6mg/ml溶液，水相体积共1250ml。水相中加入500mgL-谷胱甘肽，并在70℃下孵育6min。将油相在1000rpm的高剪切下均匀分散至水相中，得到混悬液。

该混悬液白色无乳光，目测浑浊，可见较多析出物，放置10分钟后出现沉淀，技术人员认为所得混悬液稳定性较差，无法按照专利内容继续后续操作。因此，采用本研究方法制的产品的储存稳定性数据与专利中提供的储存稳定性数据进行对比，发明人认为足以证明本研究产品的稳定性明显优于专利CN 106137969 B。

N/A：稳定性研究中暂无该时间点

实施例11考察蛋白药物比1.5的影响(同时降低蛋白浓度为5mg/ml)

称取无水多西他赛1.6g溶解于23.7ml无水乙醇中，溶解后得到有机相溶液，浓度为67.5mg/ml；取含2.4g白蛋白的人血白蛋白溶液(辛酸钠的含量为0.08mmol/g蛋白)，用注射用水稀释成含白蛋白5mg/ml的溶液，再加入适量盐酸半胱氨酸调节pH至4.0，40℃孵育0.5h，得酸变性白蛋白水相溶液；氯化钠用注射用水配制浓度为14.4％的盐溶液；将有机相溶液和水相溶液升温至40℃，有机相、水相及盐溶液混合载药，所得物料置于冰水浴中降温至18℃，得到载药液；将载药液浓缩至含多西他赛浓度约6mg/ml，得浓缩液；使用等渗氯化钠(0.9％，w/v)溶液作为透析液对浓缩液进行5倍透析，透析膜截留分子量为30KDa，得到透析后悬浮液；经0.45μm+0.2μm膜片进行除菌过滤，得到冻干前悬浮液；冻干，得冻干粉。

冻干前悬浮液中，多西他赛白蛋白纳米粒的粒径为91.38nm，在25℃条件下静置20小时，完全浑浊。使用注射用水复溶冻干粉得到重建悬浮液(等渗悬浮液)，重建悬浮液目测浑浊。

实施例12考察不同透析液的影响

称取无水多西他赛1.8g溶解于26.7ml无水乙醇中，溶解后得到有机相溶液，浓度为67.5mg/ml；取含8.1g白蛋白的人血白蛋白溶液(辛酸钠的含量为0.08mmol/g蛋白)，用注射用水稀释成含白蛋白15mg/ml的溶液，再加入适量盐酸半胱氨酸调节pH至4.0，40℃孵育0.5h，得酸变性白蛋白水相溶液；氯化钠用注射用水配制浓度为14.4％的盐溶液；将有机相溶液和水相溶液升温至40℃，有机相、水相及盐溶液混合载药，所得物料置于冰水浴中降温至18℃，得到载药液；将载药液浓缩至含多西他赛浓度约6mg/ml，得浓缩液；

(1)使用等渗葡萄糖(5％，w/v)溶液作为透析液对浓缩液进行5倍透析，透析膜截留分子量为30KDa，得到透析后悬浮液；经0.45μm+0.2μm膜片进行除菌过滤，得到冻干前悬浮液；冻干，得冻干粉。

冻干前悬浮液中，多西他赛白蛋白纳米粒的粒径为102.2nm，在25℃条件下静置16小时，底部较多沉淀，在2～8℃下静置16小时，透光率下降。使用注射用水复溶冻干粉得到重建悬浮液(等渗悬浮液)，多西他赛白蛋白纳米粒的粒径无明显变化，为103.3nm；重建悬浮液在25℃条件下2.5h已浑浊。

(2)使用等渗PBS缓冲液(pH为7.31，渗透压320mOsmol/Kg)作为透析液对浓缩液进行5倍透析，透析膜截留分子量为30KDa，得到透析后悬浮液；经0.45μm+0.2μm膜片进行除菌过滤，得到冻干前悬浮液；冻干，得冻干粉。

冻干前悬浮液中，多西他赛白蛋白纳米粒的粒径为92.43nm，在25℃条件下静置16小时，底部略有沉淀，在2～8℃下静置24小时，透光率下降。使用注射用水复溶冻干粉得到重建悬浮液(等渗悬浮液)，多西他赛白蛋白纳米粒的粒径无明显变化，为90.91nm；重建悬浮液在25℃条件下2.5h可见有析出。

实施例13注射用多西他赛(白蛋白结合型)(DTX-HSA)与多西他赛注射液(TAXOTERE)在裸小鼠中的最大耐受剂量(MTD)和毒性比较

1.药品及试验材料

1.1供试品

注射用多西他赛(白蛋白结合型)(DTX-HSA)，其采用本申请实施例1中的处方1-1、通过实施例1的制备方法制备得到。

1.2对照药

多西他赛注射液(商品名：泰索帝)

2.实验动物

3.实验设计

3.1实验原理

本试验定义药物对小鼠静脉给药的最大耐受剂量(MTD)为在观察期内，动物没有出现死亡和不可恢复的毒性反应，或者无体重减轻连续3天超过15％，该剂量即被认为是急性单次给药的最大耐受剂量。

3.2给药剂量设定

DTX-HSA复溶后等渗浓度为3.801mg/mL，参照2001年欧洲制药工业协会联合会和欧洲替代方法验证中心联合发布的关于对动物不同途径给药或采血时所能允许的给药体积和采血体积指导原则，小鼠缓慢静脉注射的最大给药容积为25mL/kg。24h内3次给药，剂量最大可给到285.1mg/kg。

本试验预选用剂量：

注射用多西他赛(白蛋白结合型)：285.1，228.1，182.5，146.0mg/kg(梯度1.25)。

多西他赛注射液(TAXOTERE)：187.5，150，120，96mg/kg(梯度1.25)。

4.实验方法

4.1动物分组及标记

挑选健康、体重差异较小的小鼠，按体重均衡分为8组，每组5只小鼠，分别为DTX-HSA285.1，228.1，182.5，146.0mg/kg组及TAXOTERE 187.5，150，120，96mg/kg组。

4.2给药

给药方式：静脉注射

给药频次：24h内给药3次，给药间隔4h。

给药容积：25mL/kg。

给药速度：缓慢推注。

给药量：以最近1次称重计算给药量。

4.3指标观察

一般状态观察：所有动物于试验期每天观察，观察指标包括但不限于皮肤、被毛、眼、耳、鼻、口腔、胸部、腹部、泌尿生殖部、四肢等部位，以及呼吸、运动、排尿、排便和行为改变等。动物不良反应参见下表。

体重：所有动物于试验前称重1次，挑选合适体重动物用于试验。每天固定时间称量动物体重1次。

死亡和濒死：死亡动物记录死亡时间，濒死动物注意增加观察频率，试验期间确定死亡时间。

4.4评价指标

在观察期内，小鼠无死亡，无不可恢复的毒性症状，无体重减轻连续3天超过15％的最大剂量即可认为是本实验药物的最大耐受剂量(MTD)。

5.实验结果

5.1死亡情况

DTX-HSA和TAXOTERE各给药组均未见动物死亡。

5.2临床观察

DTX-HSA 285.1和228.1mg/kg组动物分别自D4和D7开始，可见轻微后肢震颤，228.1mg/kg组动物D20后肢震颤症状恢复，285.1mg/kg组动物D22后肢震颤症状恢复。DTX-HSA182.5和146.0mg/kg组动物未见明显异常。

TAXOTERE 187.5，150mg/kg组动物分别自D4和D6开始，可见轻中度后肢震颤，150mg/kg组动物D19后肢震颤症状恢复，187.5mg/kg组动物D24后肢震颤症状恢复。TAXOTERE 120和96mg/kg组动物未见明显异常。

5.3体重

DTX-HSA 285.1mg/kg组1/5只动物D5～D8体重降低超过15％，1/5只动物在D10，D12，D13体重降低超过15％，其他DTX-HSA给药组未见体重降低超过15％的动物。

TAXOTERE 187.5mg/kg组1/5只动物D4～D14体重降低超过15％，其他TAXOTERE给药组未见体重降低超过15％的动物。

给药后小鼠毒性情况(n＝5)

MTD：在观察期内，小鼠无死亡，无不可恢复的毒性症状，无体重减轻连续3天超过15％的最大剂量。观察时间：24天。

6.结论

本试验条件下，DTX-HSA裸小鼠MTD为228.1mg/kg；TAXOTERE裸小鼠MTD为150.0mg/kg。

Claims (70)

1.一种含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物，其特征在于，所述组合物包含多西他赛和酸变性白蛋白；所述酸变性白蛋白由人血白蛋白加酸调至适当的pH值后变性得到，所述酸为盐酸半胱氨酸，所述适当的pH值为3.8-4.7，所述人血白蛋白中辛酸钠的含量不高于0.08mmol/g蛋白，以无水多西他赛计，多西他赛和人血白蛋白的质量比为1:（2.0~10.0）；

所述含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物通过包含如下步骤的制备方法来制备：

（1）多西他赛溶解于有机溶剂中，溶解后得到有机相溶液；

（2）取人血白蛋白溶液，加酸调节pH值，得酸变性白蛋白水相溶液；另取一种盐溶液；

（3）将有机相溶液、水相溶液及盐溶液混合载药，得到载药液；

（4）透析；

其中，

步骤（2）在加酸调节pH值前，任选地包含用注射用水稀释人血白蛋白溶液得白蛋白稀释液的步骤；

步骤（2）在加酸调节pH值后，任选地包含孵育的步骤；

步骤（3）在混合载药后，任选地包含降温步骤；

步骤（4）在透析前，任选地包含将步骤（3）所得载药液浓缩得到浓缩液的步骤；

步骤（4）中使用氯化钠溶液作为透析液进行透析，

步骤（4）透析后，任选地包含浓缩或稀释步骤；

步骤（4）后任选地含有步骤（5）除菌过滤；

步骤（5）后任选地含有步骤（6）冻干。

2.一种含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物，其特征在于，所述组合物由多西他赛和酸变性白蛋白制成；所述酸变性白蛋白由人血白蛋白加酸调至适当的pH值后变性得到，所述酸为盐酸半胱氨酸，所述适当的pH值为3.8-4.7，所述人血白蛋白中辛酸钠的含量不高于0.08mmol/g蛋白，以无水多西他赛计，多西他赛和人血白蛋白的质量比为1:（2.0~10.0）；

所述含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物通过包含如下步骤的制备方法来制备：

（1）多西他赛溶解于有机溶剂中，溶解后得到有机相溶液；

（2）取人血白蛋白溶液，加酸调节pH值，得酸变性白蛋白水相溶液；另取一种盐溶液；

（3）将有机相溶液、水相溶液及盐溶液混合载药，得到载药液；

（4）透析；

其中，

步骤（2）在加酸调节pH值前，任选地包含用注射用水稀释人血白蛋白溶液得白蛋白稀释液的步骤；

步骤（2）在加酸调节pH值后，任选地包含孵育的步骤；

步骤（3）在混合载药后，任选地包含降温步骤；

步骤（4）在透析前，任选地包含将步骤（3）所得载药液浓缩得到浓缩液的步骤；

步骤（4）中使用氯化钠溶液作为透析液进行透析，

步骤（4）透析后，任选地包含浓缩或稀释步骤；

步骤（4）后任选地含有步骤（5）除菌过滤；

步骤（5）后任选地含有步骤（6）冻干。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述多西他赛为无水型多西他赛、多西他赛半水合物或多西他赛三水合物。

4. 如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，

（1）所述适当的pH值为4.0~4.5；和/或

（2）所述人血白蛋白中辛酸钠的含量为0.03-0.08mmol/g蛋白；和/或

（3）以无水多西他赛计，多西他赛和人血白蛋白的质量比为1:（3.0~7.0）。

5.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述人血白蛋白中辛酸钠的含量为0.04-0.08mmol/g蛋白。

6.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述人血白蛋白中辛酸钠的含量为0.04-0.07mmol/g蛋白。

7.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，以无水多西他赛计，多西他赛和人血白蛋白的质量比1:（4.0~6.0）。

8.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述多西他赛白蛋白纳米粒的粒径为60-200nm。

9.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述多西他赛白蛋白纳米粒的粒径为90-150nm。

10.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述多西他赛白蛋白纳米粒的粒径为90-135nm。

11.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物任选的包含渗透压调节剂；所述渗透压调节剂选自氯化钠。

12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物中氯化钠与多西他赛的重量比为（0.75-9）:1。

13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述组合物中氯化钠与多西他赛的重量比为（1-7）：1。

14.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述组合物中氯化钠与多西他赛的重量比为（1.5-4.5）:1。

15.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，氯化钠与多西他赛的重量比为2.25:1。

16.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物任选的包含pH调节剂。

17.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为悬浮液；所述悬浮液含多西他赛2-10mg/ml；所述悬浮液的pH值为3.9-4.8；所述悬浮液含氯化钠0-1.8%（w/v）。

18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述悬浮液含多西他赛2-8mg/ml。

19.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述悬浮液含氯化钠0.45%-1.8%（w/v）。

20.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述悬浮液含氯化钠0.9%-1.8%（w/v）。

21.由权利要求17至20中任一项所述的组合物制成的冻干粉。

22.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为冻干粉；所述冻干粉含氯化钠，氯化钠与多西他赛的重量比为（0.75-9）:1；所述冻干粉由含多西他赛白蛋白纳米粒的悬浮液冻干而成；所述悬浮液的pH为3.9-4.8。

23.如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述冻干粉中氯化钠与多西他赛的重量比为（1-7）:1。

24.如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述冻干粉中氯化钠与多西他赛的重量比为（1.5-4.5）:1。

25.如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述冻干粉中氯化钠与多西他赛的重量比为2.25:1。

26.一种重建悬浮液，由权利要求21所述冻干粉或权利要求22至25中任一项所述组合物使用复溶介质重建得到；所述复溶介质选自注射用水、氯化钠溶液或葡萄糖溶液；所述重建悬浮液的pH为3.9-4.8。

27.如权利要求26所述的重建悬浮液，其特征在于，所述复溶介质为注射用水。

28.一种药物，其由权利要求1-20、22-25中任一项所述的组合物或者权利要求21所述的冻干粉或者权利要求26所述的重建悬浮液制成；所述药物为临床可接受的剂型。

29.如权利要求28所述的药物，其特征在于，所述药物为注射剂。

30.如权利要求28所述的药物，其特征在于，所述药物为液体注射剂或冻干粉针剂。

31.一种含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物的制备方法，包含如下步骤：

（1）多西他赛溶解于有机溶剂中，溶解后得到有机相溶液；

（2）取人血白蛋白溶液，加酸调节pH值，得酸变性白蛋白水相溶液；另取一种盐溶液；

（3）将有机相溶液、水相溶液及盐溶液混合载药，得到载药液；

（4）透析；

其中，

以无水多西他赛计，多西他赛和人血白蛋白的质量比为1:（2.0~10.0）；

步骤（2）中，所述人血白蛋白溶液中辛酸钠的含量为不高于0.08mmol/g蛋白，所述酸为盐酸半胱氨酸，所述pH值为3.8-4.7；

步骤（2）在加酸调节pH值前，任选地包含用注射用水稀释人血白蛋白溶液得白蛋白稀释液的步骤；

步骤（2）在加酸调节pH值后，任选地包含孵育的步骤；

步骤（3）在混合载药后，任选地包含降温步骤；

步骤（4）在透析前，任选地包含将步骤（3）所得载药液浓缩得到浓缩液的步骤；

步骤（4）中使用氯化钠溶液作为透析液进行透析，

步骤（4）透析后，任选地包含浓缩或稀释步骤；

步骤（4）后任选地含有步骤（5）除菌过滤；

步骤（5）后任选地含有步骤（6）冻干。

32.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述多西他赛为无水型多西他赛、多西他赛半水合物或多西他赛三水合物；以无水多西他赛计，多西他赛和人血白蛋白的质量比为1:（3.0~7.0）；

或者，步骤（1）中所述有机溶剂选自可与水互溶的溶剂；以无水多西他赛计，所述有机相溶液含多西他赛45-90mg/ml。

33. 如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中以无水多西他赛计，多西他赛和人血白蛋白的质量比为1:（4.0 ~6.0）。

34.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述有机溶剂为乙醇、甲醇、丙酮或DMSO。

35.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述有机溶剂为乙醇。

36.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，以无水多西他赛计，所述有机相溶液含多西他赛45-70mg/ml。

37.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述人血白蛋白溶液中辛酸钠的含量为0.045-0.08mmol/g蛋白；

或者，步骤（2）中，所述pH值为4.0~4.5；

或者，步骤（2）中，所述孵育是指在加酸调节pH值后，升温至35℃-42℃；孵育30min以上；

或者，步骤（2）中所述盐溶液的盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠或硫酸镁；盐溶液浓度不低于2%；

或者，步骤（2）中，白蛋白稀释液为含白蛋白6-25mg/ml溶液。

38.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述孵育是指在加酸调节pH值后，升温至38℃-42℃。

39.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，孵育30min-60min。

40.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述盐溶液的盐为氯化钠。

41.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述盐溶液浓度为2%~35%。

42.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述盐溶液浓度为10%~20%。

43.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，白蛋白稀释液为含白蛋白10-20mg/ml溶液。

44.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，白蛋白稀释液为含白蛋白12-18mg/ml溶液。

45.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，白蛋白稀释液为含白蛋白15mg/ml溶液。

46.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，载药条件为将有机相溶液、水相溶液升温至35℃-42℃，将有机相溶液、水相溶液及盐溶液混合载药；

或者，步骤（3）所述降温，指降温至低于室温。

47.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，载药条件为将有机相溶液、水相溶液升温至38℃-42℃。

48.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述降温指降温至0-20℃。

49.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述降温指降温至7-15℃。

50.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述氯化钠溶液的浓度不高于1.8%（w/v）；

或者，步骤（4）中透析使用的透析膜的截留分子量为10-50KDa；

或者，步骤（4）中透析使用的透析液体积不低于载药液或浓缩液的3倍；

或者，步骤（4）中所述浓缩液含多西他赛4-10mg/ml。

51.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述氯化钠溶液的浓度为0.45%-1.8%（w/v）。

52.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述氯化钠溶液的浓度为0.9%-1.8%（w/v）。

53.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中透析使用的透析膜的截留分子量为10-30KDa。

54.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中透析使用的透析膜的截留分子量为10KDa或者30KDa。

55.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中透析使用的透析液体积为载药液或浓缩液的3-10倍。

56.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中透析使用的透析液体积为载药液或浓缩液的3-6倍。

57.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述浓缩液含多西他赛6-10mg/ml。

58.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述浓缩液含多西他赛7-9mg/ml。

59.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述浓缩液含多西他赛8mg/ml。

60.如权利要求31所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的人血白蛋白溶液由以下方法制备得到：取市售的人血白蛋白溶液，用注射用水或者生理盐水稀释，得到稀释的白蛋白溶液；用注射用水或者生理盐水作为透析液对稀释的白蛋白溶液进行透析，以部分去除辛酸钠，得到低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液；所述低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液直接用作步骤（2）所述的人血白蛋白溶液，或者与其它辛酸钠含量的人血白蛋白溶液按比例混合得到期望含量后用作步骤（2）所述的人血白蛋白溶液。

61.如权利要求60所述的制备方法，其特征在于：人血白蛋白溶液的稀释倍数不低于4倍；

或者，所述透析中使用的透析膜的截留分子量为10-50KDa；透析液的体积为稀释的白蛋白溶液的体积的3倍以上；

或者，所述低辛酸钠含量的人血白蛋白溶液含辛酸钠低于0.08 mmol/g蛋白。

62.如权利要求60所述的制备方法，其特征在于，人血白蛋白溶液的稀释倍数为4-7倍。

63.如权利要求60所述的制备方法，其特征在于，所述透析中使用的透析膜的截留分子量为10-30KDa。

64.如权利要求60所述的制备方法，其特征在于，所述透析中使用的透析膜的截留分子量为10KDa或者30KDa。

65.如权利要求60所述的制备方法，其特征在于，透析液的体积为稀释的白蛋白溶液的体积的3-10倍。

66.如权利要求60所述的制备方法，其特征在于，透析液的体积为稀释的白蛋白溶液的体积的3-6倍。

67.一种含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物，其由权利要求31-66任一项所述的方法制备得到。

68.一种药物，其由权利要求67所述的含多西他赛白蛋白纳米粒的组合物制备得到；所述药物为临床可接受的剂型。

69.如权利要求68所述的药物，其特征在于，所述药物为注射剂。

70.如权利要求68所述的药物，其特征在于，所述药物为液体注射剂或冻干粉针剂。