HK40027581B

HK40027581B - 从宿主细胞半乳糖凝集素和其他污染物中纯化糖基化蛋白的方法

Info

Publication number: HK40027581B
Application number: HK62020017224.0A
Authority: HK
Inventors: L·A·康奈尔-克罗利; M·J·麦克卢尔; R·O·吉莱斯皮
Original assignee: 济世易为生物有限公司
Priority date: 2017-08-17
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2024-02-09

Description

从宿主细胞半乳糖凝集素和其他污染物中纯化糖基化蛋白的方法

本申请要求于2017年8月17日在美国专利商标局提交的美国临时专利申请序列号62/546,558的优先权。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2018年8月14日，名称为JUST0381_SL.txt，大小为4,148字节。

技术领域

发明领域

本发明涉及从污染的宿主细胞蛋白质和金属离子中纯化重组产生的蛋白质的方法。

背景技术

相关技术的讨论

重组治疗性蛋白质的工业生产要求从目的蛋白质中有效去除污染性宿主细胞蛋白质和金属离子，以满足严格的监管标准。

当糖基化的重组蛋白富含末端β-半乳糖残基时，从与这些半乳糖苷残基可逆地结合的宿主细胞蛋白半乳糖凝集素(galectin)中纯化重组蛋白是关键问题。

半乳糖凝集素是可特异性结合β-半乳糖苷的动物凝集素。脊椎动物中已描述了十二种半乳糖凝集素，它们属于三个不同的亚组：原型半乳糖凝集素(例如，半乳糖凝集素-1，-2，-7，-10，-13，-14)、串联重复型半乳糖凝集素(例如，半乳糖凝集素-4，-8，-9，-12)和嵌合型半乳糖凝集素(例如，半乳糖凝集素-3)。据报道，这些半乳糖凝集素蛋白参与宿主细胞中的细胞相互作用和肿瘤转化。(参见，例如，Varki A、Cummings RD、Esko JD、FreezeHH、Stanley P、Bertozzi CR、Hart GW、Etzler ME编写的Essentials of Glycobiology(《糖生物学概要》)第2版，Cold Spring Harbor(纽约)：Cold Spring Harbor LaboratoryPress(纽约冷泉港：冷泉港实验室出版社)，2009年，第33章：Cummings RD和Liu FT，Galectins(半乳糖凝集素)；Gitt，MA等，Galectin-4 and galectin-6are two closelyrelated lectins expressed in mouse gastrointestinal tract(半乳糖凝集素-4和半乳糖凝集素-6是在小鼠胃肠道中表达的两种密切相关的凝集素)，J Biol Chem.273(5)：2954-60(1998)；Bidon，N.等，Galectin-8：a complex sub-family of galectins(Review)(半乳糖凝集素-8：一种半乳凝素的复杂亚家族(综述))，Int J Mol Med.8(3)：245-50(2001)；Hadari，YR等，Galectin-8.A new rat lectin，related to galectin-4(半乳糖凝集素-8：与半乳糖凝集素-4有关的新的大鼠凝集素)，J Biol Chem.270(7)：3447-53(1995)；Sato，M.等，Functional analysis of the carbohydrate recognition domainsand a linker peptide of galectin-9as to eosinophil chemoattractant activity(半乳糖凝集素-9的碳水化合物识别域和连接肽的关于嗜酸性粒细胞趋化活性的功能分析)，Glycobiology 12(3)：191-97(2002)；Yang，RY等，Cell cycle regulation bygalectin-12，a new member of the galectin superfamily(半乳糖凝集素超家族新成员半乳糖凝集素-12对细胞周期的调节)，J Biol Chem.276(23)：20252-60(2001)；Ramaswamy，S等，Structural basis of multivalent galactose-based dendrimerrecognition by human galectin-7(人半乳糖凝集素-7识别多价半乳糖基树枝状聚合物的结构基础)，FEBS J.2015Jan；282(2)：372-87(2015)；Patnaik，SK等，Complex N-glycansare the major ligands for galectin-1，-3，and-8on Chinese hamster ovary cells(复合型N-聚糖是中国仓鼠卵巢细胞中半乳糖凝集素-1、-3和-8的主要配体)，Glycobiology 16(4)：305-17(2006))。

半乳糖凝集素-3的分子量(MW)为约30kDa，并包含约130个氨基酸的碳水化合物识别结合结构域(CRD，carbohydrate-recognition-binding domain)，CRD使得能够特异性结合β-半乳糖苷。据报道，半乳糖凝集素-3结合的蛋白质包括：层粘连蛋白；纤连蛋白；hensin蛋白；弹性蛋白；IV型胶原蛋白；肌腱蛋白C；肌腱蛋白R；整联蛋白α1β1、整联蛋白α4β7、整联蛋白α6β1和整联蛋白αMβ1；VEGFR2；NG2；以及氨肽酶N。(Funasaka等，Galectin-3inangiogenesis and metastasis(半乳糖凝集素-3在血管生成和转移中的作用)，Glycobiology 24(10)：886-891(2014))。据报道，宿主细胞蛋白半乳糖凝集素-3是重组产生的因子IX蛋白的污染物。(Blostein等，Galectin-3Binding Protein Contaminates thePurification of Recombinant Factor IX(半乳糖凝集素-3结合蛋白污染重组因子IX的纯化)，Blood 108：1038(2006)。

阿柏西普(Aflibercept)是另一种重组治疗性蛋白质，其通常富含末端β-半乳糖残基。阿柏西普蛋白包括两种主要成分：来自人VEGF受体1和受体2胞外结构域的血管内皮生长因子(VEGF)结合部分，其融合至人IgG1的Fc部分。(参见，Papadopoulos等，Modifiedchimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties(具有改善的药代动力学性质的经修饰的嵌合多肽)，WO 00/75319A1；US 7070959B2)。美国食品药品监督管理局(FDA)于2011年11月批准了阿柏西普上市销售，欧洲药品管理局(EMA)于2012年11月批准了阿柏西普上市销售。商标名称为(Regeneron Pharmaceuticals，Inc.)的阿柏西普被用作眼科药剂，用于治疗眼病或眼疾，例如，视网膜中央静脉阻塞(CRVO)导致的黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、新生血管(湿性)年龄相关性黄斑变性(AMD)、近视脉络膜新生血管引起的视力受损、糖尿病性黄斑水肿(DME)、DME患者的糖尿病性视网膜病变(DR)以及新生血管年龄相关性黄斑变性(AMD)。商标名称为(Regeneron Pharmaceuticals，Inc.)的阿柏西普(Ziv-aflibercept)是开发用于治疗转移性结直肠癌的静脉输液。

在结构上，阿柏西普是一种二聚体糖蛋白，其蛋白质分子量为约96.9千道尔顿(kDa)。它含有约15％的糖基化，总分子量为约115kDa。由一级序列预测的各个多肽链上的所有五个推定的N-糖基化位点均可被碳水化合物占据，并表现出一定程度的链异质性，包括末端唾液酸残基的异质性。然而，CHO细胞产生的阿柏西普可能富含末端β-半乳糖残基(即半乳糖凝集素-3的结合靶标)。

本发明提供了一种有效且经济的纯化重组蛋白的方法，以去除半乳糖凝集素和其他宿主细胞污染物(例如金属阳离子)，该方法适于用于工业生产目的。

发明内容

本发明涉及一种从污染物中纯化经糖基化的重组目的蛋白的方法。该方法涉及：

(a)在约中性pH下，将宿主细胞培养上清液或滤液上样到蛋白A(Protein A)基质上，所述宿主细胞培养上清液或滤液包含经糖基化的重组目的蛋白(POI)和半乳糖凝集素宿主细胞蛋白污染物；其中，POI包含免疫球蛋白Fc结构域的C_H2结构域和C_H3结构域和一个以上末端β-半乳糖残基，所述半乳糖凝集素宿主细胞蛋白污染物可逆地结合到所述末端β-半乳糖残基；

(b)用pH为约6.0至6.5的包含1M至3M氯化钙的缓冲液，洗涤结合有POI的蛋白A基质；

(c)用pH低于约4的包含柠檬酸或柠檬酸盐的缓冲液，将POI从蛋白A基质洗脱到洗脱合并液中，并且：

(i)如果洗脱合并液的碱性大于pH 3.3至3.7的pH范围，则用柠檬酸将洗脱合并液滴定至pH 3.3至3.7，以及

(ii)可选地，将洗脱合并液在pH 3.3至3.7保持足以灭活病毒的一段时间(通常30分钟至90分钟，但根据经验需要通过病毒面板验证病毒灭活)；

(d)在pH为5.0至5.5的约2至15毫西门子(mS)的低电导率缓冲液中，使来自(c)的洗脱合并液中的POI结合到阳离子交换基质；

(e)用电导率递增的电解质浓度梯度(最高约40mS至100mS)，将POI从阳离子交换基质洗脱到CEX洗脱合并液中；以及

(f)在pH 5.0至6.0的高电导率缓冲液中，将CEX洗脱合并液上样到疏水相互作用色谱(HIC)基质上，并洗涤HIC基质。本发明方法从β-半乳糖基结合的半乳糖凝集素宿主细胞蛋白污染物和其他不需要的污染物(例如金属阳离子污染物)中分离POI。

可使用本发明方法以工业规模从此类污染物中纯化经糖基化的重组治疗性蛋白质，例如但不限于：阿柏西普、阿法西普(alefacept)、依那西普(etanercept)，阿巴西普(abatacept)、贝拉西普(belatacept)、rFVIIIFc、rFIXFc和利纳西普(rilonacept)。

前述发明内容并非旨在定义本发明的每个方面，并且其他小节(例如具体实施方式)描述了本发明的其他方面。整个文档旨在被关联为一个统一的公开内容，并且应理解，即使特征的组合未同时出现在本文档的同一句子、同一段落或同一小节中，也可考虑本文所述特征的所有组合。

除前述内容之外，作为一个附加方面，本发明包括在任何方面都比上述具体段落所限定的变型范围更窄的本发明的所有实施方式。例如，被描述为属(genus)的本发明的某些方面，并且应理解，属的每个成员分别是本发明的一个方面。同样，被描述为属或选择属的成员的方面应理解为包括该属的两个以上成员的组合。尽管申请人发明了本文所述发明的全部范围，但申请人并不旨在要求他人的现有技术中所述的主题。因此，如果专利局或其他实体或个人提请申请人注意权利要求范围内的法定现有技术，申请人保留根据适用专利法行使修改权的权利，以重新定义此类权利要求的主题，以将此类法定现有技术或法定现有技术的明显变型排除在此类权利要求的范围之外。由此类修改的权利要求书限定的本发明的变型也旨在作为本发明的方面。

附图说明

图1显示了通过尺寸排阻色谱在整个NaCl梯度洗脱中分析的SO₃CEX色谱馏分的产物浓度和HMW水平的数据比较。

图2显示了来自SO₃CEX梯度洗脱馏分的数据的比较：产物浓度、HMW、累积产物产率和累积合并液单体(纯度)。垂直虚线表示要达到90％产率的回收终点(EOC，endof collection)目标。

图3显示了在单个CEX洗脱梯度馏分中半乳糖凝集素-3和总宿主细胞蛋白(HCP)水平的比较。水平短虚线表示CEX上样样品中的CHO HCP总水平。水平长虚线表示CEX合并液中的CHO HCP总水平。

图4A显示了来自在pH 4.5下操作的填充有SO₃ ^-的的单个馏分的伪色谱图(pseudo-chromatogram)和半乳糖凝集素-3浓度的结果。菱形表示产品浓度(g/L)，正方形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mg)，三角形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图4B显示了来自在pH 5.0下操作的填充有SO₃ ^-的的单个馏分的伪色谱图和半乳糖凝集素-3浓度的结果。菱形表示产品浓度(g/L)，正方形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mg)，三角形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图4C显示了来自在pH 5.5下操作的填充有SO₃ ^-的的单个馏分的伪色谱图和半乳糖凝集素-3浓度的结果。菱形表示产品浓度(g/L)，正方形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mg)，三角形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图4D显示了来自在pH 6.0下操作的填充有SO₃ ^-的的单个馏分的伪色谱图和半乳糖凝集素-3浓度的结果。菱形表示产品浓度(g/L)，正方形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mg)，三角形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图5A显示了来自在pH 4.5下操作的填充有COO^-的的单个馏分的伪色谱图和半乳糖凝集素-3浓度的结果。菱形表示产品浓度(g/L)，正方形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mg)，三角形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图5B显示了来自在pH 5.0下操作的填充有COO^-的的单个馏分的伪色谱图和半乳糖凝集素-3浓度的结果。菱形表示产品浓度(g/L)，正方形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mg)，三角形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图5C显示了来自在pH 5.5下操作的填充有COO^-的的单个馏分的伪色谱图和半乳糖凝集素-3浓度的结果。菱形表示产品浓度(g/L)，正方形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mg)，三角形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图5D显示了来自在pH 6.0下操作的填充有COO^-的的单个馏分的伪色谱图和半乳糖凝集素-3浓度的结果。菱形表示产品浓度(g/L)，正方形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mg)，三角形表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图6显示了CEX树脂筛选的步骤产率百分比与纯度百分比(单体产物)的比较。SO₃ ^-的结果用空心符号表示，而COO^-的结果用实心符号表示。菱形表示pH 4.5，正方形表示pH 5.0，三角形表示pH 5.5，圆圈表示pH 6.0。

图7显示了CEX树脂筛选的步骤产率百分比与半乳糖凝集素-3去除百分比的比较。SO₃ ^-的结果用空心符号表示，而COO^-的结果用实心符号表示。菱形表示pH 4.5，正方形表示pH 5.0，三角形表示pH 5.5，圆圈表示pH 6.0。

图8A显示了等高线图，其表示SO₃ ^-树脂的pH和盐水平对产率百分比的影响。

图8B显示了等高线图，其表示SO₃ ^-树脂通过SEC的pH和盐水平对纯度百分比的影响。

图8C显示了等高线图，其表示SO₃ ^-树脂的pH和盐水平对半乳糖凝集素-3浓度(ng/mg)的影响。

图9A显示了等高线图，其表示SO₃ ^-树脂的pH和盐水平对产率百分比的影响。

图9B显示了等高线图，其表示COO^-树脂通过SEC的pH和盐水平对纯度百分比的影响。

图9C显示了等高线图，其表示COO^-树脂的pH和盐水平对半乳糖凝集素-3浓度(ng/mg)的影响。

图10显示了在单个SO₃ ^-洗脱梯度馏分中半乳糖凝集素-3水平的比较。圆圈表示各个馏分的蛋白质浓度(g/L)，正方形表示通过多属性质谱方法(MAM，multi-attribute mass spectrometry method)测得的各个馏分的半乳糖凝集素-3水平(ppm)，三角形表示通过ELISA测得的各个馏分的半乳糖凝集素-3水平(ppm)。上样样品中半乳糖凝集素-3(ppm)的水平显示为短虚线(通过ELISA测量)和长虚线(通过MAM测量)。

图11A显示了在pH 5.0下用乙酸钠和NaCl进行的来自中的PhenylFast Flow High Sub的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图11B显示了在pH 6.0下用MES钠和NaCl进行的来自中的PhenylFast Flow High Sub的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图11C显示了在pH 5.0下用柠檬酸钠进行的来自中的PhenylFast Flow High Sub的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图11D显示了在pH 6.0下用柠檬酸钠进行的来自中的PhenylFast Flow High Sub的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图11E显示了在pH 5.0下用乙酸钠和硫酸钠进行的来自中的PhenylFast Flow High Sub的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图11F显示了在pH 6.0下用MES钠和硫酸钠进行的来自中的PhenylFast Flow High Sub的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图11G显示了在pH 6.0下用磷酸钠进行的来自中的PhenylFast Flow High Sub的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图11H显示了在pH 7.0下用磷酸钠进行的来自中的PhenylFast Flow High Sub的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图12A显示了在pH 5.0下用乙酸钠和NaCl进行的来自中的Butyl 650M的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图12B显示了在pH 6.0下用MES钠和NaCl进行的来自中的Butyl 650M的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图12C显示了在pH 5.0下用柠檬酸钠进行的来自中的Butyl 650M的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图12D显示了在pH 6.0下用柠檬酸钠进行的来自中的Butyl 650M的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图12E显示了在pH 5.0下用乙酸钠和硫酸钠进行的来自中的Butyl 650M的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图12F显示了在pH 6.0下用MES钠和硫酸钠进行的来自中的Butyl 650M的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图12G显示了在pH 6.0下用磷酸钠进行的来自中的Butyl 650M的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图12H显示了在pH 7.0下用磷酸钠进行的来自中的Butyl 650M的单个馏分的伪色谱图、盐浓度和半乳糖凝集素-3浓度。菱形表示产品浓度(g/L)，实线表示盐浓度，圆圈表示半乳糖凝集素-3浓度(ng/mL)。

图13表示使用不同的洗涤2缓冲液的筛选的蛋白A洗脱合并液的铁水平。

图14表示使用不同的洗涤2缓冲液的筛选的蛋白A洗脱合并液的铁水平，其中如图所示洗涤2缓冲液含有更高的柠檬酸盐浓度。

图15显示了蛋白A低pH病毒灭活实验的示意图，该实验用于分析柠檬酸盐对洗脱的影响以及保持低pH对产物中铁浓度的影响。

图16显示了来自筛选的CEX洗脱合并液的铁水平，以评估柠檬酸盐作为蛋白A洗涤2缓冲液、蛋白A洗脱缓冲液和低pH病毒灭活滴定剂。白条表示未检测到铁。

图17显示了高铁和低铁样品分别随时间变化的高分子量(HMW)水平的比较，样品保持在30℃用于加速的稳定性(accelerated stability)。

图18显示了配制的高铁样品(方法1)和低铁样品(方法2)的视觉比较。

图19显示了本发明方法的一个示例性实施方式的示意性流程图，用于从CHO半乳糖凝集素-3和铁中纯化经糖基化的重组目的蛋白。

图20显示了通过ICP-MS定量的水和缓冲液样品中铁的浓度(μg/L)。

图21显示了通过ICP-MS定量的水和缓冲液样品中铜的浓度(μg/L)。

图22显示了通过ICP-MS定量的水和缓冲液样品中锌的浓度(μg/L)。

图23显示了来自水冲洗液和柠檬酸盐缓冲液冲洗液的硅藻土(DE)深度过滤级分中观察到的铁浓度(μg/L)。

图24显示了来自水冲洗液和柠檬酸盐缓冲液冲洗液的硅藻土(DE)深度过滤级分中观察到的铜浓度(μg/L)。

图25显示了来自水冲洗液和柠檬酸盐缓冲液冲洗液的硅藻土(DE)深度过滤级分中观察到的锌浓度(μg/L)。

图26是在蛋白A亲和色谱步骤和CEX色谱步骤之间加入可选的深度过滤步骤的实验程序的示意图，其中如本文实施例5中所述，用平衡缓冲液(EQ)或柠檬酸盐缓冲液冲洗液通过深度过滤器中的硅藻土。

图27显示了在不同蛋白A洗脱液和深度过滤器冲洗液条件的蛋白A合并液、深度过滤器合并液和CEX合并液中观察到的铁水平(ppm)。

图28显示了在不同蛋白A洗脱液和深度过滤器冲洗液条件的蛋白A合并液、深度过滤器合并液和CEX合并液中观察到的铜水平(ppm)。

图29显示了在不同蛋白A洗脱液和深度过滤器冲洗液条件的蛋白A合并液、深度过滤器合并液和CEX合并液中观察到的锌水平(ppm)。

具体实施方式

本文中使用的小节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。

定义

除非本文另外定义，否则与本申请结合使用的科学术语和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。因此，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括多个细胞的群体。

本发明涉及从污染物中纯化经糖基化的重组目的蛋白的方法。经糖基化的重组目的蛋白包含免疫球蛋白Fc结构域的至少C_H2和C_H3结构域和一个以上末端β-半乳糖残基。此种经糖基化的重组蛋白的一个实例是阿柏西普，阿柏西普在商业上也被称为阿柏西普是具有阿柏西普氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的两条相同融合多肽链的组装，通常通过重组DNA表达技术最方便地产生。阿柏西普的氨基酸序列如下：

预期本发明的二硫(Disulfide)桥在SEQ ID NO：1的以下位置(position)氨基酸的半胱氨酸残基(上文SEQ ID NO：1所示的带下划线的半胱氨酸(C)残基)之间：

30-79(链内)

124-185(链内)

211-211(链间)

214-214(链间)

246-306(链内)

352-410(链内)。

阿柏西普的两条融合多肽链在SEQ ID NO：1的211位和214位氨基酸处通过二硫键共价连接。通常，融合蛋白是经糖基化的，其中N-聚糖(其可具有末端β-半乳糖残基，取决于培养条件)共价连接于SEQ ID NO：1的36位、68位、123位、196位和282位处的天冬酰胺残基(如上述SEQ ID NO：1所示的粗体/斜体天冬酰胺(N)残基)。在本发明范围内的“阿柏西普”还包括其中融合多肽链中的一个或两个具有氨基酸序列SEQID NO：1和另外的羧基末端赖氨酸(K)残基的实施方式或两个融合多肽链都不具有氨基酸序列SEQ ID NO：1和另外的羧基末端赖氨酸(K)残基的实施方式。

其他经糖基化的重组目的蛋白(或“POI”)可包括但不限于：阿法西普、依那西普、阿巴西普、贝拉西普、rFVIIIFc、rFIXFc和利纳西普，以及各种治疗性肽抗体(peptibody)。

经糖基化的重组目的蛋白最初包含在分批或灌流(连续流生物工艺)宿主细胞培养上清液或滤液中(例如，在一个以上渗滤和/或超滤和/或病毒过滤步骤之后)，以通过本发明方法进行进一步处理。视需要，还可在应用本发明方法的步骤之前或之后，将另外的纯化步骤应用于经糖基化的重组目的蛋白的制备。例如，可使用以下方法适当地通过一个或几个步骤对POI进行纯化：例如，渗滤、超滤、羟磷灰石色谱、阳离子交换(CEX)色谱或阴离子交换(AEX)色谱，或使用目的抗原或蛋白A或蛋白G作为亲和配体的亲和色谱。蛋白A可用于纯化包含基于人γ1、γ2或γ4重链的多肽的蛋白(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和配体所连接的基质通常为琼脂糖，但也可使用其他基质。与琼脂糖相比，机械稳定的基质(例如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯苯))可实现更快的流速和更短的处理时间。如果蛋白质包含C_H3结构域，则Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)可用于纯化。取决于待回收的蛋白质，也可选择其他蛋白质纯化技术，例如乙醇沉淀、反相HPLC、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。

用于从污染物中纯化经糖基化的重组目的蛋白的本发明方法包括：在约中性pH下，将包含经糖基化的重组目的蛋白(POI)的分批或灌流的宿主细胞培养物上清液或滤液上样到蛋白A亲和色谱基质(即蛋白A基质)。“蛋白A”是最初在细菌“金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)”的细胞壁上发现的约42kDa的表面蛋白；蛋白A由金黄色葡萄球菌(S.aureus)的spa基因编码，金黄色葡萄球菌(S.aureus)中蛋白A的表达受DNA拓扑结构、细胞渗透压和称为ArlS-ArlR的双组分系统控制。(参见，Fournier，B.和Klier，A，ProteinA gene expression is regulated by DNA supercoiling which is modified by theArlS–ArlR two-component system of Staphylococcus aureus(蛋白A基因的表达受DNA超螺旋调节，该DNA超螺旋由金黄色葡萄球菌的ArlS-ArlR双组分系统修饰)，Microbiology150：3807-19(2004))。蛋白A(Spa基因产品)具有结合免疫球蛋白的能力，因此可用于生化研究和生物化工行业。蛋白A由折叠成三螺旋束(three-helix bundle)的五个同源Ig结合域组成。各个结构域均能结合来自多种哺乳动物物种的蛋白质，最著名的是IgG。已通过晶体学精修(crystallographic refinement)表明，蛋白A的主要结合位点在C_H2和C_H3结构域之间的Fc区域上。(Deisenhofer，J，Crystallographic refinement andatomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment B ofProtein A from Staphylococcus aureus at 2.9-and 2.8-A resolution(人Fc片段及其与金黄色葡萄球菌蛋白A的片段B的复合物在2.9-A和2.8-A分辨率下的晶体学精修和原子模型)，Biochemistry 20(9)：2361-70(1981))。此外，蛋白A结合包含来自人VH3基因家族的IgG F(ab')₂片段的人IgG分子。(参见，的Sasso EH，Silverman GJ，Mannik M，Human IgAand IgG F(ab')₂that bind to staphylococcal Protein A belong to the VHIIIsubgroup(与葡萄球菌蛋白A结合的人IgA和IgG F(ab')₂属于VHIII亚组)，Journal ofImmunology 147(6)：1877-83(1991))。通常，蛋白A通过工业发酵进行生产和纯化，用于免疫学、生物学研究和工业应用。天然(natural)(或天然(native))蛋白A可在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中培养，并含有上述的五个同源抗体结合区和用于细胞壁附着的C-末端区。通常在大肠杆菌(Escherichia coli)中产生的蛋白A的重组形式也可用于本发明的目的。为了用于本发明，各个实施方式中的蛋白A基质可通过商购获得(例如，购自Sigma Aldrich的来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白购自GE Healthcare Life Sciences的MabSelect^TM蛋白A、MabSelect蛋白A、MabSelectLX和蛋白AFF；购自EMD Millipore的A蛋白A；购自TosohBioscience的AF-r蛋白A；购自Thermo Fisher Scientific的蛋白A；购自Repligen的蛋白A亲和树脂)。通常，蛋白A的重组形式包含五个同源抗体结合域；但用于本发明的目的，蛋白A的重组形式可在结构的其他部分有所变化，以促进共价偶联至底物，例如树脂(例如但不限于琼脂糖)。可将蛋白A基质放置或填充到可用于纯化蛋白质的柱中。蛋白A基质中，工程化形式的蛋白A也可用于本发明，该工程化形式的蛋白A为经修饰的单结构域的多聚体(通常为四聚体、五聚体或六聚体)，以改善其在工业应用中的特性。

术语“基质”包括用于本发明方法的目的的携带相关色谱配体(例如，蛋白A或其他亲和色谱配体、带电部分或疏水部分等)的树脂、磁珠、纳米颗粒、纳米纤维、水凝胶、膜和整料(monolith)，或任何其他物理基质。

含有经糖基化的重组目的蛋白的分批宿主细胞培养物或灌流(连续流生物工艺)宿主细胞培养物、上清液或滤液还含有半乳糖凝集素宿主细胞污染物，该污染物可逆地结合到经糖基化的重组目的蛋白(POI)的一个以上末端β-半乳糖残基上。术语“半乳糖凝集素”指β-半乳糖苷结合凝集素，通常以可溶形式存在。各种半乳糖凝集素可由多种动物细胞类型表达，并可通过其碳水化合物识别结构域(CRD)的氨基酸序列加以区分。存在三个亚组：(i)原型半乳糖凝集素，其包含可结合形成同型二聚体的单个CRD；(ii)嵌合型半乳糖凝集素(例如半乳糖凝集素-3)，其特征在于具有单个CRD和富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸残基的大的氨基末端结构域；(iii)串联重复型半乳糖凝集素，其中单个多肽内有通过小的肽连接结构域(长度通常为5至50个以上的氨基酸残基)共价桥接或共价连接的至少两个CRD。此外，可对许多半乳糖凝集素转录物进行不同的剪接以产生不同的同工型(isoform)。半乳糖凝集素的实例包括电凝集素(electrolectin)和各种S型(巯基依赖性)半乳糖凝集素。一些实例包括但不限于：半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-4、半乳糖凝集素-6、半乳糖凝集素-7、半乳糖凝集素-8、半乳糖凝集素-9、半乳糖凝集素-10、半乳糖凝集素-12、半乳糖凝集素-13和半乳糖凝集素-14。(参见，例如，Varki A、Cummings RD、Esko JD、Freeze HH、Stanley P、Bertozzi CR、Hart GW、Etzler ME编写的Essentials ofGlycobiology(《糖生物学概要》)第2版，Cold Spring Harbor(纽约)：Cold Spring HarborLaboratory Press(纽约冷泉港：冷泉港实验室出版社)，2009年，第33章：Cummings RD和Liu FT，Galectins(半乳糖凝集素)；Gitt，MA等，Galectin-4and galectin-6are twoclosely related lectins expressed in mouse gastrointestinal tract(半乳糖凝集素-4和半乳糖凝集素-6是在小鼠胃肠道中表达的两种密切相关的凝集素)，J BiolChem.273(5)：2954-60(1998)；Bidon，N.等，Galectin-8：a complex sub-family ofgalectins(Review)(半乳糖凝集素-8：一种半乳凝素的复杂亚家族(综述))，Int J MolMed.8(3)：245-50(2001)；Hadari，YR等，Galectin-8.A new rat lectin，related togalectin-4(半乳糖凝集素-8：与半乳糖凝集素-4有关的新的大鼠凝集素)，J BiolChem.270(7)：3447-53(1995)；Sato，M.等，Functional analysis of the carbohydraterecognition domains and a linker peptide of galectin-9as to eosinophilchemoattractant activity(半乳糖凝集素-9的碳水化合物识别域和连接肽的关于嗜酸性粒细胞趋化活性的功能分析)，Glycobiology 12(3)：191-97(2002)；Yang，RY等，Cellcycle regulation by galectin-12，a new member of the galectin superfamily(半乳糖凝集素超家族新成员半乳糖凝集素-12对细胞周期的调节)，J Biol Chem.276(23)：20252-60(2001)；Ramaswamy，S等，Structural basis of multivalent galactose-baseddendrimer recognition by human galectin-7(人半乳糖凝集素-7识别多价半乳糖基树枝状聚合物的结构基础)，FEBS J.2015Jan；282(2)：372-87(2015)；Patnaik，SK等，ComplexN-glycans are the major ligands for galectin-1，-3，and-8on Chinese hamsterovary cells(复合型N-聚糖是中国仓鼠卵巢细胞中半乳糖凝集素-1，-3和-8的主要配体)，Glycobiology 16(4)：305-17(2006))。

“半乳糖凝集素-3”是哺乳动物细胞的β-半乳糖苷结合蛋白，所述哺乳动物细胞例如但不限于：仓鼠细胞或仓鼠来源的细胞、小鼠细胞或小鼠来源的细胞，或人细胞或人来源的细胞。这种宿主细胞凝集素广泛分布于哺乳动物物种的细胞中。(参见，例如，Mehul，B.等，J.Biol.Chem.269，18250-18258(1994)；Mehul，B.等，Cross-linking of galectin 3,agalactose-binding protein of mammalian cells,by tissue-type transglutaminase(一种哺乳动物细胞的半乳糖结合蛋白半乳糖凝集素3通过组织型转谷氨酰胺酶的交联)，FEBS Lett 360：160-164(1995)；Reljic，R.等，Mouse monoclonal IgA binds to thegalectin-3/Mac-2lectin from mouse macrophage cell lines(小鼠单克隆IgA与小鼠巨噬细胞细胞系的半乳糖凝集素-3/Mac-2凝集素结合)，Immunology Letters，93：1，51(2004)；Henrick，K.等，Evidence for subsites in the galectins involved in sugarbinding at the nonreducing end of the central galactose of oligosaccharideligands：sequence analysis,homology modeling and mutagenesis studies ofhamster galectin-3(半乳糖凝集素在寡糖配体中央半乳糖的非还原端参与糖结合的亚位点的证据：仓鼠半乳糖凝集素-3的序列分析、同源性建模和诱变研究)，Glycobiology 8(1)：45-57(1998)；Dumic等，Galectin-3：An open-ended stor(半乳糖凝集素-3：一个尚无定论的故事)，Biochimica and Biophysica Acta1760：616-635(2006))。

术语“污染物”或“杂质”指存在于待纯化的重组蛋白样品中除了待纯化的重组目的蛋白之外的任何外来或有害的分子或离子，特别是生物大分子(例如DNA、RNA或蛋白质)。例如，污染物包括：例如来自分泌待纯化重组蛋白的宿主细胞的其他蛋白质，如污染性半乳糖凝集素宿主细胞蛋白质(例如，半乳糖凝集素-3)，或金属阳离子，例如铝阳离子(例如，Al(III))、钡阳离子、钙阳离子、钴阳离子(例如Co(II))、铜阳离子、铁阳离子(例如，Fe(II)或Fe(III))、锌阳离子、镁阳离子、锰阳离子、汞阳离子、镍阳离子和/或锶阳离子。蛋白质的天然环境或培养基中的污染物成分是会干扰该蛋白质诊断或治疗用途的物质，该污染物成分可包括酶、激素以及其他蛋白质的或非蛋白质的(例如多核苷酸、脂质、碳水化合物)溶质。通常，“分离的蛋白质”构成给定样品的至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。在一些实施方式中，通过SDS-PAGE或其他合适的技术，在还原或非还原条件下，可选地使用染色剂(例如考马斯蓝或银染色剂)，将目的蛋白质(例如阿柏西普融合蛋白)纯化至：(1)大于95重量％(最优选大于99重量％)的蛋白质；或者(2)均质。分离的重组蛋白包括重组细胞中的原位(in situ)。然而，通常，通过至少一个纯化步骤来制备分离的目的蛋白(例如，阿柏西普)。使用任何合适的测定法来评估纯度和杂质水平，该测定法包括但不限于：CE-SDS、HCP ELISA、半乳糖凝集素ELISA、多属性质谱(MAM)、通过质谱法的金属分析和/或DNA的QPCR。

在实施本发明方法的过程中，用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可获得的，并且在例如Wang，W.(1999)，Instability,stabilization and formulationof liquid protein pharmaceuticals(液体蛋白药物的不稳定性、稳定化及制剂)，Int.J.Pharm.185：129-188中已对相关分析技术进行了综述。可在选定温度下测量选定时间段内的稳定性。例如，在实践中将制剂实际存储在2℃至8℃下的情况下，通常，该制剂应在30℃下稳定至少1个月，或在40℃下稳定至少一周，和/或在2℃至8℃下稳定至少两年。为了快速筛选，可将含有蛋白质的溶液或制剂在30℃至40℃下保持2周至1个月，然后测量蛋白质的稳定性。此种在高于正常储存温度(30℃至40℃)下的储存是为了模拟在更长时间的更传统的冷藏温度储存下会发生的情况，此种储存被称为“加速的稳定性”。

蛋白质的“稳定”溶液或制剂是其中的蛋白质(例如重组阿柏西普蛋白)经纯化和/或处理(例如，超滤、渗滤或其他过滤步骤、色谱步骤、低pH病毒灭活、小瓶填充、运输和/或存储)后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的溶液或制剂。总之，在特定的物理条件(例如，温度和pH)下，特定溶液或制剂中目的蛋白质的物理、化学和生物学稳定性体现了蛋白质的“稳定性”。例如，预期在零下温度下存储的蛋白质在化学、物理或生物学活性方面均不会发生显著变化，而预期在40℃下存储的蛋白质在其物理、化学和生物学活性方面均会发生一定程度的变化(取决于蛋白质的存储时间)。蛋白质制剂的构型也可影响变化速率。例如，聚集体的形成受蛋白质浓度的高度影响，其中在更高蛋白质浓度下观察到更高的聚集速率。还已知赋形剂会影响药物产品的稳定性，例如，对于某些蛋白质，添加盐会增加聚集速率，而其他赋形剂(例如蔗糖)已知会降低储存期间的聚集速率。pH值也极大地影响不稳定性，pH值会导致降解速率升高和降低(取决于修饰的类型和pH依赖性)。

如果在目视检查颜色和/或透明度，或者通过紫外光散射或通过尺寸排阻色谱法或其他合适方法检测时，蛋白质显示出最低迹象的二级和/或三级结构(即，固有结构)变化或聚集和/或沉淀和/或变性，则该蛋白质“保持其物理稳定性”。蛋白质的物理不稳定性(即物理稳定性的丧失)可能由低聚导致，其中低聚产生二聚体和更高级聚集体、亚可见和可见的颗粒形成以及沉淀。可根据目标降解物的类型，使用各种技术来确定物理降解的程度。二聚体和更高级可溶性聚集体可使用尺寸排阻色谱法来定量，而亚可见颗粒可使用光散射、光阻法或其他合适技术来定量。在一个实施方式中，根据降解的(例如，片段化的)和/或聚集的蛋白百分比低的溶液中阿柏西普单体蛋白的百分比，来确定蛋白质的稳定性。

如果在给定时间内的化学稳定性使得未形成或未破坏共价键(导致蛋白质组分的一级结构发生改变)，则该蛋白质在药物制剂中“保持其化学稳定性”。一级结构的变化可导致蛋白质的二级和/或三级和/或四级结构的修饰，并且可导致聚集体的形成或已形成聚集体的逆转。典型的化学修饰可包括：异构化、脱酰胺化、N-末端环化、主链水解、甲硫氨酸氧化、色氨酸氧化、组氨酸氧化、β消除(beta-elimination)、二硫键形成、二硫键错配(disulfide scrambling)、二硫键断裂以及其他导致一级结构改变的变化，包括D-氨基酸的形成。化学不稳定性(即化学稳定性的丧失)可通过多种技术来进行研究，包括离子交换色谱、毛细管等电聚焦、肽消化物分析和多种质谱技术。化学稳定性可通过检测和量化蛋白质的化学改造的形式来进行评估。化学改造(chemical alteration)可能涉及尺寸改变(例如剪裁)，其可使用例如尺寸排阻色谱法(SEC)、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)进行评估。其他类型的化学改造包括电荷改变(例如由于脱酰胺作用而发生)，其可通过基于电荷的方法来评估，所述方法例如但不限于：离子交换色谱、毛细管等电聚焦或肽图谱(peptide mapping)。

物理和/或化学稳定性的丧失可能导致生物学活性的改变，取决于修饰和所修饰的蛋白质，目标生物学活性增加或降低。如果蛋白质在给定时间内的生物活性为药物制剂制备时所表现出的生物活性的约30％以内，则该蛋白质在药物制剂中“保持其生物活性”。如果活性低于其起始值的70％，则认为活性降低。生物学测定法可包括基于体内和体外的测定法，例如配体结合、效价、细胞增殖或其生物药物活性的其他替代测量法。例如，可使用体外配体结合测量法，例如通过ELISA测量胎盘生长因子(PlGF)的结合或VEGFA依赖性人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的抑制，来评估阿柏西普的生物活性。

通常，用于本发明目的的重组目的蛋白(例如，阿柏西普、阿法西普、依那西普、阿巴西普、贝拉西普、rFVIIIFc、rFIXFc和利纳西普)通过重组表达技术产生。术语“重组”表示材料(例如，核酸或多肽)已通过人工干预进行人工或合成(即，非天然)改变。可在材料的天然环境或天然状态内对该材料进行改造，或可对从材料的天然环境或天然状态取出的该材料进行改造。例如，“重组核酸”是通过在例如克隆、DNA改组或其他公知的分子生物学方中重组核酸而制成的。此种分子生物学方法的实例可见于：Maniatis等，MolecularCloning.A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring HarborLaboratory(冷泉港实验室)，Cold Spring Harbor,N.Y.(纽约冷泉港)(1982年)。“重组DNA分子”由通过此种分子生物学技术连接在一起的DNA片段组成。如本文所用，术语“重组蛋白”或“重组多肽”指使用重组DNA分子表达的蛋白质分子。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸的细胞。例如，用于表达阿柏西普融合蛋白的重组DNA分子描述于：例如Papadopoulos等，Modified Chimeric Polypeptides with Improved PharmacokineticProperties(具有改善的药代动力学性质的经修饰的嵌合多肽)、US 7,070,959 B2以及WO00/75319A1。

在说明书中，术语“天然存在的”与生物材料(例如多肽、核酸、宿主细胞等)有关时指在自然界中发现的材料。

术语“控制序列(control sequence)”或“控制信号(control signal)”指可在特定宿主细胞中影响其所连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。此类控制序列的性质可能取决于宿主生物。在特定实施方式中，原核生物的控制序列可包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。真核生物的控制序列可包括启动子，该启动子包含一个以上转录因子的识别位点、转录增强子序列或元件、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。控制序列可包括前导序列(leader sequence)和/或融合伴侣序列(fusion partner sequence)。启动子和增强子由短阵列的DNA组成，该短阵列的DNA特异性地与参与转录的细胞蛋白相互作用(Maniatis等，Science 236：1237(1987))。已从多种真核来源(包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞的基因)和病毒中分离了启动子和增强子元件(原核生物中也发现了类似的控制元件，即启动子)。具体启动子和增强子的选择取决于用于表达目的蛋白的细胞类型。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其他真核启动子和增强子在有限的细胞类型亚群中起作用(有关综述，请参见Voss等，Trends Biochem.Sci.，11：287(1986)和Maniatis等，Science 236：1237(1987))。

“启动子”是包含RNA聚合酶结合位点的DNA区域，以通过一个以上下游结构基因启动信使RNA的转录。启动子位于同一条链上的基因的转录起始位点附近，并位于DNA的上游(朝向有义链的5'区域)。启动子的长度通常为约100bp至1000bp。

“增强子”是可与一种以上激活蛋白(转录因子)结合以激活基因转录的短(50bp至1500bp)DNA区域。

如本文所用，术语“以可操作的组合”、“以可操作的顺序”和“可操作地连接”指核酸序列的连接，通过此种连接产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子。该术语还指核酸序列的连接，通过此种连接产生功能性蛋白。例如，载体中“可操作地连接”蛋白质编码序列的控制序列与蛋白质编码序列相连接，从而在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。

“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且包括通过肽键共价连接的两个以上氨基酸的分子链。这些术语不涉及产品的具体长度。因此，“肽”和“寡肽”被包括在多肽的定义内。该术语包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，蛋白质片段、类似物、突变蛋白质或变异蛋白质、融合蛋白等包括在多肽的含义内。该术语还包括其中包含一种以上氨基酸类似物或非规范或非天然氨基酸的分子，这些分子可使用已知的蛋白质工程技术重组表达。此外，融合蛋白可如本文所述通过熟知的有机化学技术来衍生。

多肽的“变体”(例如，融合蛋白、免疫球蛋白或抗体)包含一种氨基酸序列，其中相对于另一多肽序列，一个以上氨基酸残基被插入到该氨基酸序列中、从该氨基酸序列中缺失和/或替换到该氨基酸序列中。变体包括融合蛋白。

术语“融合蛋白”(例如，阿柏西普融合蛋白)表示该蛋白包括衍生自一种以上亲本蛋白或多肽的多肽组分。通常，融合蛋白由“融合基因”表达，在“融合基因”中，编码一种蛋白质的多肽序列的核苷酸序列与编码不同蛋白质的多肽序列的核苷酸序列被附加在框架内并可选地由接头(linker)分开。然后，重组宿主细胞可将融合基因表达为单个蛋白质。

“分泌”蛋白质指由于分泌型信号肽序列而能够被导向内质网(ER)、分泌性囊泡或细胞外空间的那些蛋白质，以及无需信号序列而释放到细胞外的那些蛋白质。如果分泌蛋白质被释放到细胞外空间，则分泌蛋白质可以经历细胞外加工以产生“成熟”蛋白质。到细胞外空间的释放可通过许多机制发生，包括胞吐作用和蛋白水解切割。在一些其他实施方式中，目标的阿柏西普融合蛋白可由宿主细胞合成为分泌蛋白，然后可从细胞外空间和/或培养基进一步纯化。

如本文所用，当涉及通过重组DNA技术在宿主细胞中产生的蛋白质时，“可溶性”是存在于水溶液中的蛋白质；如果蛋白质包含双精氨酸信号氨基酸序列，则可溶蛋白质被运输到革兰氏阴性细菌宿主中的周质空间，或由能够分泌的真核宿主细胞或具有适当基因(例如，kil基因)的细菌宿主分泌到培养基中。因此，可溶性蛋白质是在宿主细胞内的包涵体中未发现的蛋白质。可选地，取决于上下文，可溶性蛋白是这样的蛋白质：未被发现整合在细胞膜中，或在体外溶解，或当在生理条件下将其悬浮在目标水性缓冲液中且不含其他蛋白质时，能够在生理条件下溶解于水性缓冲液中而不会形成大量不溶性聚集体(即，形成小于总蛋白质的10％、通常小于总蛋白质的5％的聚集体)的蛋白质，其中此类缓冲液不含去污剂或离液剂，例如尿素、盐酸胍或高氯酸锂。相反，不溶性蛋白是以变性形式存在于宿主细胞中的细胞质颗粒(称为包涵体)中的蛋白质，或者，也取决于上下文，不溶性蛋白是存在于细胞膜(包括但不限于细胞质膜、线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜等)中的蛋白质，或当在生理条件下(在生理相容性温度下)将其悬浮在目标水性缓冲液中且不含其他蛋白质时，在生理条件下在体外水性缓冲液中形成大量不溶性聚集体(即，形成等于或大于总蛋白质的10％的聚集体)的蛋白质，其中此类缓冲液不含去污剂或离液剂，例如如尿素、盐酸胍或高氯酸锂。

术语“多核苷酸”或“核酸”包括含有两个以上核苷酸残基的单链和双链核苷酸聚合物。构成多核苷酸的核苷酸残基可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰(例如溴尿苷和肌苷衍生物)、核糖修饰(例如2',3'-二脱氧核糖)和核苷酸间键合修饰(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoraniladate)和氨基磷酸酯)。

术语“寡核苷酸”指包含200个以下的核苷酸残基的多核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为10至60个碱基。在其他实施方式中，寡核苷酸的长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可为单链或双链，例如用于构建突变基因。寡核苷酸可为有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定法的标记物，包括放射性标记物、荧光标记物、半抗原性标记物或抗原性标记物。例如，寡核苷酸可用作PCR引物、克隆引物或杂交探针。

本文可互换使用的“多核苷酸序列”或“核苷酸序列”或“核酸序列”是多核苷酸中核苷酸残基的一级序列，包括寡核苷酸、DNA和RNA、核酸或表示核苷酸残基一级序列的字符串，这取决于上下文。从任何指定的多核苷酸序列，可确定给定的核酸或互补的多核苷酸序列。包括基因或合成来源的DNA或RNA，它们可是单链或双链的，表示有义链或反义链。除非另有说明，否则本文讨论的任何单链多核苷酸序列的左端是5'端，双链多核苷酸序列的左侧方向称为5'方向。新生RNA转录物的从5'到3'的添加方向称为转录方向；具有与RNA转录物相同的序列、在RNA转录物的5'至5'末端的DNA链上的序列区域被称为“上游序列”；具有与RNA转录物相同的序列、在RNA转录物的3'至3'末端的DNA链上的序列区域被称为“下游序列”。

如本文所用，“分离的核酸分子”或“分离的核酸序列”是下述核酸分子：(1)该核酸分子经鉴定并从通常与该核酸的天然来源相关的至少一种污染核酸分子中分离出，或(2)该核酸分子经克隆、扩增、标记或其他方式与背景核酸区分开，从而可确定目标核酸的序列。分离的核酸分子并非它在自然界中所发现的形式或设置。但是，分离的核酸分子包括通常表达免疫球蛋白(例如抗体)的细胞中所包含的核酸分子，其中，例如该核酸分子处于与天然细胞不同的染色体位置。

如本文所用，术语“编码核酸分子”、“编码DNA序列”和“编码DNA”指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿mRNA链的核糖核苷酸的顺序，也决定了沿多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。因此，DNA序列编码RNA序列和氨基酸序列。

术语“基因”广泛地用于指与生物学功能相关的任何核酸。通常，基因包括编码序列和/或表达这种编码序列所需的调控序列。术语“基因”适用于特定的基因组或重组序列，以及适用于该序列编码的cDNA或mRNA。基因也包括例如形成其他蛋白质的识别序列的非表达核酸片段。非表达调控序列，包括与调节蛋白(例如转录因子)结合的转录调控元件，使得邻近或附近序列转录。

如上下文所示，“基因的表达”或“核酸的表达”指DNA转录成RNA(可选地包括RNA的修饰，例如剪接)、RNA翻译成多肽(可能包括随后的翻译后修饰)，或转录和翻译。

表达组件(expression cassette)是重组表达技术的典型特征。表达组件包括编码目的蛋白的基因，例如，编码阿非普西融合蛋白序列的基因。真核“表达组件”指能够在真核细胞(例如哺乳动物细胞)中产生蛋白质的表达载体的部分。表达组件包括可在真核细胞中起作用的用于mRNA转录的启动子，一个以上编码目的蛋白质的基因以及mRNA终止和加工信号。表达组件可有用地在编码序列中包含用作选择标志物的基因。在表达组件中，启动子5'可操作地连接至编码外源目的蛋白的开放阅读框架(open reading frame)；多腺苷酸化位点可操作地连接至开放阅读框架的3'端。只要表达组件保持可操作性，表达组件还可包含其他合适的控制序列。可选地，开放阅读框架包含一种以上目的蛋白的编码序列。

如本文所用，当在涉及结构基因中使用时，术语“编码区”或“编码序列”指编码由于mRNA分子翻译而在新生多肽中发现的氨基酸的核苷酸序列。在真核生物中，编码区在5'侧由编码起始子甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”界定，在3'侧由指定终止密码子(即，TAA、TAG、TGA)的三个三联体之一界定。

通常，重组表达技术涉及包含表达组件的重组表达载体的使用。

术语“载体”指用于将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。

本文所用的术语“表达载体”或“表达构建体”指重组DNA分子，该重组DNA分子包含所需的编码序列和在特定宿主细胞中表达可操作连接的编码序列所必需的适当的核酸控制序列。表达载体可包含但不限于以下序列：影响或控制转录、翻译并且(如果存在内含子)影响与内含子可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。原核生物中表达所必需的核酸序列包括：启动子、可选的操纵子序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止信号和聚腺苷酸化信号。可选地，分泌信号肽序列也可由表达载体编码，与目的编码序列可操作地连接，从而使表达的多肽可由重组宿主细胞分泌，以便更容易地从细胞中分离目的多肽(视需要)。此种技术在本领域中是公知的。(例如，Goodey、Andrew R.等，Peptide and DNA sequences(肽和DNA序列)，美国专利号5,302,697；Weiner等，Compositions and methods for protein secretion(蛋白质分泌的组合物和方法)，美国专利号6,022,952和美国专利号6,335,178；Uemura等，Protein expression vectorand utilization thereof(蛋白质表达载体及其用途)，美国专利号7,029,909；Ruben等，27human secreted proteins(27种人分泌蛋白)，US 2003/0104400 A1)。为了表达多亚基目的蛋白，可使用合适数量和比例的单独的表达载体(每个表达载体包含每个不同亚基单体的编码序列)来转化宿主细胞。在其他实施方式中，单个表达载体可用于表达目的蛋白的不同亚基。

重组表达技术通常涉及包含重组表达载体的哺乳动物宿主细胞。

术语“宿主细胞”指已被核酸转化或能够被核酸转化从而表达目的基因或编码目的序列的细胞。该术语包括亲代细胞的后代，无论该后代在形态或遗传组成上是否与原始亲代细胞相同，只要存在目的基因即可。在实施本发明时，可使用大量可获取的和公知的宿主细胞中的任何一种来产生重组的阿柏西普融合蛋白。具体宿主的选择取决于本领域已知的许多因素。这些因素包括：例如，与所选表达载体的相容性、由DNA分子编码的肽的毒性、转化率、肽的易回收性、表达特性、生物安全性和成本。在理解对于特定DNA序列的表达可能并非所有宿主都同样有效的前提下，必须取得这些因素之间的平衡。在这些一般性指导原则中，培养中有用的微生物宿主细胞包括：细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli sp.))、酵母(例如酵母属(Saccharomyces sp.))和其他真菌细胞、藻类或藻类样细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物(包括人)细胞，例如CHO细胞和HEK-293细胞。也可在DNA水平上进行修饰。可将编码肽的DNA序列改变为与所选宿主细胞更相容的密码子。对于大肠杆菌(E.coli)，优化的密码子是本领域已知的。可替换密码子以消除限制性位点或以包括沉默限制性位点，这可帮助加工所选宿主细胞中的DNA。接下来，培养并纯化转化的宿主。可在常规发酵条件下培养宿主细胞，例如以分批模式或连续灌流模式培养宿主细胞，从而表达所需化合物。这类发酵条件是本领域公知的。

有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是：中国仓鼠卵巢细胞，包括CHO-K1细胞(例如，ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；SV40转化的猴肾CV1品系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(通过悬浮培养亚克隆生长的293或293细胞(Graham等，J.GenVirol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(Sertoli cell)(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝癌细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals NY Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞或FS4细胞；或哺乳动物骨髓瘤细胞。

“细胞”，“细胞系”和“细胞培养物”通常可互换使用，并且本文中所有此类名称包括细胞后代。例如，“衍生”自CHO细胞的细胞是中国仓鼠卵巢细胞的细胞后代，其可与原始的原代细胞亲本隔任何数量的世代，并且还可包括转化子(transformant)后代细胞。转化子和转化细胞包括原代目的细胞和从其衍生的培养物，而无需考虑转化的数量。还应理解，由于故意或无意的突变，所有后代的DNA含量可能不完全相同。具有与原始转化细胞中筛选的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变后代被包括在内。

用上述核酸或载体转化或转染宿主细胞以产生多肽(包括靶结合蛋白)，并在经适当修饰的常规营养培养基中培养宿主细胞以诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需的序列。此外，具有被选择标志物分隔的多拷贝转录单位的新载体和转染细胞系对于多肽(例如抗体)的表达特别有用。

术语“转染”指细胞吸收外来或外源DNA，并且当将外源DNA被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术是本领域公知的，并在本文中公开。参见，例如，Graham等，1973，Virology 52：456；Sambrook等，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，同上；Davis等，1986，Basic Methods in Molecular Biology(分子生物学基础方法)(Elsevier)；Chu等，1981，Gene 13：197。此类技术可用于将一种以上外源DNA部分引入合适的宿主细胞中。

术语“转化”指细胞遗传特性的改变，并且当细胞已被修饰以包含新的DNA或RNA时已被转化。例如，通过转染、转导或其他技术引入新的遗传物质，将细胞由天然状态进行遗传修饰，从而对细胞进行转化。转染或转导后，转化的DNA可通过物理整合到细胞的染色体中而与细胞的DNA重组，或者转化的DNA可作为游离成分暂时保持而不被复制，或者转化的DNA可作为质粒独立地复制。当转化的DNA随细胞分裂而复制时，认为细胞已“稳定转化”。

用于产生本发明的经糖基化的重组目的蛋白质或POI(例如，重组阿柏西普融合多肽)的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基，例如Ham's F10(Sigma)、最低基础培养基((MEM，Minimal Essential Medium)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改进的Eagle培养基((DMEM，Dulbecco's Modified Eagle's Medium)，Sigma))，适用于培养宿主细胞。此外，在Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469；WO 90103430；WO 87/00195或美国专利参考号30,985中描述的任一培养基，可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种均可根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素^TM药物)、微量元素(通常定义为以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源，以使细胞在培养基中或培养基上的生理条件促进宿主细胞表达目的蛋白质；也可包含本领域技术人员已知的合适浓度的任何其他必要补充剂。培养条件，例如温度(通常但不一定是约37℃)、pH(通常但不一定是约pH 6.5至7.5)、氧合等，是先前选择用于表达目的蛋白质的宿主细胞所使用的那些培养条件，并且对于普通技术人员而言是显而易见的。培养基可包含适量的血清，例如胎牛血清(FBS)；或者优选地，宿主细胞可适于在无血清培养基中培养。在一些实施方式中，水性培养基是液体，使得宿主细胞在液体培养基内以细胞悬浮液进行培养。宿主细胞可在分批细胞培养或连续(灌流)细胞培养系统中有效地生长。

在其他实施方式中，哺乳动物宿主细胞可在固体或半固体水性培养基(例如含有琼脂或琼脂糖以形成培养基或底物表面)上培养，细胞粘附于培养基上并形成粘附层。

在培养宿主细胞后，重组多肽可产生于细胞内的周质空间中，或直接分泌到培养基中。如果多肽(例如阿柏西普)在细胞内产生，作为第一步，例如通过离心、深度过滤或超滤除去颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。

关于孵育缓冲液或其他结合/反应测定试剂的“在生理条件下”指在允许发生生化反应(例如非共价结合反应)的温度、pH和离子强度的条件下孵育。通常，温度是在至多约37℃的室温或环境温度和pH 6.5至pH 7.5下。

物质组合物的“生理上可接受的盐”，例如目的蛋白质(例如融合蛋白或免疫球蛋白，例如抗体，或任何其他目的蛋白质)的盐，指任何已知或后来发现是药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的一些非限制性实例为：乙酸盐；三氟乙酸盐；氢卤化物(例如盐酸盐和氢溴酸盐)；硫酸盐；柠檬酸盐；马来酸盐；酒石酸盐；乙醇酸盐；葡萄糖酸盐；琥珀酸盐；甲磺酸盐；苯磺酸盐；没食子酸酯的盐(没食子酸也称为3,4,5-三羟基苯甲酸)，例如五没食子酰葡萄糖(PGG)的盐和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的盐；胆固醇硫酸盐；双羟萘酸盐；丹宁酸盐；以及草酸盐。

“反应混合物”是包含所有必需的试剂和因子的水性混合物，在孵育的生理条件下，反应混合物允许体外发生目标生化反应，例如共价或非共价结合反应。

多核苷酸的“结构域”或“区域”(本文可互换使用)是完整多核苷酸的任何部分，直至并包括完整多核苷酸，但通常包含少于完整多核苷酸的部分。结构域可以但不必独立于多核苷酸链的其余部分折叠(例如，DNA发夹折叠)和/或与特定的生物学、生化或结构功能或位置(例如编码区或调控区)相关。

蛋白质的“结构域”或“区域”(本文可互换使用)是完整蛋白质的任何部分，直至并包括完整蛋白质，但通常包含少于完整蛋白质的部分。结构域可以但不必独立于蛋白质链的其余部分折叠和/或与特定的生物学、生化或结构功能或位置(例如，配体结合结构域或胞质、跨膜或胞外结构域)相关。

重组目的蛋白(例如但不限于阿柏西普融合蛋白)的定量通常在跟踪蛋白质生产或蛋白质纯化步骤产量(或用于含有阿柏西普或其他治疗性目的蛋白质的原料药或药物产品的批次释放测定)中有用或必需。因此，特异性结合目的蛋白质的抗体(特别是单克隆抗体)可用于这些目的。

术语“抗体”或可互换的“Ab”以最广含义使用，并且包括完全组装的抗体、单克隆抗体(包括人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及可结合抗原的抗体片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、单链抗体、双抗体)，其包含前述的互补决定区(CDR)，只要它们具有所需的生物学特性。涵盖完整分子和/或片段的多聚体或聚集体，包括化学衍生抗体。涵盖任何同种型或亚类的抗体，包括IgG、IgM、IgD、IgA和IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，或任何同种异型。不同的同种型可具有不同的效应子功能，例如，IgG1和IgG3同种型可具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。

“分离的”蛋白质(例如，阿柏西普融合蛋白或其他重组目的蛋白质)是已被鉴定并已从该蛋白质的天然环境或培养基的一种以上成分中分离出来的蛋白质，在该培养基中该蛋白质被生产细胞分泌。在一些实施方式中，分离的蛋白质基本上不含在该蛋白质的天然环境或培养基环境中发现的会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的蛋白质或多肽或其他污染物。

术语“结合(to bind)”或“结合(binding)”分子至蛋白A或蛋白A基质，指在适当条件下(例如，pH和所选盐/缓冲液组合物)，将分子暴露于蛋白A，使得该分子借助在这些条件下与蛋白A的结合亲和力而可逆地固定在蛋白A基质(例如，蛋白A树脂)中或蛋白A基质(例如，蛋白A树脂)上，而不考虑可能涉及的亲和性的物理机制如何。(参见，例如，Jendeberg，L.等，The Mechanism of Binding Staphylococcal Protein A to Immunoglobin G DoesNot Involve Helix Unwinding(葡萄球菌蛋白A与免疫球蛋白G结合的机制不涉及螺旋展开)，Biochemistry 35(1)：22–31(1996)；Nelson，J.T.等，Mechanism of ImmobilizedProtein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces(固定在纳米传感器阵列表面上的蛋白A与免疫球蛋白G结合的机制)，Anal.Chem.87(16)：8186–8193(2015))。

术语“结合”或“结合”分子至离子交换基质(例如，CEX基质，例如CEX树脂)，指在适当条件下(例如，pH和所选盐/缓冲液组合物)，将该分子暴露于离子交换基质，使得该分子借助其与离子交换基质的带电基团(即带电配体)之间的离子相互作用而可逆地固定在离子交换基质中或离子交换基质上。

术语“缓冲液”或“缓冲溶液”指通过其共轭酸碱范围的作用而抵抗pH变化的溶液。将pH控制在约pH 4至约pH 6.5范围内的有用缓冲液的实例包括：乙酸盐、MES、柠檬酸盐、Tris、bis-tris、组氨酸、精氨酸、琥珀酸盐、柠檬酸盐、谷氨酸和乳酸盐，或两种以上这些缓冲液的组合，或其他无机酸缓冲液或有机酸缓冲液；磷酸盐是有用缓冲液的另一个实例。含有钠、铵和钾阳离子的盐常用于制备缓冲溶液。

术语“上样缓冲液”或“平衡缓冲液”指这样的缓冲液和盐：其与蛋白质制剂(例如，分批或灌流培养上清液或滤液，或含有目的蛋白质的洗脱合并液)混合，用于将蛋白质制剂上样到蛋白A基质或离子交换基质(例如，CEX基质或AEX基质)或疏水相互作用色谱(HIC)基质上(视情况而定)。这种缓冲液还用于在上样之前平衡基质，以及在上样蛋白质后进行洗涤。

本文所用的术语“洗涤缓冲液”指：在上样蛋白质制剂之后且在洗脱之前或者在目的蛋白质流穿之后，通过蛋白A基质或离子交换基质(例如，CEX基质或AEX基质)或疏水相互作用色谱(HIC)基质(视情况而定)的缓冲液。洗涤缓冲液可用于去除一种以上污染物而基本上不洗脱所需的蛋白质，或者可用于洗出非结合蛋白。

术语“洗脱缓冲液”或“洗脱液”指用于洗脱与基质可逆地结合的目的蛋白(POI)的缓冲液。如本文所用，术语“溶液”指缓冲溶液或非缓冲溶液，包括水。

术语“洗脱合并液”或“洗脱液合并液”指从基质洗脱的包含重组目的蛋白的物质。

针对蛋白A基质或离子交换基质(例如，CEX基质)或疏水相互作用色谱(HIC)基质的术语“上样”指将蛋白质制剂(例如，批次或灌流培养上清液或滤液，或含有目的蛋白质的洗脱合并液)上样到蛋白A基质或离子交换基质或HIC基质上。

针对蛋白A基质或离子交换基质(例如CEX基质)或疏水相互作用色谱(HIC)基质的术语“洗涤”指使合适的缓冲液穿过或通过蛋白A基质或离子交换基质或HIC基质(视情况而定)。

本发明的用于从污染物中纯化经糖基化的重组目的蛋白的方法包括：用约pH 6.0至6.5的包含1M至3M氯化钙的缓冲液，洗涤可逆地结合有POI的蛋白A基质。更优选地，洗涤缓冲液中氯化钙的浓度为2M至2.7M氯化钙，例如，约2.0M、约2.1M、约2.2M、约2.3M、约2.4M、约2.5M、约2.6M，或约2.7M氯化钙。

从蛋白A基质或离子交换基质(例如CEX基质)“洗脱”分子(例如所需的重组蛋白质或污染物)，该术语“洗脱”指通常通过使洗脱缓冲液流过蛋白质A基质或离子交换基质来从此种材料中移除分子。

与蛋白质纯化结合使用的术语“分开”或“分离”指：在包含所需的蛋白质和第二种蛋白质或其他污染物或杂质的混合物中，将所需的蛋白质与第二种蛋白质或其他污染物或杂质分离，使得至少大部分的所需的蛋白质的分子从包含至少大部分第二种蛋白质或其他污染物或杂质的分子的那部分混合物中分离。

从包含重组目的蛋白(即“POI”)和一种以上污染物的组合物或溶液中“纯化(purify)”或“纯化(purifying)”所需的蛋白质，该术语“纯化(purify)”或“纯化(purifying)”指通过从组合物或溶液中(完全或部分)去除至少一种污染物来提高组合物或溶液中所需的重组蛋白的纯度。

术语“治疗性生物产品”指适用于预防、治疗或治愈人类疾病或病症的蛋白质。治疗性生物产品的实例包括：单克隆抗体、天然蛋白(例如，受体、配体、激素、酶或细胞因子)的重组形式、融合蛋白、肽抗体和/或单体结构域结合蛋白(monomer domain bindingprotein)，例如，基于选自LDL受体A结构域、血小板反应蛋白结构域、甲状腺球蛋白结构域、三叶/PD结构域、VEGF结合结构域、EGF结构域、Anato结构域、Notch/LNR结构域、DSL结构域、整联蛋白β结构域和Ca-EGF结构域的结构域。

术语“肽抗体(peptibody)”指包含抗体Fc结构域(即，至少C_H2和C_H3抗体结构域)的融合蛋白分子，该抗体Fc结构域排除了抗体C_H1、CL、VH和VL结构域以及Fab和F(ab)₂，其中，Fc结构域连接至一个以上的肽(优选药理活性肽)。肽抗体的产生一般性地描述于PCT公开号WO00/24782中。

术语“阳离子交换基质”或“CEX基质”指带负电荷并且具有可以与通过或穿过固相的水溶液中的阳离子交换的游离阳离子的固相。可通过将一种以上带电配体连接至固相(例如通过共价连接)来提供负电荷。替代地或另外地，电荷可为固相的固有性质(例如，二氧化硅具有整体负电荷)。阳离子交换(“CEX”)基质(例如，CEX树脂)可被放置或填充到用于纯化蛋白质的色谱柱中。CEX是去除高分子量(HMW)蛋白质类以及宿主细胞蛋白质、DNA和残留蛋白A的有效步骤(Zeid等(2008)，Biotechnology and Bioengineering 102，971-976；Yigzaw，Y.等(2009)，Current Pharmaceutical Biotechnology10，421-426；Gagnon，P.，Purification tools for monoclonal antibodies(单克隆抗体的纯化工具)，1996：Validated Biosystems，Inc.；Stein，A.和Kiesewetter，A.(2007)，Journal ofChromatography B 848，151-158；Staby，A.等(2006)，Journal of Chromatography 1118，168-179)。通常，CEX以结合-洗脱模式(BEM，bind-and-elute mode)操作，其中，在低于目标分子的pI的pH下，在低电导率条件下，蛋白质结合至CEX基质(例如，CEX树脂)。然后通常通过增加电导率和/或诱导pH变化，来实现结合蛋白的洗脱。这可通过线性梯度或逐步洗脱至预定条件来进行。通常，杂质(特别是HMW类)比mAb产物结合得更紧，并且可通过调整洗脱条件和合并液收集标准，从主要所需馏分中分离出杂质(Yigzaw，Y.等(2009)，同上；Gagnon，P等(1996)，同上；Pabst，T.M.等(2009)，Journal of Chromatography 1216，7950-7956)。可商购的有用CEX基质的实例包括但不限于：购自EMD Millipore的COO^-、SO₃ ^-或S；购自GE Healthcare Life Sciences的SPFF或Capto^TM S；以及购自Thermo Fisher Scientific的XS，购自Tosoh Bioscience的Sulfate-650-F。

术语“阴离子交换基质”或“AEX基质”指带正电荷且具有可以与通过或穿过固相的水溶液中的阴离子交换的游离阴离子的固相。可通过将一种以上带正电荷的配体连接至固相(例如通过共价连接)来提供电荷。替代地或另外地，电荷可为固相的固有性质。可将阴离子交换(“AEX”)基质(例如，AEX树脂)放置或填充到用于纯化蛋白质的色谱柱中。

术语“疏水相互作用色谱基质”或“HIC基质”指基于物质的表面疏水性而与该物质发生不同的相互作用的固相材料或基质。(参见例如Queiroz，J.A.等，Hydrophobicinteraction chromatography of proteins(蛋白质的疏水相互作用色谱)，J.Biotechnol.87(2)：143-59(2001)；Chen，J.等，Comparison of standard and new generationhydrophobic interaction chromatography resins in the monoclonal antibodypurification process(单克隆抗体纯化过程中标准和新一代疏水相互作用色谱树脂的比较)，Journal of Chromatography A 1177(2)：272-81(2008))。各种合适的HIC基质是可商购的，例如HIC树脂，例如购自Bio-Rad的t-Butyl；购自ToosohBioscience的Butyl、Butyl 650M、Hexyl、Hexyl650C或Phenyl；购自EMD Millipore的EMD苯基650；以及购自GEHealthcare Life Sciences的Fast Flow High Sub或PhenylFast Flow Low Sub。用于实施本发明方法的有用的HIC基质也可以是包括HIC部分的多峰树脂。可将HIC基质(例如，HIC树脂)放置或填充到可用于纯化蛋白质的色谱柱中。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除可能少量存在的可能自然发生的突变之外,构成群体的各个抗体是相同的。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，作为靶结合蛋白的单克隆抗体是针对单个抗原性位点或表位的高度特异性结合物。单克隆抗体的非限制性实例包括：鼠抗体、兔抗体、大鼠抗体、鸡抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体、完全组装的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、可结合抗原的抗体片段(包括Fab、Fab'、F(ab)₂、Fv、单链抗体、双抗体)、巨抗体(maxibody)、纳米抗体和包含前述CDR的重组肽(只要它们表现出所需的生物学活性即可)，或它们的变体或衍生物。

修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，单克隆抗体可以通过Kohler等，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法来制备，或者单克隆抗体可通过重组DNA方法来制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。例如，还可使用Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。

术语“免疫球蛋白”涵盖：包含两个二聚化重链(HC)的完整抗体，各个重链(HC)均与轻链(LC)共价连接；单个未二聚化的免疫球蛋白重链和共价连接的轻链(HC+LC)；或嵌合免疫球蛋白(轻链+重链)-Fc异三聚体(所谓的“半抗体(hemibody)”)。“免疫球蛋白”是蛋白质，但不一定是靶结合蛋白。

在“抗体”中，每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一个约220个氨基酸(约25kDa)的“轻”链和一个约440个氨基酸(约50-70kDa)的“重”链。每条链的氨基末端部分包括约100个至110个或更多氨基酸的主要负责抗原识别的“可变”(“V”)区。每条链的羧基末端部分定义一个主要负责效应子功能的恒定区。不同抗体之间的可变区不同。不同抗体之间的恒定区相同。在每个重链或轻链的可变区内，存在三个高变亚区，在抗体是靶结合蛋白的情况下，高变亚区有助于确定抗体对抗原的特异性。高变区之间的可变结构域残基称为框架残基，通常在不同抗体之间在某种程度上同源。免疫球蛋白可根据其重链恒定域的氨基酸序列分为不同的类别。人轻链分为卡帕(κ)轻链和拉姆达(λ)轻链。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12个以上氨基酸的“J”区相连，重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。一般参见，Fundamental Immunology(基础免疫学)，第7章(Paul，W.主编，第二版，Raven Press，N.Y.(1989))。“抗体”还包括重组制备的抗体，以及糖基化的抗体或缺乏糖基化的抗体。

术语“轻链”或“免疫球蛋白轻链”包括全长轻链及其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长轻链包括可变区结构域V_L和恒定区结构域C_L。轻链的可变区结构域在多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。

术语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括全长重链及其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长重链包括可变区结构域V_H和三个恒定区结构域C_H1、C_H2和C_H3。V_H结构域在多肽的氨基末端，C_H结构域在羧基末端，C_H3最接近多肽的羧基末端。重链分为mu(μ)、delta(δ)、gamma(γ)，alpha(α)和epsilon(ε)，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链可以是任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。这些中的几种可进一步分为亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同的IgG同种型可具有不同的效应子功能(由Fc区介导)，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗体的Fc区与免疫效应细胞(例如天然杀伤细胞和巨噬细胞)表面上的Fc受体(Fc.γ.Rs)结合，导致靶细胞的吞噬作用或裂解。在CDC中，抗体通过触发细胞表面的补体级联反应杀死靶细胞。

“Fc区”或本文可互换使用的“Fc结构域”或“免疫球蛋白Fc结构域”包含两个重链片段，其完整抗体包含抗体的C_H1和C_H2结构域。两个重链片段通过两个以上二硫键以及通过C_H3结构域的疏水相互作用保持在一起。

术语“补救受体结合表位(salvage receptor binding epitope)”指负责增加IgG分子的体内血清半衰期的IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位。

对于抗体的结构和产生的详细描述，参见Roth，D.B.和Craig，N.L.，Cell，94：411-414(1998)，其全部内容通过引用并入本文。简而言之，产生编码重链和轻链免疫球蛋白序列的DNA的过程主要发生在发育中的B细胞中。在重新排列和连接各种免疫球蛋白基因片段之前，通常发现单个染色体上的V、D、J和恒定(C)基因片段相对邻近。在B细胞分化过程中，V、D、J(在轻链基因的情况下，仅有V和J)基因片段的每个适当家族成员中的一个被重组，形成重免疫球蛋白基因和轻免疫球蛋白基因的功能性重排可变区。该基因片段重排过程似乎是依次序的。首先，制作重链D-至-J接头，然后制作重链V-至-DJ接头和轻链V-至-J接头。除V、D和J片段的重排之外，通过轻链中V和J片段连接位置以及重链的D和J片段连接位置的可变重组，免疫球蛋白重链和轻链的一级库(repertoire)产生了进一步的多样性。通常，轻链中的此种变化发生在V基因片段的最后一个密码子和J片段的第一个密码子内。在D和J_H片段之间的重链染色体上会出现类似的连接不精确现象，并且可能会延伸多达10个核苷酸。此外，可在D和J_H基因片段之间以及V_H和D基因片段之间插入几个不是由基因组DNA编码的核苷酸。这些核苷酸的添加被称为N区多样性。可变区基因片段中的此种重排和在此种连接过程中可能发生的可变重组的净效应是一级抗体库(primary antibody repertoire)的产生。

术语“高变”区指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自互补决定区或CDR的氨基酸残基[即，轻链可变结构域中24-34残基(L1)、50-56残基(L2)和89-97残基(L3)和重链可变结构域中31-35残基(H1)、50-65残基(H2)和95-102残基(H3)，如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)所述]。尽管亲和力低于包含所有CDR的整个抗原结合位点，但即使是单个CDR也可识别并结合抗原。“框架”或“FR”残基是除高变区残基之外的那些可变区残基。

高变“环”的残基的替代定义被Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)描述为轻链可变结构域中残基26-32(L1)、残基50-52(L2)和残基91-96(L3)和重链可变结构域中残基26-32(H1)、残基53-55(H2)和残基96-101(H3)。

术语“靶结合蛋白”(TBP，target binding protein)包括：阿柏西普、阿法西普、依那西普、阿巴西普、贝拉西普、rFVIIIFc、rFIXFc和利纳西普，或抗体，或抗体的免疫功能片段，以及其他重组蛋白，该重组蛋白包含衍生自具有所需靶标结合特性的CDR或其他配体结合部分的序列，使得它们特异性结合目标靶标部分。

通常，在相似的结合测定条件下，与对其他无关靶标的亲和力相比，当靶结合蛋白对靶标部分或目的配体具有显著更高的结合亲和力时，靶结合蛋白“特异性结合”靶标部分或目的配体，因此能够区分该靶标部分或目的配体。通常，当解离常数(K_D)为10^-8M以下时，称为靶结合蛋白“特异性结合”其靶标。当K_D为10^-9M以下时，靶结合蛋白以“高亲和力”特异性结合靶标；当K_D为10^-10M以下时，靶结合蛋白以“非常高的亲和力”特异性结合靶标。

术语“同一性”指通过序列比对和比较确定的两个以上多肽分子的序列或两个以上核酸分子的序列之间的关系。“同一性百分比”指所比较的分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并且是基于所比较的最小分子的大小来计算的。对于这些计算，必须通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来处理比对中的空位(gap)(如果有)。可用来计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括Computational Molecular Biology(计算分子生物学)(Lesk，A.M.主编)，1988年，纽约：牛津大学出版社(Oxford University Press)；Biocomputing Informatics and Genome Projects(生物计算信息学和基因组计划)(Smith，D.W.主编)，1993年，纽约：学术出版社(Academic Press)；Computer Analysis ofSequence Data(序列数据的计算机分析)(上)，(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.主编)，1994年，新泽西州：胡马纳出版社出版社(Humana Press)；von Heinje，G.，1987年，SequenceAnalysis in Molecular Biology(分子生物学的序列分析)，纽约：学术出版社(AcademicPress)；Sequence Analysis Primer(序列分析入门)(Gribskov，M.和Devereux，J.主编)，1991年，纽约：M.斯托克顿出版社(M.Stockton Press)；以及Carillo等，1988年，SIAMJ.Applied Math.48：1073中描述的那些。例如，序列同一性可通过通常用于比较两个多肽的氨基酸位置相似性的标准方法来确定。使用计算机程序(例如BLAST或FASTA)，对两个多肽或两个多核苷酸序列进行比对，以使其各自残基最佳匹配(沿着一个或两个序列的全长，或沿着一个或两个序列的预定部分)。程序提供默认开放罚分(opening penalty)和默认空位罚分(gap penalty)以及得分矩阵(例如PAM 250)[标准得分矩阵，参见Dayhoff等，Atlasof Protein Sequence and Structure，vol.5，supp.3(1978)]可与计算机程序结合使用。例如，同一性百分比可计算为：相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配跨度(matchedspan)内较长序列的长度与为了比对两个序列引入较长序列的空位数量之和。在计算同一性百分比时，将比较序列进行比对，以使序列之间具有最大匹配。

GCG程序包是可用于确定同一性百分比的计算机程序，该程序包包括GAP(Devereux等，1984，Nucl.Acid Res.12：387，Genetics Computer Group,University ofWisconsin,Madison,Wis.)。计算机算法GAP用于比对待确定百分比序列同一性的两个多肽或两个多核苷酸。比对序列以使其各自的氨基酸或核苷酸最佳匹配(如算法所确定的“匹配跨度”)。空位开放罚分(gap opening penalty)(其计算为平均对角线的3倍，其中，“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是由特定比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的分数或数字)和空位扩展罚分(gap extension penalty)(通常是空位开放罚分的1/10倍)以及比较矩阵(例如PAM 250或BLOSUM 62)与该算法结合使用。在某些实施方式中，该算法还使用标准比较矩阵(对于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff等，1978年，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345-352；对于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff等，1992年，Proc.Natl.Acad.Sci.美国89：10915-10919)。

使用GAP程序确定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的推荐参数包括以下：

算法：Needleman等，1970年，J.Mol.Biol.48：443-453；

比较矩阵：Henikoff等，1992年，BLOSUM 62，同上；

空位罚分：12(但末端空位无罚分)

空位长度罚分：4

相似性阈值：0

用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可导致仅两个序列的短区域匹配，并且即使两个全长序列之间无显著关系，该较小的比对区域也可具有非常高的序列同一性。因此，视需要，可调整所选择的比对方法(GAP程序)以产生跨越靶多肽的至少50个连续氨基酸的比对。

当与目的蛋白质(例如，阿柏西普、阿法西普、依那西普、阿巴西普、贝拉西普、rFVIIIFc、rFIXFc和利纳西普)结合使用时，术语“修饰”包括但不限于：一个以上氨基酸改变(包括替换、插入或删除)；化学修饰；通过缀合与治疗剂或诊断剂的共价修饰；标记(例如，用放射性核素或各种酶标记)；共价聚合物连接，例如PEG化(用聚乙二醇衍生化)以及通过非天然氨基酸的化学合成进行插入或取代。将“工程化”蛋白质的编码序列包括在表达组件中之前，可通过本领域技术人员已知的方法来“工程化”或修饰蛋白质以改善靶标亲和力、选择性、稳定性和/或可制造性。

当与目的蛋白质(例如，阿柏西普、阿法西普、依那西普、阿巴西普、贝拉西普、rFVIIIFc、rFIXFc和利纳西普)结合使用时，术语“衍生物”指通过缀合治疗剂或诊断剂、标记(例如，用放射性核素或各种酶)、共价聚合物连接(例如PEG化)(用聚乙二醇衍生化)以及通过非天然氨基酸的化学合成进行插入或取代而被共价修饰的蛋白质。

克隆DNA

使用标准技术进行DNA的克隆(参见，例如，Sambrook等(1989年)MolecularCloning：A Laboratory Guide(分子克隆：实验室指南)，第1-3卷，Cold Spring HarborPress(冷泉港出版社)，其通过引用并入本文)。例如，可通过polyA+mRNA(优选膜相关mRNA)的反转录来构建cDNA文库，并使用对人免疫球蛋白多肽基因序列具有特异性的探针筛选该文库。然而，在一个实施方式中，使用聚合酶链反应(PCR)扩增编码目的免疫球蛋白基因片段(例如，轻链或重链可变片段)的cDNA(或全长cDNA的部分)。经扩增的序列可容易地克隆到任何合适的载体中，例如表达载体、微小基因载体(minigene vector)或噬菌体展示载体(phage display vector)。应理解，所用的具体克隆方法并不重要，只要能确定目的多肽某些部分的序列(例如阿柏西普融合多肽序列)即可。

抗体核酸的一种来源是通过从用目的抗原免疫的动物中获得B细胞并将该B细胞融合到永生细胞中而产生的杂交瘤。或者，可从免疫动物的B细胞(或整个脾脏)分离核酸。编码抗体的核酸的另一个来源是例如通过噬菌体展示技术产生的此类核酸的文库。编码目标肽(例如具有所需结合特性的可变区肽)的多核苷酸可通过标准技术(例如淘选(panning))来鉴定。

DNA的测序使用标准技术(参见，例如，Sambrook等(1989年)Molecular Cloning：ALaboratory Guide(分子克隆：实验室指南)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Press(冷泉港出版社)以及Sanger，F.等(1977年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467，其内容通过引用并入本文)来进行。通过将克隆核酸的序列与基因和cDNA的公开序列进行比较，根据测序的区域，技术人员将能够很容易地确定。基因序列信息的一种来源是美国马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院国家医学图书馆国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information,National Library of Medicine,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD)。

分离的DNA可以可操作地连接至控制序列或置于表达载体中，然后将其转染入原本不产生重组目的蛋白的宿主细胞中，以指导重组宿主细胞中蛋白质合成。免疫球蛋白和其他蛋白质的重组产生是本领域公知的。

当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，则为核酸可操作地连接。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其可操作地连接至该多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导的情况下，被连接的DNA序列是连续的并且处于阅读阶段。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点连接来完成连接。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子(adaptor)或接头。

许多载体是本领域已知的。载体组件可包括以下中的一种以上：信号序列(例如，可以指导表达的蛋白质的分泌；复制起点；一个以上选择性标记基因(例如，可以赋予抗生素或其他抗药性、补体营养缺陷型或提供培养基中无法获得的关键营养素)、增强子元件、启动子和转录终止序列，这些都是本领域公知的。

水和其他成分的纯度。优选地，本发明中使用的水和所有其他成分的纯度满足目标管辖区域内此类药物组合物和药物所需的适用法律或药典标准，例如美国药典(USP)、欧洲药典、日本药典或中国药典等。例如，根据USP，注射用水在生产必须控制产品内毒素含量的肠胃外制剂和其他制剂以及其他药物应用(某些设备和非肠道产品接触部件的清洁)中用作赋形剂；并且用于生产注射用水的源水或给水的最低质量是由美国环境保护署(EPA)、欧盟、日本或WHO定义的饮用水。

在向患者给药之前，治疗性重组目的蛋白在无菌性、不含内毒素或病毒污染物等方面应满足目标司法辖区中药物组合物和药物所需的适用法律或药典标准。

缓冲体系

本发明方法中用于从污染物中纯化经糖基化的重组目的蛋白的缓冲液可包括浓度为约5至100mM的缓冲液。用于实施本发明方法的合适的缓冲系统可选自：磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、TRIS缓冲液、BIS-TRIS缓冲液、组氨酸缓冲液、精氨酸缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、谷氨酸缓冲液和乳酸缓冲液，或者缓冲液可是这些缓冲液系统中两个以上的组合。本发明的一些有用的实施方式的缓冲液浓度为约5mM至约20mM，而其他实施方式的缓冲液浓度为约5至约10mM。

可选地，所使用的缓冲液可包含浓度为约0.001(w/v)至约0.1％(w/v)的非离子表面活性剂。有用的非离子表面活性剂可为：聚山梨酯20、聚山梨酯80、35(即聚乙二醇十二烷基醚)、泊洛沙姆188(即普朗尼克F68；聚乙烯-聚丙二醇；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；聚(环氧乙烷-共聚环氧丙烷))或Triton^TM X-100(即4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)。为了实施本发明的目的，“非离子表面活性剂”中还包括烷基糖或烷基糖苷(例如，由Aegis Therapeutics，LLC以商品名出售；参见，例如，Maggio，StabilizingAlkylglycoside Compositions And Methods Thereof(稳定的烷基糖苷组合物及其方法)，US 8,133,863 B2)。

电解质

本发明的从污染物中纯化经糖基化的重组目的蛋白的方法包括步骤：在低电导率缓冲液(pH 5.0至pH 5.5)中，使洗脱合并液中的POI结合到阳离子交换基质，该洗脱合并液由从蛋白A基质洗脱POI而产生。这通常是电导率为约2mS至15mS的缓冲液。可选地，在使来自蛋白A基质的洗脱合并液中的POI结合到阳离子交换基质之前，可对洗脱合并液进行硅藻土深度过滤。优选地，用于可选的深度过滤步骤中的硅藻土在使用之前通过用约0.1M至约1M柠檬酸盐的柠檬酸盐缓冲液(约pH 4至约pH 6的缓冲液)冲洗来进行预处理。此种柠檬酸盐预处理缓冲液冲洗液可以从待用于可选的深度过滤的硅藻土中显著除去一些附着的金属阳离子。

在结合至阳离子交换基质之后，然后用电导率递增(最高为约40mS至100mS)的电解质浓度梯度(线性或阶梯梯度)，将POI从阳离子交换基质中洗脱到CEX洗脱合并液中。因此，用于CEX洗脱的合适的梯度范围的电导率为2mS至100mS。取决于具体的POI，有效梯度范围可为2mS至70mS，例如，用于纯化阿柏西普的有用梯度范围在约15mS至约66mS的范围内增加缓冲液的电导率。用于调节电导率的有用电解质包括氯化钠、氯化钾和硫酸钠。

本发明方法的下一步是：在pH 5.0至6.0的高电导率缓冲液中，将CEX洗脱合并液上样到疏水相互作用色谱(HIC)基质上，并(用几个体积的高电导率缓冲液，例如通常用三个以上的柱体积)洗涤HIC基质。用于HIC上样的高电导率缓冲液的电导率通常为约40mS至100mS。HIC洗涤缓冲液可为与HIC上样的高电导率缓冲液相同的缓冲液或不同的缓冲液，但应具有相同或更高的电导率，且pH值为5.0至6.0。调节电导率的有用电解质包括氯化钠、氯化钾和硫酸钠。

本发明的示例性实施方式

通过进一步的说明，本发明涵盖以下编号的实施方式：

实施方式1：一种从污染物中纯化经糖基化的重组目的蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在约中性pH下，将宿主细胞培养上清液或滤液上样到蛋白A基质上，所述宿主细胞培养上清液或滤液包含经糖基化的重组目的蛋白(POI)和半乳糖凝集素宿主细胞蛋白(HCP)污染物，其中，POI包含免疫球蛋白Fc结构域的C_H2结构域和C_H3结构域和一个以上末端β-半乳糖残基，半乳糖凝集素-3污染物可逆地结合到所述末端β-半乳糖残基；

(ii)可选地，将洗脱合并液在pH 3.3至3.7保持足以灭活病毒的一段时间；

(d)在pH为5.0至5.5的约2mS至15mS的低电导率缓冲液中，使来自(c)的洗脱合并液中的POI结合到阳离子交换基质；

(f)在pH 5.0至6.0的高电导率缓冲液中，将CEX洗脱合并液上样到疏水相互作用色谱(HIC)基质上，并洗涤HIC基质，

由此将POI与半乳糖凝集素HCP污染物分离。

实施方式2：实施方式1的方法，其中，在(b)中，用包含2M至2.7M氯化钙的缓冲液，洗涤结合有POI的蛋白A基质。

实施方式3：实施方式1-2的方法，其中，POI选自：阿柏西普、阿法西普、依那西普、阿巴西普、贝拉西普、rFVIIIFc、rFIXFc和利纳西普。

实施方式4：实施方式1-3的方法，其中，POI是阿柏西普。

实施方式5：实施方式1-4的方法，其中，半乳糖凝集素HCP污染物是半乳糖凝集素-3。

实施方式6：实施方式1-5的方法，其中，宿主细胞培养上清液或滤液还包含金属阳离子污染物，并且，POI也与金属阳离子污染物分离。

实施方式7：实施方式1-6的方法，其中，金属阳离子污染物选自：铝阳离子、钡阳离子、钙阳离子、钴阳离子、铜阳离子、锌阳离子、铁阳离子、镁阳离子、锰阳离子、汞阳离子、镍阳离子和锶阳离子。

实施方式8：实施方式1-7的方法，其中，金属阳离子污染物是铁阳离子。

实施方式9：实施方式1-8的方法，该方法进一步包括：在使来自(c)的洗脱合并液中的POI结合至阳离子交换基质之前，对洗脱合并液进行包括通过硅藻土过滤的深度过滤。

实施方式10：实施方式1-9的方法，其中，硅藻土用柠檬酸盐缓冲液预处理。

以下工作实施例是说明性的，而不以任何方式解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：材料和方法

由于POI并非用于对患者的最终施用，因此本文所述的所有实验中使用的水均使用Integral净水系统(Merck)进行净化。

CHO半乳糖凝集素去除研究：

高通量筛选(“HTS”)。使用Tecan Freedom全自动化液体处理系统(TecanUS，Research Triangle Park,NC,美国)进行HTS下游研究。全自动化液体处理系统配置有Te-Chrom组件，以促进自动化微色谱。在集成的酶标仪上进行浓度和浊度的测量。树脂以预装450μL购自Atoll(Weingarten，德国)；根据实验，八个此类色谱柱可在“结合-洗脱”(BEM)模式或“流穿”(FT)模式下并行运行。

蛋白A色谱。使用含有MabSelect蛋白A树脂(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)的以BEM模式进行HTS蛋白A洗涤筛选研究。用平衡缓冲液(25mMTris，100mM NaCl，pH 7.4)平衡色谱柱，然后将收获的细胞培养液上样到色谱柱中直至每升树脂约10g。上样后，用平衡缓冲液(“EQ”)进行3个柱体积(“CV”)的平衡洗涤步骤。然后各个色谱柱用以下洗涤缓冲液中的一种洗涤，以进行实验比较：

25mM Tris，480mM乳糖pH 7.3；

25mM MES，2M CaCl₂ pH 6.0；

25mM MES，2M CaCl₂ pH 6.5；

25mM Tris，2M CaCl₂ pH 7.0；

25mM MES，750mM精氨酸pH 6.0；

25mM MES，750mM精氨酸pH 6.5；或

25mM Tris，750mM精氨酸pH 7.0。

第二个实验是使用两种条件洗涤，将用25mM MES(pH 6)缓冲的浓度增加的氯化钙(0.25M至2.63M)用于4个柱体积。然后用2个柱体积的EQ进行第三次洗涤。用4个柱体积的25mM柠檬酸盐(pH 3.6)将色谱柱洗脱到96深孔板(Qiagen Sciences，Germantown，Maryland，美国)中。随后的洗脱合并液用2M Tris碱中和至pH 5。使用制造商推荐的方案和CHO半乳糖凝集素-3蛋白质标准品，通过分析性蛋白A HPLC和半乳糖凝集素-3ELISA(R&D系统，Minneapolis，MN，美国)，测量每根色谱柱的洗脱合并液的产物浓度。

CEX色谱。使用含有SO₃ ^-或COO^-(EMD Millipore，Billerica，MA，USA)的进行HTS NaCl洗脱梯度筛选，并以20cm/hr的速度运行。上样前，将CEX色谱柱平衡至目标pH(pH 4.5至pH 6.0)和电导率(约3mS/cm至8mS/cm)。平衡后，色谱柱上样15g/L至30g/L的树脂。在用平衡缓冲液洗涤的步骤之后，用氯化钠梯度逐步洗脱色谱柱。将洗脱馏分(1CV/馏分)收集到96深孔板(Qiagen Sciences，Germantown，Maryland，美国)中进行进一步分析，包括：使用制造商推荐的方案，通过280nm吸光度(A280)进行产品浓度分析和通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行纯度分析、半乳糖凝集素-3特异性ELISA和CHO宿主细胞蛋白(HCP)特异性ELISA(Cygnus，Southport，NC)。使用单个馏分的结果生成伪色谱图。使用各个馏分的累积结果计算产率和质量平衡。

使用100或100(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，美国)液相色谱系统进行实验室规模的(bench scale)色谱实验。将SO₃ ^-(EMD Millipore，Billerica，MA，美国)和COO^-树脂填充到1.15cm ID或3.2cmID Vantage色谱柱(EMD Millipore，Billerica，MA，美国)中，床高为约15厘米至20厘米。以140cm/hr至180cm/hr运行。上样前，用乙酸钠缓冲液以约6mS/cm的电导率将CEX柱平衡至pH5.0或pH 5.5。然后用中和的蛋白A洗脱合并液上样色谱柱至约20g/L至30g/L树脂，用平衡缓冲液洗涤，并用线性NaCl梯度洗脱，以每柱体积(CV)增加50mM NaCl来增加NaCl浓度，进行10CV至20CV。在色谱运行期间，监测色谱柱流出物的pH、电导率和吸光度。在洗脱阶段，收集馏分并通过A280、SEC、CHO HCP特异性ELISA和半凝集素3特异性ELISA测量产物浓度。由单个馏分计算合并液回收产率和纯度。

HIC色谱。使用充有Butyl 650M(Tosoh，King of Prussia，PA，美国)和Fast Flow High Sub(GE Healthcare，Piscataway，NJ，美国)的进行HTS NaCl梯度筛选。将用NaCl调节的中和后的蛋白A合并液上样到色谱柱至每升树脂25g产品(g/Lr)。以逐步的方式从高盐浓度到低盐浓度进行洗脱盐梯度。筛选的缓冲液/盐条件包括：乙酸钠/NaCl、MES钠/NaCl、乙酸钠/硫酸钠、柠檬酸钠和磷酸钠。所有步骤以20cm/hr进行。(通过A280和SEC)和半乳糖凝集素-3特异性ELISA，对流穿馏分和洗脱馏分的蛋白质浓度进行分析。

使用充有Butyl 650M的进行HTS HIC产物流穿液筛选，运行速度为20cm/小时。上样为中和的蛋白A洗脱合并液材料，并以1CV的增量应用于色谱柱直至70-125g/L树脂。还以1CV的增量进行6CV至9CV的洗涤体积。收集馏分，通过光谱学分析蛋白质浓度(A280)，通过半乳糖凝集素-3特异性ELISA进行分析。

在100(GE Healthcare Life Sciences)上以180cm/小时进行实验室规模运行，将Butyl 650M树脂填充到L色谱柱中，尺寸范围为内径(ID)1.15cm、床高25cm至内径3.2cm、床高25cm。色谱柱上样量为100g/Lr至125g/Lr。流穿的产物合并液作为馏分收集，或者根据UV吸光度进行收集。通过A280、SEC、CHO HCP特异性ELISA和半乳糖凝集素-3特异性ELISA，分析馏分或流穿洗液/产物合并液样品的蛋白质浓度。

铁去除研究：

蛋白A色谱。使用充有MabSelect蛋白A的以45cm/小时的速度，进行HTS蛋白A洗涤筛选。将色谱柱上样至12g/Lr，然后用3CV的EQ洗涤，然后在第二次洗涤(洗涤2)中用4CV的不同缓冲液条件洗涤。所筛选的洗涤2缓冲液包括以下条件：

50mM柠檬酸钠，pH 6.0；

50mM柠檬酸钠，pH 7.0；

200mM柠檬酸钠，pH 200；

200mM柠檬酸钠，pH 7.0；

125mM Tris，500mM NaCl，pH 7.4；

25mM Tris，100mM NaCl，pH 7.4；

25mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 7.0；或

25M Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.0。

洗涤2之后，使用另外的3CV平衡缓冲液。如上所述，对洗涤2和洗脱馏分的蛋白质浓度进行分析。还由布鲁克斯分析实验室(Brooks Analytical Laboratory)(Bothell，WA，美国)使用常规的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定分析这些馏分的铁水平。

实验室规模的蛋白A、低pH病毒灭活(“VI”)和CEX实验。先导蛋白A洗涤2条件是在1.15cm ID、25cm柱高、装填MabSelect蛋白A的Aktapurifier 100上以250cm/小时以实验室规模运行。该色谱柱上样有收获的细胞培养液(HCCF)至19g/L树脂。将洗涤缓冲液的体积减少至：洗涤1：2CV的EQ；3CV的洗涤2；和洗涤3：3CV的EQ。比较两种不同的洗涤2条件：EQ缓冲液(25mM Tris，100mM NaCl，pH 7.4)和500mM柠檬酸钠(pH 5.5)。还比较了pH均为3.6的100mM乙酸钠和25mM柠檬酸钠的洗脱缓冲液。洗脱合并液分为两个等分试样。使用2M柠檬酸，将1个等分试样滴定至较低的pH 3.5，保持60分钟以模拟低pH值病毒灭活(VI)操作，并用2M Tris碱中和至pH 5.0。第二个等分试样仅用2M Tris碱中和至pH 5.0。

所得的四个产物合并液(即：具有和不具有低pH保持力的乙酸钠洗脱液和具有和不具有低pH保持力的柠檬酸钠洗脱液)使用装有COO^-的通过HT-CEX色谱法进行纯化。将色谱柱上样至20g/Lr，在100mM乙酸钠(pH 5.5)缓冲液中以40mMNaCl/CV的斜率逐步进行NaCl洗脱梯度。所有步骤均以20cm/小时的速度进行。合并馏分，通过A280分析蛋白质浓度。通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)分析所有步骤的样品中的铁。

实施例2：从阿柏西普中去除CHO半乳糖凝集素-3

蛋白A色谱洗涤筛选实验。使用含有2M CaCl₂或750mM精氨酸缓冲液的缓冲液作为“洗涤2”进行HTS筛选实验，以测定它们是否可破坏CHO半乳糖凝集素-3与阿柏西普之间的相互作用。实验在Tecan液体处理器上使用八(8)个装有MabSelect蛋白A的进行。使用平衡缓冲液(“EQ”，25mM Tris，100mM NaCl，pH 7.4)进行色谱柱平衡、上样后的洗涤1和洗涤3。使用25mM柠檬酸盐、pH 3.6进行洗脱，用2M Tris碱将所有合并液中和至pH5.0。将收获的含有阿柏西普的细胞培养液用于上样，并且所有柱子均上样相同的产物质量。对于洗涤2，480mM乳糖用作阳性对照，因为乳糖含有可以竞争性结合半乳糖凝集素-3的β-半乳糖部分。平衡缓冲液(EQ，25mM Tris，100mM NaCl，pH 7.4)用作洗涤2阴性对照。与EQ相比，含乳糖的缓冲液能够去除2log的半乳糖凝集素-3(下表1)。2M CaCl₂洗涤比EQ多去除了1log的半乳糖凝集素-3，在pH 6.0和pH 6.5时未观察到明显的产物损失。pH 7.0的2MCaCl₂洗涤去除了大量的产物，表明此pH值对于这种特定产物并不理想。与EQ相比，精氨酸洗涤去除了少量的多于0.5log的半乳糖凝集素-3，在pH 6.0和pH 6.5的洗涤过程中观察到显著产率损失，但在pH 7.0未观察到显著产率损失。

表1：初始蛋白A洗涤2筛选的结果。HCCF＝收获的细胞培养液；NA＝不适用；EQ＝平衡缓冲液，即25mM Tris，100mM NaCl，pH 7.4。

使用装有MabSelect蛋白A的如上所述进行第二轮实验，以评估可期望有效去除半乳糖凝集素-3的氯化钙范围。测试了0.25M至2.63M的洗涤2CaCl₂浓度，用20mM MES在pH 6.0下缓冲。EQ用作阴性对照。结果显示于下表2。相对于对照条件，直至2.40M CaCl₂，蛋白A步骤产率一致。在更高的CaCl₂浓度下，观察到步骤产率的降低，这很可能对研究所用的产品(阿柏西普)具有特定性，而用其他分子不一定会观察到。与收获的细胞培养液(HCCF)相比，与步骤产率无关，在测试条件下，半乳糖凝集素-3清除率很高。当与未用CaCl₂洗涤的蛋白A洗脱合并液中的半乳糖凝集素-3浓度相比，0.25M CaCl₂溶液未除去半乳糖凝集素-3，而0.5M CaCl₂溶液仅除去了4％的半乳糖凝集素-3。在1.0M CaCl₂下，半乳糖凝集素-3的额外去除率适中(24％)。在2.0M至2.63M CaCl₂下，观察到额外42％至52％的半乳糖凝集素-3去除。用此种经糖基化的重组蛋白分子观察到：与对照相比，通过使用浓度≥1.0M的CaCl₂洗涤，可实现额外的半乳糖凝集素-3去除。在这个实验中还观察到，有效的半乳糖凝集素-3去除发生在高达2.63M CaCl₂下。从这些实验结果中，可以预期甚至更高浓度的CaCl₂(受氯化钙的溶解度限制)可以有效地去除半乳糖凝集素-3。同样，取决于半乳糖凝集素-3和POI之间的相互作用，更低的CaCl₂浓度可能对于其他糖基化重组蛋白产品有用。在实施本发明的方法时，合适CaCl₂浓度的选择涉及到目的蛋白的步骤产率与半乳糖凝集素清除的理想平衡。

表2：蛋白A洗涤2CaCl₂筛选研究的结果。NA＝不适用。

CEX色谱筛选实验。用CEX树脂进行的初步实验在实验室规模下进行，以确定充分去除聚集产物和CHO宿主细胞蛋白(包括特定蛋白半乳糖凝集素-3)同时保持高回产率的操作条件。使用SO₃ ^-用10CV NaCl洗脱梯度进行的筛选研究表明，可实现高产率，但是高分子量(HMW)物种仅适度(<20％)降低，产率约为90％。图1显示了二聚体、寡聚体和总HMW叠加的CEX色谱图。图2显示了计算的洗脱合并液纯度和总洗脱合并液HMW含量叠加的CEX色谱图。

为了确定此CEX运行是否也可去除半乳糖凝集素-3，使用基于肽图谱的多属性方法(“MAM”；Rogers，R.等，Development of a quantitative mass spectrometry multi-attribute method for characterization,quality control testing and dispositionof biologics(表征、质量控制测试和生物制剂处理的定量质谱多属性方法的发展)，mAbs，7(5)：881-890(2015))寻找和定量洗脱馏分中半乳糖凝集素-3的水平(下表3)。此外，表3显示了通过Cygnus HCP ELISA测量的CHO宿主细胞蛋白的总浓度。图3显示了各种NaCl洗脱梯度馏分中半乳糖凝集素-3、总体宿主细胞蛋白(HCP)和目标产物的比较。

对从SO₃ ^-柱洗脱的单个馏分的分析表明，有少量HCP和半乳糖凝集素-3与POI共洗脱。但是，POI洗脱>80％后，总HCP和半乳糖凝集素-3的洗脱量均急剧增加。这表明Fractogel SO₃ ^-可从产物中分离出大量的半乳糖凝集素-3，同时保持较高的产品回产率。此外，半乳糖凝集素-3的洗脱趋势与总HCP的洗脱趋势相似，这意味着在产品上样液中观察到的大部分HCP是半乳糖凝集素-3。这进一步表明，通过Cygnus HCP ELISA检测到的宿主细胞蛋白(HCP)去除是半乳糖凝集素-3去除的良好指示。

基于所观察到的SO₃ ^-可以提供一些半乳糖凝集素-3去除，HTS被用于筛选CEX操作条件以改善半乳糖凝集素-3的去除。在这些研究中，使用Tecan液体处理系统在上分别以pH 4.5、5.0、5.5和6.0筛选了强阳离子交换剂和弱阳离子交换剂(SO₃ ^-和COO^-)。色谱柱上样至30g/L树脂，并用以超过20CV的50mM/CV的NaCl梯度逐步洗脱。收集洗脱梯度的馏分，通过ELISA测定产物浓度和半乳糖凝集素-3浓度(图4A-D和图5A-D)。

比较POI和半乳糖凝集素-3在SO₃ ^-和COO^-上的相对滞留，发现：在较低pH值下，半乳糖凝集素-3在POI洗脱峰的尾部洗脱。当COO^-的pH升至5.0，SO₃ ^-的pH升至5.5，半乳糖凝集素-3的洗脱移至梯度中更靠前的部分，从而与POI洗脱峰重叠。对于COO^-，在pH 4.5梯度，半乳糖凝集素-3与POI显示出一些分离，但与SO₃ ^-相比，该分离是适度的。

通过尺寸排阻色谱法测定的产物回产率与产物单体百分比的比较显示于图6。通过ELISA测定的产物回产率与半乳糖凝集素-3去除的比较显示于图7。

表3：CEX洗脱梯度单个馏分中的半乳糖凝集素-3和CHO HCP总浓度。HCP＝宿主细胞蛋白；NA＝不适用；NT＝未检测；MAM＝质谱多属性方法(参见，Rogers，R.等，mAbs，7(5)：881-890(2015))

在这些实验期间，还通过SEC监测了高分子量(HMW)物质的整体去除，并发现：两种树脂均可以在宽范围的操作条件下实现高产率和高产物纯度。不出所料，随着步骤产率接近100％，产品纯度降低，尽管在所有条件下纯度都大于98％。

还使用统计软件包(JMP，SAS，版本12.1.0，2015年)对步骤产率、半乳糖凝集素-3去除和CEX合并液HMW含量进行回归分析，以生成预测模型用于定义方法设定点。通过SEC的产率、半乳糖凝集素-3浓度和纯度的等高线图显示于图8A-C(SO₃ ^-)和图9A-C(COO^-)。上样样品中的HMW和半乳糖凝集素-3浓度分别为1.2％和13.8ng/mg。

不出所料，当pH或洗脱NaCl强度增加时，强阳离子交换剂和弱阳离子交换剂的步骤产率都增加。此外，在所有测试条件范围内，使用SEC的纯度均很高。对于两种测试的树脂，通过降低pH值均可提高半乳糖凝集素-3的去除率。对于COO^-，半乳糖凝集素-3的最佳去除效果在pH 4.5下，但在pH≥5.0下操作范围小、有极少量去除。SO₃ ^-具有更大的半乳糖凝集素-3去除操作范围，在pH 4.5至pH 5.5观察到清除。SO₃ ^-的最佳操作pH显示在pH 5.0左右，以最大程度地去除半乳糖凝集素-3，同时避免在低pH下操作CEX。

使用SO₃ ^-色谱柱在pH 5.0下以实验室规模证实了CEX筛选的半乳糖凝集素-3去除结果。实验室规模的色谱柱的CEX方法与类似，并采用pH 5.0的乙酸钠缓冲液中的0M到1M NaCl的20CV洗脱梯度。梯度洗脱的结果如图10所示。上样材料通过质谱多属性方法(“MAM”，Rogers等，Development of a quantitativemass spectrometry multi-attribute method for characterization,quality controltesting and disposition of biologics(表征、质量控制测试和生物制剂处理的定量质谱多属性方法的发展)，mAbs，7(5)：881-890(2015))测得含有57.5ng/mg半乳糖凝集素-3，通过ELISA测得含有5.6mg/mg半乳糖凝集素-3。当梯度超过约500mM钠时，洗脱峰的尾端富含半乳糖凝集素-3，而峰的主要部分显示一部分半乳糖凝集素-3去除。可通过增加洗脱结束时收集的峰的百分比，进一步控制CEX合并液中半乳糖凝集素-3的水平。

HIC色谱筛选。使用进行的HTS筛选用于评估两种HIC树脂的半乳糖凝集素-3去除：PhenylHi-Sub和Butyl 650M。用pH 5.0的乙酸钠缓冲液和NaCl或硫酸钠、pH 6.0的MES缓冲液和NaCl或硫酸钠、pH 5.0和6.0的柠檬酸钠以及pH6.0和7.0的磷酸钠，以结合-洗脱模式筛选这些树脂。蛋白A纯化的阿柏西普的上样材料通过ELISA测得含有18ng/mg半乳糖凝集素-3，并上样至25g/L树脂。使用从高盐到低盐的盐梯度，洗脱结合的产物。通过半乳糖凝集素-3ELISA，分析流穿液、洗涤液和洗脱梯度峰的馏分。结果显示于图11A-H和图12A-H。在任何测试条件下，产品与两种HIC树脂均未紧密结合。但是，两种树脂均去除了一定水平的半乳糖凝集素-3。Butyl 650M对半乳糖凝集素-3的清除能力最强，几乎没有馏分包含可测得的半乳糖凝集素-3。

进行第二次筛选，以确定Butyl 650M(其具有最强的半乳糖凝集素-3去除能力)的最佳pH和盐操作范围。由于半乳糖凝集素-3显示比产物更牢固地结合到树脂上，以产物流穿模式进行此实验。在四个不同pH下评估两种不同的NaCl含量。对于pH 5.0和pH 5.5，乙酸钠用作缓冲液。对于pH 6.0和pH 6.5，MES钠用作缓冲液。将上样材料调节至与洗涤液具有相同的pH和盐含量，并在色谱柱中上样最高100g/L的树脂。收集流穿的馏分，分析表示上样水平不断增加的小型合并液中的半乳糖凝集素-3。此外，收集上样后的洗涤液并分两个馏分进行分析，在先馏分包含大部分产物洗脱液，在后馏分包含洗脱液的末尾部分。结果显示在下表4中。结果表明，较高的盐含量和较低的pH值最适用于Butyl 650M树脂去除半乳糖凝集素-3，在pH 5.0时显示完全清除率。半乳糖凝集素-3穿透(breakthrough)确实随上样水平升高而开始增加，但在上样量为100g/L树脂时，半乳凝素去除仍然显著，并且在上样后洗涤过程中，大多数或全部半乳凝素显示仍与色谱柱结合。

表4：使用Batyl 650M树脂的流穿筛选的馏分通过特异性ELISA确定的半乳糖凝集素-3水平。LOQ＝检测的定量限。

在实验室规模的Butyl 650M柱上证实了高通量流穿筛选的结果。色谱柱上样有用pH 5.0的400mM NaCl调节的CEX合并液。通过半乳糖凝集素-3ELISA，分析流穿的馏分(收集至125g/L树脂)和上样后的洗涤液(见下表5)。

表5：使用Batyl 650M树脂的实验室规模流穿馏分的通过特异性ELISA确定的半乳糖凝集素-3水平。LOQ＝检测的定量限。

实施例3：通过去除铁阳离子纯化重组蛋白

蛋白A色谱筛选。在Tecan液体处理器上使用八(8)个MabSelect蛋白A填充的色谱柱，进行洗涤2条件的高通量筛选以去除铁。色谱柱进行平衡并类似地用收获的含铁的细胞培养液(HCCF)上样，然后用平衡缓冲液(EQ：25mM Tris，100mM NaCl，pH 7.4)洗涤。然后用不同的二次洗涤液洗涤各个色谱柱，该二次洗涤液由已知的金属螯合化合物(例如柠檬酸盐和EDTA)组成，而EQ用作阴性对照。二次洗涤后进行EQ，使用低pH缓冲液洗脱产物。通过ICP-MS对洗脱合并液进行铁定量(图13)。所有洗脱合并液均含有显著量的铁，其中EQ条件的铁水平最高，而200mM柠檬酸盐洗涤2条件显示约200ppm的去除。EDTA洗涤2仅提供少量的去除。

进行第二次洗涤筛选，以确定洗涤2缓冲液中更高水平的柠檬酸盐是否可提供更多的铁去除。结果如图14所示。如通过ICP-MS所测定，柠檬酸盐含量的增加导致铁的去除明显增加。有趣的是，与pH 6.0相比，更低pH条件(pH 5.5)的铁去除率略有提高，表明更低的pH可改善柠檬酸盐对铁的螯合。

观察到柠檬酸盐和更低pH的联合作用，从而进行研究：比较在低pH洗脱步骤中使用柠檬酸盐和随后的低pH保持对于病毒灭活的益处(参见图15中的实验示意图)。用200mM柠檬酸盐洗涤液2或EQ洗涤液2，使用pH 3.6的25mM柠檬酸盐洗脱液进行两次实验室规模的蛋白A分析。将所得洗脱合并液的等分试样一分为二，每份洗脱合并液的一半用柠檬酸滴定至pH 3.5，保持1小时进行病毒灭活，而另一半则中和至pH 5.0。随后的所有四个合并液均在CEX上运行，以去除产品中已螯合的任何铁。使用EQ洗涤2和乙酸钠洗脱液，将CEX合并液与对照CEX合并液一起进行ICP-MS分析(参见图16)。结果表明，柠檬酸盐洗脱液的添加显著减少了结合至产物的铁的量。此外，柠檬酸盐洗涤、洗脱和低pH病毒灭活的组合使得铁被去除至检测限以下。

接下来，将高铁合并液(EQ洗涤液2、乙酸盐洗脱液和无低pH VI)和低铁合并液(柠檬酸盐洗涤液2、柠檬酸盐洗脱和柠檬酸低pH VI)的样品置于加速稳定性下，以确定铁的存在是否会影响产品的稳定性。样品配制成浓度40g/L、10mM磷酸盐、40mM NaCl、5％(w/v)蔗糖和0.03％PS-20并保存在30℃。每两周取一个时间点，通过分析SEC检测高分子量(HMW)物种。数据显示于图17。与低铁样品相比，高铁样品的HMW增加率更高，并且颜色也呈棕色(参见图18)。高铁样品的颜色等同于棕色/黄色4标准(BY4)，而低铁样品的颜色介于棕色/黄色5和6标准(BY5和BY6)之间。

实施例4：通过下游方法去除半乳糖凝集素和金属阳离子

通过三柱下游方法(three column downstream process)，评价了通过从重组阿柏西普中除去CHO半乳糖凝集素-3和铁阳离子来纯化糖基化重组阿柏西普的方法，该下游方法在本发明的示例性实施方式中结合了以上概述的几种技术。流程示意图如图19所示。

如以上实施例1中所述以实验室规模进行色谱运行，并且将色谱柱上样至容量：蛋白A为19g/L树脂，CEX为30g/L树脂，以及HIC为100g/L树脂。对于半乳糖凝集素-3的去除，该方法包括：蛋白A步骤的2M CaCl₂洗涤2、使用SO₃ ^-树脂的pH 5.0的CEX色谱和Butyl 650M树脂的HIC步骤。对于铁的去除，该方法包括：蛋白A的25mM柠檬酸盐洗脱和用于病毒灭活的柠檬酸滴定，以从产物中螯合铁。然后通过CEX步骤除去螯合的铁。

结果表明，通过该方法有效地除去了半乳糖凝集素-3：从收获的细胞培养液(HCCF)中的>667ppm至HIC合并液中的无法检测水平(参见下表6)。HIC步骤最有效，但蛋白A和CEX步骤也作出显著贡献。铁也被有效地去除：从HCCF中的1022ppb至CEX合并液中的5ppb。

蛋白A/VI和CEX步骤的组合有助于铁的去除。这些数据表明，上述方法的步骤可显著去除半乳糖凝集素-3和铁阳离子杂质。

表6：产物合并液中的CHO半乳糖凝集素-3水平和铁水平，该产物合并液由开发的除去这些污染物的本发明的三柱方法的实施方式纯化。VI＝病毒灭活。

*蛋白A流穿馏分中半乳糖凝集素-3的水平。

实施例5：在方法中消除其他金属阳离子污染物来源

水和缓冲液样品的金属分析。为了了解方法中铁和其他金属污染物的潜在来源，如上所述，通过ICP-MS对水和缓冲液样品中的铁、铜和锌进行评估。结果分别显示于图20、图21和图22。水样品中3种金属含量非常低至无法检测到，而2M柠檬酸和500mM柠檬酸盐缓冲液则显示出显著的铁污染水平，以及一些铜和锌。柠檬酸盐缓冲液中的铁含量高于柠檬酸，这表明柠檬酸钠成分可能比酸形式具有更多金属污染。由于柠檬酸盐是金属螯合剂，在制造这些化学品时可能会发生金属污染。

硅藻土深度过滤器中的金属污染。为了确定硅藻土(DE)深度过滤器是否可能是金属阳离子污染来源，我们使用0.0023cm² Millipore A1HC深度过滤器进行了过滤器冲洗研究。过滤器用水以30L/m²冲洗，然后用500mM的柠檬酸盐(pH 5.5)以>100L/m²冲洗。各个冲洗期间收集四个至五个4mL滤液的馏分，通过ICP-MS分析铁、铜和锌。结果分别显示于图23、图24和图25。用水冲洗后，一些铁、铜和锌阳离子从过滤器中洗脱出来，这些金属的含量在10L/m²的水冲洗通过过滤器后恢复到基线。随后用0.5M柠檬酸盐(pH 5.5)冲洗过滤器，使得另外三种金属都被洗脱，包括高水平的铁(>6000μg/L)。这些数据表明，柠檬酸盐缓冲液可能会螯合过滤器中的其他金属阳离子。在约50L/m²的缓冲液后，金属水平恢复到基线(即缓冲液中存在的金属水平)。这些结果表明，DE可以是金属阳离子(包括铁)污染的重要来源，这种情况可能会由于使用含柠檬酸盐的洗脱缓冲液或使用柠檬酸进行病毒灭活而在蛋白A合并液中存在的柠檬酸盐而加剧。

使用不同的蛋白A洗脱缓冲液和深度过滤器冲洗缓冲液评估铁、铜和锌阳离子的去除。我们使用一连串的三个步骤评估了本发明的方法从目的蛋白质中去除铁、铜和锌阳离子的能力，三个步骤如下：蛋白A色谱、使用A1HC深度过滤器的深度过滤和CEX色谱(图26)。作为实验的一部分，我们测试了两种不同的蛋白A洗脱缓冲液：100mM乙酸盐(pH 3.6)和25mM柠檬酸盐(pH 3.6)以及两种不同深度过滤器冲洗缓冲液、单独的平衡(EQ)缓冲液(100mM乙酸盐，pH 5.0)和500mM柠檬酸盐(pH 5.5)，然后进行EQ冲洗对金属去除的影响。使用ICP-MS，对蛋白A洗脱合并液(“ProA合并液”)、经过深度过滤的蛋白A洗脱合并液(“深度过滤合并液”)和CEX洗脱合并液(“CEX合并液”)中的铁、铜和锌阳离子水平进行定量；结果分别显示于图27、图28和图29中。

与25mM柠檬酸盐缓冲液洗脱相比，使用100mM乙酸盐缓冲液进行蛋白A洗脱使得蛋白A洗脱合并液中铁和锌阳离子的水平较低，而铜的水平低且未改变。当合并液经深度过滤器过滤后，在所有情况下铁的含量均增加，这可能是由于过滤器中的铁阳离子污染所致。通过用500mM柠檬酸盐缓冲液进行预冲洗来对深度过滤器进行的预处理降低了深度过滤合并液中的铁水平，并且与100mM乙酸盐蛋白A洗脱缓冲液相结合的条件可进一步减少铁阳离子的含量。在所有深度过滤条件下，铜和锌阳离子均保持较低水平。

通过CEX色谱法对深度过滤合并液中的POI进行纯化，除去了大量的铁阳离子，其中所有条件下均含有约1ppm的铁。对于锌阳离子和铜阳离子，所有条件都具有与深度过滤池中观察到的相似的低水平(1ppm至2ppm)。综上所述，这些数据表明，将100mM乙酸盐蛋白A洗脱缓冲液的使用与柠檬酸盐缓冲液深度过滤器预处理冲洗相结合，可以显著减少在深度过滤合并液阶段的纯化过程中的铁阳离子污染。在蛋白A洗脱合并液阶段，通过乙酸盐缓冲液蛋白A洗脱降低了锌阳离子水平，而在所有条件下铜阳离子含量均保持较低且相对不受影响。

序列表

<110> 济世易为生物有限公司（Just-Evotec Biologics, Inc.）

<120> 从宿主细胞半乳糖凝集素和其他污染物中纯化糖基化蛋白的方法

<130> JUST0381

<140>

<141>

<150> 62/546,558

<151> 2017-08-17

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 431

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> 来源

<223> /注意="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 1

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

165 170 175

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr

195 200 205

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

210 215 220

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

225 230 235 240

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

245 250 255

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

260 265 270

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

275 280 285

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

290 295 300

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

305 310 315 320

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

325 330 335

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

355 360 365

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

370 375 380

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

385 390 395 400

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

405 410 415

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

420 425 430

Claims

1.一种从污染物中纯化经糖基化的重组目的蛋白的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(a)在中性pH下，将宿主细胞培养上清液或滤液上样到蛋白A基质上，所述宿主细胞培养上清液或滤液包含经糖基化的重组目的蛋白POI和半乳糖凝集素-3污染物，其中，POI包含免疫球蛋白Fc结构域的C_H2结构域和C_H3结构域和一个以上末端β-半乳糖残基，半乳糖凝集素-3污染物可逆地结合到所述末端β-半乳糖残基；

(b)用pH为6.0至6.5的包含1M至3M氯化钙的缓冲液，洗涤结合有POI的蛋白A基质；

(c)用pH低于4的包含柠檬酸或柠檬酸盐的缓冲液，将POI从蛋白A基质洗脱到洗脱合并液中，并且：

(d)在pH为5.0至5.5的2mS至15mS的低电导率缓冲液中，使来自(c)的洗脱合并液中的POI结合到CEX基质；

(e)用电导率递增的电解质浓度梯度，最高40mS至100mS，将POI从CEX基质洗脱到CEX洗脱合并液中；以及

(f)在pH 5.0至6.0的高电导率缓冲液中，将CEX洗脱合并液上样到疏水相互作用色谱HIC基质上，并洗涤HIC基质，

由此将POI与半乳糖凝集素-3污染物分离；用于HIC上样的高电导率缓冲液的电导率为40mS至100mS，用于HIC洗涤的高电导率缓冲液的电导率与用于HIC上样的高电导率缓冲液的电导率相同或更高。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在(b)中，用包含2M至2.7M氯化钙的缓冲液，洗涤结合有POI的蛋白A基质。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述POI选自：阿柏西普、阿法西普、依那西普、阿巴西普、贝拉西普、rFVIIIFc、rFIXFc和利纳西普。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述POI是阿柏西普。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主细胞培养上清液或滤液还包含金属阳离子污染物，所述POI也与金属阳离子污染物分离。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述金属阳离子污染物选自：铝阳离子、钡阳离子、钙阳离子、钴阳离子、铜阳离子、锌阳离子、铁阳离子、镁阳离子、锰阳离子、汞阳离子、镍阳离子和锶阳离子。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述金属阳离子污染物是铁阳离子。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括：在使来自(c)的洗脱合并液中的POI结合至CEX基质之前，对洗脱合并液进行包括通过硅藻土过滤的深度过滤。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述硅藻土用柠檬酸盐缓冲液预处理。