HK1202425B - 用於靶向递送至表达lfa-1的细胞的整联蛋白拮抗剂缀合物 - Google Patents

Description

用于靶向递送至表达LFA-1的细胞的整联蛋白拮抗剂缀合物

本发明涉及有效和选择性小分子整联蛋白拮抗剂的合成和反应，所述小分子整联蛋白拮抗剂包含适合的连接基和官能团，其用于与包含反应性亲核体例如硫氢基的化学反应，使得在缀合部分与靶向本体之间形成共价键。所述小分子靶向拮抗剂结合关连受体系统如LFA-1拮抗剂和/或双重LFA-1/MAC-1拮抗剂与ICAM-1受体。共价连接的部分包括小分子治疗剂、聚合物、肽类和寡核苷酸。包括用于形成5’-硫代-siRNA衍生物的5’-含硫寡核苷酸作为能够靶向递送所述siRNAs的方式。这种衍生的siRNA与适合的转染试剂结合有助于选择性地将siRNAs递送至表达这种整联蛋白受体的细胞，由此通过RNA干扰(RNAi)防止靶基因表达。

淋巴细胞功能相关抗原1、也称作LFA-1是在所有T-细胞中和还在B-细胞、巨噬细胞和中性白细胞上发现的整联蛋白，其涉及补充至感染部位。它结合抗原呈递细胞上的ICAM-1并且作为粘附分子起作用。ICAM-1(细胞间粘附分子1)、也称作CD54(分化簇54)是细胞表面糖蛋白。认为LFA-1/ICAM-1相互作用水平异常在炎性疾病和障碍中起作用且由此认为拮抗这种系统是疗法的方式。因此，使高亲和力小分子靶向至这些系统可以提供选择性地将治疗剂例如siRNA递送至表达ICAM-1受体的细胞系统的方式。

RNA干扰是众所周知的方法，其中通过联合或结合互补或部分互补寡核苷酸例如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)或反义寡核苷酸干扰将信使RNA(mRNA)翻译成蛋白质。siRNA是双链RNA分子，通常长度为19-25个核苷酸，其结合一组胞质中的蛋白质，称作RISC(RNA-诱导的沉默复合物)。RISC最终分离双链siRNA，使得一条链结合或联合mRNA分子的互补或部分互补部分，此后mRNA被RISC破坏，否则就是防止被翻译-由此抑制编码的蛋白质或基因产物表达。

在治疗应用(尤其是用于人体中的全身施用)中使用核酸例如siRNA的问题之一在于将核酸递送至：(1)特定靶组织或细胞类型；和(2)那些细胞的胞质(即其中存在mRNA且被翻译成蛋白质)。部分递送问题基于如下事实：核酸带负电荷且易于降解(尤其是如果未被修饰)，有效地被肾过滤，且不易于通过其自身转运至细胞的胞质。因此，大量研究集中于解决使用不同载体和制剂包括脂质体、胶束、肽类、聚合物、缀合物和适体解决递送问题。参见Ling等人，Advances in Systemic siRNA Delivery，Drugs Future34(9)：721(2009年9月)。一些更富有希望的递送媒介物涉及应用脂质系统，包括脂质纳米粒。参见Wu等人，Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery，AAPS J.11(4)：639-652(2009年12月)；Hope等人的国际专利申请公开号WO 2010/042877(“Improved Amino Lipids and MethodsFor the Delivery of Nucleic Acids”)。然而，持续需要进一步改进使siRNA以及其它物质例如小分子、肽类、其它核酸、荧光部分和聚合物靶向至特定靶细胞和这种细胞的胞质。

本发明涉及式I的化合物：

其中R1、R2和n如本说明书和权利要求中所定义。特别地，本发明涉及式I的化合物，其用于将缀合的部分例如小分子、肽类、核酸、荧光部分和聚合物改进地递送至表达整联蛋白α4β1(极晚期抗原-4)二聚体、αVβ3二聚体或淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)的靶细胞，以用于各种治疗和其它应用。本发明还涉及这类化合物的制备方法和使用方法。

附图简述

图1a：表1显示特定5’-衍生的siRNA单链和双链的组成。

图1b：表2显示小分子iRNA缀合物的分析数据。

图1c：表3显示siRNA序列，其中5’-反义链被Nu547衍生。

图1d：表4显示小分子-siRNA缀合物在整联蛋白拮抗剂测定和siRNAKD数据中的效力。

图1e：表5显示FITC异构体标记的试剂的鉴定、表征和结合效力。

图1f：显示直方图(“B”：双链体-27500nM和实施例14010μM；“A”：双链体-27)。

图2显示有代表性的siRNA摄取图像(双链体-27(500nM)。

图3显示具有与10μM实施例FITC-5(LFA-1拮抗剂-标记的FITC)缀合的FITC的Jurkat细胞的图像。

图4显示具有与10μM实施例FITC-14(VLA-4拮抗剂-标记的FITC)缀合的FITC的Jurkat细胞的图像。直方图表示在具有VLA-4靶向元件的siRNA双链体的存在下的移动。在VLA-4拮抗剂实施例140的存在下，这种移动是扁球状的。

图5显示当用siRNA双链体处理时H1299细胞中AHA1的表达减少，所述siRNA双链体已经被整联蛋白靶向小分子在5’-有义链上进行了衍生。y-轴表示所观察到的AHA1表达水平。较低的条表示更大程度的敲除(较高程度的siRNA转染)；条越高，则敲除程度越低(即较低程度的siRNA转染)。蓝色中的双链体在有义链的5’-端上具有靶向修饰；粉色中的那些在有义链的5’-端上具有靶向修饰；并且Nu547荧光团连接反义链的5’-端。

图6显示为细胞健康标记的GAPDH mRNA表达水平。用衍生的siRNA处理的那些细胞的表达水平与模拟和未处理的细胞的表达水平的类似性是在治疗浓度下和期间无细胞毒性的表示。

除非另有指示，否则下列本说明书和权利要求中使用的具体术语和措词如下文所定义：

术语“部分”是指通过一个或多个化学键连接另一个原子或分子的原子或化学键合的原子团，由此形成分子的组成部分。例如，式I的变量R1和R2是指通过如果存在的共价键连接式I中所示的结构的部分。

术语“缀合部分”是指这样的部分，其为治疗或有用的化合物、肽、聚合物、小分子、荧光部分、寡核苷酸或核酸。实例包括药物、治疗肽类、反义寡核苷酸、siRNA和异硫氰酸荧光素(FITC)。

除非另有描述，否则术语“氢”或“氢”是指氢原子部分(-H)，而不是H₂。

术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘的部分。

术语″烷基″是指具有1-25个碳原子的脂族直链或支链饱和烃部分。

术语“TFA”是指三氟乙酸。

除非另有指示，否则术语“通式的化合物”是指选自由该通式所定义的化合物种类的化合物(如果没有另外的注解，则包括任意这种化合物的任意药学可接受的盐或酯)。

术语“药学可接受的盐”是指保持游离碱或游离酸的生物有效性和特性的那些盐，其不是生物学或另外不期望的。盐可以使用无机酸和有机酸形成，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，优选盐酸，所述有机酸例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、水杨酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、N-乙酰半胱氨酸等。此外，可以通过将无机碱或有机碱添加到游离酸中制备盐。衍生自无机碱的盐包括、但不限于钠、钾、锂、铵、钙和镁的盐等。衍生自有机碱的盐包括、但不限于伯、仲和叔胺类的盐、取代的胺的盐，所述取代的胺包括天然存在的取代的胺类、环胺类和碱性离子交换树脂，例如异丙基胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙基胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂等。根据取代模式的不同，本发明的化合物也可以作为两性离子存在。

本发明的化合物可以以药学可接受的盐的形式存在。本发明的化合物还可以以药学可接受的酯类的形式存在(即式I的酸的甲酯和乙酯，用作前药)。本发明的化合物还可以被溶剂化，即水化。在制备方法过程中溶剂化可能受到影响或可以作为式I的最初无水化合物的吸湿性的结果发生(水化)。

具有相同分子式、但在其原子性质或键合顺序或其原子空间排列方面不同的化合物称作″异构体″。在其原子空间排列方面不同的异构体称作″立体异构体″。非对映异构体是在一个或多个手性中心上具有相反构象的非对映体的立体异构体。具有一个或多个不对称中心的彼此不具有可重叠镜像的立体异构体称作″对映体″。当化合物具有不对称中心时，例如，如果碳原子键合4个不同的基团，则对映体对是可能的。对映体的特征可以在于其不对称中心的绝对构型并且描述为Cahn，Ingold和Prelog的R-和S-顺位规则或通过这样一种方式描述，其中分子围绕偏振光平面旋转并且命名为右旋或左旋(即分别描述为(+)或(-)-异构体)。手性化合物可以作为各个对映体或其混合物存在。包含等比例对映体的混合物称作″外消旋混合物″。

术语“治疗有效量”是指有效预防、缓解或改善疾病症状或延长所治疗受试者存活的化合物用量。测定治疗有效量属于本领域技术人员的范围。本发明化合物的治疗有效量或剂量可以在宽限范围内改变且可以按照本领域公知的方式测定。可以根据每种具体情况中个体的需求调整这种剂量，包括所施用的具体化合物、施用途经、所治疗的病症、以及被治疗的患者。可以将每日剂量作为单剂量或分次剂量施用，或对于胃肠外施用，可以将其作为连续输注施用。

术语″药学可接受的载体″预以包括与药物施用相容的任意和所有材料，包括溶剂、分散介质、包衣衣料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延缓吸收剂和其它与药物施用相容的材料和化合物。除外任意与活性化合物不相容的常用介质或试剂，关注它们在本发明组合物中的用途。还可以将补充的活性化合物掺入组合物。

具体地，本发明涉及式I的化合物：

或其药学可接受的盐或酯类；其中n是1-24，且其中：

R1选自：

(1)下式的化合物：

(2)下式的化合物：

(3)下式的化合物：

其中Q是H或OH；

R2选自：

(1)下式的化合物：

(2)下式的化合物：

(3)下式的化合物：

(4)下式的化合物：

其中R3是缀合部分，且X表示硫或下式的化合物：

作为上述结构中使用的，符号用于表示其中结构或部分通过共价键与基础分子连接。此外，用于与上述符号组合的措词“-PEG”或“-S”或类似语言表示其中结构或部分连接基础分子或所述结构或部分如何连接基础分子，条件是存在多个连接点。例如，如果R2是下式的化合物：

其中X是下式的化合物：

则基于式I的结构可以为：

其中R1、R3和n如式I中所定义。

本发明还涉及式I的化合物的制备方法和使用方法以及包含这种化合物的药物组合物。式I的化合物用于改善小分子、蛋白质、核酸、聚合物、荧光标记和其它物质至表达ICAM-1受体的靶细胞的递送。在具体的实施方案中，本发明涉及包含式I的化合物的组合物和制剂，其用于将siRNA递送至表达ICAM-1受体的靶细胞胞质，以便通过RNA干扰抑制一些靶蛋白的表达。

在更具体的实施方案中，本发明涉及式I的化合物在有利于核酸例如siRNA递送至肿瘤细胞和其它细胞类型的表达ICAM-1受体的制剂中的用途。此外，式I的化合物在合成用于治疗炎症和增殖性障碍如癌症的递送制剂中的用途是本发明的组成部分。

R1表示使式I的化合物靶向至LFA-1整联蛋白的小分子整联蛋白拮抗剂，由此有利于其递送至表达这种受体的细胞。

在具体的实施方案中，R1的小分子整联蛋白拮抗剂靶向部分连接在这样一个位置上，使得小分子与整联蛋白的结合亲和力相对于游离小分子整联蛋白拮抗剂基本上未减小。式I的R1部分靶向ICAM-1受体(通过针对ICAM-1受体的LFA-1或双重LFA-1/MAC-1拮抗剂)。

在具体的实施方案中，R1是下式的LFA-1和/或双重LFA-1/MAC-1拮抗剂或ICAM-1受体靶向部分：

或其药学可接受的盐或酯。

在其它的实施方案中，R1是下式的LFA-1和/或双重LFA-1/MAC-1拮抗剂或ICAM-1受体靶向部分：

或其药学可接受的盐或酯。

在其它的实施方案中，R1是下式的LFA-1和/或双重LFA-1/MAC-1拮抗剂或ICAM-1受体靶向部分：

或其药学可接受的盐或酯，其中Q是H或OH。

R2可以表示反应部分，该部分可以与治疗或其它有用化合物或缀合部分形成共价键，所述治疗或其它有用化合物或缀合部分具有强亲核体，例如包含硫氢基的分子。这种反应部分的实例包括选自如下的部分：

或者，R2可以表示已经连接缀合部分例如治疗或其它有用化合物、蛋白质或寡核苷酸(R3)的部分。更具体地，R2可以表示下式的部分：

其中R3是缀合部分，且X表示硫或下式的化合物：

在具体的实施方案中，R3表示寡核苷酸。在更具体的实施方案中，R3表示可以作为单链存在的RNA分子的有义链或在双链体例如siRNA分子中的5’-端。这种siRNA分子也称作RNAi活性剂，其抑制细胞中靶基因的表达。在具体的实施方案中，R3是主要由15-30个核苷酸长度的寡核糖核苷酸链组成的siRNA分子，其中有义寡核糖核苷酸链的5’末端与如上述结构中所示的R2偶合，并且与相当于靶基因的mRNA的至少一个部分互补。在其它的实施方案中，R3是连接在其5’-端的DNA的寡核苷酸。这种衍生的DNA可以作为单链或作为一条与另一种寡核苷酸互补链杂交的链存在。所述的寡核苷酸链可以未被修饰或因代谢稳定性而被修饰。这种修饰包括、但不限于在磷酸(例如硫代磷酸)上的具体位置和2’-羟基(例如2’-O-甲基和2’-氟)上的取代。

在具体的实施方案中，式I的R2表示-X-S-CH₂-R3，其中R3包括如下式5(基于式I)中所示的RNA的有义链：

其中R1、n和X如式I中所定义。

在其它具体的实施方案中，所述有义链可以结合反义链。

在其它具体的实施方案中，R2表示-X-S-CH₂-R3，其中R3表示小分子或蛋白质，由此形成式I的共价连接的特异性靶向本体。

在更具体的实施方案中，R2表示-X-S-CH₂-R3，其中R3表示治疗小分子或蛋白质。

在其它具体的实施方案中，R2表示-X-S-CH₂-R3，其中R3表示用于使用细胞显微镜检查技术使这些整联蛋白受体结合显影的荧光部分。

在其它具体的实施方案中，R2表示-X-S-CH₂-R3，其中R3表示具有主要反应性硫化物的聚合物。更具体地，R3可以表示用于配合并且将siRNA递送至细胞表面和细胞胞质结构域的阳离子聚合物。

在更具体的实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中R3是如下所示的异硫氰酸荧光素(FITC)的结构异构体之一：

在另外更具体的实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中R3是如下所示的FITC-14的结构异构体之一：

在其它的实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其中n是9-13，优选12。

在更具体的实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其选自如下化合物之一(或其药学可接受的盐或酯)：

LFA-1配体试剂1

(S)-3-{3-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酰基氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}氨基)丙酸；

LFA-1配体试剂2

(S)-3-{3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酰基氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}氨基)丙酸；

LFA-1配体试剂3

(S)-3-{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酰基氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}氨基)丙酸；

IFA-1配体试剂4

(S)-3-{4-[4-(3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-氨基-丙氧基)-2，6-二氯-苯甲酰基氨基]-苯基}-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-丙酸-PEG8；

LFA-1配体试剂5

S)-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-3-(4-{2，6-二氯-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苯甲酰基氨基}-苯基)-丙酸；

LFA-1配体试剂6

S)-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-3-(4-{2，6-二氯-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苯甲酰基氨基}-苯基)-丙酸；

LFA-1配体试剂7

S)-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-3-(4-{2，6-二氯-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苯甲酰基氨基}-苯基)-丙酸；

LFA-1配体试剂8

(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基氨基]-丙基-氧基}-苯基)-羰基]-氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸；

LFA-1配体试剂9

(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基氨基]-丙基-氧基}-5-羟基-苯基)-羰基]-氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸；

LFA-1配体试剂10

(S)-3-[({3-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙基-氧基]-5-羟基-苯基}-羰基)-氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸。

此外，本发明涉及包含式I化合物的新组合物和制剂，其在与siRNA组合时用于生成纳米粒，导致将核酸例如siRNA改进的递送至表达LFA-1/ICAM-1复合物的靶细胞的胞质。在具体的实施方案中，本发明涉及siRNA制剂，其包含：(1)式I的化合物，其中R2包括5′-siRNA寡核苷酸；和(2)聚阳离子转染剂。

本发明还涉及这种化合物和组合物的制备方法和使用方法。式I的化合物用作改善将药物、核酸或其它治疗化合物递送至表达LFA-1/ICAM-1复合物的组织或细胞的的组合物或制剂的成分。在具体的实施方案中，本发明涉及包含式I的化合物的制剂，其用于将siRNA递送至靶细胞LFA-1/ICAM-1复合物的胞质，以便通过RNA干扰抑制一些蛋白质表达。在更具体的实施方案中，本发明涉及式I的化合物和包含这种化合物的组合物，其可以有效地将siRNA递送至肿瘤细胞和表达ICAM-1受体的其它的细胞类型，以便治疗癌症或炎性疾病。这种化合物和组合物与不含式I的化合物的类似制剂相比是更有效的且显示改善的敲除能力。

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物：

或其药学可接受的盐或酯；其中n是1-24，且其中：

R1选自：

(1)下式的化合物：

(2)下式的化合物：

(3)下式的化合物：

其中Q是H或OH；

R2选自：

(1)下式的化合物：

(2)下式的化合物：

(3)下式的化合物：

(4)下式的化合物：

其中R3是缀合部分，且X表示硫或下式的化合物：

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R1是下式的化合物：

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R1是下式的化合物：

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R1是下式的化合物：

其中Q是H或OH。

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R1是下式的化合物：

其中Q是H。

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R1是下式的化合物：

其中Q是OH。

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R2是下式的化合物：

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R2是下式的化合物：

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R2是下式的化合物：

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R2是下式的化合物：

其中R3是单链或双链寡核苷酸且X表示硫或下式的化合物：

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R2是下式的化合物：

其中R3是单链或双链寡核苷酸且X表示硫。

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R2是下式的化合物：

其中R3是siRNA分子，且X表示硫或下式的化合物：

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R1是下式的化合物：

其中R2是下式的化合物：

其中R3是siRNA分子，且X表示硫或下式的化合物：

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R1是下式的化合物：

其中R2是下式的化合物：

其中R3是siRNA分子，且X表示硫或下式的化合物：

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其中R1是下式的化合物：

其中Q是H或OH。

其中R2是下式的化合物：

其中R3是siRNA分子，且X表示硫或下式的化合物：

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其选自：

(S)-3-{3-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酰基氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}氨基)丙酸；和

(S)-3-{3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-丙酰基氨基)-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}氨基)丙酸。

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其选自：

(S)-3-{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酰基氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}氨基)丙酸；和

(S)-3-{4-[4-(3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基]-氨基-丙氧基)-2，6-二氯-苯甲酰基氨基]-苯基}-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-丙酸-PEG8。

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其选自：

S)-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-3-(4-{2，6-二氯-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苯甲酰基氨基}-苯基)-丙酸；和

S)-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-3-(4-{2，6-二氯-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基}-丙氧基}-苯甲酰基氨基}-苯基}-丙酸。

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其选自：

S)-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-3-(4-{2，6-二氯-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苯甲酰基氨基}-苯基)-丙酸；和

(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基氨基]-丙基-氧基}-苯基)-羰基]-氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸。

在本发明的一个实施方案中，提供了式I的化合物，其选自：

(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基氨基]-丙基-氧基}-5-羟基-苯基)-羰基]-氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸；和

(S)-3-[({3-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙基-氧基]-5-羟基-苯基}-羰基)-氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸。

在本发明的另一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含式I化合物和药学可接受的载体。

本发明化合物的一般合成

在实施例中提供了合成式I化合物的适合的方法。一般而言，可以根据如下所示例的方案制备式I化合物。除非另有指示，否则如下方案中的变量n和R1和R2与上述对式I的种类所定义的相同的方式定义。

马来酰亚胺-(PEG)n-整联蛋白拮抗剂缀合剂的一般合成

方案1中不同长度的PEG的化合物例如26是商购的(例如来自PierceBioScience)。这种化合物还可以通过下列步骤制备：用3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酸在酰胺键形成条件下酰化PEG氨基酸的氨基末端，然后通过N-羟基琥珀酸在酯形成条件下的反应形成反应性N-羟基琥珀酸酯类。如方案1中所示，使26的化合物与包含伯或仲胺类的化合物例如27的反应在无质子或质子溶剂中在碱性胺类例如DIEA(二异丙基乙胺)的存在下在室温进行，生成聚乙二醇化中间体28。

方案2中的化合物例如29也是商购的，其中R4是硫代乙酰基或2-二硫代吡啶基并且具有不同长度的PEG部分(例如来自Pierce BioScience)。具有29结构的化合物与包含伯或仲胺类的化合物例如27的反应在无质子或质子溶剂中在碱性胺类例如DIEA(二异丙基乙胺)的存在下在室温进行，生成聚乙二醇化中间体30。

作为本发明具体的非限制性实施例，中间体26与31反应，产生马来酰亚胺中间体32，如方案3中所示：

按照类似方式，中间体26可以与33反应，产生马来酰亚胺中间体34，如方案4中所示：

按照类似方式，中间体29可以与35反应，产生马来酰亚胺中间体36，其中R4表示硫代乙酰基或2-二硫代吡啶基：

按照类似方式，中间体29可以与37反应，产生中间体38，如方案6中所示，其中R4表示硫代乙酰基或2-二硫代吡啶基：

对于一般结构26或29的化合物，不同的PEG长度可获得或易于由本领域技术人员制备；优选n＝8-24。该课题充分报道和综述(例如Chemistry for peptide and proteinPEGylation，Advanced Drug Delivery Reviews第54卷，第4期，2002年6月17日，459-476页)。

可以按照与报道的类似的方式如方案7中所示合成中间体31(例如Sidduri，A.等人Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2002，12，2475-2478)：

特别地，如方案7中所示，中间体41由商购的(S)-3-[4-硝基苯基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸40生成。在室温在几小时过程中在氯化铵的存在下用锌粉还原甲醇溶液中的商购原料40的硝基，得到苯胺41。用于硝基还原的其它方法是本领域技术人员公知的。用苯甲酰卤衍生物例如2，6-二氯苯甲酰氯42在无质子溶剂例如二氯甲烷中在碱例如二异丙基-乙胺的存在下在室温使苯胺41酰化。按照这种方式，形成酰胺43。根据本领域技术人员公知的标准方法除去叔丁基羰基(Boc)胺保护基，例如通过用HCl的二噁烷溶液在室温下处理；该步骤形成盐酸盐44。用酰胺键形成条件(也是本领域技术人员众所周知的)在已知1-(2-叠氮基-乙基)-环戊烷甲酸45的存在下处理盐酸盐44，导致产生二-酰胺46。通过用三-烷基膦在无质子溶剂例如四氢呋喃中在室温下处理还原中间体46的叠氮基。此外，通过用氢氧化钠在例如乙醇和四氢呋喃的溶剂混合物中在升温例如50℃下处理15小时皂化甲酯。该方法导致形成中间体31，它也可以作为两性离子存在。

PEG部分还能够与如方案8中所示合成的中间体39连接。特别地，用三异丙基甲硅烷基氯在碱例如咪唑的存在下在极性无质子溶剂例如DMF中保护3，5-二氯苯酚47，然后与强碱例如丁基锂的无水四氢呋喃溶液在低温例如-78℃下反应。通过加入干冰形式的二氧化碳使得到的锂复合物猝灭，得到中间体48苯甲酸衍生物。然后通过在无质子溶剂中用磺酰氯(SOCl₂)处理氯化中间体48，以形成酰氯。此时，随后使酰氯与胺盐酸盐49在碱例如二异丙基乙胺(DIPEA)的存在下在无质子溶剂例如二氯甲烷(DCM)中反应，由此形成中间体50。通过用氟化四丁基铵(TBAF)在质子溶剂例如四氢呋喃中在室温下处理除去中间体50的甲硅烷基保护基。使这种苯酚中间体在碱例如碳酸钾(K₂CO₃)的存在下在无质子溶剂例如二甲基甲酰胺(DMF)中与3-N-叔丁基-氨基甲酸酯-1-溴丙烷反应。按照这种方式，在用三氟乙酸(TFA)脱保护时，形成中间体52，然后用碱例如氢氧化钠在质子溶剂例如乙醇中水解，形成中间体39：

LFA-1拮抗剂衍生试剂的合成

靶向LFA-1/ICAM相互作用、由此提供靶向表达ICAM系统的细胞的方式的小分子如下方案11、12、13和14中所示。正如方案11中所示的那样，形成3-(3-甲氧基)-丙酸酯70的伯酰胺，在本领域技术人员公知的标准条件下还原。使用与脲、乙醛和3-氧代-丁酸乙酯的Bignelli反应单独地形成二氢嘧啶。通过用50％硝酸处理形成这种产物的嘧啶，得到4，6-二甲基-2-羟基-嘧啶-5-甲酸乙酯。

通过与POCl₃(磷酰氯)反应形成72形成这种物质的氯化物。使胺71与氯化物72反应，形成仲胺酯73。此时，通过用路易斯酸例如三溴化硼在无质子溶剂中处理除去甲氧基，形成苯酚74。在碱水的存在下皂化这种苯酚74，然后在S-3-N-叔丁基-氨基甲酸酯-2-羧基-二氨基丙烷盐酸盐(H-DAP(Boc)OMe盐酸盐)的存在下施加酰胺偶合条件，由此形成中间体77。在标准条件下除去Boc保护基，然后皂化甲酯，形成ICAM-1靶向小分子21。

下列实施例的反应方案11：LFA-1配体试剂1、LFA-1配体试剂2、LFA-1配体试剂3：

靶向LFA-1/ICAM相互作用、由此提供靶向表达ICAM系统的细胞的方式的其它小分子如下方案12中所示。特别地，用氯化试剂亚硫酰氯在回流条件下处理在无质子溶剂例如甲苯中的2，6-二氯-4-三异丙基硅烷氧基-苯甲酸79。在后处理时，随后用碱例如二异丙基乙胺和(S)-3-(4-氨基-苯基)-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲酯80处理酰氯，由此生成酰胺81。在标准条件下除去Boc氨基保护基，在标准酰胺键形成反应条件下偶合得到的伯胺83。甲酯84报道在WO 01/58853中；通过本领域技术人员众所周知的标准条件进行甲酯84的甲硅烷基保护。在偶合和脱保护后，用(3-溴-丙基)-氨基甲酸叔丁酯处理酰胺88。在标准条件下除去Boc保护基，然后皂化甲酯，形成ICAM-1靶向小分子22。

下列实施例的反应方案12：LFA-1配体试剂4、LFA-1配体试剂5、LFA-1配体试剂6、LFA-1配体试剂7

按照类似方式，产生靶向LFA-1/ICAM相互作用、由此提供靶向表达ICAM系统的细胞的方式的其它小分子如下方案13中所示。特别地，用(3-溴-丙基)-氨基甲酸叔丁酯在碱性条件下例如在碳酸钾溶剂混合物例如丙酮和DMF的存在下使3-羟基甲基苯甲酸酯烷基化，由此生成中间体91。皂化甲酯91，使得到的游离酸92在标准酰胺键形成条件下与中间体93偶合(方案11)，得到中间体94。在标准条件下除去Boc保护基，然后皂化甲酯，形成ICAM-1靶向小分子96。

下列实施例的反应方案13：LFA-1配体试剂8

类似的反应顺序用于生成化合物102，如下方案14中所示，该化合物靶向LFA-1/ICAM相互作用，由此提供靶向表达ICAM系统的细胞的方式。替代作为原料的3-羟基甲基苯甲酸酯，原料3，5-二羟基甲基苯甲酸酯97用于类似顺序，以生成中间体103，也如方案14中所示。

下列实施例的反应方案14：LFA-1配体试剂9、LFA-1配体试剂10

用途

式I化合物用于将缀合部分例如治疗剂、小分子、肽类、核酸、荧光部分和聚合物递送至表达LFA-1整联蛋白受体复合物的靶细胞，用于各种治疗和其它应用。因此，式I的化合物可以用于治疗与LFA-1表达或超表达相关的各种疾病和病症。这种疾病和病症可以包括炎症、癌症和代谢相关疾病。

在具体的实施方案中，本发明包含治疗或预防需要这种治疗的哺乳动物(优选人)的癌症的方法，其中该方法包含施用治疗有效量的式I化合物。在另一个实施方案中，提供了式I的化合物在治疗或预防炎症、癌症或代谢性疾病或病症中的用途。在另一个实施方案中，提供了在制备用于治疗或预防炎症、癌症或代谢性疾病或病症的药物中的用途。

可以按照与良好医疗实践一致性的方式施用这种组合物。在本文上下文中需要考量的因素包括所治疗的具体障碍、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病情、障碍的原因、活性剂的递送部位、施用方法、施用方案和医务人员公知的其它因素。所施用的化合物的“有效量”根据例如治疗或预防疾病或病症所必不可少的最低用量这样的考量来控制(例如抑制钯蛋白表达)并且避免不可接受的毒性。例如，这种用量可以低于对正常细胞或作为整体的哺乳动物有毒性的用量。包含本发明式I的化合物的组合物可以通过胃肠外、腹膜内和肺内施用来施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。

实施例

本发明通过参照下列实施例更完整地理解。然而，不应将它们视为限定本发明的范围。

试剂购自Aldrich，Sigma和Pierce BioScience或如下所示的其他供应商且不经进一步纯化使用。多毫克至多克规模的纯化通过本领域技术人员公知的方法例如根据硅胶闪蒸塔洗脱进行。在一些情况中，还通过使用一次性预填充多克硅胶柱(RediSep)进行制备型闪蒸塔纯化，用CombiFlash系统洗脱。Biotage^TM和ISCO^TM也是可以用于本发明纯化中间体的闪蒸塔仪器。

为了判断化合物身份和纯度的目的，使用如下系统记录LC/MS(液相色谱法/质谱法)光谱。为了测定质谱，系统由Micromass Platform II光谱仪组成：ES电离，正模式(质量范围：150-1200 amu)。使用下列HPLC系统进行同时色谱分离：ES IndustriesChromegabond WR C-18 3u(3.2x30mm)柱筒；流动相A：水(0.02％TFA)和相B：乙腈(0.02％TFA)；梯度10％B-90％B，3分钟；1分钟平衡时间；流速2mL/分钟。在一些情况中，将20毫摩尔浓度的乙酸铵用作制备型HPLC过程中有效电离的修饰剂。在这样的情况中，分离铵盐。

为了一些分离。超临界流体色谱法的应用也是有用的。使用Mettler-ToledoMinigram系统与如下典型条件进行超临界流体色谱分离：100巴，30℃，2.0mL/min，用在超临界CO₂中的40％MeOH洗脱12mm AD柱。在具有碱性氨基的分析物的情况中，将0.2％异丙基胺加入到甲醇修饰剂中。

通过¹H-NMR、使用Varian Inova 400 MHz NMR光谱仪或Varian Mercury 300 MHzNMR光谱仪并且通过高分辨率质谱法、使用Bruker Apex-II高分辨率4.7T FT-质谱仪表征化合物。还通过高分辨率质谱法、使用Thermo Electron销售的LTQ CL Orbitrap表征最终的化合物。

本文所用的缩写如下：

AIBN 2，2’-偶氮二异丁腈

Bu 丁基

DCE 1，2-二氯乙烷

DCM 二氯甲烷

DBU 1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯

DIAD 偶氮二甲酸二异丙酯

DIEA 二乙胺

DIPEA 二异丙基乙胺

DMF N，N-二甲基甲酰胺

DMSO 二甲亚砜

EDC-HCl 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐

EtOAc 乙酸乙酯

EtOH 乙醇

FCC 闪蒸塔色谱法

h 小时

HBTU O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐

HOBt 羟基苯并三唑

HPLC 高压液相色谱法

HRMS 高分辨质谱

LRMS 低分辨率质谱

LC 液相色谱法

L-Pro L-脯氨酸

MCPBA 间-氯过氧化苯甲酸

MeOH 甲醇

MW 微波

NIS N-碘代琥珀酰亚胺

NBS N-溴琥珀酰亚胺

NMP 1-甲基-2-吡咯烷酮

PdCl₂(dppf) [1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)

PEGn n次聚乙二醇重复单元(例如PEG2＝-OCH2CH2OCH2CH2-)PG保护基

PyBroP 溴-三-吡咯烷代-磷鎓六氟磷酸盐

rt 室温

TBAF 氟化四丁基铵

TBDMS 叔丁基-二甲基甲硅烷基

TBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐

TMS 三甲基甲硅烷基

TEA 三乙胺

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

TLC 薄层色谱法

TPP 三苯膦

用作靶向剂的ICAM-1受体的小分子LFA-1拮抗剂和/或双重LFA-1/MAC-1拮抗剂的 合成

第1部分：优选的中间体

3-(3-甲氧基-苯基)-丙酰胺的制备

将3-(3-甲氧基-苯基)-丙酸(15g，83.2mmol)和4-甲基-吗啉(10.1ml，91.56mmol)在THF(150ml)中的溶液冷却至0℃(冰-水浴)，在20分钟内加入氯甲酸异-丙酯(1M的甲苯溶液，91.6ml，91.56mmol)。将该混合物在0℃再搅拌30分钟，然后滴加7N NH₃/MeOH(24ml，168mmol)。将该混合物温至室温，搅拌2h。用10％K₂CO₃水溶液猝灭，用EtOAc萃取。合并有机萃取物，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，蒸发，得到期望的酰胺(11.15g，75％收率)。MS m/e179.9(M+H⁺)。

3-(3-甲氧基-苯基)-丙基胺的制备

在室温将BH₃的THF溶液(2.2g，188mmol)加入到3-(3-甲氧基-苯基)-丙酰胺(11.15g，62.26mmol)在THF(100ml)中的溶液中，将该溶液回流加热4h，冷却至室温，用MeOH(50ml)猝灭。将该溶液加热至回流30min，浓缩，用水处理，用EtOAc萃取。用10％K₂CO₃水溶液、水和盐水洗涤萃取物，用Na₂SO₄干燥，过滤，蒸发，得到标题化合物(9.26g，90％收率)。MSm/e165.9(M+H⁺)。

4，6-二甲基-2-羟基-1，6-二氢-嘧啶-5-甲酸乙酯的制备

将3-氧代-丁酸乙酯(16.27g，125mmol)、乙醛(5.51g，125mmol)、脲(7.51g，125mmol)和冰醋酸(20滴)在乙醇(35ml)中的混合物在350ml压力烧瓶中加热至90℃过夜。用水稀释该混合物。通过过滤收集沉淀，用水洗涤，风干，得到期望的产物(17.68g，71％收率)。MS m/e198.8(M+H⁺)。

4，6-二甲基-2-羟基-嘧啶-5-甲酸乙酯的制备

将4，6-二甲基-2-羟基-1，6-二氢-嘧啶-5-甲酸乙酯(34.63g，174.7mmol)分部分在5分钟内加入到冰冷的50％硝酸溶液(120ml)中。将该溶液在0℃搅拌10分钟，倾入冰水(500ml)，用固体K₂CO₃中和，用氯仿萃取。用水和盐水洗涤合并的有机层，用Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，得到标题化合物(21.9g，71％收率)。MS m/e197.1(M+H⁺)。

2-氯-4，6-二甲基-嘧啶-5-甲酸乙酯的制备

向POCl₃(106ml)和DIEA(65ml)的溶液中加入4，6-二甲基-2-羟基-嘧啶-5-甲酸乙酯(21.9mg，111.6mmol)。将该混合物加热至110℃2h。通过减压蒸发除去过量的POCl₃和DIEA。将残余物溶于EtOAc(1.2l)，用脱色碳处理。过滤后，用1N NaOH、水和盐水洗涤该溶液。用Na₂SO₄干燥有机层，过滤，浓缩。通过快速色谱法与0-30％EtOAc的己烷溶液梯度纯化粗残余物，得到期望的产物(9.33g，39％收率)。

2-[3-(3-甲氧基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-甲酸乙酯的制备

将3-(3-甲氧基-苯基)-丙基胺(2.31g，13.98mmol)、2-氯-4，6-二甲基-嘧啶-5-甲酸乙酯(2g，9.32mmol)在EtOH(12ml)中的混合物在160℃微波处理1.5h。将该反应混合物冷却至室温，用10％K₂CO₃猝灭，用EtOAc萃取。用盐水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩。通过快速色谱法与30％EtOAC的己烷溶液纯化残余物，得到期望的产物(2.42g，76％收率)。MS m/e344.1(M+H⁺)。

2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，-二甲基-嘧啶-5-甲酸乙酯的制备

用冰-水浴冷却2-[3-(3-甲氧基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-甲酸乙酯(2.42g，7.05mmol)的DCM(50ml)溶液，滴加BBr₃/DCM(1M，14.1ml，14.1mmol)。将得到的溶液温至室温，在室温搅拌2h。用冰水使该溶液猝灭，用DCM萃取。合并有机层，用水和盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，浓缩，得到期望的产物(2g，86％收率)。MS m/e330.1(M+H⁺)。

(S)-3-叔丁氧基羰基氨基-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯的制备

用一水合氢氧化锂(6.3g，150mmol)的水(30ml)溶液处理2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，5-二甲基-嘧啶-5-甲酸乙酯(2.0g，6.0mmol)在二噁烷(30ml)中的溶液。将该混合物在90℃搅拌12h，然后冷却至室温，硫酸氢钾水溶液猝灭，以调整pH至～2-4。用EtOAc萃取得到的溶液。合并有机萃取物，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到所述酸(1.76g)，不进行纯化，而直接用于下一步。向2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-甲酸(1.76g，5.84mmol)在无水DMF(60ml)中的溶液中加入Et₃N(2.5ml，7.0mmol)、HBTU(2.66g，7.01mmol)、HOBT(0.95g，7.01mmol)和H-DAP(Boc)OMe盐酸盐(1.79g，7.01mmol)。将该混合物在室温搅拌3h，用盐水(200ml)稀释，用乙酸乙酯萃取。用1∶1饱和碳酸氢钠/盐水和盐水洗涤合并的有机层，然后用Na₂SO₄干燥，过滤，减压浓缩。通过快速色谱法与40-100％EtOAc的己烷溶液梯度纯化粗残余物，得到标题化合物(2.66g，91％收率)。MS m/e501.9(M+H⁺)。

(S)-3-氨基-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯盐酸盐的制备

向(S)-3-叔丁氧基羰基氨基-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯(2.66g，5.30mmol)在MeOH(10ml)中的溶液中加入4.0M HCl的二噁烷溶液(20mL)。1小时后，浓缩该混合物，与MeOH一起共沸。将产物与乙醚一起研磨，过滤，用乙醚洗涤，得到标题化合物(2.16g，93％收率)。MS m/e401.9(M+H⁺)。

(S)-3-氨基-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸盐酸盐的制备；LFA-1配体1

将(S)-3-氨基-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯盐酸盐(50mg，0.114mmol)加入到LiOH水溶液(13mg，0.57mmol的2mL水溶液)中。将得到的混悬液在室温搅拌过夜。然后用1N盐酸中和该反应混合物，冻干。将该物质不再进行任何纯化用于下一步。

3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯甲酸甲酯的制备

在丙酮(10mL)和DMF(10mL)的混合物中合并3-羟基甲基苯甲酸酯(500mg，3.29mmol)、(3-溴-丙基)-氨基甲酸叔丁酯(861mg，1.1eq.)和碳酸钾(2.3g，5eq.)。将该反应混合物在75℃搅拌过夜。过滤不溶物，弃去，减压浓缩滤液，用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。进行使用乙酸乙酯和己烷的硅胶快速色谱，得到900mg标题化合物。HRMS m/e332.1466(M+Na)⁺。

3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯甲酸的制备

向3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯甲酸甲酯(900mg)在甲醇(3mL)中的溶液中加入LiOH(334mg，5eq.)在水(3mL)中的溶液，将得到的反应混合物在45℃搅拌过夜。然后用1N HCl将该反应混合物酸化至pH3，即刻用乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥。然后减压浓缩，从乙酸乙酯中结晶，得到600mg标题化合物。

HRMS m/e318.1311(M+Na)⁺。

(S)-3-[3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯甲酰基氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯的制备

向3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯甲酸(57mg，0.193mmol)在DMF(1mL)中的溶液中加入HBTU(78mg，1.05eq.)、DIEA(172μL，5eq.)和(S)-3-氨基-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯盐酸盐(100mg，0.194mmol)。将得到的反应混合物在室温搅拌4h。然后用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。进行使用甲醇/二氯甲烷的硅胶快速色谱，得到97mg标题化合物。

HRMS m/e679.3447(M+H)⁺。

(S)-3-[3-(3-氨基-丙氧基)-苯甲酰基氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯盐酸盐的制备

将三甲基甲硅烷基氯(177μL)加入到甲醇(2mL)中，将得到的混合物在室温搅拌5min。然后将其加入到(S)-3-[3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯甲酰基氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯(94.6mg，0.139mmol)中，将得到的反应混合物在室温搅拌1个周末。然后减压浓缩，与乙醚一起研磨，得到84.8mg标题化合物。HRMS m/e579.2925(M+H)⁺。

(S)-3-[3-(3-氨基-丙氧基)-苯甲酰基氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸的制备LAF-1配体2

将(S)-3-[3-(3-氨基-丙氧基)-苯甲酰基氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯盐酸盐(82.6mg，0.134mmol)溶于甲醇(1mL)和2M NaOH(336μL，5eq.)，将得到的反应混合物在室温搅拌过夜。然后用1N HCl中和，冻干，不经进一步纯化用于下一步。MS m/e565.5(M+H)⁺。

3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-5-羟基-苯甲酸甲酯的制备

在丙酮(50mL)和DMF(50mL)的混合物中合并3，5-二羟基甲基苯甲酸酯(1.8g，10.7mmol)、(3-溴-丙基)-氨基甲酸叔丁酯(1.3g，5.46mmol)和碳酸钾(1.5g，10.8mmol)。将该反应混合物在75℃搅拌过夜。减压浓缩粗反应混合物，用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。进行使用乙酸乙酯和己烷的硅胶快速色谱，得到462mg标题化合物。HRMS m/e348.1417(M+Na)⁺。

3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-5-羟基-苯甲酸的制备

向3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-5-羟基-苯甲酸甲酯(1.2g 3.69mmol)在2MNaOH(9.2mL，5eq.)中的溶液中加入水(20mL)，将得到的反应混合物在室温搅拌过夜。然后用1N HCl中和该反应混合物，即刻用乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥。然后减压浓缩，得到1.0g标题化合物。MS m/e211.8(M+H-Boc)⁺。

3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-5-羟基-苯甲酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯的制备

向冷却的3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-5-羟基-苯甲酸(500mg，1.606mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(185mg，1eq.)在THF(20mL)中的溶液中加入DCC(332mg，1eq.)。1h后除去冷却浴。过滤不溶物，弃去。减压浓缩滤液，通过使用乙酸乙酯和己烷的硅胶色谱法纯化粗物质，得到602mg标题化合物。HRMS m/e431.1426(M+Na)⁺。

(S)-3-[3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-5-羟基-苯甲酰基氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯的制备

向(S)-3-氨基-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯盐酸盐(476.4mg，0.924mmol)在DMF(5mL)中的溶液中加入DIEA(321μL，3eq.)和3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-5-羟基-苯甲酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(377mg，1eq.)。将得到的反应混合物在室温搅拌2h。然后用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过硅胶快速色谱法纯化粗物质，使用甲醇/二氯甲烷，得到301mg标题化合物。

HRMS m/e695.3395(M+H)⁺。

(S)-3-[3-(3-氨基-丙氧基)-5-羟基-苯甲酰基氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯盐酸盐的制备

将三甲基甲硅烷基氯(548μL)加入到甲醇(5mL)中，将得到的溶液在室温搅拌1min。然后加入(S)-3-[3-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-5-羟基-苯甲酰基氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯(299.6mg，0.431mmol)，在室温持续搅拌过夜。减压除去甲醇，将残余物与乙醚一起研磨，得到272mg标题化合物。HRMS m/e595.2875(M+H)⁺。

(S)-3-[3-(3-氨基-丙氧基)-5-羟基-苯甲酰基氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸的制备；LFA-1配体3

将(S)-3-[3-(3-氨基-丙氧基)-5-羟基-苯甲酰基氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸甲酯盐酸盐(100mg，0.158mmol)溶于水(1mL)和甲醇(1mL)的混合物，然后加入2N NaOH(400μL，5eq.)。将该反应混合物在室温搅拌3h。然后用1N HCl中和，冻干，不经进一步纯化用于下一步。MS m/e581.1(M+H)⁺。

(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(2，6-二氯-4-三异丙基硅烷氧基-苯甲酰基氨基)-苯基]-丙酸甲酯的制备

向2，6-二氯-4-三异丙基硅烷氧基-苯甲酸(50mg，0.138mmol)在甲苯(2mL)中的溶液中加入亚硫酰氯(50μL，0.69mmol)。将得到的溶液回流2h。然后减压除去亚硫酰氯和甲苯。将油状残余物再溶于二氯甲烷(3mL)，冷却至0℃。然后加入DIEA(72μL，0.414mmol)和(S)-3-(4-氨基-苯基)-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸甲酯(43mg，0.145mmol)，将得到的反应混合物在室温搅拌1个周末。通过使用乙酸乙酯和己烷的硅胶快速色谱法纯化粗物质，得到87mg标题化合物。HRMS m/e661.2237(M+Na)⁺。

(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(2，6-二氯-4-羟基-苯甲酰基氨基)-苯基]-丙酸甲酯的制备

向(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(2，6-二氯-4-三异丙基硅烷氧基-苯甲酰基氨基)-苯基]-丙酸甲酯(84.7mg，0.132mmol)在THF(1mL)中的溶液中加入TBAF(199μL 1M的THF溶液)，将得到的混合物在室温搅拌过夜。减压除去溶剂，再溶于乙酸乙酯后，用水和盐水洗涤残余物，然后用无水硫酸钠干燥。通过使用乙酸乙酯和己烷的硅胶快速色谱法纯化粗物质，得到50.3mg标题化合物。HRMS m/e505.0903(M+Na)⁺。

(S)-2-氨基-3-[4-(2，6-二氯-4-羟基-苯甲酰基氨基)-苯基]丙酸甲酯盐酸盐的制备

向TMSCl(1.4mL，11.3mmol)在MeOH(15mL)中的溶液中加入(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-(2，6-二氯-4-羟基-苯甲酰基氨基)-苯基]-丙酸甲酯(548mg，1.13mmol)，将得到的混合物在室温搅拌过夜。减压浓缩粗混合物，将残余物与乙醚一起研磨，得到379mg标题化合物。HRMS m/e383.0561(M+H)⁺。

N-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-苄基]-2-氯-对苯二甲酸甲酯的制备

2-氯-N-(3-羟基-苄基)-对苯二甲酸甲酯的制备描述在专利WO01/58853中。将2-氯-N-(3-羟基-苄基)-对苯二甲酸甲酯(4.0g，12.54mmol)、TBDMSCl(2.3g，15.0mmol)和咪唑(1.9g，27.6mmol)溶于DMF(80mL)，在室温搅拌过夜。然后用乙酸乙酯稀释该反应混合物，用水和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。通过使用乙酸乙酯和己烷的硅胶快速色谱法纯化粗物质，得到5.0g标题化合物。MS m/e433.9(M+H)⁺。

N-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-苄基]-2-氯-对苯二甲酸的制备

向N-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-苄基]-2-氯-对苯二甲酸甲酯(4.9g，11.29mmol)在1，2-二氯乙烷(80mL)中的溶液中加入氢氧化三甲基锡(20.4g，112.9mmol)，将得到的反应混合物在80℃搅拌8h。减压除去溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯。然后用KHSO₄的水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，通过硅胶垫过滤。减压浓缩滤液，得到4.0g标题化合物。HRMS m/e420.1393(M+H)⁺。

(S)-2-{4-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-苄基氨基甲酰基]-2-氯-苯甲酰基氨基}-3-[4-(2，6-一氯-4-羟基-苯甲酰基氨基)-苯基]-丙酸甲酯的制备

向N-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-苄基]-2-氯-对苯二甲酸(103mg，0.246mmol)在DMF(2mL)中的溶液中加入HBTU(103mg，0.271mmol)、DIEA(128μL，0.738mmol)和(S)-2-氨基-3-[4-(2，6-二氯-4-羟基-苯甲酰基氨基)-苯基]丙酸甲酯盐酸盐(103mg，0.246mmol)。将得到的反应混合物在室温搅拌1个周末。然后用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤。通过使用甲醇/二氯甲烷的硅胶快速色谱法纯化粗物质，得到100mg标题化合物。HRMSm/e784.1776(M+H)⁺。

(S)-3-{4-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-2，6-二氯苯甲酰基氨基]-苯基}-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-丙酸甲酯的制备

向(S)-2-{4-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-苄基氨基甲酰基]-2-氯-苯甲酰基氨基}-3-[4-(2，6-二氯-4-羟基-苯甲酰基氨基)-苯基]-丙酸甲酯(91.5mg，0.116mmol)在丙酮(1mL)和DMF(1mL)混合物中的溶液中加入碳酸钾(48mg，3eq.)和(3-溴-丙基)-氨基甲酸叔丁酯(33mg，1.2eq.)。将得到的反应混合物在75℃搅拌过夜。然后用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过硅胶快速色谱法纯化粗物质，使用甲醇/二氯甲烷，得到76.5mg标题化合物。HRMS m/e827.2016(M+H)⁺。

(S)-3-{4-[4-(3-氨基-丙氧基)-2，6-二氯-苯甲酰基氨基]-苯基}-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-丙酸甲酯盐酸盐的制备

将三甲基甲硅烷基氯(100μL，10eq.)加入到甲醇(2mL)中。5min后，将得到的溶液加入到(S)-3-{4-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-2，6-二氯苯甲酰基氨基]-苯基}-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-丙酸甲酯(65.6mg，0.079mmol)中，在室温搅拌过夜。浓缩粗反应混合物，与乙醚一起研磨，得到60.4mg标题化合物。HRMS m/e727.1492(M+H)⁺。

(S)-3-{4-[4-(3-氨基-丙氧基)-2，6-二氯-苯甲酰基氨基]-苯基}-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-丙酸的制备；LFA-1配体4

向(S)-3-{4-[4-(3-氨基-丙氧基)-2，6-二氯-苯甲酰基氨基]-苯基}-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-丙酸甲酯盐酸盐(55mg，0.072mmol)在甲醇(1mL)中的溶液中加入2M NaOH的水溶液(178μL，5eq.)。将得到的反应混合物在室温搅拌过夜。然后用1N HCl中和，冻干，不经进-步纯化用于下一步。MS m/e713.0(M+H)⁺。

实施例1

LFA-1配体试剂1的制备

(S)-3-氨基-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸盐酸盐(0.114mmol)在乙腈(1mL)中的溶液和琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚氨基丙酰氨基)-四乙二醇]酯(58mg，0.114mmol)在1mLDMSO和二异丙基乙胺(40μL，0.228mmol)中的溶液。合并两种溶液，在室温搅拌30min。减压浓缩粗反应混合物，通过SFC纯化，得到51mg标题产物。HRMS m/e786.3665(M+H)⁺。

实施例2

LFA-1配体试剂2的制备

按照与如实施例1中所示类似的方式用(S)-3-氨基-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸盐酸盐和琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚氨基丙酰氨基)-八乙二醇]酯制备标题化合物。

HRMS m/e984.4530(M+Na)⁺。

实施例3

LFA-1配体试剂3的制备

按照与如实施例1中所示类似的方式用(S)-3-氨基-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸盐酸盐和琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚氨基丙酰氨基)-十二乙二醇]酯制备标题化合物。

HRMS m/e1138.5761(M+H)⁺。

实施例4

LFA-1配体试剂4的制备

向(S)-3-{4-[4-(3-氨基-丙氧基)-2，6-二氯-苯甲酰基氨基]-苯基}-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-丙酸(0.196mmol)在DMSO(2mL)中的溶液中加入DIEA(102μL，3eq.)和琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚氨基丙酰氨基)-八乙二醇]酯(135mg，1eq.)。将得到的混合物在室温搅拌1h。通过HPLC纯化粗物质，得到105mg标题化合物。

HRMS m/e1287.4077(M+H)⁺。

实施例5

IFA-1配体试剂5的制备

按照与如实施例4中所示类似的方式用(S)-3-{4-[4-(3-氨基-丙氧基)-2，6-二氯-苯甲酰基氨基]-苯基}-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-丙酸和琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚氨基丙酰氨基)-四乙二醇]酯制备标题化合物。

HRMS m/e1111.3021(M+H)⁺。

实施例6

LFA-1配体试剂6的制备

按照与如实施例4中所示类似的方式用(S)-3-{4-[4-(3-氨基-丙氧基)-2，6-二氯-苯甲酰基氨基]-苯基}-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-丙酸和琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚氨基丙酰氨基)-十二乙二醇]酯制备标题化合物。

HRMS m/e732.2595(M+2H)²⁺。

实施例7

LFA-1配体试剂7的制备

向(S)-3-{4-[4-(3-氨基-丙氧基)-2，6-二氯-苯甲酰基氨基]-苯基}-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-丙酸(0.131mmol)在DMSO(2mL)中的溶液中加入DIEA(46μL，2eq.)和3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(78mg，1eq.)。将得到的混合物在室温搅拌1h。通过HPLC纯化粗物质，得到114mg标题化合物。

HRMS m/e1195.3511(M+H)⁺。

实施例8

IFA-1配体试剂8的制备

按照与如实施例1中所示类似的方式用(S)-3-[3-(3-氨基-丙氧基)-苯甲酰基氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸和琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚氨基丙酰氨基)-八乙二醇]酯制备标题化合物。

HRMS m/e1139.5511(M+H)⁺。

实施例9

LFA-1配体试剂9的制备

按照与如实施例1中所示类似的方式用(S)-3-[3-(3-氨基-丙氧基)-5-羟基-苯甲酰基氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸和琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚氨基丙酰氨基)-八乙二醇]酯制备标题化合物。

HRMS m/e1155.5448(M+H)⁺。

实施例10

LFA-1配体试剂10的制备

按照与如实施例1中所示类似的方式用(S)-3-[3-(3-氨基-丙氧基)-5-羟基-苯甲酰基氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸和琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚氨基丙酰氨基)-四乙二醇]酯制备标题化合物。

HRMS m/e979.4403(M+H)⁺。

荧光素(FITC)标记的靶向试剂的制备

用荧光团衍生靶向试剂，所述荧光团可以用于研究其结合追踪表达受体的细胞与靶向小分子。这种分子可以用两种方法之一或它们两种制备，首先，能够进行靶向马来酰亚胺与2-[(5-氟丝氨酰基)氨基羰基]乙硫醇的反应。或者，整联蛋白拮抗剂小分子靶向配体与2-[(5-氟丝氨酰基)氨基羰基]乙硫醇和双官能PEG试剂的单罐反应如方案17和18中所示。

方法a)的实施例

(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸-FITC的制备

在室温在氮气气氛中向(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸(37.5mg，0.03mmol)和2-[(5-氟丝氨酰基)氨基羰基]乙硫醇(FITC试剂)(15.6mg，0.036mml)在甲醇(5mL)中的黄色混悬液中加入过量的DIPEA(38.7mg，52uL，0.3mmol)。将得到的淡黄色混悬液搅拌2h，此时，LCMS分析显示不存在原料。然后真空除去过量的DIPEA，通过使用HPLC纯化分离期望的产物，得到25mg(50％收率)的(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸-FITC衍生物，为棕色固体。

ES(+)-HRMS m/e计算值C₈₀H₁₀₄N₁₀O₂₈S(M+2H)²⁺843.3444，测定值843.3437。

LCMS数据＝M+H，1687.6。

方法b)的实施例

步骤1.将胱胺二盐酸盐(68mg，0.301mmol)和DIEA(110μL，2.1eq.)溶于DMF(10mL)，然后添加NHS-荧光素、5-和6-羧基荧光素(300mg，0.634mmol)的混合物，将得到的反应混合物在室温搅拌过夜。然后用乙酸乙酯稀释，用水洗涤3次，用盐水洗涤1次。用无水硫酸钠干燥萃取物，减压浓缩，再溶于少量甲醇和乙酸乙酯，然后与乙醚一起研磨，得到140mg荧光素-胱胺加合物，为亮橙色固体。

步骤2.将荧光素-胱胺加合物(80mg，0.092mmol)溶于3∶1的甲醇和水的混合物(4mL)，加入TCEP盐酸盐(80mg，3eq.)。将得到的反应混合物在室温搅拌2h。通过HPLC纯化产物，得到78mg产物。LRMS(ESI)435.0。

荧光素-标记的小分子-PEG缀合物的制备

一般方法：向配体(1eq.)在DMSO中的溶液中加入DIEA(2eq.)和SM(PEG)_4n(1eq.)。将得到的反应混合物在室温搅拌1h。接下来加入带有硫氢基柄的荧光素(1eq.)，将该反应混合物再搅拌10min。通过HPLC纯化产物。

小分子整联蛋白靶向配体与5’-硫氢基-siRNA寡核苷酸的共价结合方法siRNA制备

寡糖核苷酸合成

根据固相亚磷酰胺技术、使用ABI394合成仪(Applied Biosystems)以10μmol规模合成寡核糖核苷酸。序列：

有义链 GGAuGAAGuGGAGAuuAGudTsdT(SEQ ID NO.1)

反义链 ACuAAUCUCcACUUcAUCCdTsdT(SEQ ID NO.2)

使相应的siRNAs定向于管家基因AHA1。使用定孔玻璃珠(CPG，具有75μmol/g载量，获自Prime Synthesis，Aston，PA，USA)制成的固相支持物进行合成。规则RNA亚磷酰胺类、2’-O-甲基亚磷酰胺类和辅助试剂购自Proligo(Hamburg，Germany)。特别地，使用如下DNA合成试剂：(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N⁶-(苯甲酰基)-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-腺苷-3’-O-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-N⁴-(乙酰基)-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷-3’-O-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N²-(异丁酰基)-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-鸟苷-3’-O-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基)亚磷酰胺和5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-3’-O-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基)亚磷酰胺。2’-O-甲基亚磷酰胺类携带与规则RNA DNA合成试剂相同的保护基。将全部DNA合成试剂溶于无水乙腈(100mM)，加入分子筛为了在寡聚体1-O-二甲氧基三苯甲基-己基-二硫化物的5’-端生成硫氢基连接基，使用来自Glen Research(Sterling，Virginia，USA)的1′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺连接基。在小分子缀合前，使用三-(2-羧基乙基)膦(TCEP，参见下文)还原二硫键。对于带有Nu547荧光团的5’-端标记，使用获自Thermo Fisher(Milwaukee，Wisconsin)的相应的亚磷酰胺。将5-乙基硫代四唑(ETT，500mM的乙腈溶液)用作激活物溶液。偶合时间为6分钟。为了引入硫代磷酸键，使用100mM3-乙氧基-1，2，4-二噻唑啉-5-酮(EDITH，获自Link Technologies，Lanarkshire，Scotland)在无水乙腈中的溶液。

支持物结合的寡聚体的裂解和脱保护

在最终固相合成后，将干燥的固体支持物转入15mL试管，用甲胺的甲醇溶液(2M，Aldrich)在45℃处理180min。离心后，将上清液转入新15mL试管，用1200μL N-甲基吡咯烷-2-酮(NMP，Fluka，Buchs，Switzerland)洗涤CPG。将洗涤液与甲醇的甲胺溶液合并，加入450μL三乙胺三氢氟酸盐(TEA·3HF，Alfa Aesar，Karlsruhe，Germany)。使该混合物达到65℃150min。冷却至室温后，加入0.75mL NMP和1.5mL乙氧基三甲基硅烷(Fluka，Buchs，Switzerland)。10min后，通过离心收集沉淀的寡核糖核苷酸，弃去上清液，用1mL缓冲液A(参见下文)再溶解固体。

寡核糖核苷酸的纯化

通过强阴离子交换(SAX)HPLC、使用制备型22x 250mm DNA Pac100柱(Dionex，Idstein，Germany)、用AKTA Explorer系统(GE Healthcare)纯化粗寡核糖核苷酸。缓冲液A由10mM NaClO₄、1mM EDTA、10mMTris，pH7.4、6M脲和20％乙腈组成。缓冲液B具有在缓冲液A中的500mMNaClO₄。使用的流速为4.5mL/min。记录在260和280nm的UV痕迹。使用55min内的20％B-45％B梯度。收集适合的级分，用3M NaOAc，pH＝5.2和70％乙醇沉淀。

通过RP HPLC、使用XTerra Prep MS C8 10x 50mm柱(Waters，Eschborn，Germany)、用AKTA Explorer系统(GE Helthcare)纯化粗Nu547标记的寡聚体。缓冲液A是100mM乙酸三乙铵(Biosolve，Valkenswaard，The Netherlands)，缓冲液B包含在缓冲液A中的50％乙腈。使用5mL/min流速。记录260、280和547nm(在Nu547标记的寡核糖核苷酸的情况中)处的UV痕迹。使用在58个柱体积(CV)内的梯度5％B-60％B。收集适合的级分，用3MNaOAc，pH＝5.2和70％乙醇沉淀。

最终，通过使用包含Sephadex G-25(GE Healthcare)的柱的尺寸排阻色谱法使纯化的寡聚体脱盐。根据使用UV光度计(Beckman Coulter，Krefeld，Germany)在260nm的吸光度测量值确定溶液的浓度。直到退火，将各链作为冷冻溶液贮存在-20℃。

小分子RNA缀合物的制备

使装配马来酰亚胺官能团的小分子与RNA通过硫醚键共价缀合。为了使这种化学过程成为可能，使用1mL TCEP(0.5M水溶液，获自Sigma Aldrich)在水(5mL)中将包含5’-二硫键的～60mg RNA还原成相应的硫醇。一旦分析型阴离子交换HPLC显示反应完成(在室温～2h)，在-20℃用30mL乙醇/3M NaOAc(pH5.4)32∶1(v/v)将RNA沉淀过夜。通过离心收集沉淀，用于随后的小分子缀合。

在典型缀合反应中，将10mg RNA溶于2mL磷酸钠缓冲液(0.1M，pH7.0)。在5分钟内向该溶液中加入小分子(0.12mM)在ACN/NMP1∶1(v/v)中的溶液。一旦RP LC-ESI MS显示输入的RNA耗尽，则用水(～10mL)稀释该混合物，在-20℃将～40mL乙醇/3M NaOAc(pH5.4)32∶1(v/v)加入以沉淀缀合的RNA过夜。通过离心收集沉淀，溶于水，如果必要，通过阴离子交换HPLC、按照上述方法纯化。如果所述缀合物足够纯，则将该反应混合物通过尺寸排阻柱(Sephadex G-25，GE Healthcare)过滤。

为生成siRNA的寡核糖核苷酸的退火

通过合并等摩尔的RNA溶液使互补链退火。冻干该混合物，用适当体积的退火缓冲液(100mM NaCl、20mM磷酸钠pH6.8)再溶解，以达到期望的浓度。将该溶液在95℃放入水浴，在3h内冷却至rt。表3：siRNA序列信息；小写字母：2′-OMe核苷酸；s：硫代磷酸键；dT：脱氧胸苷；(C6SSC6)：C-6二硫键；(Cy5)：酞菁5染料。

进行如下试验以评价靶分子对sLFA-1/ICAM-1 ELISA和Mac-1/ICAM-1相互作用的效应。

在4℃用50μl/孔的2.0ug/ml sLFA-1或Mac-1受体在二价阳离子缓冲液(1mMMnCI₂，0.14M NaCl，20mM HEPES pH7.2)中的溶液将培养板包被过夜。在37℃将250μl的封闭缓冲液(1％BSA的二价阳离子缓冲液溶液)加入到各孔中1小时。用洗涤缓冲液(TBS/0.05％ Tween-20/1mMMnCl₂)将培养板洗涤3次。将测试化合物溶于DMSO。进行一系列1∶3稀释，以达到0.45nM-3uM的浓度范围。将50μl结合缓冲液(0.5％BSA的二价阳离子缓冲液溶液)/1％DMSO和50μl测试溶液加入到适合的孔中，温育1小时。将50μl 5dICAM-Fc(27ng/ml)加入到适合的孔中，将50μl结合缓冲液加入到非特异性结合孔中，温育2小时，洗涤。将100μl 1∶4000HRP-山羊抗-huIgG加入到各孔中，温育1小时，洗涤。将100μl1∶1TMB溶液加入到各孔中，在室温展开20min。通过添加100μl H₃PO₄至各孔中终止显色。在450nm测定吸光度。结果如下表4和5中所示。

测定对照化合物(142和143)分别具有37和11nM的IC₅₀。推定细胞的LFA-1受体结合对照化合物。

用于靶向递送的与FITC荧光团和siRNA共价连接的整联蛋白拮抗剂的小分子衍生物的细胞渗透性和定位的证据

方法

在37℃将生长培养基(具有10％FBS的RPMI1640)中的AMLMV4-11细胞与Duplex-27(500nM)一起温育1小时。为了测定VLA-4独立的结合，在一种条件下包括140(10μM)以阻断VLA-4依赖性结合。温育后，用D-PBS将细胞洗涤2次，用1％低聚甲醛固定10分钟。通过成像细胞计量术、使用ImageStreamx(Aminis Corporation，Seattle)分析siRNA的摄取。结果如表A和图1-4中所示。

表A

化合物(浓度)	平均Cy3强度
		无	638
140(10μM)	663
		Duplex-27(500nM)	4007
140(10μM)+Duplex-27(500nM)	2273

用于敲除AHA1mRNA细胞系统中的5’-有义链修饰的siRNA的测定

材料和方法

逆转染：用终浓度为50nM的所示的siRNA、使用0.15μl/孔的DharmaFect-1转染试剂转染H1299细胞。然后将细胞以5000细胞/孔在96-孔培养板上铺板，在37℃温育48小时。

使用由供应商报道的支链DNA测定法测定siRNA敲除的效力；这种敲除结果如图5中所示。通过同一孔中的GAPDH的绝对表达评价相对细胞存活力(图6)。

除非有相反的描述，否则如所述的那样制备和表征实施例中的所有化合物。将本文引述的全部专利和出版物完整地引入本文作为参考。

Claims (22)

1.式I的化合物：

或其药学可接受的盐或酯；其中n是1-24，且其中：

R1选自：

(1)下式的化合物：

(2)下式的化合物：

(3)下式的化合物：

其中Q是H或OH；

R2选自：

(1)下式的化合物：

(2)下式的化合物：

(3)下式的化合物：

(4)下式的化合物：

其中R3是缀合部分，且X表示硫或下式的化合物：

2.根据权利要求1的化合物，其中R1是下式的化合物：

3.根据权利要求1的化合物，其中R1是下式的化合物：

4.根据权利要求1的化合物，其中R1是下式的化合物：

其中Q是H或OH。

5.根据权利要求4的化合物，其中Q是H。

6.根据权利要求4的化合物，其中Q是OH。

7.根据权利要求1-6任一项的化合物，其中R2是下式的化合物：

8.根据权利要求1-6任一项的化合物，其中R2是下式的化合物：

9.根据权利要求1-6任一项的化合物，其中R2是下式的化合物：

10.根据权利要求1-6任一项的化合物，其中R2是下式的化合物：

其中R3是单链或双链寡核苷酸，且X表示硫或下式的化合物：

11.根据权利要求10的化合物，其中X表示硫。

12.根据权利要求10的化合物，其中R3是siRNA分子。

13.根据权利要求7的化合物，其中R1是下式的化合物：

14.根据权利要求7的化合物，其中R1是下式的化合物：

15.根据权利要求7的化合物，其中R1是下式的化合物：

其中Q是H或OH。

16.根据权利要求1的化合物，其选自：

(S)-3-{3-[2-(2-{2-[2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酰基氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}氨基)丙酸；和

(S)-3-{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酰基氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}氨基)丙酸。

17.根据权利要求1的化合物，其选自：

(S)-3-{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-丙酰基氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}氨基)丙酸；和

(S)-3-{4-[4-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-氨基-丙氧基)-2，6-二氯-苯甲酰基氨基]-苯基}-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-丙酸。

18.根据权利要求1的化合物，其选自：

(S)-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-3-(4-{2，6-二氯-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苯甲酰基氨基}-苯基)-丙酸；和

(S)-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-3-(4-{2，6-二氯-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苯甲酰基氨基}-苯基)-丙酸。

19.根据权利要求1的化合物，其选自：

(S)-2-[2-氯-4-(3-羟基-苄基氨基甲酰基)-苯甲酰基氨基]-3-(4-{2，6-二氯-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苯甲酰基氨基}-苯基)-丙酸；和

(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基氨基]-丙基-氧基}-苯基)-羰基]-氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸。

20.根据权利要求1的化合物，其选自：

(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基氨基]-丙基-氧基}-5-羟基-苯基)-羰基]-氨基}-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸；和

(S)-3-[({3-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙基-氧基]-5-羟基-苯基}-羰基)-氨基]-2-({2-[3-(3-羟基-苯基)-丙基氨基]-4，6-二甲基-嘧啶-5-羰基}-氨基)-丙酸。

21.药物组合物，其包含根据权利要求1-20任一项的化合物和药学可接受的载体。

22.根据权利要求1-20任一项的化合物在制备用于治疗或预防炎症、癌症或代谢性疾病或病症的药物中的用途。