HK1131661B - 通过分析低频电磁信号来表徵有生物学活性的生物化学元件的方法 - Google Patents

Description

通过分析低频电磁信号来表征有生物学活性的生物化学元件的方法

本发明涉及通过分析在过滤后、优选在稀释后产生的电磁信号来表征微生物或其结构或分子组分的生化材料特征的领域。

在Jacques BENVENISTE教授的工作之后，用电脑声卡记录并数字化生物活性分子的特异活性就广为人知了。在现有技术中分析的分子是天然物质(组胺，咖啡因，尼古丁，肾上腺素......)或药物。

现有技术中，人们提出以模拟或优选地以数字形式接收或传输此信号。

在这些研究中，欧洲专利EP0701695描述了一种以显示已知物质特异性的生物活性或生物特性为特征的信号的传递装置和方法。它还描述了具有上述生物活性的从第一载体材料至第二材料的这种信号的处理以及通过这种方法获得的材料，所述第二材料与所述第一材料物理性分开并且最初没有所述已知物质的物理存在。现有技术中的这种方法包括放大由所述第一材料放射的所述电或电磁信号且被传感器接收，并将以显示第一材料的生物活性或生物特性为特征的信号传递到发射器，然后在第二材料中检测以显示所述已知物质特异性的生物活性为特征并且以高增益放大方式被传输至所述第二材料的信号。

已知法国专利FR2811591描述了一种产生以所研究物质的生物学或/和化学活性为特征的信号尤其是电信号的方法，以处理那些最初没有特定生物活性的接收物质(une substance réceptrice)尤其是水，因此在被处理后其就具有生物活性。处理后的接收物质在下文称为“被处理物质”(或被调查物质(Matière Informée))。当接收物质是水时，被处理物质称为“被处理水”(或被调查水)。有生物活性的物质还可是制品或顺势颗粒(granuleshoméopathiques)形式。

国际专利申请WO0001412描述了一种活化非活性溶液的方法，在溶剂中具有非常低浓度的化学和/或生物已知物质，所述方法包括把所述溶液放到机械激励场(un champ d’excitation mécanique)中，搅动所述溶液以产生所述机械激励场。在所述溶液中所述已知物质的浓度小于10^-6摩/升。

本发明的目的是提供针对所述技术的改进以扩展应用范围及其性能。

为此，在最广泛的意义上，本发明涉及通过分析由被分析的生物材料样品制备的溶液发射的低频电磁信号来表征具有生物活性的生物化学元件的方法，特征在于其包括预过滤阶段(uneétape préalable de filtration)。

优选地，所述样品在分析阶段之前通过孔隙率小于或等于150纳米及更特别地孔隙率在20纳米至100纳米之间的滤器过滤。

有利地，稀释阶段的稀释度在10^-2至10^-20之间，特别是在10^-2至10^-9之间。

根据优选的实施方案，所述方法包括强力搅动阶段和/或离心阶段。

根据优选的实施方案，当获得电磁信号时，通过白噪声激发(excitation)所述溶液。

本发明特别涉及所述表征方法分析微生物的应用。

它还涉及一种生物分析，包括记录通过将所述表征方法应用到已知生物化学元件获得的特征信号，以及比较获得的特征信号和预先记录特征信号的要被表征的生物化学元件的特征信号。

本发明还涉及一种生物学抑制方法，包括记录至少一种通过将所述表征方法应用到至少一种已知生物化学元件获得的特征信号，并根据所述特征信号将抑制信号运用到样品上。

本发明也涉及用于生物分析的装置，其包括通过应用本发明的表征方法获得溶液发射的电磁信号的传感器和用来处理所述信号以计算被分析样品的特征信号的电路和用来比较如此计算的特征信号和预先记录的特征信号的基数(une base)的电路。

通过阅读如下说明书以及参考相应于非限制性实施方案的附图可以更好地理解本发明，其中：

-图1是信号接收装置的概括图；

-图2是在没有任何发射源时由螺线管产生的电信号示意图(背景噪声)；

-图3、4示出了在分别用0.02微米和0.1微米过滤后，存在发射源(梨支原体(M.Pirum))时由螺线管产生的电信号示意图；

-图5是在没有任何发射源时由螺线管检测到的波长分布的三维柱状图(背景噪声)；

-图6示出了在0.02微米过滤后存在发射源(梨支原体)时由螺线管检测到的波长分布的三维柱状图；

-图7示出了在相同背景噪声下的傅立叶分析(未过滤的源电流的谐波)；

-图8示出了存在发射源(梨支原体)时由螺线管产生的信号的傅立叶分析；

-图9示出了用来预先记录信号的放大装置的概括图。

下文中，应注意：

^*活的生物体悬浮在血液样品的体外或体内培养基中时，更特别地是悬浮在存在抗凝剂优选肝素下提取的血浆中。

^*发射信号的纳米结构是从过滤过的以除去所有活生物体(对细菌用0.45微米、0.1微米或0.02微米，对病毒用0.45、0.02微米)的培养基或血浆中分离出的。

^*电磁信号记录在计算机中并可以用不同方式表示：

-总体上，每6秒记录两次，当信号是背景噪声的至少1.5倍时认为这个信号是正的

-在三维柱状图中分析

-由傅立叶变换分析。

本说明书通过分析发射信号来表征三个微生物的例子揭示了本发明方法的实施：

-梨支原体

-HIV(人免疫缺陷病毒)，IIIB株(LAI)

-大肠杆菌(Escherichia coli)K12细菌(E.Coli)

-感染HIV的患者血浆。

实验1：应用到CEM细胞中的梨支原体的培养物

在10％胎牛血清RPMI1640培养基中制备CEM细胞的梨支原体培养物。这些健康细胞示出了与梨支原体存在相关的典型聚集物(agrégatstypiques)的存在。

低速离心悬浮液以除去细胞。上清液经过0.45μPEVD Millipore(商品名)滤器过滤后，过滤液又经过0.02μWhatman Anotop(商品名)滤器或0.1μMillipore(商品名)滤器过滤。

与在相同条件下过滤的未感染CEM细胞的上清液比较。溶液在层流通风橱中在完全RPMI中以10倍10倍地稀释到10^-7。在后续稀释前，在涡流器(最大功率)处理每种溶液15秒。

信号检测由图1示意图中所示设备进行。所述设备包括灵敏度在0至20000赫兹的螺线管单元(1)，其置于由绝缘材料制成的平台上。要读数的溶液分配在1.5毫升的圆锥塑料管(2)Eppendorf(商品名)中。液体体积通常为1毫升，在一些情况下为0.3到0.5毫升，在响应上没有任何值得注意的区别。每份样品在6秒内读取两次，每个读数分别输入。

螺线管发出的电信号由声卡(4)放大后传送到电脑(3)上，电脑上适当软件给出了所记录元件的视觉图像：

原始总体振幅图像由图2，3和4所示。可以观察到背景噪声(-)(图2)，这个噪声被平均。当振幅超过背景噪声至少1.5倍时，可以检测到一个正信号，定义为(+)。通常，检测到的振幅是背景噪声的两倍(++)，有时是三倍：检测到的信号将被称为SEM电磁信号。

-背景噪声和存在样品时的信号的3d柱状图分析分别示于图5和6。

-背景噪声和存在样品时的信号分别由傅立叶变换分解为各个频率示于图7和8。

结果：

1)SEM发射

未过滤的悬浮液：在未感染对照和感染的悬浮液中观测到背景噪声(-)。图2是检测到的信号的原始总体振幅表示图。

0.02微米过滤的溶液。图3是检测到的信号的原始总体振幅表示图：可以观察到明显的不同。来自支原体悬浮液的溶液直到稀释度为10^-7都是(++)。未感染CEM对照是(-)。从10^-6稀释度开始进行了几小时的一个补充实验可以使得在稀释度10^-14都是正值(++)，到了稀释度10^-15为(+)。第一个实验的稀释度10^-6和10^-7在20℃下几小时后仍保持(++)。

0.1u过滤的溶液。图4是检测到的原始总体振幅表示图。梨支原体滤液直至稀释度10^-7都是(++)。对照除了在稀释度为10^-2的1个读数以外都为负值。值得注意的是有8个对照管靠近梨支原体管，他们都被置于相同的塑料支持物上。其中一个管子的正值可以由通过管壁从一个管子到另一个管子的信号传递来解释。

正频率的傅立叶分析显示了强度递减顺序的不同峰值：对于10^-6和10^-7为1000，2000，3000，1999，999，2999，500，399，300，900(全部经0.02过滤)。

3D分析(图6)显示了一个在正信号(+)中向最高频的位移。

实验2：在无Ca++和Mg++的PBS中20-70％蔗糖的密度梯度平衡离心 中SEM源的行为

在4℃，以每分钟35000转离心。从+4℃过夜保存的第一次0.02μ滤液开始。在离心之前证实其是正的。

离心后，从管底收集12个级分。测量折射率以确定密度梯度。

然后将级分重新以两两分组。在RPMI16/40+10％胎牛血清的培养基中稀释到10^-7。

用由许多源发射的信号的自干扰(auto-interférence)可以解释较少稀释的级分的负值。这种自身抑制可以如下检测：混合0.1毫升未稀释元件和0.4ml的10^-4的稀释液：涡旋后，可以有效地观测到变成负值的信号淬灭。

 

样品池5-6，密度1.21-1.225	样品池7-8，密度1.165-1.194
		未稀释(-)	未稀释(-)

 

样品池9-10，密度1.112-1.114	样品池11-12-13(高)

注意电磁信号源表现像具有较大大小(但是<0.02μ)和密度在1.16至1.26之间的聚合物。

存在一个非离心原始制品中未见到的区间作用(un effet de zone)。直至稀释度10^-4都出现具有峰值(5-6和7-8)的自干扰。

实验3：应用于HIV1/IIIB感染的CEM细胞培养物

这个实验涉及被HIV1/IIIB感染的CEM细胞培养物，它由两次培养制备。

-4天：开始致细胞病变作用(CPE)

-6天：CPE++作用

与未感染的CEM对照培养物比较。

操作方法包括如下步骤：

-用0.45微米过滤上清液

-然后用0.02微米过滤

-在RPMI培养基+牛血清中10倍10倍地稀释滤液至10^-7

-在每个稀释步骤涡旋强力搅拌15秒。

结果：

1)用4天的培养物，没有观察到任何高于背景噪声的信号。直至稀释度为10^-7，与未感染CEM对照没有任何区别。

2)用6天感染的培养物：

10^-1至10^-5          (-)

10^-6                (++)

10^-7                (++)

10^-8                (++)

10^-9至10^-15         (-)

再做一遍自干扰实验：

0.1ml的10^-1溶液(负)+0.4ml的10^-7溶液(正)：后一个变成了负值。因此，在低稀释度也会发生自干扰。

3)分析密度梯度

用BECKMANN(商品名)SW56转子在4℃以每分钟35000转用20-70％蔗糖的密度梯度平衡离心经0.02微米过滤的正培养物的上清液。

以相似方式处理未污染CEM细胞的对照上清液。

离心后，收集13个级分，两两分组。用ABBE(商品名)折光计确定一些级分的折射率以确定密度梯度。

400ml级分在RPMI16/40培养基和牛血清中稀释。由这些级分开始以10倍进行连续稀释。

注意是密度为1.23-1.24和密度为1.19-1.21的组直至稀释度10^-7都是正的。密度为1.15-1.16的组至稀释度10^-7都给出正信号。无论如何稀释，管顶部的组均没有信号。

在管底部的组(密度1.25-1.28)仅在一些稀释度时给出正信号。

与梨支原体相反，开始滤液发生自干扰而梯度级分没有自干扰。

与梨支原体一样，在这种情况中大部分信号集中在密度为1.19-1.26的级分，在接近较低的1.16密度级分出现一个肩(uneépaule)。

实验5：梨支原体的SEM源失活试验

在Eppendorf试管中放入1毫升的梨支原体0.02微米过滤的10^-1稀释液。这个试管置于有源螺线管中10分钟，放大后预先记录具有相同稀释度的梨支原体制品的原始电信号。

图9是所述设备概括图，包括具有声卡(4)的电脑3，声卡输出与最大功率为60瓦的放大器(10)相连，如实施例所述。放大信号施加给Eppendorf管(12)放置的挠性螺线管(un  flexible)(11)。被施加的信号用设备(13)测量。

不同类型的放大信号对发出正信号的梨支原体悬浮液施加10分钟。

a)被放大的相同信号：开始信号是正的。相反，含有负的未感染CEM细胞的0.02微米滤液的对照管变成正的。这提示可以在非活性介质中传递电磁信号，只要其初始波谱未被改动。

b)如果在梨支原体纳米结构发射的电磁信号谱中选择最高强度频率(179，374，624，1000，2000赫兹)，在施加这些放大了的频率后，信号依然保持是正的。

c)相反，如果施加相位颠倒的相同信号，SEM正值消失。

当使用相位颠倒的梨支原体发射的所有SEM细胞时，也是这样。

d)通过自干扰也可以中和所述信号，即用另一种微生物(大肠杆菌)的信号。

试验4：分析具有不同感染(HIV，尿素分解尿素支原体(Uréaplasma urolyticum)尿道炎和类风湿性关节炎)的人的血浆

这种分析示出这些过滤一次且适当稀释的血浆传输与在体外相同微生物传输的信号相类似的信号，除了尚未鉴定多关节炎的感染原因。

特别地，通过抗逆转录病毒三联疗法治疗AIDS感染患者时，这种信号由高稀释度血浆(直到10^-16)发射，提示其在血浆病毒攻击消失之后大量存在并且对治疗后残余的剩余感染有作用。

总结

不同性质的微生物例如逆转录病毒(HIV)、无坚硬胞壁类似于Gram+(梨支原体)的细菌、有坚硬胞壁的Gram-的细菌(大肠杆菌)在水溶液中产生了持久的纳米结构。

在除去微生物物理颗粒的必需的过滤步骤之后，这些纳米结构(大小小于100纳米)发射可以记录并数字化的复杂的低频电磁信号。

从被这些微生物感染的患者血浆得到相同结果。

微生物的这些纳米结构不同，其使得这些微生物产生了广泛的密度光谱和对冷冻的灵敏性。其发射的信号可以用预先记录的相位颠倒的信号通过自干扰或通过与其他微生物的信号的自干扰而中和。

Claims (14)

1.一种表征有生物活性的生物化学元件的方法，其通过分析由分析材料样品制备的溶液发射的低频电磁信号而进行，其特征在于包括预过滤阶段，其中所述样品在分析阶段前通过孔隙率小于150纳米的滤器过滤。

2.如权利要求1所述的表征生物化学元件的方法，其特征在于所述样品在分析阶段前通过孔隙率在20纳米至100纳米之间的滤器过滤。

3.如权利要求1或2所述的表征生物化学元件的方法，其特征在于所述方法包括稀释阶段，所述稀释阶段的稀释度在10^-2至10^-20之间。

4.如权利要求3所述的表征生物化学元件的方法，其特征在于稀释度在10^-2至10^-9之间。

5.如权利要求1所述的表征生物化学元件的方法，其特征在于其包括强力搅动阶段。

6.如权利要求1所述的表征生物化学元件的方法，其特征在于其包括离心阶段。

7.如权利要求1所述的表征生物化学元件的方法，其特征在于在获得电磁信号时，溶液用白噪声激发。

8.如前述权利要求中至少一项所述的表征方法在分析微生物中的应用。

9.一种表征生物化学元件的方法，包括：

(a)记录通过分析由预先过滤阶段后的已知生物样品制备的溶液发射的低频电磁信号获得的特征信号，所述预先过滤在分析阶段前用孔隙率小于或等于150纳米的滤器进行，

(b)记录通过分析由预先过滤阶段后的待表征生物样品制备的溶液发射的低频电磁信号获得的特征信号，所述预先过滤在分析阶段前用孔隙率小于或等于150纳米的滤器进行，和

(c)比较待表征的元件的特征信号和预先记录的特征信号。

10.如权利要求9所述的表征生物化学元件的方法，其中(a)和/或(b)中的滤器的孔隙率在20纳米和100纳米之间。

11.权利要求1所述的表征方法用于生物抑制的应用，其特征在于其包括记录有生物活性的生物化学元件的至少一种特征信号的阶段，包括分析由在分析阶段前用孔隙率小于或等于150纳米的滤器预先过滤阶段后的已知分析材料制备的溶液发射的低频电磁信号，并且之后根据所述特征信号将抑制信号施加给样品。

12.如权利要求11所述的应用，其中滤器的孔隙率在20纳米和100纳米之间。

13.用于根据如权利要求1所述的方法表征生物化学元件的装置，所述装置包括在分析阶段前用通过孔隙率小于或等于150纳米的滤器过滤的样品制备溶液的手段，用来接收从溶液发射的电磁信号的传感器，用来处理所述信号来计算被分析样品的特征信号的电路和用来比较如此计算的特征信号和预先记录的特征信号基数的比较电路。

14.如权利要求13所述的装置，其中滤器的孔隙率在20纳米和100纳米之间。