GR20190100504A - Μεθοδος για την αναπτυξη μιας πλατφορμας για την παραγωγη δυναμενων για μεταφορα μεσω πεπτιδιου μεταγωγης (ptd), in vitro μεταγραφομενων (ivt) mrna θεραπευτικων - Google Patents

Abstract

Η εφεύρεση αυτή σχετίζεται με μια μέθοδο για την ανάπτυξη μιας πλατφόρμας για την παραγωγή δυνάμενων για μεταφορά μέσω πεπτιδίου μεταγωγής (PTD), in vitro μεταγραφόμενων (IVT) mRNA θεραπευτικών, όπου η Τεχνολογία Πεπτιδίων Μεταγωγής (Protein Transduction Domains—PTDs) χρησιμοποιείται ως πλατφόρμα μεταγωγής για θεραπευτικά in vitro μεταγραφόμενα (IVT) mRNAs και η ανάπτυξη της εν λόγω πλατφόρμας μεταγωγής επιτυγχάνεται με ομοιοπολική χημική αντίδραση μεταξύ των εν λόγω μορίων IVT-mRNA και ενός επιλεγμένου πεπτιδίου μεταγωγής, το PFVYLI. Είναι αξιοσημείωτος ο συνδυασμός της τεχνολογίας PTD με IVT-mRNA, μέσω ομοιοπολικής χημικής σύνδεσης-σύζευξης, όπου το εν λόγω IVT-mRNA συζεύγνυται με ένα πεπτίδιο μεταγωγής (PTD) μέσω του οποίου επιτυγχάνεται η σταθερότητα της σύνδεσης μεταξύ του μεταφορέαPTD και του θεραπευτικού IVT- mRNA μορίου και έτσι προκύπτει το σύμπλοκο PTD-I VT-niRNA, το οποίο είναι πολύ σταθερό και όπου τα ανωτέρω IVT-mRNAs, τα οποία αποτελούν τα θεραπευτικά μόρια, υποβάλλονται σε ενδοκυττάρια μεταγωγή μέσω της προαναφερθείσας ομοιοπολικής σύζευξης με το κατάλληλο πεπτίδιο μεταγωγής, ενώ μετά την μεταγωγή τα εν λόγω IVT-mRNAs κατευθύνονται στα ριβοσώματα και μεταφράζονταιστις αντίστοιχες πρωτεΐνες-στόχους για να εκδηλώσουν το θεραπευτικό τους αποτέλεσμα.

Description

Μέθοδος για την ανάπτυξη μιας πλατφόρμας για την παραγωγή, δυνάμενων για μεταφορά μέσω πεπτιδίου μεταγωγής (PTD), in vitro μεταγραφόμενων (IVT) mRNA θεραπευτικών

Πεδίο της εφεύρεσης

Η παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε μια μέθοδο για την ανάπτυξη μιας ασφαλούς πλατφόρμας ενδοκυττάριας μεταφοράς για τη βελτίωση της υγείας, συμπεριλαμβανομένης της τροφής.

Υπόβαθρο της εφεύρεσης

Η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται σε μια μέθοδο για την ανάπτυξη μιας ασφαλούς καινοτόμου πλατφόρμας ενδοκυττάριας μεταφοράς, μέσω της αξιοποίησης της τεχνολογίας των πεπτιδίων μεταγωγής (PTD), για την ενδοκυττάρια μεταγωγή θεραπευτικών in vitro μεταγραφόμενων mRNAs (IVT-mRNAs) και την ακόλουθη έκφραση της επιθυμητής πρωτεΐνης.

Το επιλεγόμενο πεπτίδιο μεταγωγής είναι ένα πεπτίδιο 6 αμινοξέων (6αα), όπως αποκαλείται PFVYLI, το οποίο συνδέεται ομοιοπολικά με το IVT-mRNA.

Το ανωτέρω θεραπευτικό IVT-mRNA που χρησιμοποιείται σε αυτή την πλατφόρμα μπορεί να είναι ένα οποιοδήποτε IVT-mRNA του ενδιαφέροντος, ανάλογα με το γονιδιακό μεταφραστικό προϊόν που πρέπει να μεταφερθεί ενδοκυτταρικά.

Η πλατφόρμα είναι σχεδιασμένη για να προσφέρει πολυάριθμες βελτιστοποιήσεις αναφορικά με προγενέστερες πλατφόρμες ενδοκυττάριας μεταφοράς, καθώς αντιμετωπίζει επιτυχώς προβλήματα σταθερότητας, μεταγωγής και μετάφρασης στο πεδίο των θεραπευτικών mRNA.

Η κύρια δυσκολία όλων των IVT-mRNA θεραπευτικών - που εμπεριέχει την in vivo μεταφορά τους - είναι η ενδοκυττάρια μεταφορά τους.

To IVT-mRNA, για να μεταφραστεί σε πρωτεΐνη, πρέπει: (1) να επιβιώσει στον εξωκυττάριο χώρο, που περιέχει υψηλά επίπεδα μοναδικών ριβονουκλεασών (RNασων), (2) να φτάσει στα κύτταρα του ενδιαφέροντος και, τέλος, (3) να διαπεράσει την κυτταρική μεμβράνη.

Το ιδανικό σύστημα μεταφοράς IVT-mRNA θα πρέπει να εκπληρώνει αρκετές λειτουργίες, όπως η ικανότητα: α) να σχηματίζει σύμπλοκα με το IVT-mRNA, β) να προάγει την ενδοκυττάρια πρόσληψη, γ) να προστατεύει το mRNA από την αποικοδόμηση από ενδοκυττάριες και εξωκυττάριες νουκλεάσες και δ) να επιτρέπει την απελευθέρωση του mRNA στο κυτταρόπλασμα.

Στο πεδίο αυτό της εφεύρεσης, το IVT-mRNA είναι ένα συνθετικό mRNA που προσομοιάζει με το ενδογενές mRNA και μετά την επιτυχή του μεταφορά εντός του κυττάρου μπορεί να μεταφραστεί στην επιθυμητή αντίστοιχη πρωτεΐνη.

Το ισχυρότερο πλεονέκτημα της τεχνολογίαςτου IVT-mRNA είναι ότι τα μόρια mRNA δεν παρεμβαίνουν στο γονιδίωμα του ξενιστή, επομένως δεν προκαλούνται ογκογόνες μεταλλάξεις. Επιπλέον, αυτή η τεχνολογία πλεονεκτεί σε σύγκριση με την πρωτεϊνική θεραπεία αντικατάστασης, με την παραγωγή βιοτεχνολογικά των επιθυμητών ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, ειδικά λόγω των χρονοβόρων και κοστοβόρων σταδίων καθαρισμού.

To IVT-mRNA αποικοδομείται μετά από λίγες ημέρες στο κυτταρόπλασμα μέσω φυσιολογικών μονοπατιών και ως εκ τούτου δεν απαιτεί ούτε αδρανοποίηση ούτε απομάκρυνση του IVT-mRNA, σε περιπτώσεις μη αναμενόμενης παρατηρούμενης τοξικότητας σε σύγκριση με στρατηγικές μέσω ιϊκών φορέων.

Μπορεί να χαρακτηριστεί ως ένα σύστημα «χτύπα και τρέξε» ή hit-and-run ), το οποίο δεν αφήνει τελικό γενετικό υπόλειμμα στα κύτταρα-δέκτες. Επί της αρχής, οι θεραπείες στηριζόμενες στο IVT-mRNA φαίνεται να είναι πολύ πιο ασφαλείς από τις θεραπείες στηριζόμενες σε DNA ή σε ιούς και είναι εφαρμόσιμες σε ένα ευρύ φάσμα ασθενειών, τόσο σε οξείες όσο και σε χρόνιες.

Θεωρητικά, δεν υπάρχει όριο μεγέθους για τη δημιουργία της επιθυμητής αλληλουχίας mRNA μέσω της in vitro μεταγραφής και η παραγωγή του IVT-mRNA μπορεί να πραγματοποιηθεί στις επιθυμητές κλίμακες με εμπορικά διαθέσιμα υλικά. Επιπλέον, η χρήση των IVT-mRNAs ως θεραπευτικών είναι «ευεργετική», λόγω της βιολογικής τους προέλευσης.

Επομένως, αυτό που χρειάζεται είναι μια βελτιωμένη μέθοδος για την ασφαλή ενδοκυττάρια μεταφορά των θεραπευτικών IVT-mRNAs, προκειμένου να μεταφραστούν στην επιθυμητή πρωτεΐνη.

Προγενέστερη τεχνική

Οι συμβατικές μέθοδοι για την ενδοκυττάρια μεταφορά των IVT-mRNAs περιλαμβάνουν την παραγωγή συμπλοκών χρησιμοποιώντας κατιονικά λιπίδια-φορείς όπως για παράδειγμα λιποφεκταμίνη ή DOTAP (Ν-[1-(2,3-διολεοϋλοξυ)προπυλ]-Ν,Ν,Ν-τριμεθυλαμμώνιο) συνδεδεμένα με τα αρνητικά φορτισμένα μόρια IVT-mRNA, σχηματίζοντας τα λιποσυμπλέγματα. Επιπρόσθετα, διάφορα βιοϋλικά χρησιμοποιούνται, όπως νανοσωματίδια, ιοσωμάτια, σύμπλοκα πρωταμίνης/IVT-mRNAs, μικροσωματίδια, πολυμερικά νανοσωματίδια, αυτοσυναρμολογούμενα υλικά και ικριώματα βιοϋλικών.

Μια ελπιδοφόρα πλατφόρμα ενδοκυττάριας μεταφοράς του IVT-mRNA αποτελείται από λιπιδικά νανοσωματίδια (LNPs) και πρόσφατα είχε επιτυχία στη μεταφορά μικρών μορίων ενδοπαρεμβολής RNAs (siRNAs) in vivo και υποσχόμενες κλινικές δοκιμές φάσης III, IVT-mRNAs μέσω των λιπιδικών νανοσωματιδίων (LNPs) αναπτύσσονται ως μια θεραπευτική προσέγγιση για μια σειρά ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλών τύπων καρκίνου, καθώς και των ιών Zika, Ebola, της ηπατίτιδας C και της γρίπης. Τα LNPs αυξάνουν τον χρόνο κατακράτησης του φορτίου IVT-mRNA in vivo και ενισχύουν την κυτταροπλασματική μεταφορά του IVT-mRNA. Ωστόσο, τα LNPs αντιμετωπίζουν το πρόβλημα της διαφυγής-απελευθέρωσης του IVT-mRNA, μετά από την ενδοκυττάρωση, καθώς και το ότι συνηθίζουν να συσσωρεύονται σε όργανα εκτός στόχου, όπως το ήπαρ, ενώ παρατηρήθηκαν περιπτώσεις αλλεργικών αντιδράσεων σε ανθρώπους.

Συνολικά, η παρουσία ορού έχει τεκμηριωθεί καλά, ότι ρυθμίζει την αποτελεσματικότητα διαμόλυνσης των συμπλοκών με λιποσυμπλέγματα και των συμπλόκων με πολυμερή. Επιπρόσθετα, το μέγεθος των συμπλοκών με λιπίδια, η πυκνότητα του επιφανειακού φορτίου, η κολλοειδής σταθερότητα και οι τροποποιημένοι μηχανισμοί πρόσληψης (συνήθως η ενδοκυττάρωση, που μεσολαβείται μέσω κλαθρίνης και καβεολίνης) έχουν προταθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο και θέτουν πρακτικά ζητήματα για την in vivo εφαρμογή τους.

Υπάρχει ανάγκη να αναπτυχθεί ένας νέος ουδέτερος φορέας χωρίς τους προαναφερθέντες περιορισμούς για τη μεταφορά του θεραπευτικού IVT-mRNA στη θέση-στόχο του.

Σκοπός της εφεύρεσης

Τα IVT-mRNAs, τα οποία αποτελούν μια νέα γενιά θεραπευτικών μορίων, μετά την επιτυχή ενδοκυττάρια χορήγησή τους, μέσω της προτεινόμενης ανακάλυψης, την ομοιοπολική συνένωση με το κατάλληλο πεπτίδιο μεταγωγής PTD, ειδικότερα το ανωτέρω πεπτίδιο PFVYLI, κατευθύνονται στα ριβοσώματα και μεταφράζονται προς τις αντίστοιχες επιθυμητές πρωτεΐνες, εγείροντας το αναμενόμενο θεραπευτικό αποτέλεσμα.

Συνοπτική περιγραφή της εφεύρεσης

Η PTD τεχνολογία χρησιμοποιεί μικρά πεπτίδια, ικανά να διαπερνούν σχεδόν όλες τις βιολογικές μεμβράνες, μεταφέροντας ενδοκυττάρια μια ποικιλία «φορτίων» από μικρομόρια, μικρά παρεμβατικά RNA, μέχρι μακρομόρια (πρωτεΐνες, RNA, πλασμιδιακό DNA, νανοσωματίδια).

Αυτή η εφεύρεση σχετίζεται με την ομοιοπολική σύνδεση ενός επιλεγμένου πεπτιδίου μεταγωγής, ήτοι το πεπτίδιο PFVYLI [Προλίνη (Ρ) - Φαινυλαλανίνη (F) - Βαλίνη (V) - Τυροσίνη (Υ) - Λεύκινη (L) - Ισολευκίνη (I)], το οποίο χρησιμοποιείται ως φορέας ουδέτερου επιφανειακού φορτίου για οποιοδήποτε θεραπευτικό IVT-mRNA ενδιαφέροντος, οδηγώντας σε μεγαλύτερη σταθερότητα παρουσία ορού, αυξάνοντας έτσι τη λειτουργικότητά του, αυξάνοντας την αντοχή του στον ορό και μειώνοντας τη μεταβλητότητα της διαμόλυνσης ανάμεσα στους διαφορετικούς τύπους κυττάρων.

Στην πραγματικότητα, η εφεύρεση PTD-IVT-mRNA (IVT-mRNA: PTD) εμφανίζει χαμηλότερη κυτταροτοξικότητα από άλλες μεθόδους διαμόλυνσης, όπως η λιποφεκταμίνη (Lpf2k), ένας κοινώς χρησιμοποιούμενος εμπορικός παράγοντας διαμόλυνσης για τα IVT-mRNAs.

Τα σύμπλοκα PTD-IVT-mRNA επιδεικνύουν υψηλή σταθερότητα σε χαμηλές και υψηλές συνθήκες ορού και πλάσματος σε σύγκριση με το γυμνό IVT-mRNA.

Αυτή η εφεύρεση επιτυγχάνει υψηλά ποσοστά διαμόλυνσης σε κυτταρικά μοντέλα, ακόμη και διπλασιασμό των επιπέδων μετάφρασης της επιθυμητής πρωτεΐνης, αυξάνοντας την Μέση Φθορίζουσα Ένταση (MFI . -Mean Fluorescent Intensity ) τρεις φορές (3Χ) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

Επιπλέον, η υποκυτταρική στοχευμένη μεταφορά της προς παραγωγή πρωτεΐνης, φαίνεται να επιτυγχάνεται ακόμη και σε οργανίδια, όπως τα μιτοχόνδρια του κυτταρικού μοντέλου που χρησιμοποιήθηκε.

Εν κατακλείδι, η προτεινόμενη τεχνολογία είναι γρήγορη και χαμηλού κόστους, ενώ επίσης έχει τα ακόλουθα πλεονεκτήματα :

• ασφάλεια, καθώς δεν υπάρχει ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή, καθώς και την παροδική φύση του IVT-mRNA.

• ενίσχυση της σταθερότητας των θεραπευτικών IVT-mRNAs.

· αποτελεσματικότητα της ενδοκυττάριας μεταγωγής και

• αύξηση των επιπέδων έκφρασης της αντίστοιχης θεραπευτικής πρωτεΐνης.

Τα PTD-IVT-mRNA σύμπλοκα, που προτείνονται σύμφωνα με την εφεύρεση, έχουν τη δυνατότητα να μεταφραστούν σε πρωτεΐνες, οι οποίες μπορούν:

α) να αντικαταστήσουν (1) τις αντίστοιχες απούσες ενδοκυττάριες πρωτεΐνες, ακόμα και αυτές που εντοπίζονται σε οργανίδια, σε μονογονιδιακές-μεταβολικές ασθένειες, ως θεραπεία πρωτεϊνικής αντικατάστασης, καθώς και (2) τα συστημικά εκκρινόμενα θεραπευτικά μόρια,

β) να μεταφερθούν στις μεμβράνες, στο πλαίσιο κυτταρικών θεραπειών, όπως η

ανοσοθεραπεία του καρκίνου με χιμαιρικούς αντιγονικούς υποδοχείς (CAR). Μια άλλη

προσέγγιση της στοχευόμενης θεραπείας του καρκίνου είναι επίσης η συστημική

χορήγηση του IVT-mRNA, που κωδικοποιεί ένα γονίδιο αυτοκτονίας (suicide gene)

[όπως η θυμιδυλική κινάση 1 του ιού του απλού έρπητα (HSV 1 -tk) ή άλλων σχετικών

με τον καρκίνο ιών],

γ) να εκκρίνονται στο πλαίσιο της ανάπτυξης εξατομικευμένων εμβολίων κατά ειδικών τύπων καρκίνου, έναντι των ταυτοποιημενών νεο-αντιγόνων, στο πλαίσιο της εξατομικευμένης ιατρικής,

δ) να κωδικοποιούν αντισώματα που εκκρίνονται για να εξουδετερώσουν τις κυτοκίνες, οι οποίες παίζουν καθοριστικό ρόλο στις φλεγμονώδεις - αλλεργικές αντιδράσεις του σώματος στο πλαίσιο προφυλακτικών εμβολίων,

ε) να κωδικοποιούν κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες σε αρκετά σωματικά κύτταρα και βλαστοκύτταρα,

στ) να συνεισφέρουν και στην ενδοκυττάρια μεταφορά μη κωδικοποιού μενών - σε πρωτεΐνη - μορίων RNA, όπως τα μικρής φουρκέτας RNAs (shRNAs), μικρά RNAs (miRNAs) για αποσιώπηση γονιδίων για θεραπευτικούς ή διαγνωστικούς σκοπούς,

(η) να οδηγήσουν σε κυτταρικό επαναπρογραμματισμό, για την άμεση επαγωγή της κυτταρικής διαφοροποίησης, στον επαναπρογραμματισμό σωματικών κυττάρων σε επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα για παράδειγμα με τη χρήση του IVT-mRNA διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων, όπως Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc, στην ανακατεύθυνση της διαφοροποίησης των κυττάρων σε επιθυμητούς κυτταρικούς τύπους (π.χ. από ινοβλάστες σε μυοκύτταρα ή ηπατοκύτταρα) ή και για την υπερέκφραση υποδοχέων ή παρακρινών παραγόντων π.χ. ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGFA) σε μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα για τη βελτίωση της συμπεριφοράς επιστροφής τους στο φυσικό τους χώρο {homing),

θ) να τροποποιήσουν γονιδιώματα σε θεραπείες γονιδιακής επεξεργασίας για την ενδοκυττάρια μεταφορά προγραμματιζόμενών νουκλεασών (ZFN, TALEN, και Cas9) στον ιστό ή στο κύτταρο στόχο. Ενδοκυττάρια μεταφορά των νουκλεασών αυτών, ως PTD-IVT-mRNA (IVT-mRNA :PTD) συμπλόκων, θα έχει αρκετά πλεονεκτήματα, όπως η παροδική έκφραση με αποδοτιική-αποτελεσματική in vivo και in vitro μετατόπιση, μη γεν ωμική ενσωμάτωση, δυνητικά χαμηλό ποσοστό εκτός-στόχου φαινομένων και υψηλή αποτελεσματικότητα γονιδιακής επεξεργασίας.

Σύντομη περιγραφή των σχεδίων

Το σχήμα 1 που επισυνάπτεται, απεικονίζει τον κύριο τρόπο ενσωμάτωσης της εφεύρεσης, ο οποίος είναι η χημική αντίδραση της ομοιοπολικής σύνδεσης-σύζευξης του πεπτιδίου μεταγωγής (PTD), όπως το πεπτίδιο PFVYLI με ένα θεραπευτικό in vitro μεταγραφόμενο (IVT) mRNA.

Τα γενικά στάδια της μεθόδου που προτείνεται σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση περιλαμβάνουν:

1. Επιλογή ενός υδρόφοβου PTD, όπου το πεπτίδιο PFVYLI είναι ένα υδρόφοβο πεπτίδιο έξι (6) αμινοξέων, με καθαρότητα > 95% και ακετυλιωμένο στο άμινο-τελικό άκρο (Ac-Pro-Phe-Val-Tyr-Leu-Ile-COOH). Αυτό το πεπτίδιο μπορεί να έχει πολύ χαμηλή υδατοδιαλυτότητα, ώστε να διατηρείται σε μορφή σκόνης στους -20°C και διαλύεται σε διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF, dimethylformamide), λίγο πριν από τη χρήση.

2. Διάλυση του πεπτιδίου μεταγωγής (PTD), όπου δείχνει την πουρομυκίνη ως το συνδέτη του πεπτιδίου με το νουκλεϊκό οξύ, δηλαδή το IVT-mRNA. Η πουρομυκίνη, ειδικότερα μια διυδροχλωρική πουρομυκίνη, θα συνδεθεί στο Ν-τελικό άκρο του PFVYLI με EDC.HC1 [υδροχλωρικό Ν-(3-διμεθυλαμινοπροπυλ)-Ν'-αιθυλοκαρβοδιιμίδιο].

3. Φωσφορυλίωση του προϊόντος πουρομυκίνη-PFVYLI, με την Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση (Τ4 ΡΝΚ).

4. Συνένωση της φωσφορυλιωμένης πουρομυκίνης-PFVYLI με το επιλεγμένο θεραπευτικό IVT-mRNA, με την Τ4 RNA λιγάση.

Περιγραφή της εφεύρεσης

Ένα από τα σημαντικότερα σημεία της πρωτοτυπίας της παρούσας εφεύρεσης είναι η χρήση της τεχνολογίας των πεπτιδίων μεταγωγής (PTDs) ως πλατφόρμα δυνάμενων για μεταφορά IVT-mRNA θεραπευτικών, η οποία αποτελεί ένα κύριο χαρακτηριστικό που παρέχεται χάρη στην παρούσα εφεύρεση και πρέπει να θεωρείται ως μη προφανής επιλογή από τη γνωστή προηγούμενη τεχνική.

Πράγματι, η ανάπτυξη αυτής της πλατφόρμας μεταφοράς επιτυγχάνεται με μια νέα ομοιοπολική χημική αντίδραση μεταξύ των μορίων IVT-mRNA και του επιλεγμένου πεπτιδίου μεταγωγής, ήτοι ενός πεπτιδίου PFVYLI, δίνοντας σοβαρά πλεονεκτήματα σε αντίθεση με τις ήδη γνωστές μεθόδους διαμόλυνσης.

Εκτός αυτού, σύμφωνα με τη γνωστή μέχρι σήμερα βιβλιογραφία, ο συνδυασμός της τεχνολογίας PTD με το IVT-mRNA, μέσω ομοιοπολικής χημικής συνένωσης -σύζευξης δεν έχει αναφερθεί.

Η σύζευξη του IVT-mRNA σε ένα PTD έχει επιτευχθεί χάρη στην παρούσα εφεύρεση και έχει επιβεβαιωθεί με διάφορες μεθόδους, καθώς επίσης και με τα υψηλά ποσοστά διαμόλυνσης σε κύτταρα,

II καινοτομία έγκειται στη σταθερότητα της σύνδεσης μεταξύ του πεπτιδίου μεταγωγής PTD και του θεραπευτικού μορίου IVT-mRNA, εφόσον ο ομοιοπολικός δεσμός παρέχει το πλεονέκτημα: α) της μείωσης απώλειας φορτίου και β) της προστασία του σε δυσμενείς συνθήκες κατά τη διάρκεια της in vivo μεταφοράς ή στο ενδοκυττάριο περιβάλλον, λόγω της ύπαρξης των ριβονουκλεασών.

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που επιτυγχάνονται χάρη στην παρούσα εφεύρεση, το σύμπλοκο PTD-IVT-mRNA φαίνεται να είναι πολύ σταθερό ακόμη και στο ανθρώπινο πλάσμα για μακρές περιόδους, καθώς αναμένεται να εγχυθεί ενδοφλέβια κατά τη διάρκεια της θεραπευτικής χορήγησης.

Η εφεύρεση αναφέρεται σε μια μέθοδο που περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια με συγκεκριμένη και καθορισμένη σειρά.

Τα αναλυτικά ειδικά στάδια της ομοιοπολικής σύζευξης του IVT-mRNA με το πεπτίδιο μεταγωγής PFVYLI είναι :

1. EDC.HC1 (0,242 mg EDC.HC1 διαλυμένο σε 200 μl Η2O = 6,3 mM) 4 μl αναμειγνύονται με 2 μl πουρομυκίνης [6,92 mg, διαλυμένα σε 1 ml DMF = 12,68 mM] και 1 mg PFVYLI σε 2 μl DMF και αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες.

2. Φωσφορυλίωση του συμπλόκου πουρομυκίνης-PFVYLI ακολούθως λαμβάνει χώρα, χρησιμοποιώντας 1 μl της Τ4 πολυνουκλεοτιδικής κινάσης (ΡΝK), 4 μl του ρυθμιστικού διαλύματος της Τ4 ΡΝΚ, 17 μl απεσταγμένου Η2O, κατεργασμένου με πυροκαρβονικό διαιθυλεστέρα (DEPC, Diethylpyrocarbonate) και 10 μl DMF. Η αντίδραση της φωσφορυλίωσης διεξάγεται σε θερμοκρασία 37° C, για 1 ώρα και 40 λεπτά, ακολουθούμενη από απενεργοποίηση του ενζύμου για 20 λεπτά στους 65°C.

3. Επώαση του συμπλόκου με 1,5 μl αναστολέα ριβονουκλεασών για διάρκεια 15 λεπτών σε θερμοκρασία 37°C.

4. Για 1 mg του πεπτιδίου PFVYLI υπολογίζεται να απαιτούνται 18 nM του αντίστοιχου θεραπευτικού in vitro μεταγραφόμενου mRNA. Το μοριακό βάρος αυτού του IVT-mRNA μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας εργαλεία βιοπληροφορικής. Για αυτό, εισάγεται η αλληλουχία του επιθυμητού IVT-mRNA, και με το μοριακό βάρος να υπολογίζεται, ανευρίσκεται η συγκέντρωση που θα προστεθεί στην αντίδραση.

Ένα παράδειγμα παρουσιάζεται παρακάτω, βάζοντας ως υπόθεση την X αλληλουχία.

Σύμφωνα με ένα εργαλείο:

1 Molar αντιστοιχεί σε 291,056 g

Άρα, 18 nmolar αντιστοιχούν σε 5,24 μg

Έτσι, για την αντίδραση με 1 mg του πεπτιδίου PFVYLI, απαιτούνται 5,24 μg του IVT-mRNA.

5. Τέλος, προστίθενται 1,5 μl Τ4 RNA λιγάσης, 6 μl ρυθμιστικού διαλύματος της Τ4 RNA λιγάσης, 18 nM IVT-mRNA και μέχρι τα 60 μl, με απεσταγμένο Η2O, κατεργασμένο με DEPC . Η αντίδραση συνένωσης διεξάγεται στους 16°C κατά τη διάρκεια της νύχτας και το ένζυμο απενεργοποιείται στους 70°C για 10 λεπτά.

6. Η επιτυχής χημική ομοιοπολική σύζευξη του PFVYLI με το IVT-mRNA μπορεί να αξιολογηθεί με ηλεκτροφόρηση σε 8Μ ουρία / 6% πηκτή πολυακρυλαμιδίου μετά από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο (Miyamoto -Sato et al., 2003). Αυτή η μέθοδος μπορεί επίσης να ονομάζεται «δοκιμασία καθυστερημένης μετατόπισης», όπου η σύνδεση στο PFVYLI με το PTD επιδεικνύει σαφώς την καθυστερημένη μετατόπιση του IVT-mRNA στην πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε σύγκριση με το γυμνό IVT-mRNA.

Ορισμένοι προτιμώμενοι τρόποι πραγμάτωσης της εφεύρεσης αναφέρονται παρακάτω με περισσότερες λεπτομέρειες, με βάση τον επισυναπτόμενο σχεδίασμά της ανωτέρω νέας μεθόδου για την παραγωγή μεταγώγιμων PTD-IVT-mRNA θεραπευτικών, παρουσιάζοντας τα διάφορα διαδοχικά στάδια της με τον ακόλουθο τρόπο :

1. Ως προς το βήμα Επιλογής ενός πεπτιδίου μεταγωγής (PTD).

Ένα οποιοδήποτε πεπτίδιο μεταγωγής, κατά προτίμηση υδρόφοβο, χωρίς ελεύθερη αμινομάδα, μπορεί να επιλεγεί.

Το επιλεγμένο αυτό PTD έχει, κατά προτίμηση, καθαρότητα > 95% και είναι ακετυλιωμένο στο αμινο-τελικό άκρο.

Το επιλεγμένο PTD συντίθεται, κατά προτίμηση, κατόπιν παραγγελίας.

Ειδικά, το PFVYLI επιλέγεται ως πεπτίδιο μεταγωγής, το οποίο αποτελείται από έξι (6) αμινοξέα (Ac-Pro-Phe-Val-Tyr-Leu-Ile-COOH).

2. Ως προς το βήμα Διάλυσης του PTD.

To PTD διαλύεται στον κατάλληλο διαλύτη, ανάλογα με τα χημικά χαρακτηριστικά του.

Το επιλεγμένο ειδικά πεπτίδιο PFVYLI, συντίθεται κατόπιν παραγγελίας. Αυτό παρουσιάζει πολύ χαμηλή υδατοδιαλυτότητα και επομένως διατηρείται σε μορφή σκόνης στους -20°C και, ακριβώς πριν από τη χρήση, διαλύεται σε DMF. Οποιοσδήποτε οργανικός διαλύτης, όπως διμεθυλοακεταμίδιο (DMA) ή διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), μπορεί να χρησιμοποιηθεί αντί του DMF.

3. Ως προς το βήμα Σύζευξης του PTD με τη Πουρομυκίνη με EDC.HC1.

Ως συνδέτης μπορεί να χρησιμοποιηθεί η πουρομυκίνη, κατά προτίμηση, διυδροχλωρική πουρομυκίνη, η οποία διαλύεται, κατά προτίμηση σε DMF. Αντί της πουρομυκίνης, άλλοι νουκλεοζίτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως συνδέτες.

To EDC.HC1 διαλύεται, κατά προτίμηση με απεσταγμένο Η2O, κατεργασμένο με DEPC.

1 mg του συγκεκριμένου πεπτιδίου μεταγωγής PTD, ήτοι διαλυμένου με 2 μl DMF, επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου, για 2 ώρες με

• 2 μl από το ανωτέρω διάλυμα πουρομυκίνης [12,68 raM] και

· 4 μl από το ανωτέρω διάλυμα EDC.FIC1 [6,3 mM]

με αποτέλεσμα να παράγεται μια πουρομυκίνη-PTD ( όπως αποκαλείται στο εξής puro-PTD) προϊόν.

Η πουρομυκίνη είναι ο συνδέτης μεταξύ του πεπτιδίου μεταγωγής και του IVT-mRNA, τα οποία προστίθενται στο βήμα 6.

4. Ως προς το βήμα Φωσφορυλίωσης του προϊόντος πουρομυκίνης-PTD.

Η πουρομυκίνη-PTD φωσφορυλιώνεται από το ένζυμο Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση (ΡΝΚ).

Ειδικότερα, αυτή η πουρομυκίνη-PTD φωσφορυλιώνεται, κατά προτίμηση, με τη χρήση 10 μονάδων από την Τ4 PΝΚ, IX του ρυθμιστικού διαλύματος της Τ4 ΡΝΚ, 10 μΐ από το διαλυτό PTD και με απεσταγμένο Η2O, κατεργασμένο με DEPC μέχρι τα 40 μl.

Η αντίδραση της φωσφορυλίωσης πραγματοποιείται στους 37°C, για 1 ώρα και 40 λεπτά, ακολουθούμενη από την απενεργοποίηση του ενζύμου Τ4 ΡΝΚ, κατά προτίμηση για 20 λεπτά, στους 65°C, όπου παράγεται το φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνης-PTD.

5. Ως προς το βήμα Αναστολής των ριβονουκλεασών.

Το φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνης-PTD επωάζεται με αναστολέα ριβονουκλεασών, κατά προτίμηση 60 μονάδες, για 15 λεπτά στους 37°C, για να απομακρυνθούν οποιεσδήποτε ριβονουκλεάσες από το μίγμα της παραπάνω αντίδρασης, προστατεύοντας έτσι το IVT-mRNA, το οποίο προστίθεται στο επόμενο στάδιο.

6. Ως προς το βήμα Συνένωσης του φωσφορυλιωμένου πουρομυκίνη-PTD προϊόντος με το IVT-mRNA,

Το παραπάνω φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνης-PTD (από 1 mg του PTD) συνδέεται με το επιλεγμένο - παραγόμενο θεραπευτικό IVT-mRNA χρησιμοποιώντας το ένζυμο Τ4 ΕΝΑ λιγάση.

Ιδιαίτερα, για την αντίδραση συνένωσης, το φωσφορυλιωμένο πουρομυκίμνη-PTD προϊόν επωάζεται με 15 μονάδες της Τ4 RNA λιγάσης, 1X του ρυθμιστικού διαλύματος της Τ4 RNA λιγάσης, 18 nM IVT-mRNA και έως τα 60 μl με απεσταγμένο Η2O,κατεργασμένο με DEPC .

Η αντίδραση αυτή της συνένωσης πραγματοποιείται στους 16°C, κατά τη διάρκεια της νύχτας και κατόπιν, το ένζυμο Τ4 RΝA λιγάση απενεργοποιείται, κατά προτίμηση στους 70°C για 10 λεπτά.

7. Ως προς το βήμα Αξιολόγησης της επιτυχούς έκβασης της προτεινόμενης καινοτόμου μεθόδου.

Η επιτυχής χημική ομοιοπολική σύζευξη του PTD με το IVT-mRNA μπορεί να αξιολογηθεί με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή. Η μέθοδος αυτή μπορεί να χαρακτηριστεί ως «δοκιμασία καθυστερημένης μετατόπισης», αφού η δέσμευση με το πεπτίδιο PTD δείχνει καθαρά την καθυστερημένη μετατόπιση του IVT-mRNA στην πηκτή σε σύγκριση με το γυμνό IVT-mRNA αναφοράς.

Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε αποδιατακτική πηκτή 8Μ ουρίας / 6% πηκτή πολυακρυλαμιδίου (PAGE), μετά από χρώση βρωμιούχου αιθιδίου (Miyamoto-Sato et al, 2003).

Εναλλακτικά, πηκτή αγαρόζης χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της επιτυχούς παραγωγής PTD-IVT-mRNA συμπλοκών (απλή ηλεκτροφόρηση πηκτής ή απο διατακτικές πηκτές αγαρόζης, που περιέχουν φορμαλδεΰδη ή γλυοξάλη/DMSO).

Claims (15)

ΑΞΙΩΣΕΙΣ

1. Μέθοδος για την ανάπτυξη μιας πλατφόρμας μεταφοράς για την παραγωγή δυνάμενων για μεταφορά, μέσω πεπτιδίου μεταγωγής (PTD), in vitro μεταγραφόμενων (IVT) mRNA θεραπευτικών (PTD-IVT-mRNA), όπου η Τεχνολογία Πεπτιδίων Μεταγωγής χρησιμοποιείται ως πλατφόρμα μεταγωγής για θεραπευτικά in vitro μεταγραφόμενα (IVT) mRNAs, όπου η ανάπτυξη της εν λόγω πλατφόρμας μεταγωγής επιτυγχάνεται με ομοιοπολική χημική αντίδραση μεταξύ των εν λόγω IVT-mRNA μορίων και ενός επιλεγόμενου πεπτιδίου μεταγωγής, ειδικά ένα πεπτίδιο PFVYLI [Ac-PFVYLI-COOH. Προλίνη (Ρ) -Φαινυλαλανίνη (F) - Βαλίνη (V) -Τυροσίνη (Υ) - Λεύκινη (L) - Ισολευκίνη (I)], η οποία μέθοδος χαρακτηρίζεται από το συνδυασμό της τεχνολογίας PTD με IVT-mRNA, μέσω ομοιοπολικής χημικής σύνδεσης - σύζευξης, όπου το ανωτέρω IVT-mRNA συζεύγνυται με ένα πεπτίδιο μεταγωγής, μέσω του οποίου επιτυγχάνεται η σταθερότητα της σύνδεσης μεταξύ του πεπτιδίου μεταγωγής PTD και του θεραπευτικού IVT-mRNA και προκύπτει έτσι ένα PTD-IVT-mRNA (IVT-mRNA:PTD) σύμπλοκο, το οποίο είναι πολύ σταθερό, όπου τα ανωτέρω IVT-mRNAs, τα οποία αποτελούν τα θεραπευτικά μόρια, υποβάλλονται σε ενδοκυττάρια μεταγωγή μέσω της ανωτέρω ομοιοπολικής σύνδεσης με το κατάλληλο PTD, ειδικότερα το εν λόγω PFVYLI πεπτίδιο, μετά την οποία τα ανωτέρω IVT-mRNAs κατευθύνονται στα ριβοσώματα και μεταφράζονται στις αντίστοιχες πρωτεΐνες-στόχους για να εκδηλώσουν το θεραπευτικό τους αποτέλεσμα, και όπου η εν λόγω ομοιοπολική σύνδεση-δεσμός μειώνει την απώλεια φορτίου και ενισχύει την προστασία σε δυσμενείς συνθήκες κατά τη διάρκεια της in vivo μεταγωγής ή στο ενδοκυτταρικό περιβάλλον, λόγω της ύπαρξης των ριβονουκλεασών.

2. Μέθοδος για την ανάπτυξη μιας πλατφόρμας για την παραγωγή, δυνάμενων για μέσω PTD, IVT-mRNA θεραπευτικών (PTD-IVT-mRNA), ειδικότερα σύμφωνα με την αξίωση 1, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι η εν λόγω μέθοδος συνίσταται σε μια χημική αντίδραση ομοιοπολικής σύζευξης του PTD, όπως το πεπτίδιο PFVYLI (Ac-PFVYLI-COOH), σε ένα θεραπευτικό IVT-mRNA, μετά την πολυ-(Α) ουρά του, η οποία περιλαμβάνει τα γενικά στάδια:

1. Επιλογή ενός πεπτιδίου μεταγωγής,

2. Πουρομυκίνη ως συνδέτης του πεπτιδίου με το νουκλεϊκό οξύ, δηλαδή το in vitro μεταγραφόμενο (IVT) mRNA.

3. Φωσφορυλίωση, και

4. Συνένωση

3. Μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 2, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο ανωτέρω πρώτο βήμα της Επιλογής, το ανωτέρω PFVYLI είναι ένα υδρόφοβο πεπτίδιο από έξι (6) αμινοξέα, καθαρότητας > 95% και ακετυλιωμένο στο αμινο-τελικό άκρο (Ac-Pro-Phe-Val-Tyr-Leu-Ile-COOH), το οποίο συντίθεται κατόπιν παραγγελίας όπου αυτό το πεπτίδιο έχει πολύ χαμηλή υδατοδιαλυτότητα, και διατηρείται σε μορφή σκόνης στους -20°C και κατόπιν διαλύεται σε διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF), λίγο πριν από τη χρήση.

4. Μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 2 ή 3, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο ανωτέρω δεύτερο βήμα Πουρομυιάνης ως συνδέτη του πεπτιδίου με το νουκλεϊκό οξύ, δηλαδή το in vitro μεταγραφόμενο (IVT) mRNA, η πουρομυκίνη, ειδικότερα μια διυδροχλωρική πουρομυκίνη, συνδέεται στο αμινο-τελικό άκρο του ανωτέρω PFVYLI με υδροχλωρικό Ν-(3-διμεθυλαμινοπροπυλ)-Ν'-αιθυλο-καρβοδιιμίδιο (EDC.HC1), και/ή από το ότι στο ανωτέρω τρίτο στάδιο Φωσφορυλίωσης του προϊόντος πουρομυκίνη-PFVYLI, πραγματοποιείται με Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση (Τ4 ΡΝΚ), ή/και απο το ότι στο ανωτέρω τέταρτο βήμα Συνένωσης του φωσφορυλιωμένου προϊόντος πουρομυιάνη-PFVYLI πραγματοποιείται με το επιλεγμένο θεραπευτικό IVT-mRNA, με την Τ4 RNA λιγάση.

5. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι η ανωτέρω μέθοδος περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια σε μια ειδική και καθορισμένη σειρά όπως περιγράφονται για τα ακόλουθα αναλυτικά στάδια ομοιοπολικής σύζευξης του IVT-mRNA στο πεπτίδιο μεταγωγής PFVYLI:

1- 4 μl EDC.HC1 [0,242 mg EDC.HC1 διαλυμένο σε 200 μl Η2O = 6,3 mM] αναμειγνύονται με 2 μl της Πουρομυκίνης [6,92 mg, διαλυμένα σε 1ml DMF - 12,68 mM] και 1 mg PFVYLI σε 2 μl DMF και επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες,

2- Η φωσφορυλίωση του συμπλόκου πουρομυκίνης-PFVYLI πραγματοποιείται με τη χρήση 1 μl Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση, 4 μl ρυθμιστικού διαλύματος Τ4 πολυνουκλεοτιδικής κινάσης, 17 μl απεσταγμένου Η2O, κατεργασμένου με πυροκαρβονικό διαιθυλεστέρα (DEPC, Diethylpyrocarbonate), και 10 μl DMF, όπου η αντίδραση φωσφορυλίωσης πραγματοποιείται στους 37°C, για 1 ώρα και 40 λεπτά, ακολουθούμενη από την απενεργοποίηση του ενζύμου για 20 λεπτά, στους 65°C, 3- Το ανωτέρω σύμπλοκο επωάζεται με 1,5 μl αναστολέα ριβονουκλεασών, για 15 λεπτά, στους 37°C,

4- Για 1 mg από το πεπτίδιο PFVYLI υπολογίζεται ότι απαιτούνται 18 nΜ από το αντίστοιχο θεραπευτικό in vitro μεταγραφόμενο mRNA, όπου το μοριακό βάρος του in vitro μεταγραφόμενου mRNA μπορεί να υπολογιστεί με τη χρήση ενός εργαλείου βιοπληροφορικής όπως προσδιορίζεται, όπου η αλληλουχία του επιθυμητού in vitro μεταγραφόμενου mRNA εισάγεται και η συγκέντρωση που θα προστεθεί στην αντίδραση καθορίζεται από το μοριακό βάρος που υπολογίζεται, και τέλος,

5- 1,5 μl από την Τ4 RNA λιγάση, 6 μl από το ρυθμιστικό διάλυμα της Τ4 RNA λιγάσης, 18 nΜ από το in vitro μεταγραφόμενο mRNA και μέχρι τα 60 μl προσθήκη απεσταγμένου Η2O, κατεργασμένου με DEPC, όπου η αντίδραση συνένωσης πραγματοποιείται στους 16°C κατά τη διάρκεια της νύχτας και το ένζυμο στη συνέχεια απενεργοποιείται στους 70°C για 10 λεπτά.

6. Μέθοδος σύμφωνα με την προηγούμενη αξίωση, χαρακτηρίζεται από το ότι η εν λόγω χημική ομοιοπολική σύζευξη του PFVYLI με το IVT-mRNA αξιολογείται με ηλεκτροφόρηση σε 8 Μ ουρία / 6% πηκτή πολυακρυλαμιδίου (PAGE) μετά από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο, όπου αυτή η μέθοδος δρα ως δοκιμασία καθυστερημένης μετατόπισης, όπου η σύνδεση στο πεπτίδιο PFVYLI επιδεικνύει καθυστερημένη μετατόπιση του in vitro μεταγραφόμενου mRNA στην πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε σύγκριση με μια προκαθορισμένη αναφορά.

7. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ιδιαιτέρως την αξίωση 3 ή 6, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο ανωτέρω στάδιο Επιλογής ενός PTD, ένα πεπτίδιο μεταγωγής (PTD), κατά προτίμηση υδρόφοβο, επιλέγεται χωρίς ελεύθερη αμινομάδα, κατά προτίμηση όπου το επιλεγμένο PTD έχει καθαρότητα >95% και είναι ακετυλιωμένο στο αμινο-τελικό άκρο, ακόμη ειδικότερα, όπου το επιλεγόμενο πεπτίδιο μεταγωγής συντίθεται κατόπιν παραγγελίας, ειδικά όπου το πεπτίδιο PFVYLI, ήτοι έξι (6) αμινοξέων (Ac-Pro-Phe-Val-Tyr-Leu-Ile-COOH), επιλέγεται ως PTD.

8. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ειδικότερα την αξίωση 2 ή 7, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο ανωτέρω στάδιο Διάλυσης, το εν λόγω PTD διαλύεται σε κατάλληλο διαλύτη, ανάλογα με τα χημικά χαρακτηριστικά του PTD, ιδιαίτερα όπου το ανωτέρω PFVYLI επιλέγεται ως PTD και συντίθεται, όπου έχει πολύ χαμηλή υδατοδιαλυτότητα και επομένως διατηρείται σε μορφή σκόνης στους -20°C και, ακριβώς πριν από τη χρήση, διαλύεται σε έναν οργανικό διαλύτη, όπως διμεθυλοακεταμίδιο (DMA) ή διμεθυλοσουλφ οξείδιο (DMSO), κατά προτίμηση DMF.

9. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ειδικά την αξίωση 2 ή 8, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο ανωτέρω στάδιο Σύζευξης του πεπτιδίου μεταγωγής και σε αυτό της πουρομυκίνης με EDC.HCI, η πουρομυκίνη, ειδικότερα διυδροχλωρική πουρομυκίνη, χρησιμοποιείται ως συνδέτης, η οποία διαλύεται κατά προτίμηση σε DMF, ενώ και άλλοι νουκλεοζίτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως συνδέτες, όπου το EDC.HC1 διαλύεται κατά προτίμηση σε, κατεργασμένο με DEPC, απεσταγμένο Η2O; όπου 1 mg του συγκεκριμένου πεπτιδίου μεταγωγής (διαλυμένου με 2 μl DMF) επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου, για 2 ώρες με:

· 2 μl από το ανωτέρω διάλυμα πουρομυκίνης [12,68 mM] και

• 4 μl από το ανωτέρω διάλυμα EDC.HC1 [6,3 mM]

παράγοντας έτσι το προϊόν πουρομυκίνη-PTD (puro-PTD), όπου η πουρομυκίνη είναι ο συνδέτης μεταξύ του πεπτιδίου μεταγωγής και του in vitro μεταγραφόμενου mRNA, το οποίο προστίθεται στο επόμενο βήμα παρακάτω.

10. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ιδιαιτέρως την αξίωση 2 ή 9, που χαρακτηρίζεται από το ότι για το εν λόγω στάδιο Φωσφορυλίωσης του προϊόντος πουρομυκίνη-PTD, το πουρομυκίνη-PTD προϊόν φωσφορυλιώνεται από το ένζυμο Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση (ΡΝΚ),

ιδιαίτερα όπου το προϊόν πουρομυκίνη-PTD φωσφορυλιώνεται κατά προτίμηση με τη χρήση 10 μονάδων από την Τ4 PΝΚ, IX του Τ4 ΡΝΚ ρυθμιστικού διαλύματος, 10 μl από το διαλυτό PTD και απεσταγμένο Η2O, κατεργασμένο με DEPC, μέχρι τα 40 μl, ακόμη ειδικότερα όπου η αντίδραση της φωσφορυλίωσης πραγματοποιείται στους 37°C, για 1 ώρα και 40 λεπτά, ακολουθούμενη από την απενεργοποίηση του ένζυμου Τ4 ΡΝK, κατά προτίμηση για 20 λεπτά, στους 65°C, όπου παράγεται το φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνη-PTD.

11. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ειδικά την αξίωση 2 ή 10, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο στάδιο Αναστολής των RΝασών, το φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνη-PTD επωάζεται με αναστολέα ριβονουκλεασών, κατά προτίμηση 60 μονάδες, για 15 λεπτά στους 37°C, με αποτέλεσμα να απομακρύνονται οποιεσδήποτε ριβονουκλεάσες από το μίγμα της παραπάνω αντίδρασης, προστατεύοντας έτσι το in vitro μεταγραφόμενο mRNA, το οποίο προστίθεται στο επόμενο στάδιο.

12. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ειδικά την αξίωση 2 ή 11 , η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο στάδιο Συνένωσης του φωσφορυλιωμένου προϊόντος πουρομυκίνης-PTD με το IVT-mRNA, το ανωτέρω φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνης-PTD (από 1 mg του PTD) συνδέεται με το επιλεγμένο παραγόμενο θεραπευτικό IVT-mRNA χρησιμοποιώντας το ένζυμο Τ4 RNA λιγάση, όπου ειδικότερα για την αντίδραση συνένωσης, το φωσφορυλιωμένο προϊόν πουρομυκίνης-PTD επωάζεται με 15 μονάδες της Τ4 RNA λιγάσης, IX του ρυθμιστικού διαλύματος της Τ4 RNA λιγάσης, 18 nM IVT-mRNA και έως 60 μl με απεσταγμένο Η2O, κατεργασμένο με DEPC, κατά προτίμηση όπου η αντίδραση συνένωσης πραγματοποιείται στους 16°C, κατά τη διάρκεια της νύχτας και κατόπιν, το ένζυμο Τ4 RNA λιγάση απενεργοποιείται, κατά προτίμηση στους 70°C για 10 λεπτά.

13. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ειδικά την αξίωση 2 ή 12, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι στο στάδιο Αξιολόγησης της έκβασης αυτής της μεθόδου παραγωγής, η χημική ομοιοπολική σύζευξη του PTD με το IVT-mRNA αξιολογείται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή, ειδικά όπου η μέθοδος αυτή αξιολογείται ως δοκιμασία καθυστερημένης μετατόπισης, στο ότι η δέσμευση με το πεπτίδιο PTD δείχνει καθυστερημένη μετατόπιση του IVT-mRNA στην πηκτή σε σύγκριση με το γυμνό IVT-mRNA αναφοράς, κατά προτίμηση όπου η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται με αποδιατακτική πηκτή 8 Μ ουρίας / 6% πηκτή πολυακρυλαμιδίου (PAGE), μετά από χρώση βρωμιούχου αιθιδίου, ή όπου εναλλακτικά, πηκτή αγαρόζης χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της δημιουργίας PTD-IVT-mRNA συμπλοκών, όπως απλή ηλεκτροφόρηση πηκτής ή απο διατακτικές πηκτές αγαρόζης, που περιέχουν φορμαλδεΰδη ή γλυοξάλη/DMSO.

14. Μέθοδος σύμφωνα με μία από τις προηγούμενες αξιώσεις, ειδικά την αξίωση 2 ή 13, η οποία χαρακτηρίζεται από το ότι έχει επικυρωθεί ειδικά από τους υψηλούς ρυθμούς διαμόλυνσης σε κύτταρα.

15. Χρήση της τεχνολογίας των πεπτιδίων μεταγωγής (Protein Transduction Domains - PTDs) για την ανάπτυξη μιάς πλατφόρμας για την παραγωγή δυνάμενων για μεταφορά, PTD-IVT-mRNA όπως ορίζεται στη μέθοδο σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 14, όπου η ανωτέρω πλατφόρμα επιτυγχάνεται με ομοιοπολική χημική αντίδραση μεταξύ των εν λόγω IVT-mRNA μορίων και του επιλεγμένου πεπτιδίου μεταγωγής (PTD), ειδικά ενός πεπτιδίου PFVYLI, περιλαμβάνοντας το συνδυασμό της PTD τεχνολογίας με το IVT-mRNA, μέσω ομοιοπολικής χημικής σύνδεσης-σύζευξης, όπου το εν λόγω IVT-mRNA είναι συζευγμένο με PTD, μέσω του οποίου η σταθερότητα της σύνδεσης μεταξύ του πεπτιδίου μεταγωγής και του θεραπευτικού IVT-mRNA μορίου ενισχύεται, έτσι παρέχοντας ένα σύμπλοκο PTD-IVT-mRNA το οποίο είναι πολύ σταθερό, όπου τα ανωτέρω in vitro μεταγραφόμενα mRNAs, τα οποία συνιστούν μία επιλεγμένη γενιά θεραπευτικών μορίων, δυνάμενων για ενδοκυτταρική μεταφορά μέσω της αναφερθείσας ομοιοπολικής σύζευξης στο κατάλληλο PTD, ειδικότερα το εν λόγω πεπτίδιο PFVYLI, μετά το οποίο, τα ανωτέρω IVT-mRNAs κατευθύνονται στα ριβοσώματα και μεταφράζονται στις αντίστοιχες πρωτεΐνες-στόχους, επιτυγχάνοντας με αυτό τον τρόπο ένα θεραπευτικό αποτέλεσμα.