GR1010735B

GR1010735B - Biotechnological method for cleaning lactic acid solutions from chemical contaminants via genetically modified microorganisms and membrane bioreactors

Info

Publication number: GR1010735B
Application number: GR20230100389A
Authority: GR
Inventors: Αναστασιος Ιωαννη Καραμπελας; Σωτηριος Ιωαννη Πατσιος; Αλεξανδρα Ναστουλη
Original assignee: Εθνικο Κεντρο Ερευνας Και Τεχνολογικης Αναπτυξης (Ε.Κ.Ε.Τ.Α.),
Priority date: 2023-05-12
Filing date: 2023-05-12
Publication date: 2024-07-25

Abstract

The present invention describes a hybrid biotechnological method for purifying lactic acid solutions from impurities, which method combines the process of aerobic fermentation of any genetically modified strain of the microorganism E.coli from which specific genes related to the catabolism of lactic acid and/or specific optical isomers of lactic acid have been removed with the technology of filtration through microfiltration or ultrafiltration membranes in a bioreactor (membrane bioreactor). The invention achieves almost complete purification (> 98.0%) of impurities (indicative but not limiting carbohydrates, organic acids, optical isomers of lactic acid) in one process step and allows the removal of the optical isomers of lactic acid as well as of the impurities of chemical compounds having a high chemical affinity to lactic acid; the complexity of this method is clearly lower than in other methods.

Description

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ DESCRIPTION

Βιοτεχνολογική μέθοδος για τον καθαρισμό διαλυμάτων γαλακτικού οξέος από χημικές προσμίξεις με γενετικά τροποποιημένους μικροοργανισμούς και βιοαντιδραστήρες μεμβρανών Biotechnological method for the purification of lactic acid solutions from chemical impurities with genetically modified microorganisms and membrane bioreactors

Τεχνικό πεδίο της εφεύρεσης Technical field of the invention

[001] Η εφεύρεση αναφέρεται στο τεχνικό πεδίο του καθαρισμού ακατέργαστων διαλυμάτων γαλακτικού οξέος από χημικές προσμίξεις/ακαθαρσίες. Συγκεκριμένα, η εφεύρεση παρέχει μεθόδους για τον βιοτεχνολογικό καθαρισμό ακατέργαστων διαλυμάτων γαλακτικού οξέος από χημικές προσμίξεις/ακαθαρσίες που προκύπτουν κατά την βιομηχανική παραγωγή γαλακτικού οξέος μέσω ζύμωσης, χρησιμοποιώντας γενετικά τροποποιημένους μικροοργανισμούς και την τεχνολογία των βιοαντιδραστήρων μεμβρανών. Επίσης, η εφεύρεση παρέχει μεθόδους για τον βιοτεχνολογικό καθαρισμό διαλυμάτων των δύο οπτικών ισομερών (δηλαδή D- και L) του γαλακτικού οξέος από ένα από τα δύο οπτικά ισομερή του γαλακτικού οξέος, χρησιμοποιώντας γενετικά τροποποιημένους μικροοργανισμούς και την τεχνολογία των βιοαντιδραστήρων μεμβρανών. [001] The invention relates to the technical field of purification of crude lactic acid solutions from chemical impurities/impurities. In particular, the invention provides methods for the biotechnological purification of crude lactic acid solutions from chemical impurities/impurities resulting from the industrial production of lactic acid by fermentation, using genetically modified microorganisms and membrane bioreactor technology. Also, the invention provides methods for the biotechnological purification of solutions of the two optical isomers (i.e. D- and L) of lactic acid from one of the two optical isomers of lactic acid, using genetically modified microorganisms and membrane bioreactor technology.

Στάθμη της τεχνικής State of the art

[002] Το γαλακτικό οξύ είναι ένα οργανικό οξύ το οποίο υπάρχει στη φύση σε δύο οπτικά ισομερής μορφές, το D-γαλακτικό οξύ και το L-γαλακτικό οξύ, και το οποίο βρίσκει πολλές εφαρμογές όπως στη βιομηχανία τροφίμων, στη χημική βιομηχανία, στην παραγωγή βιο-πολυμερών (π.χ. πολυγαλακτικό οξύ - PLA), στη βιομηχανία καλλυντικών και στη βιομηχανία των φαρμακευτικών προϊόντων. Το γαλακτικό οξύ μπορεί να παραχθεί με δύο κύριες μεθόδους: τη ζύμωση και τη χημική σύνθεση, παρ' όλα αυτά σχεδόν το 90% της παγκόσμιας παραγωγής γίνεται με τη μέθοδο της ζύμωσης [1]. Η ζύμωση είναι μια βιοτεχνολογική διεργασία μετατροπής υδατανθράκων, όπως η γλυκόζη, η σακχαρόζη ή η λακτόζη, σε γαλακτικό οξύ χρησιμοποιώντας διάφορα είδη μικροοργανισμών (κυρίως βακτήρια). Το προϊόν της ζύμωσης, μετά την απομάκρυνση των κυττάρων των μικροοργανισμών, είναι ένα ακατέργαστο διάλυμα γαλακτικού οξέος, το οποίο περιέχει, εκτός από το επιθυμητό προϊόν (δηλ. το γαλακτικό οξύ, συνήθως και στις δύο οπτικά ισομερείς μορφές του), και ένα πλήθος από προσμίξεις και ακαθαρσίες όπως ενδεικτικά σάκχαρα που δεν έχουν ζυμωθεί, άλλα οργανικά οξέα που είναι παραπροϊόντα της ζύμωσης κ.α. Το ακατέργαστο αυτό διάλυμα πρέπει να καθαριστεί και να συμπυκνωθεί με διάφορες τεχνικές για να καταστεί εμπορικά διαθέσιμο προϊόν. Υπάρχουν διάφορες κατηγορίες καθαρότητας ανάλογα με τη χρήση και κυμαίνεται από < 80% καθαρότητα για βιομηχανικές εφαρμογές (industrial grade), 80 - 90% καθαρότητα για εφαρμογές στη βιομηχανία τροφίμων (food grade), > 90% για φαρμακευτικές χρήσεις (pharmaceutical grade), και > 99,5% για χρήση στη βιομηχανία των βιο-πολυμερών. Ειδικά για τις δύο τελευταίες εφαρμογές η οπτική καθαρότητα, δηλ. το ποσοστό ενός συγκεκριμένου οπτικού ισομερούς γαλακτικού οξέος (D- ή L-γαλακτικό οξύ) ως προς τη συνολική ποσότητα γαλακτικού οξέος είναι ιδιαίτερης κρισιμότητας για τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του προϊόντος (π.χ. φαρμακευτικά σκευάσματα ή βιο-πολυμερές PLA). Μάλιστα, η διαδικασία καθαρισμού προσμίξεων από οπτικά ισομερή (D- ή L-γαλακτικό οξύ) είναι ιδιαιτέρως δύσκολη και προκλητική, καθώς τα οπτικά ισομερή έχουν πρακτικά ίδιες φυσικές και χημικές ιδιότητες, εκτός από την αλληλεπίδρασή τους με το επίπεδο του πολωμένου φωτός ή άλλες οπτικά ισομερείς ενώσεις. Επομένως, οι συμβατικές τεχνικές διαχωρισμού, όπως η απόσταξη, η εκχύλιση ή η κρυστάλλωση, δεν είναι αποτελεσματικές για τον διαχωρισμό οπτικών ισομερών. Η πιο κοινή μέθοδος για τον καθαρισμό των οπτικών ισομερών είναι η χρωματογραφία, η οποία ωστόσο είναι δαπανηρή και χρονοβόρα, ειδικά για βιομηχανική παραγωγή μεγάλης κλίμακας [2]. Επομένως, η διαδικασία καθαρισμού των οπτικών ισομερών είναι μια πολύπλοκη και απαιτητική εργασία. [002] Lactic acid is an organic acid that occurs in nature in two optically isomeric forms, D-lactic acid and L-lactic acid, and which finds many applications such as in the food industry, the chemical industry, the production of biopolymers (e.g. polylactic acid - PLA), the cosmetics industry and the pharmaceutical industry. Lactic acid can be produced by two main methods: fermentation and chemical synthesis, although almost 90% of global production is done by fermentation [1]. Fermentation is a biotechnological process of converting carbohydrates, such as glucose, sucrose or lactose, into lactic acid using various types of microorganisms (mainly bacteria). The fermentation product, after the removal of the microorganism cells, is a crude lactic acid solution, which contains, in addition to the desired product (i.e. lactic acid, usually in both its optically isomeric forms), a multitude of impurities and impurities such as indicative sugars that have not been fermented, other organic acids that are by-products of fermentation, etc. This crude solution must be purified and concentrated by various techniques to become a commercially available product. There are various purity categories depending on the use and it ranges from < 80% purity for industrial applications (industrial grade), 80 - 90% purity for applications in the food industry (food grade), > 90% for pharmaceutical uses (pharmaceutical grade), and > 99.5% for use in the biopolymer industry. Especially for the last two applications, the optical purity, i.e. the percentage of a specific optical isomer of lactic acid (D- or L-lactic acid) in relation to the total amount of lactic acid is of particular importance for the quality characteristics of the product (e.g. pharmaceutical preparations or biopolymer PLA). In fact, the process of purifying impurities from optical isomers (D- or L-lactic acid) is particularly difficult and challenging, as the optical isomers have practically identical physical and chemical properties, except for their interaction with the plane of polarized light or other optically isomeric compounds. Therefore, conventional separation techniques, such as distillation, extraction or crystallization, are not effective for the separation of optical isomers. The most common method for the purification of optical isomers is chromatography, which is however expensive and time-consuming, especially for large-scale industrial production [2]. Therefore, the purification process of optical isomers is a complex and demanding task.

[003] Η διαδικασία καθαρισμού του ακατέργαστου διαλύματος γαλακτικού οξέος παραμένει το πιο κρίσιμο στάδιο της παραγωγής του γαλακτικού οξέος, καθώς έχει υπολογιστεί ότι το κόστος της μπορεί να φτάσει και το 80% του συνολικού κόστους της παραγωγικής διαδικασίας [3]. Το υψηλό κόστος καθαρισμού οφείλεται αφενός στο μεγάλο πλήθος των προσμίξεων και ακαθαρσιών που υπάρχουν στο ακατέργαστο διάλυμα του γαλακτικού οξέος, όσο και στη μεγάλη φυσικοχημική συγγένεια του γαλακτικού οξέος με αυτές τις χημικές προσμίξεις και με το νερό [4]. Γενικά, όσο μεγαλύτερη είναι η φυσικοχημική συγγένεια μιας χημικής ουσίας (επιθυμητό προϊόν) με τις ακαθαρσίες, τόσο χαμηλότερη είναι η απόδοση διαχωρισμού. Γ ια παράδειγμα, σε μια διαδικασία διήθησης, η χημική ουσία και οι ακαθαρσίες μπορεί να έχουν παρόμοια μεγέθη, γεγονός που καθιστά δύσκολο τον διαχωρισμό τους χρησιμοποιώντας ένα πορώδες μέσο [5]. Σε μια διαδικασία απόσταξης, η χημική ουσία και οι ακαθαρσίες μπορεί να έχουν παρόμοια σημεία βρασμού, γεγονός που καθιστά δύσκολο το διαχωρισμό τους αλλάζοντας τη φυσική τους κατάσταση. Επομένως, για να επιτευχθεί υψηλή απόδοση διαχωρισμού, είναι επιθυμητή μια διεργασία διαχωρισμού που εκμεταλλεύεται μια σημαντική διαφορά σε τουλάχιστον μία φυσική ή χημική ιδιότητα μεταξύ της χημικής ουσίας και των ακαθαρσιών. [003] The purification process of the raw lactic acid solution remains the most critical step in the production of lactic acid, as it has been estimated that its cost can reach 80% of the total cost of the production process [3]. The high purification cost is due, on the one hand, to the large number of impurities and impurities present in the raw lactic acid solution, as well as to the high physicochemical affinity of lactic acid with these chemical impurities and with water [4]. In general, the greater the physicochemical affinity of a chemical substance (desired product) with the impurities, the lower the separation efficiency. For example, in a filtration process, the chemical substance and the impurities may have similar sizes, which makes their separation difficult using a porous medium [5]. In a distillation process, the chemical and impurities may have similar boiling points, making it difficult to separate them by changing their physical state. Therefore, to achieve high separation efficiency, a separation process that exploits a significant difference in at least one physical or chemical property between the chemical and the impurities is desirable.

[004] Μια συμβατική διεργασία καθαρισμού του ακατέργαστου διαλύματος γαλακτικού οξέος σε βιομηχανικό επίπεδο, είναι πολύπλοκη και συνήθως περιλαμβάνει καθίζηση με προσθήκη Ca(OH)2, διήθηση, οξίνιση, προσρόφηση σε ενεργό άνθρακα, εξάτμιση, και διαδικασίες κρυστάλλωσης [4]. Η κατακρήμνιση με χρήση Ca(OH)2συνήθως απαιτεί οξίνιση με περίσσεια H2SO4για την ανάκτηση του γαλακτικού οξέος που οδηγεί στην παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων CaSO4ως παραπροϊόν, ενώ παράλληλα προκύπτει διάλυμα γαλακτικού οξέος χαμηλότερης καθαρότητας. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, οι ερευνητές διερευνούν εναλλακτικές μεθόδους. Για παράδειγμα, μια ολοκληρωμένη διεργασία καθαρισμού μπορεί να περιλαμβάνει ένα συνδυασμό διαφορετικών διεργασιών διαχωρισμού μεμβράνης, όπως υπερδιήθηση, νανοδιήθηση, ιοντοεναλλαγή, και εξάτμισης υπό κενό. Η υβριδική αυτή διαδικασία καθαρισμού οδηγεί σε γαλακτικό οξύ υψηλής ποιότητας (> 99,5% καθαρότητα) [6] με μεγάλο όμως κόστος και σημαντική πολυπλοκότητα. Οι Anagnostopoulou et. al [7] συνδύασαν τη συμπύκνωση με την εκχύλιση υγρού-υγρού με υπερήχους, διαχωρισμό των φάσεων και τελική απόσταξη για ανάκτηση και καθαρισμό γαλακτικού οξέος από ακατέργαστα διαλύματα ζύμωσης. Αν και επιτεύχθηκε υψηλή καθαρότητα γαλακτικού οξέος, (δηλ. > 90%), η διαδικασία αποδείχθηκε αρκετά περίπλοκη με χαμηλό ποσοστό ανάκτησης, κυρίως λόγω της διαδικασίας εκχύλισης υγρού-υγρού. [004] A conventional purification process of raw lactic acid solution on an industrial scale is complex and usually involves precipitation with the addition of Ca(OH)2, filtration, acidification, adsorption on activated carbon, evaporation, and crystallization processes [4]. Precipitation using Ca(OH)2 usually requires acidification with excess H2SO4 to recover lactic acid, which leads to the production of large amounts of CaSO4 as a by-product, while at the same time resulting in a lactic acid solution of lower purity. According to the literature, researchers are investigating alternative methods. For example, a comprehensive purification process may include a combination of different membrane separation processes, such as ultrafiltration, nanofiltration, ion exchange, and vacuum evaporation. This hybrid purification process leads to high-quality lactic acid (> 99.5% purity) [6] but is expensive and complex. Anagnostopoulou et. al [7] combined concentration with ultrasonic liquid-liquid extraction, phase separation and final distillation to recover and purify lactic acid from crude fermentation broths. Although high lactic acid purity (i.e. > 90%) was achieved, the process proved to be quite complex with low recovery rates, mainly due to the liquid-liquid extraction process.

[005] Στη βιβλιογραφία υπάρχουν επίσης αρκετές πατέντες που συνδυάζουν τη μέθοδο της ζύμωσης υδατανθράκων με τη μέθοδο διαχωρισμού του γαλακτικού οξέος μέσω ηλεκτροδιάλυσης με μεμβράνες [8,9,10,11,12]. Όλες οι παραπάνω μέθοδοι περιλαμβάνουν περισσότερα του ενός σταδίου, ενώ η τελική διεργασία της ηλεκτροδιάλυσης με μεμβράνες αδυνατεί να διαχωρίσει ικανοποιητικά άλλα οργανικά οξέα που βρίσκονται (όπως και το γαλακτικό οξύ) σε ιοντική μορφή. Άλλες μέθοδοι [13,14], επίσης περιλαμβάνουν περισσότερα του ενός στάδια διαχωρισμού, ενώ η βασική μέθοδος διαχωρισμού της υγρής/υγρής εκχύλισης με μεμβράνη, επίσης αντιμετωπίζει προβλήματα με τον ικανοποιητικό διαχωρισμό άλλων οργανικών οξέων λόγω της στενής χημικής τους συγγένειας με το γαλακτικό οξύ. Επιπλέον, όλες οι παραπάνω μέθοδοι δεν μπορούν να διαχωρίσουν ακαθαρσίες οπτικών ισομερών του γαλακτικού οξέος καθώς και οι δύο μορφές παρουσιάζουν πρακτικά ίδιες φυσικοχημικές ιδιότητες. [005] There are also several patents in the literature that combine the carbohydrate fermentation method with the lactic acid separation method by means of membrane electrodialysis [8,9,10,11,12]. All of the above methods involve more than one step, while the final membrane electrodialysis process is unable to satisfactorily separate other organic acids that are (like lactic acid) in ionic form. Other methods [13,14] also involve more than one separation step, while the basic membrane liquid/liquid extraction separation method also faces problems with the satisfactory separation of other organic acids due to their close chemical affinity with lactic acid. Furthermore, all of the above methods cannot separate impurities of optical isomers of lactic acid, since both forms have practically the same physicochemical properties.

Σύντομη παρουσίαση της εφεύρεσης Brief presentation of the invention

[006] Η παρούσα εφεύρεση περιγράφει μια βιοτεχνολογική μέθοδο καθαρισμού διαλυμάτων γαλακτικού οξέος από ακαθαρσίες (ενδεικτικά αλλά όχι περιοριστικά υδατάνθρακες, οργανικά οξέα, οπτικά ισομερή του γαλακτικού οξέος), με την οποία επιτυγχάνεται η σχεδόν πλήρης απομάκρυνση (ενδεικτικά > 98.0%) των ακαθαρσιών/προσμίξεων με μία μέθοδο βιοτεχνολογικού καθαρισμού ενός μόνο σταδίου. Η μέθοδος αυτή βρίσκει εφαρμογή σε ακατέργαστα διαλύματα γαλακτικού οξέος από ζύμωση υδατανθράκων, μετά την απομάκρυνση των κυττάρων των μικροοργανισμών της ζύμωσης, ή σε ρεύματα παραπροϊόντων αγροτικών και βιομηχανικών διεργασιών που έχουν σχετικά υψηλή συγκέντρωση γαλακτικού οξέος (ενδεικτικά αλλά όχι περιοριστικά σε διασταλάγμστα προϊόντων ενσίρωσης). Στη μέθοδο μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιοδήποτε γενετικά τροποποιημένο στέλεχος του μικροοργανισμού E.coli, από το οποίο με προηγμένες τεχνικές γενετικής μηχανικής έχουν αφαιρεθεί συγκεκριμένα γονίδια που σχετίζονται με τον καταβολισμό του γαλακτικού οξέος ή συγκεκριμένων οπτικών ισομερών του γαλακτικού οξέος. Επομένως, το γενετικά τροποποιημένο στέλεχος, έχει την ικανότητα να αναπτύσσεται, καταναλώνοντας ένα πλήθος οργανικών ενώσεων, όπως ενδεικτικά αλλά όχι περιοριστικά απλούς υδατάνθρακες οργανικά οξέα (π.χ. οξικό, ηλεκτρικό κτλ.) ή συγκεκριμένο οπτικό ισομερές του γαλακτικού οξέος (είτε D- είτε L-), ενώ δεν καταναλώνει καθόλου γαλακτικό οξύ ή το εναντιομερές του (είτε L- είτε D-). Το επιλεγμένο στέλεχος καλλιεργείται σε έναν καινοτόμο βιοαντιδραστήρα, στον οποίο βρίσκεται εμβαπτισμένη ή είναι συνδεδεμένη σε παράλληλο κλάδο ανακυκλοφορίας μια μεμβράνη μικροδιήθησης ή υπερδιήθησης (βιοαντιδραστήρας μεμβρανών). Το διάλυμα του γαλακτικού οξέος με τις ακαθαρσίες τροφοδοτείται στον βιοαντιδραστήρα μεμβρανών, ο οποίος βρίσκεται υπό συνεχή αερισμό (αερόβιες συνθήκες) και ανάδευση. Οι ακαθαρσίες του διαλύματος (ενδεικτικά αλλά όχι περιοριστικά υδατάνθρακες, οργανικά οξέα, οπτικά ισομερή κτλ.) καταναλώνονται από τον μικροοργανισμό για την ανάπτυξη του, ενώ το γαλακτικό οξύ ή το οπτικό ισομερές που προορίζεται για τελικό προϊόν παραμένει ανεπηρέαστο. Με την χρήση της μεμβράνης μικροδιήθησης ή υπερδιήθησης, και μέσω της εφαρμογής μιας ήπιας διαφοράς πίεσης για τη διήθηση, επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των κυττάρων του μικροοργανισμού και η ανάκτηση ενός διαυγούς διαλύματος γαλακτικού οξέος, το οποίο έχει καθαριστεί σχεδόν πλήρως από τις παραπάνω ακαθαρσίες σε ένα μόνο στάδιο. Η διεργασία μπορεί να ολοκληρωθεί (ασυνεχής λειτουργία) ή να συνεχιστεί (συνεχής ή ημισυνεχής λειτουργία) με προσθήκη νέου διαλύματος χαμηλής καθαρότητας. [006] The present invention describes a biotechnological method for purifying lactic acid solutions from impurities (indicatively but not limited to carbohydrates, organic acids, optical isomers of lactic acid), by which the almost complete removal (indicatively > 98.0%) of impurities/contaminants is achieved with a single-stage biotechnological purification method. This method finds application in crude lactic acid solutions from carbohydrate fermentation, after removal of the cells of the fermentation microorganisms, or in by-product streams of agricultural and industrial processes that have a relatively high concentration of lactic acid (indicatively but not limited to silage product distillates). The method can use any genetically modified strain of the microorganism E.coli, from which specific genes related to the catabolism of lactic acid or specific optical isomers of lactic acid have been removed using advanced genetic engineering techniques. Therefore, the genetically modified strain has the ability to grow by consuming a variety of organic compounds, such as, but not limited to, simple carbohydrates, organic acids (e.g., acetic, succinic, etc.) or a specific optical isomer of lactic acid (either D- or L-), while not consuming any lactic acid or its enantiomer (either L- or D-). The selected strain is cultivated in an innovative bioreactor, in which a microfiltration or ultrafiltration membrane is immersed or connected in a parallel recirculation branch (membrane bioreactor). The lactic acid solution with impurities is fed to the membrane bioreactor, which is under continuous aeration (aerobic conditions) and agitation. The impurities of the solution (indicatively but not limited to carbohydrates, organic acids, optical isomers, etc.) are consumed by the microorganism for its growth, while the lactic acid or optical isomer intended for the final product remains unaffected. By using the microfiltration or ultrafiltration membrane, and by applying a mild pressure difference for filtration, the separation of the microorganism cells is achieved and a clear lactic acid solution is recovered, which has been almost completely purified from the above impurities in a single stage. The process can be completed (discontinuous operation) or continued (continuous or semi-continuous operation) by adding a new low-purity solution.

Πλεονεκτήματα της εφεύρεσης Advantages of the invention

[007] Τα κύρια πλεονεκτήματα της υβριδικής βιοτεχνολογικής μεθόδου καθαρισμού διαλυμάτων γαλακτικού οξέος από ακαθαρσίες που αποκαλύπτεται στην παρούσα εφεύρεση, σε σύγκριση με άλλες περιγραφείσες μεθόδους, συνοψίζονται ως εξής: Α) Επιτυγχάνει σχεδόν πλήρη καθαρισμό (ενδεικτικά > 98.0%) των ακαθαρσιών (ενδεικτικά αλλά όχι περιοριστικά υδατάνθρακες, οργανικά οξέα, οπτικά ισομερή του γαλακτικού οξέος) σε ένα στάδιο διεργασίας. [007] The main advantages of the hybrid biotechnological method for purifying lactic acid solutions from impurities disclosed in the present invention, compared to other described methods, are summarized as follows: A) It achieves almost complete purification (indicatively > 98.0%) of impurities (indicatively but not limited to carbohydrates, organic acids, optical isomers of lactic acid) in one process step.

Β) Επιτρέπει την απομάκρυνση προσμίξεων χημικών ενώσεων με υψηλή χημική συγγένεια με το γαλακτικό οξύ αλλά και οπτικών ισομερών του γαλακτικού οξέος που δεν επιτυγχάνεται στις άλλες περιγραφείσες μεθόδους. B) It allows the removal of impurities of chemical compounds with high chemical affinity for lactic acid as well as optical isomers of lactic acid, which is not achieved in the other methods described.

Γ) Η πολυπλοκότητα είναι σαφώς χαμηλότερη σε σχέση με τις άλλες περιγραφείσες μεθόδους. C) The complexity is clearly lower compared to the other methods described.

Αποκάλυψη της εφεύρεσης Disclosure of the invention

[008] Η παρούσα εφεύρεση περιγράφει μια υβριδική βιοτεχνολογική μέθοδο καθαρισμού διαλυμάτων γαλακτικού οξέος από ακαθαρσίες, η οποία συνδυάζει τη διεργασία της αερόβιας ζύμωσης ενός οποιοδήποτε γενετικά τροποποιημένου στελέχους του μικροοργανισμού E.coli, από το οποίο με προηγμένες τεχνικές γενετικής μηχανικής έχουν αφαιρεθεί συγκεκριμένα γονίδια που σχετίζονται με τον καταβολισμό του γαλακτικού οξέος ή/και συγκεκριμένων οπτικών ισομερών του γαλακτικού οξέος, με την τεχνολογία διήθησης μέσω μεμβρανών μικροδιήθησης ή υπερδιήθησης σε βιοαντιδραστήρα (βιοαντιδραστήρας μεμβρανών). Η υβριδική μέθοδος περιλαμβάνει ενδεικτικά τα ακόλουθα βήματα: [008] The present invention describes a hybrid biotechnological method for purifying lactic acid solutions from impurities, which combines the process of aerobic fermentation of any genetically modified strain of the microorganism E.coli, from which specific genes related to the catabolism of lactic acid and/or specific optical isomers of lactic acid have been removed by advanced genetic engineering techniques, with the technology of filtration through microfiltration or ultrafiltration membranes in a bioreactor (membrane bioreactor). The hybrid method includes, indicatively, the following steps:

Α) Τροφοδοσία του ακατέργαστου διαλύματος γαλακτικού οξέος που θα χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα της υβριδικής βιοτεχνολογικής μεθόδου καθαρισμού. Β) Καλλιέργεια και εγκλιμστισμό, στην τροφοδοσία, στελέχους E.coli, που είναι γενετικά τροποποιημένο, ώστε να μην μπορεί να καταναλώσει γαλακτικό οξύ ή συγκεκριμένο οπτικό ισομερές του (είτε D- είτε L-γαλακτικό). A) Feeding the crude lactic acid solution to be used as a substrate for the hybrid biotechnological purification method. B) Cultivation and acclimation, in the feed, of an E.coli strain that is genetically modified so that it cannot consume lactic acid or a specific optical isomer thereof (either D- or L-lactate).

Γ) Αερόβια ζύμωση του γενετικά τροποποιημένου στελέχους E.coli σε ένα βιοαντιδραστήρα υπό αερισμό και μηχανική ανάδευση. C) Aerobic fermentation of the genetically modified E.coli strain in a bioreactor under aeration and mechanical agitation.

Δ1) Διαχωρισμό της επεξεργασμένης τροφοδοσίας από τα κύτταρα του μικροοργανισμού (κυρίως) και άλλα αιωρούμενα στερεά μέσω εμβαπτισμένων ή συνδεδεμένων σε παράλληλο κλάδο ανακυκλοφορίας μεμβρανών μικροδιήθησης ή υπερδιήθησης, με την εφαρμογή διαφοράς πίεσης σε ημισυνεχή ή σε συνεχή λειτουργία. Η πραγμάτωση της εφεύρεσης παρουσιάζεται σχηματικά στο Σχήμα 1. Σε μια εναλλακτική υλοποίηση της εφεύρεσης, η υβριδική διεργασία περιλαμβάνει τα βήματα από Α έως Γ, και το βήμα: D1) Separation of the treated feed from the microorganism cells (mainly) and other suspended solids through submerged or parallel-branched recirculating microfiltration or ultrafiltration membranes, by applying a pressure differential in semi-continuous or continuous operation. The embodiment of the invention is schematically shown in Figure 1. In an alternative embodiment of the invention, the hybrid process includes steps A to C, and the step:

Δ2) Διαχωρισμό της επεξεργασμένης τροφοδοσίας μέσω φυγοκέντρησης, σε συνδυασμό με ασυνεχή ή ημισυνεχή λειτουργία του βιοαντιδραστήρα. Η πραγμάτωση της εφεύρεσης παρουσιάζεται σχηματικά στο Σχήμα 2. D2) Separation of the treated feed by centrifugation, in combination with batch or semi-continuous operation of the bioreactor. The embodiment of the invention is schematically shown in Figure 2.

Ο βιοαντιδραστήρας που χρησιμοποιείται για την εκτέλεση της ανωτέρω μεθόδου μπορεί να διαθέτει και μεμβράνες μικροδιήθησης ή υπερδιήθησης. The bioreactor used to perform the above method may also be equipped with microfiltration or ultrafiltration membranes.

Πιο αναλυτικά, στο βήμα (Α), επιλέγεται το ακατέργαστο διάλυμα γαλακτικού οξέος προς τροφοδοσία (1). Η τροφοδοσία είναι διάλυμα που προέρχεται από διεργασία παραγωγής γαλακτικού οξέος μέσω ζύμωσης υδατανθράκων ή από αγροτικό ή βιομηχανικό απόρρευμα/παραπροϊόν με υψηλή συγκέντρωση σε γαλακτικό οξύ, ενδεικτικά > 10 g/L. Στην τροφοδοσία, ανάλογα με τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της, προστίθενται μίκρο-θρεπτικά (ενδεικτικά διάλυμα ιχνοστοιχείων SL-10) σε συγκεντρώσεις από 0% έως 1% ν/ν. Το διάλυμα SL-10 περιλαμβάνει ενδεικτικά: 1 mL 25% ν/ν HCI, 1,5 g FeCI2x 4 Η2O, 70,0 mg ZnCI2, 100 mg MnCI2x 4 H2O, 3,0 mg H3BO3, 190 mg CoCI2x 6 H2O, 2,0 mg CuCI2x 2 H2O, 24 mg NiCI2x 6 H2O, και 36 mg Na2MoO4x 2 H2O, ανά λίτρο απεσταγμένου νερού. Επιπλέον, προστίθενται (ανάλογα με τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της τροφοδοσίας) μάκρο-θρεπτικά (ενδεικτικά x10 συμπυκνωμένο διάλυμα Μ9) σε συγκέντρωση από 0% έως 10% ν/ν. Το θρεπτικό Μ9 περιλαμβάνει ενδεικτικά: 6,8 g Na2HPO4, 3,0 g ΚΗ2ΡO4, 1,0 g (NH4)2SO4, 0,5 g NaCI, 4 mL of 0,1 M MgSO4x 7 H2O και 100 μL of 1 M CaCI2x 2 H2O. Επιπλέον, η τροφοδοσία ανάλογα με την αρχική συγκέντρωση γαλακτικού οξέος ενδέχεται να χρειαστεί αραίωση με νερό (ενδεικτικά απιονισμένο ή αποσκληρημένο ή πόσιμο) ώστε η αρχική συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος να είναι ενδεικτικά από 5 έως 60 g/L. Η τροφοδοσία χρειάζεται να υποστεί αποστείρωση με θερμικές ή άλλες μεθόδους. More specifically, in step (A), the raw lactic acid solution is selected for feeding (1). The feed is a solution originating from a lactic acid production process through carbohydrate fermentation or from an agricultural or industrial effluent/by-product with a high lactic acid concentration, indicatively > 10 g/L. Micronutrients (indicatively SL-10 trace element solution) are added to the feed, depending on its physicochemical characteristics, at concentrations ranging from 0% to 1% v/v. The SL-10 solution includes indicatively: 1 mL 25% v/v HCl, 1.5 g FeCI2x 4 H2O, 70.0 mg ZnCI2, 100 mg MnCI2x 4 H2O, 3.0 mg H3BO3, 190 mg CoCI2x 6 H2O, 2.0 mg CuCI2x 2 H2O, 24 mg NiCI2x 6 H2O, and 36 mg Na2MoO4x 2 H2O, per liter of distilled water. In addition, macronutrients (indicatively x10 concentrated M9 solution) are added (depending on the physicochemical characteristics of the feed) at a concentration of 0% to 10% v/v. The M9 nutrient includes indicatively: 6.8 g Na2HPO4, 3.0 g KH2PO4, 1.0 g (NH4)2SO4, 0.5 g NaCl, 4 mL of 0.1 M MgSO4x 7 H2O and 100 μL of 1 M CaCI2x 2 H2O. In addition, depending on the initial lactic acid concentration, the feed may need to be diluted with water (indicatively deionized or softened or potable) so that the initial lactic acid concentration is indicatively from 5 to 60 g/L. The feed needs to be sterilized by thermal or other methods.

Στο βήμα (Β), το γενετικά τροποποιημένο στέλεχος του βακτηρίου E.coli που έχει τροποποιηθεί γενετικά ώστε να μην είναι ικανό να καταναλώσει γαλακτικό οξύ ή συγκεκριμένο οπτικό ισομερές του (είτε D- είτε L-γαλακτικό) καλλιεργείται σε τριβλίο (2), που περιέχει Άγαρ Τρυπτικής Σόγιας (Tryptic Soy Agar) σε επωαστήρα (3) σε θερμοκρασία 35 - 39 °C και χρόνο επώασης ενδεικτικά από 8 έως 24 ώρες. Έπειτα επιλέγεται μια καθαρή αποικία από το τριβλίο και καλλιεργείται σε αντίστοιχο πλούσιο θρεπτικό υπόστρωμα Τρυπτικής Σόγιας (Tryptic Soy Broth) υγρής μορφής σε δοκιμαστικό σωλήνα (4), αποτελώντας την πρώτη προκαλλιέργεια. Η πρώτη προκαλλιέργεια τοποθετείται σε επωαστήρα (3) σε θερμοκρασία 35 - 39 °C και χρόνο επώασης ενδεικτικά από 8 έως 24 ώρες υπό ανακίνηση. Ακολουθεί δεύτερη προκαλλιέργεια όπου πραγματοποιείται εμβολιασμός σε ποσοστό από 1% έως 10% σε κωνικές φιάλες (5) που περιέχουν την τροφοδοσία (1) και τοποθετείται σε επωαστήρα (3) σε θερμοκρασία 35 - 39 °C και χρόνο επώασης ενδεικτικά από 8 έως 48 ώρες υπό ανακίνηση. In step (B), the genetically modified strain of E.coli bacteria that has been genetically modified to be unable to consume lactic acid or a specific optical isomer thereof (either D- or L-lactic acid) is cultured on a plate (2) containing Tryptic Soy Agar in an incubator (3) at a temperature of 35 - 39 °C and an incubation time of indicatively from 8 to 24 hours. A pure colony is then selected from the plate and cultured on a corresponding rich nutrient medium of Tryptic Soy Broth in liquid form in a test tube (4), constituting the first preculture. The first preculture is placed in an incubator (3) at a temperature of 35 - 39 °C and an incubation time of indicatively from 8 to 24 hours under shaking. A second pre-culture follows where inoculation is carried out at a rate of 1% to 10% in conical flasks (5) containing the feed (1) and placed in an incubator (3) at a temperature of 35 - 39 °C and an incubation time of indicatively from 8 to 48 hours under shaking.

Στο βήμα (Γ), η δεύτερη προκαλλιέργεια (5) χρησιμοποιείται για τον εμβολιασμό του βιοαντιδραστήρα (6) σε ποσοστό από 1% έως 20% για την έναρξη της υβριδικής βιολογικής διεργασίας καθαρισμού της τροφοδοσίας (1). Η ζύμωση λαμβάνει χώρα σε ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας (ενδεικτικά από 35 έως 39 °C) και pH (ενδεικτικά από 6,5 έως 7,5) ανάλογα με το στέλεχος E.coli που χρησιμοποιείται. Επιπλέον, καθορίζονται οι στροφές ανάδευσης (7) (ενδεικτικά από 150 έως 850 rpm) και ο αερισμός (8) με ατμοσφαιρικό αέρα ή μίγμα οξυγόνου/αζώτου 20/80 με ρυθμό ενδεικτικά από 0,5 έως 2,5 wm. To pH διατηρείται σταθερό μέσω συστήματος ρύθμισης που περιλαμβάνει έναν κοινό αισθητήρα pH (9) και περισταλτικές αντλίες (10) για την προσθήκη διαλύματος βάσης (11) (ενδεικτικά αλλά όχι περιοριστικά NaOH από 2 έως 10Ν) ή διαλύματος οξέος (12) (ενδεικτικά αλλά όχι περιοριστικά HCI από 2 έως 5Ν). Επιπλέον ελέγχεται ο αφρισμός μέσω χρήσης κοινού αισθητήρα μέτρησης στάθμης (13) και περισταλτικής αντλίας (10) για την προσθήκη αντιαφριστικού διαλύματος (14), ενδεικτικά με βάση παράγωγα σιλικόνης ή πολυοξυαλκυλενίων. Η υλοποίηση του βήματος (Γ) της εφεύρεσης λαμβάνει χώρα υπό στείρες συνθήκες, δηλαδή το σύνολο του εξοπλισμού και των υλικών αποστειρώνεται. In step (C), the second preculture (5) is used to inoculate the bioreactor (6) at a rate of 1% to 20% to initiate the hybrid biological purification process of the feed (1). The fermentation takes place under controlled conditions of temperature (indicatively from 35 to 39 °C) and pH (indicatively from 6.5 to 7.5) depending on the E.coli strain used. In addition, the stirring speed (7) (indicatively from 150 to 850 rpm) and the aeration (8) with atmospheric air or a 20/80 oxygen/nitrogen mixture at a rate of indicatively from 0.5 to 2.5 wm are determined. The pH is kept constant by means of a regulation system comprising a common pH sensor (9) and peristaltic pumps (10) for the addition of a base solution (11) (indicatively but not limited to NaOH from 2 to 10N) or an acid solution (12) (indicatively but not limited to HCI from 2 to 5N). In addition, foaming is controlled by using a common level measurement sensor (13) and a peristaltic pump (10) for the addition of an antifoam solution (14), indicatively based on silicone or polyoxyalkylene derivatives. The implementation of step (C) of the invention takes place under sterile conditions, i.e. all equipment and materials are sterilized.

Στο βήμα (Δ1) της εφεύρεσης, στοιχείο μεμβρανών μικροδιήθησης ή υπερδιήθησης (15), με ενδεικτικό μέγεθος πόρων από 0,01 έως 1,0 μm, εμβαπτίζεται στον βιοαντιδραστήρα ή προστίθεται σε παράλληλο κλάδο ανακυκλοφορίας (βιοαντιδραστήρας μεμβρανών). Το στοιχείο των μεμβρανών χρησιμοποιείται για την απομάκρυνση της επεξεργασμένης τροφοδοσίας, συγκροτώντας παράλληλα (λόγω του μέγεθος των πόρων) τα κύτταρα του μικροοργανισμού. Το διήθημα των μεμβρανών (16) απομακρύνεται μέσω μιας περισταλτικής αντλίας (17) μέσω της επιβολής διαμεμβρανικής πίεσης ενδεικτικά < 5 bar, με ανηγμένο ρυθμό διηθήματος ενδεικτικά από 5 έως 40 L/(m<2.>h), και συλλέγεται στο δοχείο επεξεργασμένης τροφοδοσίας (18). Η έναρξη απομάκρυνσης του διηθήματος λαμβάνει χώρα μετά από χρονικό διάστημα από 6 έως 48 ώρες από τον εμβολιασμό του βιοαντιδραστήρα (6) (βήμα Γ). Το διήθημα (16) είναι ένα διαυγές διάλυμα υψηλής καθαρότητας γαλακτικού οξέος. Κατά την ημισυνεχή λειτουργία του βιοαντιδραστήρα στο βήμα (Δ1), μέσω της διήθησης απομακρύνεται ποσότητα επεξεργασμένης τροφοδοσίας ενδεικτικά από 5 έως 50% του όγκου λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα, ενώ ακολουθεί προσθήκη νέας τροφοδοσίας (1) ίσου όγκου ώστε να συνεχιστεί η υβριδική διεργασία καθαρισμού της. Μετά από χρονικό διάστημα ενδεικτικά μεγαλύτερο από 2 ώρες, η διαδικασία της διήθησης της επεξεργασμένης τροφοδοσίας και η προσθήκη νέας τροφοδοσίας επαναλαμβάνεται. Στο χρονικό αυτό διάστημα πραγματοποιείται σχεδόν πλήρης κατανάλωση (ενδεικτικά > 98.0% ποσοστό απομάκρυνσης) των υδατανθράκων, άλλων οργανικών οξέων ή οπτικά ισομερών του γαλακτικού οξέος που μπορεί να καταβολίσει το στέλεχος E.coli. Κατά τη συνεχή λειτουργία του βιοαντιδραστήρα στο βήμα (Δ1), η διήθηση της επεξεργασμένης τροφοδοσίας λαμβάνει χώρα ταυτόχρονα με τη προσθήκη νέας τροφοδοσίας. Ο ρυθμός απομάκρυνσης της επεξεργασμένης τροφοδοσίας είναι ενδεικτικά μικρότερος από 0,2 h<1>, και επιτυγχάνεται σχεδόν πλήρης κατανάλωση (ενδεικτικά > 98.0% ποσοστό απομάκρυνσης) των υδατανθράκων, άλλων οργανικών οξέων ή οπτικά ισομερών του γαλακτικού οξέος που μπορεί να καταβολίσει το στέλεχος E.coli. In step (Δ1) of the invention, a microfiltration or ultrafiltration membrane element (15), with an indicative pore size of 0.01 to 1.0 μm, is immersed in the bioreactor or added to a parallel recirculation branch (membrane bioreactor). The membrane element is used to remove the treated feed, while simultaneously retaining (due to the pore size) the cells of the microorganism. The membrane filtrate (16) is removed by means of a peristaltic pump (17) by applying a transmembrane pressure indicatively < 5 bar, with a reduced filtrate rate indicatively from 5 to 40 L/(m<2.>h), and is collected in the treated feed vessel (18). The start of the removal of the filtrate takes place after a period of time of 6 to 48 hours from the inoculation of the bioreactor (6) (step C). The filtrate (16) is a clear solution of high purity lactic acid. During the semi-continuous operation of the bioreactor in step (Δ1), through filtration, an amount of treated feed indicatively from 5 to 50% of the operating volume of the bioreactor is removed, while a new feed (1) of equal volume is added so that the hybrid purification process continues. After a period of time indicatively greater than 2 hours, the process of filtering the treated feed and adding new feed is repeated. During this time, almost complete consumption (indicatively > 98.0% removal rate) of carbohydrates, other organic acids or optical isomers of lactic acid that can be catabolized by the E.coli strain occurs. During continuous operation of the bioreactor in step (Δ1), the filtration of the treated feed takes place simultaneously with the addition of new feed. The removal rate of the treated feed is indicatively less than 0.2 h<1>, and almost complete consumption (indicatively > 98.0% removal rate) of carbohydrates, other organic acids or optical isomers of lactic acid that can be catabolized by the E.coli strain is achieved.

Στο βήμα (Δ2) της εφεύρεσης, κατά την ασυνεχή λειτουργία του βιοαντιδραστήρα, μετά από χρονικό διάστημα από 6 έως 48 ώρες από τον εμβολιασμό του βιοαντιδραστήρα (βήμα Γ) απομακρύνεται το μικτό υγρό (19) (δηλ. η επεξεργασμένη τροφοδοσία και τα κύτταρα του μικροοργανισμού), της καλλιέργειας και συλλέγεται μέσω περισταλτικής αντλίας (20) σε δοχείο κατάλληλου όγκου (21). Στη συνέχεια, γίνεται διαχωρισμός των κυττάρων από την επεξεργασμένη τροφοδοσία με τη χρήση φυγόκεντρου (22) σε συνθήκες λειτουργίας ενδεικτικά μεγαλύτερες από 2.000 rpm για χρονικό διάστημα ενδεικτικά μεγαλύτερο από 5 min. Μετά τη φυγοκέντρηση, η υπερκείμενη φάση (23) (δηλαδή η επεξεργασμένη τροφοδοσία) συλλέγεται και λαμβάνεται ένα διαυγές διάλυμα υψηλής καθαρότητας γαλακτικού οξέος (24), ενδεικτικά > 98.0% ποσοστό απομάκρυνσης των υδατανθράκων, άλλων οργανικών οξέων ή οπτικά ισομερών του γαλακτικού οξέος που μπορεί να κσταβολίσει το στέλεχος E.coli. Κατά την ημισυνεχή λειτουργία του βιοαντιδραστήρα στο βήμα (Δ2), μετά από χρονικό διάστημα από 6 έως 48 ώρες από τον εμβολιασμό του βιοαντιδραστήρα (βήμα Γ), απομακρύνεται ποσότητα, ενδεικτικά μεγαλύτερη από 10% του όγκου λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα, από το μικτό υγρό (δηλ. την επεξεργασμένη τροφοδοσία και τα κύτταρα του μικροοργανισμού), της καλλιέργειας και συλλέγεται μέσω περισταλτικής αντλίας (20) σε δοχείο κατάλληλου όγκου (21), ενώ ακολουθεί προσθήκη νέας τροφοδοσίας (1) ίσου όγκου ώστε να συνεχιστεί η διεργασία καθαρισμού. Ο διαχωρισμός των κυττάρων από την επεξεργασμένη τροφοδοσία γίνεται με τη χρήση φυγόκεντρου (22) (σε συνθήκες λειτουργίας ενδεικτικά μεγαλύτερες από 2.000 rpm για χρονικό διάστημα ενδεικτικά μεγαλύτερο από 5 min. Μετά τη φυγοκέντρηση, η υπερκείμενη φάση (23) (δηλαδή η επεξεργασμένη τροφοδοσία) συλλέγεται και λαμβάνεται ένα διαυγές διάλυμα υψηλής καθαρότητας γαλακτικού οξέος (24), ενδεικτικά > 98.0% ποσοστό απομάκρυνσης των υδατανθράκων, άλλων οργανικών οξέων ή οπτικά ισομερών του γαλακτικού οξέος που μπορεί να καταβολίσει το στέλεχος E.coli. Η διαδικασία της απομάκρυνσης μέρους του μικτού υγρού, προσθήκης νέας τροφοδοσίας ίσου όγκου και φυγοκέντρησης του μικτού υγρού επαναλαμβάνεται μετά από χρονικό διάστημα ενδεικτικά μεγαλύτερο από 2 ώρες. In step (D2) of the invention, during the discontinuous operation of the bioreactor, after a period of 6 to 48 hours from the inoculation of the bioreactor (step C), the mixed liquid (19) (i.e. the treated feed and the cells of the microorganism) of the culture is removed and collected via a peristaltic pump (20) in a container of appropriate volume (21). Subsequently, the cells are separated from the treated feed using a centrifuge (22) at operating conditions indicatively greater than 2,000 rpm for a period of time indicatively greater than 5 min. After centrifugation, the supernatant (23) (i.e. the treated feed) is collected and a clear solution of high purity lactic acid (24) is obtained, indicatively > 98.0% removal rate of carbohydrates, other organic acids or optical isomers of lactic acid that can stabilize the E.coli strain. During the semi-continuous operation of the bioreactor in step (D2), after a period of 6 to 48 hours from the inoculation of the bioreactor (step C), an amount, indicatively greater than 10% of the operating volume of the bioreactor, is removed from the mixed liquid (i.e. the treated feed and the microorganism cells) of the culture and is collected via a peristaltic pump (20) in a container of appropriate volume (21), while a new feed (1) of equal volume is added in order to continue the purification process. The separation of the cells from the treated feed is carried out using a centrifuge (22) (at operating conditions indicatively greater than 2,000 rpm for a period of time indicatively greater than 5 min. After centrifugation, the supernatant phase (23) (i.e. the treated feed) is collected and a clear solution of high purity lactic acid (24) is obtained, indicatively > 98.0% removal rate of carbohydrates, other organic acids or optical isomers of lactic acid that can be catabolized by the E.coli strain. The process of removing part of the mixed liquid, adding a new feed of equal volume and centrifuging the mixed liquid is repeated after a period of time indicatively greater than 2 hours.

[009] Συνοψίζοντας τα παραπάνω η εφεύρεση συνίστσται σε βιοτεχνολογική μέθοδο καθαρισμού διαλυμάτων γαλακτικού οξέος από ακαθαρσίες, η οποία συνδυάζει τη διεργασία της αερόβιας ζύμωσης σε βιοαντιδραστήρα ενός οποιοδήποτε γενετικά τροποποιημένου στελέχους του μικροοργανισμού E.coH και την τεχνολογία διήθησης, που αποτελείται από τα εξής βήματα: [009] Summarizing the above, the invention consists of a biotechnological method for purifying lactic acid solutions from impurities, which combines the process of aerobic fermentation in a bioreactor of any genetically modified strain of the microorganism E.coH and filtration technology, consisting of the following steps:

Α) Τροφοδοσία του ακατέργαστου διαλύματος γαλακτικού οξέος που θα χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα της υβριδικής βιοτεχνολογικής μεθόδου καθαρισμού. Β) Καλλιέργεια και εγκλιμστισμό, στο υπόστρωμα, στελέχους E.coli, που είναι γενετικά τροποποιημένο, ώστε να μην μπορεί να καταναλώσει γαλακτικό οξύ ή συγκεκριμένο οπτικό ισομερές του (είτε D- είτε L-γαλακτικό). A) Feeding of the crude lactic acid solution to be used as the substrate of the hybrid biotechnological purification method. B) Cultivation and acclimation, in the substrate, of an E.coli strain, which is genetically modified so that it cannot consume lactic acid or a specific optical isomer thereof (either D- or L-lactic).

Δ) Διαχωρισμό της επεξεργασμένης τροφοδοσίας από τα κύτταρα του μικροοργανισμού (κυρίως) και από άλλα αιωρούμενα στερεά, μέσω εμβαπτισμένων ή συνδεδεμένων σε παράλληλο κλάδο ανακυκλοφορίας μεμβρανών μικροδιήθησης ή υπερδιήθησης, με την εφαρμογή διαφοράς πίεσης σε ημισυνεχή ή σε συνεχή λειτουργία. D) Separation of the treated feed from the microorganism cells (mainly) and from other suspended solids, through submerged or connected in a parallel recirculation branch of microfiltration or ultrafiltration membranes, by applying a pressure difference in semi-continuous or continuous operation.

Ο διαχωρισμός της επεξεργασμένης τροφοδοσίας από τα κύτταρα του μικροοργανισμού (κυρίως) και από άλλα αιωρούμενα στερεά μπορεί να γίνει εναλλακτικά ή συμπληρωματικά μέσω φυγοκέντρησης, σε συνδυασμό με ασυνεχή ή ημισυνεχή λειτουργία του βιοαντιδραστήρα. The separation of the treated feed from the microorganism cells (mainly) and from other suspended solids can be done alternatively or additionally by centrifugation, in combination with discontinuous or semi-continuous operation of the bioreactor.

Οι ακαθαρσίες του διαλύματος καταναλώνονται από τον μικροοργανισμό για την ανάπτυξη του, ενώ το γαλακτικό οξύ ή το οπτικό ισομερές που προορίζεται για τελικό προϊόν παραμένει ανεπηρέαστο. The impurities in the solution are consumed by the microorganism for its growth, while the lactic acid or optical isomer intended for the final product remains unaffected.

Επιτυγχάνεται απομάκρυνση των ακαθαρσιών/προσμίξεων από το γαλακτικό οξύ, σε ποσοστό μεγαλύτερο του 98,0%. Removal of impurities/contaminants from lactic acid is achieved at a rate greater than 98.0%.

Επιτυγχάνεται απομάκρυνση προσμίξεων χημικών ενώσεων με υψηλή χημική συγγένεια με το γαλακτικό οξύ αλλά και οπτικών ισομερών του γαλακτικού οξέος. Χρησιμοποιείται καινοτόμος βιοαντιδραστήρας, για την εκτέλεση της υβριδικής βιοτεχνολογικής μεθόδου καθαρισμού διαλυμάτων γαλακτικού οξέος από ακαθαρσίες, ο οποίος διαθέτει σύστημα αερισμού, ανάδευσης, σύστημα ελέγχου pH και αφρισμού και μεμβράνη μικροδιήθησης ή υπερδιήθησης. Removal of impurities of chemical compounds with high chemical affinity to lactic acid as well as optical isomers of lactic acid is achieved. An innovative bioreactor is used to perform the hybrid biotechnological method of purifying lactic acid solutions from impurities, which has an aeration, stirring system, pH and foaming control system and a microfiltration or ultrafiltration membrane.

Περιγραφή των σχεδίων Description of the plans

[010] Το Σχήμα 1 δείχνει την πραγμάτωση της εφεύρεσης που αφορά τα βήματα Α, Β, Γ, Δ1. Συγκεκριμένα, στο Σχήμα 1 απεικονίζονται τα εξής στοιχεία της εφεύρεσης: (1) ακατέργαστο διάλυμα γαλακτικού οξέος προς τροφοδοσία, (2) καλλιέργεια του γενετικά τροποποιημένου στελέχους του βακτηρίου E.coli σε τριβλία, (3) επωαστήρας, (4) δοκιμαστικός σωλήνας και πραγμάτωση πρώτης προκαλλιέργειας, (5) κωνική φιάλη και πραγμάτωση δεύτερης προκαλλιέργειας, (6) βιοαντιδραστήρας, (7) αναδευτήρας, (8) τροφοδοσία αέρα ή μίγματος αερίων, (9) αισθητήρας ρύθμισης pH, (10) περισταλτικές αντλίες τροφοδοσίας βάσης, οξέος και αντιαφριστικού, (11) διάλυμα βάσης, (12) διάλυμα οξέος, (13) αισθητήρας μέτρησης στάθμης, (14) αντιαφριστικό διάλυμα, (15) στοιχείο μεμβρανών μικροδιήθησης ή υπερδιήθησης, (16) διήθημα μεμβρανών, (17) περισταλτική αντλία για τη διήθηση, (18) δοχείο για τη συλλογή του επεξεργασμένου διηθήματος (διάλυμα υψηλής καθαρότητας γαλακτικού οξέος). [010] Figure 1 shows the embodiment of the invention relating to steps A, B, C, D1. Specifically, Figure 1 illustrates the following elements of the invention: (1) raw lactic acid solution to be fed, (2) culture of the genetically modified strain of E.coli bacteria in plates, (3) incubator, (4) test tube and implementation of the first pre-culture, (5) conical flask and implementation of the second pre-culture, (6) bioreactor, (7) stirrer, (8) supply of air or gas mixture, (9) pH adjustment sensor, (10) peristaltic pumps for feeding base, acid and antifoam, (11) base solution, (12) acid solution, (13) level measurement sensor, (14) antifoam solution, (15) microfiltration or ultrafiltration membrane element, (16) membrane filtrate, (17) peristaltic pump for filtration, (18) container for collecting the treated filtrate (high purity lactic acid solution).

[011] Το Σχήμα 2 δείχνει την εναλλακτική πραγμάτωση της εφεύρεσης που περιλαμβάνει τα βήματα A, Β, Γ, Δ2. Συγκεκριμένα, στο Σχήμα 2 απεικονίζονται τα εξής στοιχεία της εφεύρεσης: (1) ακατέργαστο διάλυμα γαλακτικού οξέος προς τροφοδοσία, (2) καλλιέργεια του γενετικά τροποποιημένου στελέχους του βακτηρίου E.coli σε τριβλία, (3) επωαστήρας, (4) δοκιμαστικός σωλήνας και πραγμάτωση πρώτης προκαλλιέργειας, (5) κωνική φιάλη και πραγμάτωση δεύτερης προκαλλιέργειας, (6) βιοαντιδραστήρας, (7) αναδευτήρας, (8) τροφοδοσία αέρα ή μίγματος αερίων, (9) αισθητήρας ρύθμισης pH, (10) περισταλτικές αντλίες τροφοδοσίας βάσης, οξέος και αντιαφριστικού, (11) διάλυμα βάσης, (12) διάλυμα οξέος, (13) αισθητήρας μέτρησης στάθμης, (14) αντιαφριστικό διάλυμα, (19) μικτό υγρό που περιλαμβάνει την επεξεργασμένη τροφοδοσία και τα κύτταρα του μικροοργανισμού, (20) περισταλτική αντλία για τη συλλογή του μικτού υγρού, (21) δοχείο συλλογής του μικτού υγρού, (22) φυγόκεντρος, (23) μικτό υγρό μετά το διαχωρισμό της επεξεργασμένης τροφοδοσίας - υπερκείμενη φάση και της βιομάζας που έχει υποστεί καθίζηση (24) διάλυμα υψηλής καθαρότητας γαλακτικού οξέος. [011] Figure 2 shows the alternative embodiment of the invention comprising steps A, B, C, D2. Specifically, Figure 2 illustrates the following elements of the invention: (1) raw lactic acid solution to be fed, (2) culture of the genetically modified strain of E.coli bacteria in plates, (3) incubator, (4) test tube and implementation of the first pre-culture, (5) conical flask and implementation of the second pre-culture, (6) bioreactor, (7) stirrer, (8) supply of air or gas mixture, (9) pH adjustment sensor, (10) peristaltic pumps for feeding base, acid and antifoam, (11) base solution, (12) acid solution, (13) level measurement sensor, (14) antifoam solution, (19) mixed liquid including the processed feed and the cells of the microorganism, (20) peristaltic pump for collecting the mixed liquid, (21) mixed liquid collection vessel, (22) centrifuge, (23) mixed liquid after separation of the treated feed - supernatant phase and the precipitated biomass (24) high purity lactic acid solution.

Πραγματοποίηση της εφεύρεσης Realization of the invention

[012] Παράδειγμα 1 [012] Example 1

Σε βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας 3 L πραγματοποιήθηκε δοκιμή υβριδικού βιοτεχνολογικού καθαρισμού ενός συνθετικού διαλύματος που προσομοιώνει διαστάλαγμα ενσυρωμένου γρασιδιού. Το συνθετικό διαστάλαγμα, που χρησιμοποιήθηκε ως τροφοδοσία/υπόστρωμα στο συγκεκριμένο παράδειγμα, αποτελείται από θρεπτικό Μ9, 10 g/L γαλακτικό οξύ, 0,5 g/L οξικό οξύ, 0,5 g/L γλυκόζη, και 0,1 % w/v NaCI. Το θρεπτικό Μ9 αποτελείται από: 6,8 g Na2HPO4, 3,0 g ΚΗ2ΡO4, 1,0 g (NH4)2SO4, 0,5 g NaCI, 4 mL of 0,1 M MgSO4x 7 H2O και 100 μL of 1 M CaCI2x 2 H2O ανά λίτρο απεσταγμένου νερού. Επίσης, προστίθεται 1 mL από το διάλυμα SL-10 ιχνοστοιχείων, ανά λίτρο απεσταγμένου νερού. Το διάλυμα SL-10 αποτελείται από: 1 mL 25% ν/ν HCI, 1,5 g FeCI2χ 4 Η2O, 70,0 mg ZnCI2, 100 mg MnCI2x 4 H2O, 3,0 mg H3BO3, 190 mg CoCI2x 6 H2O, 2,0 mg CuCI2x 2 H2O, 24 mg NiCI2x 6 H2O, και 36 mg Na2MoO4x 2 H2O, ανά λίτρο απεσταγμένου νερού. Χρησιμοποιήθηκε στέλεχος του βακτηρίου E.coli που έχει τροποποιηθεί γενετικά ώστε να καταναλώνει εκλεκτικά υδατάνθρακες και οργανικά οξέα εκτός του γαλακτικού οξέος. Το στέλεχος φυλάσσεται σε 25% ν/ν διάλυμα καθαρής γλυκερόλης στους -80 °C, καλλιεργήθηκε σε τριβλία, που περιέχουν Τρυπτικό Άγαρ Σόγιας (Tryptic Soy Agar) και τοποθετήθηκε σε επωαστήρα στους 37 °C με χρόνο επώασης, περίπου 12 με 15 ώρες. Έπειτα επιλέχθηκε μια καθαρή αποικία από το τριβλίο και καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό υγρής μορφής (Tryptic Soy broth) όγκου 5 ml στους 37 °C με χρόνο επώασης περίπου 12 με 15 ώρες και ανακίνηση 200 rpm. Ακολούθησε δεύτερη προκαλλιέργεια όπου πραγματοποιήθηκε 4% ν/ν εμβολιασμός σε συνολικό όγκο 100 ml του συνθετικού διασταλάγμστος, σε κωνικές φιάλες 250 mL. A hybrid biotechnological purification test of a synthetic solution simulating a turgid grass exudate was performed in a 3 L laboratory scale bioreactor. The synthetic exudate, used as feed/substrate in this example, consists of nutrient M9, 10 g/L lactic acid, 0.5 g/L acetic acid, 0.5 g/L glucose, and 0.1 % w/v NaCl. Nutrient M9 consists of: 6.8 g Na2HPO4, 3.0 g KH2PO4, 1.0 g (NH4)2SO4, 0.5 g NaCl, 4 mL of 0.1 M MgSO4x 7 H2O, and 100 μL of 1 M CaCI2x 2 H2O per liter of distilled water. Also, 1 mL of SL-10 trace element solution is added per liter of distilled water. The SL-10 solution consists of: 1 mL of 25% v/v HCl, 1.5 g FeCl2x 4 H2O, 70.0 mg ZnCl2, 100 mg MnCl2x 4 H2O, 3.0 mg H3BO3, 190 mg CoCl2x 6 H2O, 2.0 mg CuCl2x 2 H2O, 24 mg NiCl2x 6 H2O, and 36 mg Na2MoO4x 2 H2O, per liter of distilled water. A strain of E.coli bacteria that has been genetically modified to selectively consume carbohydrates and organic acids other than lactic acid was used. The strain was stored in a 25% v/v solution of pure glycerol at -80 °C, cultured on plates containing Tryptic Soy Agar and placed in an incubator at 37 °C with an incubation time of approximately 12 to 15 hours. A pure colony was then selected from the plate and cultured in a 5 ml liquid nutrient medium (Tryptic Soy broth) at 37 °C with an incubation time of approximately 12 to 15 hours and shaking at 200 rpm. A second preculture followed where a 4% v/v inoculation was performed in a total volume of 100 ml of the synthetic diastase, in 250 mL conical flasks.

Έπειτα, ο βιοαντιδραστήρας με όγκο τροφοδοσίας 1,8 L εμβολιάστηκε με 72 mL καλλιεργήματος της δεύτερης προκαλλιέργειας, αφού ρυθμίστηκαν οι συνθήκες διεξαγωγής της διεργασίας. Συγκεκριμένα, το pH ρυθμίστηκε στο 7,0, η ταχύτητα ανάδευσης στις 450 rpm, η θερμοκρασία στους 37 °C και η ροή αέρα στο 1,5 wm. Η ζύμωση διήρκησε 34 h επιτυγχάνοντας σταθερή συγκέντρωση γαλακτικού οξέος και ολική κατανάλωση (100%) γλυκόζης και οξικού οξέος. Στη συνέχεια, 250 ml από το μικτό υγρό της ζύμωσης διηθήθηκαν μέσω του στοιχείου μεμβρανών υπερδιήθησης. Το στοιχείο εμβαπτισμένων μεμβρανών υπερδιήθησης, με ενδεικτικό μέγεθος πόρων 0,03 μm, αποτελείται από 16 κοίλες ίνες με μήκος 9 mm και έχει συνολική επιφάνεια διήθησης 117,5 cm<2>. Η υπερδιήθηση διήρκησε 40 min με ανηγμένη ροή 30 L/(m<2,>h) διαχωρίζοντας την επεξεργασμένη τροφοδοσία από τα κύτταρα του μικροοργανισμού. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε νέα τροφοδοσία όγκου ίσου με του διηθήματος. Τα βήματα της διεργασίας υπερδιήθησης και προσθήκης νέας τροφοδοσίας επαναλήφθηκαν ανά 4 h. Σε κάθε διάστημα 4 h επιτεύχθηκε 100% κατανάλωσης της γλυκόζης και του οξικού οξέος που περιείχε η νέα τροφοδοσία. Παράλληλα, η συγκέντρωση γαλακτικού οξέος παρέμεινε σταθερή με μικρές αποκλίσεις καθ' όλη τη διάρκεια διεργασίας. Ο βιοαντιδραστήρας μεμβρανών λειτούργησε για 12 ώρες σε ημισυνεχή ροή, παράγοντας συνολικά 1,0 L διαυγούς διαλύματος γαλακτικού οξέος με 100% απομάκρυνση των προσμίξεων της γλυκόζης και του οξικού οξέος. Then, the bioreactor with a feed volume of 1.8 L was inoculated with 72 mL of the second preculture culture, after adjusting the process conditions. Specifically, the pH was adjusted to 7.0, the stirring speed to 450 rpm, the temperature to 37 °C and the air flow to 1.5 wm. The fermentation lasted 34 h, achieving a constant lactic acid concentration and total consumption (100%) of glucose and acetic acid. Then, 250 ml of the mixed fermentation liquid were filtered through the ultrafiltration membrane element. The immersed ultrafiltration membrane element, with an indicative pore size of 0.03 μm, consists of 16 hollow fibers with a length of 9 mm and has a total filtration area of 117.5 cm<2>. The ultrafiltration lasted 40 min with a reduced flow of 30 L/(m<2,>h) separating the treated feed from the microorganism cells. Then, a new feed of a volume equal to the filtrate was carried out. The steps of the ultrafiltration process and addition of a new feed were repeated every 4 h. In each 4 h interval, 100% consumption of the glucose and acetic acid contained in the new feed was achieved. At the same time, the lactic acid concentration remained constant with small deviations throughout the process. The membrane bioreactor operated for 12 h in semi-continuous flow, producing a total of 1.0 L of clear lactic acid solution with 100% removal of glucose and acetic acid impurities.

[013] Παράδειγμα 2 [013] Example 2

Σε βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας 3 L πραγματοποιήθηκε δοκιμή υβριδικού βιοτεχνολογικού καθαρισμού ενός συνθετικού διαλύματος που προσομοιώνει διαστάλαγμα ενσιρωμένου γρασιδιού. Το συνθετικό διαστάλαγμα, που χρησιμοποιήθηκε ως τροφοδοσία/υπόστρωμα στο συγκεκριμένο παράδειγμα, αποτελείται από θρεπτικό Μ9, 10 g/L γαλακτικό οξύ, 0,5 g/L οξικό οξύ, 0,5 g/L γλυκόζη, και 0,1 % w/v NaCI. Το θρεπτικό Μ9 αποτελείται από: 6,8 g Na2HPO4, 3,0 g ΚΗ2ΡO4, 1,0 g (NH4)2SO4, 0,5 g NaCI, 4 mL of 0,1 M MgSO4x 7 H2O και 100 μL of 1 M CaCI2x 2 H2O ανά λίτρο απεσταγμένου νερού. Επίσης, προστίθεται 1 mL από το διάλυμα SL-10 ιχνοστοιχείων, ανά λίτρο απεσταγμένου νερού. Το διάλυμα SL-10 αποτελείται από: 1 mL 25% ν/ν HCI, 1,5 g FeCI2χ 4 Η2O, 70,0 mg ZnCI2,100 mg MnCI2x 4 H2O, 3,0 mg H3BO3, 190 mg CoCI2x 6 H2O, 2,0 mg CuCI2x 2 H2O, 24 mg NiCI2x 6 H2O, και 36 mg Na2MoO4x 2 H2O„ ανά λίτρο απεσταγμένου νερού. Χρησιμοποιήθηκε στέλεχος του βακτηρίου E.coli που έχει τροποποιηθεί γενετικά ώστε να καταναλώνει εκλεκτικά υδατάνθρακες και οργανικά οξέα εκτός του γαλακτικού οξέος. Το στέλεχος φυλάσσεται σε 25% ν/ν διάλυμα καθαρής γλυκερόλης στους -80 °C, καλλιεργήθηκε σε τριβλία, που περιέχουν Τρυπτικό Άγαρ Σόγιας (Tryptic Soy Agar) και τοποθετήθηκε σε επωαστήρα στους 37 °C με χρόνο επώασης, περίπου 12 με 15 ώρες. Έπειτα επιλέχθηκε μια καθαρή αποικία από το τριβλίο και καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό υγρής μορφής (Tryptic Soy broth) όγκου 5 ml στους 37 °C με χρόνο επώασης περίπου 12 με 15 ώρες και ανακίνηση 200 rpm. Ακολούθησε δεύτερη προκαλλιέργεια όπου πραγματοποιήθηκε 4% ν/ν εμβολιασμός σε συνολικό όγκο 100 ml του συνθετικού διασταλάγματος, σε κωνικές φιάλες 250 mL. A hybrid biotechnological purification test of a synthetic solution simulating silage grass was carried out in a 3 L laboratory scale bioreactor. The synthetic silage, used as feed/substrate in this example, consists of nutrient M9, 10 g/L lactic acid, 0.5 g/L acetic acid, 0.5 g/L glucose, and 0.1 % w/v NaCl. Nutrient M9 consists of: 6.8 g Na2HPO4, 3.0 g KH2PO4, 1.0 g (NH4)2SO4, 0.5 g NaCl, 4 mL of 0.1 M MgSO4x 7 H2O, and 100 μL of 1 M CaCI2x 2 H2O per liter of distilled water. Also, 1 mL of the SL-10 trace element solution is added per liter of distilled water. The SL-10 solution consists of: 1 mL 25% v/v HCl, 1.5 g FeCl2x 4 H2O, 70.0 mg ZnCl2, 100 mg MnCl2x 4 H2O, 3.0 mg H3BO3, 190 mg CoCl2x 6 H2O, 2.0 mg CuCl2x 2 H2O, 24 mg NiCl2x 6 H2O, and 36 mg Na2MoO4x 2 H2O„ per liter of distilled water. A strain of E. coli that has been genetically modified to selectively consume carbohydrates and organic acids except lactic acid was used. The strain is stored in a 25% v/v solution of pure glycerol at -80 °C, cultured on plates containing Tryptic Soy Agar. and placed in an incubator at 37 °C with an incubation time of approximately 12 to 15 hours. Then a pure colony was selected from the plate and cultured in a liquid nutrient medium (Tryptic Soy broth) of 5 ml volume at 37 °C with an incubation time of approximately 12 to 15 hours and shaking at 200 rpm. A second pre-culture followed where a 4% v/v inoculation was performed in a total volume of 100 ml of the synthetic distillate, in 250 mL conical flasks.

Έπειτα, ο βιοαντιδραστήρας με όγκο τροφοδοσίας 1,8 L εμβολιάστηκε με 72 mL καλλιεργήματος της δεύτερης προκαλλιέργειας, αφού ρυθμίστηκαν οι συνθήκες διεξαγωγής της διεργασίας. Συγκεκριμένα, το pH ρυθμίστηκε στο 7,0, η ταχύτητα ανάδευσης στις 450 rpm, η θερμοκρασία στους 37 °C και η ροή αέρα στο 1,5 wm. Η ζύμωση διήρκησε 34 h επιτυγχάνοντας σταθερή συγκέντρωση γαλακτικού οξέος και ολική κατανάλωση (100%) γλυκόζης και οξικού οξέος. Μετά την ολοκλήρωση της ζύμωσης το μικτό υγρό συλλέχθηκε σε μπουκάλι όγκου 2 L με τη βοήθεια περισταλτικής αντλίας. Για το διαχωρισμό της βιομάζας από το επεξεργασμένο υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε φυγόκεντροςστις 4.500 rpm για 10 min. Το υπερκείμενο υγρό συνολικού όγκου 1,5 L ήταν ένα διαυγές διάλυμα γαλακτικού οξέος με 100% απομάκρυνση των προσμίξεων της γλυκόζης και του οξικού οξέος. Then, the bioreactor with a feed volume of 1.8 L was inoculated with 72 mL of the second pre-culture culture, after adjusting the process conditions. Specifically, the pH was adjusted to 7.0, the stirring speed to 450 rpm, the temperature to 37 °C and the air flow to 1.5 wm. The fermentation lasted 34 h, achieving a constant lactic acid concentration and total consumption (100%) of glucose and acetic acid. After the completion of the fermentation, the mixed liquid was collected in a 2 L bottle with the help of a peristaltic pump. A centrifuge was used to separate the biomass from the treated substrate at 4,500 rpm for 10 min. The supernatant liquid with a total volume of 1.5 L was a clear lactic acid solution with 100% removal of glucose and acetic acid impurities.

Claims

Claim 1<η>: Hybrid biotechnological method for purifying lactic acid solutions from impurities, which combines the process of aerobic fermentation in a bioreactor of any genetically modified strain of the microorganism E.coli and filtration technology, consisting of the following steps:

A) Feeding of the crude lactic acid solution (1) to be used as the substrate of the hybrid biotechnological purification method.

B) Cultivation and acclimatization, on the substrate, of an E.coli strain (2), which is genetically modified so that it cannot consume lactic acid or a specific optical isomer thereof (either D- or L-lactic acid).

C) Aerobic fermentation of the genetically modified E.coli strain in a bioreactor (6) under aeration (8) and mechanical agitation (7).

D) Separation of the treated feed from the microorganism cells (mainly) and from other suspended solids, through submerged or connected in parallel branch per circulation microfiltration or ultrafiltration membranes (15), by applying a pressure difference in semi-continuous or continuous operation.

Claim 2<η>: Hybrid biotechnological method for purifying lactic acid solutions from impurities, as described in claim 1, and characterized in that the separation of the treated feed from the microorganism cells (mainly) and from other suspended solids can be done alternatively or additionally by centrifugation (22), in combination with discontinuous or semi-continuous operation of the bioreactor (6).

Claim 3<η>: Hybrid biotechnological method for purifying lactic acid solutions from impurities, as described in the previous claims, and characterized in that the impurities of the solution are consumed by the microorganism for its growth, while the lactic acid or the optical isomer intended for the final product remains unaffected.

Claim 4<η>: Use of the hybrid biotechnological method for purifying lactic acid solutions from impurities, as described in the previous claims, and characterized in that it is used for removing impurities/impurities from lactic acid, at a rate greater than 98.0%.

Claim 5<η>: Use of the hybrid biotechnological method for purifying lactic acid solutions from impurities, as described in the previous claims, and characterized by being used for removing impurities of chemical compounds with high chemical affinity for lactic acid as well as optical isomers of lactic acid.

Claim 6<η>: Bioreactor (6) used for carrying out the hybrid biotechnological method of purifying lactic acid solutions from impurities, as described in claims 1 to 5, and characterized in that it has an aeration system (8), stirring system (9), pH control and foaming system (10,11,12,13,14) and a microfiltration or ultrafiltration membrane (15).