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FR3135094A1 - Système d’expression bactérien de protéines hétérologues - Google Patents

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FR3135094A1
FR3135094A1 FR2204127A FR2204127A FR3135094A1 FR 3135094 A1 FR3135094 A1 FR 3135094A1 FR 2204127 A FR2204127 A FR 2204127A FR 2204127 A FR2204127 A FR 2204127A FR 3135094 A1 FR3135094 A1 FR 3135094A1
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plasmid
gene
seq
bacteria
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FR2204127A
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Didier Lereclus
Michel Gohar
Auriane MONESTIER
Leyla Slamti
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Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
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Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
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Abstract

La présente invention se rapporte à une cassette d’expression permettant l’expression de protéines hétérologues par des bactéries, de préférence des bactéries Gram positives ; cette cassette se caractérise en ce qu’elle contient la séquence codant pour la protéine ORF2 de Bacillus thuringiensis. La présente invention se rapporte encore à des vecteurs d’expression recombinants comprenant une telle cassette d’expression et à des bactéries, de préférence Gram positives, transformées avec ce vecteur d’expression recombinant.

Description

Système d’expression bactérien de protéines hétérologues
La présente invention se rapporte à un nouveau système d’expression par des bactéries de protéines hétérologues sous forme pseudo cristalline, dans un état stable et protégées de la dégradation, ce système présente un avantage significatif en termes de purification desdites protéines.
La présente invention se rapporte plus particulièrement à une cassette d’expression permettant l’expression de protéines hétérologues par des bactéries, de préférence des bactéries Gram positives ; cette cassette se caractérise en ce qu’elle contient la séquence codant pour la protéine ORF2 deBacillus thuringiensis. La présente invention se rapporte encore à des vecteurs d’expression recombinants comprenant une telle cassette d’expression et à des bactéries, de préférence Gram positives, transformées avec ce vecteur d’expression recombinant.
L’utilisation de bactéries recombinantes pour produire des protéines hétérologues d’intérêt, telles que l’insuline et l’hormone de croissance, est connue de longue date et a été largement mise en œuvre, mais elle a aussi montré ses limites. En effet, les bactéries sont incapables de produire des protéines ayant une structure complexe comme les anticorps ou les facteurs de coagulation sanguine. Pour être stables et activesin vivoet donc efficaces chez l’homme, ces protéines doivent subir de multiples modifications post-traductionnelles.
En particulier, lorsqueE. coliest utilisé pour produire des protéines en grande quantité, celles-ci peuvent se retrouver mal repliées ou former des agrégats insolubles. Pour pallier ce problème, des protéines chaperons peuvent être co-exprimées avec la protéine d’intérêt, augmentant ainsi les chances d’obtenir une protéine correctement repliée et soluble. Cependant, de façon générale, ces méthodes donnent des résultats limités. En effet, lorsque l’expression de protéines formant des agrégats insolubles a été associée à l’expression de protéines chaperons deE. coli(DnaK, DnaJ, GrpE, GroES, GroEL), le résultat montre soit une augmentation très faible de la production de protéine soluble (Malekianet al., 2019, Protein Expression and Purification 160:66-72), soit la nécessité de traiter les agrégats insolublesin vitropar un système de maturation ATP-dépendant (Alfiet al., J Bioscience and. Bioengineering 128:290-295.). Lorsque cette expression est associée à des protéines chaperons d’autres origines, comme Spy (Spheroplast protein Y), l’augmentation de la production de protéines solubles est trop réduite pour présenter un intérêt industriel (Ruanet al., 2020, J. Biotech. 307:130-138).
Bacillus thuringiensis(Bt) est une bactérie Gram-positive sporulante qui produit d’importantes quantités de protéines insecticides (protéines Cry et Cyt). Celles-ci s’accumulent dans la cellule mère et forment des inclusions cristallines représentant jusqu’à 25% du poids sec de la bactérie. Ces inclusions sont libérées, par lyse cellulaire, à la fin du processus de sporulation (Agaisse et Lereclus, 1995). Cette production massive de protéines dépend de plusieurs facteurs : i) le nombre de copies des gènescryoucyt, ii) la force du promoteur, iii) la stabilité des transcrits, et iv) la formation d’un cristal stable. La capacité de produire certaines de ces toxines (Cry ou Cyt) sous forme cristalline est due, soit à un domaine C-terminal de certaines protéines Cry permettant la formation d’inclusions cristallines, soit à une protéine additionnelle « Helper » qui pourrait avoir un rôle de chaperon intervenant dans la cristallisation des protéines Cyt ou de certaines protéines Cry, dont le domaine C-ter est absent (Adalatet al.2017).
Par la mise au point d’une cassette d’expression originale permettant la co-expression de la protéine ORF2 de Bt et une protéine hétérologue d’intérêt sous le contrôle d’un promoteur fort, les Inventeurs sont parvenus à produire d’importantes quantités de protéines hétérologues (autres que des protéines Cry ou Cyt) dans une souche asporogène de Bt, préférentiellement en phase stationnaire.En absence de lyse cellulaire, la protéine hétérologue ainsi produite s’accumule dans la cellule bactérienne sous forme d’inclusion pseudo cristalline ; ceci apporte un avantage considérable pour la production de protéines instables ou cytotoxiques difficilement exprimées par les méthodes actuelles d’expression chez les microorganismes.
Ainsi, la présente invention se rapporte à unecassette d’expressioncomprenant :
(i) un promoteur fort actif pendant la phase stationnaire ;
(ii) une séquence ayant au moins 80%, de préférence au moins 90%, encore préférentiellement au moins 95% et tout préférentiellement 100% d’identité, avec la séquence SEQ ID N°2 du gène codant ORF2 de Bt de SEQ ID N°1 ; et
(iii) la séquence d’un gène codant une protéine hétérologue ;
lesdites séquences des gènes codant ORF2 et la protéine hétérologue étant en opéron sous le contrôle dudit promoteur fort.
Promoteur fort
Un promoteur fort est un promoteur permettant un niveau de transcription élevé du gène qui se situe en aval.
Le promoteur fort peut provenir de la cellule hôte utilisée pour l’expression de la protéine hétérologue ; il peut aussi s’agir d’un promoteur exogène. Les promoteurs forts sont préférentiellement des promoteurs activés en début de phase stationnaire et/ou qui sont fonctionnels pendant une grande partie de cet état physiologique.
En particulier, le promoteur fort peut être choisi parmi les promoteurs qui requièrent directement ou indirectement le régulateur Spo0A tels que ceux des gènescalY,inhA1,sipW,ces. Selon ce mode de réalisation, le promoteur fort est le promoteur du gènecalY(numéro d’accès EU604076 dans GenBank) et est désigné PcalYde séquence SEQ ID N°5, PinhA1de SEQ ID N°6 ou Pcesde SEQ ID N°7.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le promoteur fort peut être choisi parmi les promoteurs qui sont réprimés par le régulateur CodY pendant la phase de croissance exponentielle, le promoteur fort est alors choisi parmi PoppAde SEQ ID N°8 et PnppCde SEQ ID N°9. La répression par CodY est levée en fin de phase exponentielle et ces promoteurs sont donc spécifiquement actifs pendant la phase stationnaire.
Selon encore un autre mode de réalisation de l’invention, le promoteur fort est exprimé pendant la phase stationnaire deBacilluset plus préférentiellement le promoteur fort est régulé positivement par un régulateur choisi parmi PlcR et NprR. Les promoteurs forts sont préférentiellement choisis parmi PpapR(SEQ. ID. N°10), PplcB(SEQ. ID. N°11), PnprA(SEQ. ID. N°12), PnprR(SEQ ID N°13).
Ainsi, préférentiellement, le promoteur fort actif en phase stationnaire est choisi parmi PcalY, PinhA1, Pces, PoppA, PnppC, PpapR, PplcB, PnprAet PnprR.
Gène codant ORF2
La protéine ORF2 de Bt de séquence SEQ ID N°1 est co-transcrite avec le gène codant pour la protéine Cry2A et a été décrite comme facteur de cristallisation de cette protéine (Denget al.,Regulation of cry gene expression in Bacillus thuringiensis, Toxins, 2014 ; 6(7) : 2194-2209) ; elle est codée par la séquence nucléique SEQ ID N°2.
De façon surprenante, les Inventeurs ont mis en évidence que la co-expression du gène de la protéine hétérologue avec le gène codant pour la protéine ORF2 permet de condenser sous forme d’inclusion les protéines hétérologues produites (voir la partie expérimentale ci-après) dans les cellules hôtes et ainsi d’augmenter substantiellement la quantité de protéines hétérologues produites.
Gène codant la protéine hétérologue
On entend par protéine hétérologue, une protéine qui n’est pas naturellement exprimée par la cellule hôte modifiée par un vecteur d’expression comprenant la cassette d’expression selon l’invention. De préférence, la protéine hétérologue est une protéine d’intérêt industriel ou médical comme des enzymes, telles que protéases, lipases, amylases ; des hormones ; des antigènes, par exemple, utilisables comme immunogènes, des peptides ou des protéines à usage thérapeutique (bactériocines, inhibiteurs ou stimulateurs de la réponse cellulaire, …).
Il peut encore s’agir de toxines insecticides cytolytiques naturellement exprimées par Bt et utilisées comme biopesticide ; il pourra en particulier s’agir des protéines de la famille Cry (protéines du cristal) ou des protéines de la famille Cyt (toxines insecticides cytolytiques) ou des protéines Vip3 (toxines actives contre les insectes lépidoptères).
La cassette d’expression selon l’invention conduisant à l’expression et à la condensation des protéines hétérologues sous forme d’inclusion au sein des bactéries, son utilisation est particulièrement appropriée à la production de protéines hétérologues cytotoxiques pour la souche productrice ou instables.
De préférence, la séquence codant ORF2 est clonée encisdu gène codant la protéine hétérologue d’intérêt. Elle est préférentiellement clonée en opéron avec le gène codant la protéine hétérologue d’intérêt.
Autres composants de la cassette d’expression
Selon des modes de réalisations particuliers, la cassette d’expression selon l’invention peut en outre comprendre :
- une séquence stabilisatrice de l’ARNm positionnée en aval du promoteur et en amont de la séquence du gène codant ORF2 ; de préférence, il s’agit de STAB-SD de séquence SEQ ID N°3 ; de préférence, la séquence STAB-SD est en aval du +1 de transcription et à une position comprise entre environ 100 et 500, préférentiellement entre 100 et 300 et encore préférentiellement entre 100 et 150 paires de bases en amont du site de liaison ribosomique (dit RBS pour Ribosomal Binding Site) ; et/ou
- une séquence terminatrice du gène cry1Ac, désignée, Tcry1Ac, par exemple de séquence présentant au moins 90%, de préférence au moins 95% ou au moins 98%, d’identité avec la SEQ ID N°4, de préférence, il s’agit de la SEQ ID N°4 ; cette séquence est clonée en aval du gène codant la protéine hétérologue.
Le choix de ces séquences ne doit toutefois pas être considéré comme limitant du fait qu’il est à la portée de l’homme du métier de substituer ces séquences par des séquences aux fonctions équivalentes.
Ainsi, la cassette d’expression selon l’invention peut comprendre :
(i) un promoteur fort actif pendant la phase stationnaire ;
et la séquence stabilisatrice de l’ARNm STAB-SD ;
(ii) la séquence du gène codant ORF2 ;
(iii) la séquence d’un gène codant une protéine hétérologue ;
ou
(i) un promoteur fort actif pendant la phase stationnaire ;
(ii) la séquence du gène codant ORF2 ;
(iii) la séquence d’un gène codant une protéine hétérologue ;
et la séquence terminatrice du gène cry1Ac, Tcry1Ac ;
ou encore
(i) un promoteur fort actif pendant la phase stationnaire ;
et la séquence stabilisatrice de l’ARNm STAB-SD ;
(ii) la séquence du gène codant ORF2 ;
(iii) la séquence d’un gène codant une protéine hétérologue ;
et la séquence terminatrice du gène cry1Ac, Tcry1Ac.
Selon ces modes de réalisation, le promoteur fort actif pendant la phase stationnaire peut être choisi parmi PcalY, PinhA1, Pces, PoppA, PnppC, PpapR, PplcB, PnprAet PnprR.
plasmides recombinants
La présente invention se rapporte également à un plasmide recombinant comprenant la cassette d’expression selon l’invention.
Les plasmides utilisables selon l’invention comprennent classiquement une origine de réplication et au moins un système de sélection consistant en un ou plusieurs gènes permettant la sélection des bactéries transformées, par exemple des gènes de résistance aux antibiotiques.
Tout plasmide, de préférence à haut nombre de copies, adapté à l’hôte bactérien utilisé peut être mis en œuvre.
Les plasmides appropriés selon l’invention sont des plasmides permettant une expression dans les bactéries du genreBacillus.
De préférence, les plasmides utilisés sont ceux présentant une forte stabilité ségrégationnelle (par exemple, le plasmide doit rester présent dans la souche pendant au moins 25 générations) et/ou structurale (c’est-à-dire qu’il ne subit pas de remaniements moléculaires au cours de la croissance des bactéries). La stabilité des plasmides dérivés du réplicon pHT1030 (par exemple, les plasmides (pHT304, pHT315 ou pHT370) ou du réplicon pBC16 a été démontré (Lereclus, D., Arantes, O., 1992.spbAlocus ensures the segregational stability of pHT1030, a novel type of Gram-positive replicon.Mol. Microbiol. 7: 35-46 doi: 10.1111/j.1365-2958.1992.tb00835.x ; Arantes, O., Lereclus, D., 1991. Construction of cloning vectors forBacillus thuringiensis.Gene108: 115-119 doi: 10.1016/0378-1119(91)90495-w).
La stabilité structurale se définit comme une non recombinaison intramoléculaire du plasmide. La stabilité structurale du plasmide pHT1030 et de ses dérivés est démontrée par le fait qu’ils peuvent porter des fragments d’ADN exogène de grande taille (> 10 kb) sans subir de remaniements moléculaires (Lerecluset al., 1989. Transformation and expression of a cloned delta-endotoxin gene inBacillus thuringiensis.FEMS Microbiol . Lett. 60: 211-217).
Dans le cas de Bt, on peut utiliser des plasmides dérivés du pHT1030, du pBC16, du pE194, du pC194 et de tout plasmide naturellement présent dans cette bactérie, par exemple le pHT8-1 présent dans les souches BtkurstakiHD73 et Bt 407, le pHT73 présent dans la souche BtkurstakiHD73, ou encore le pBMB299 présent dans la souche BtkurstakiHD1.
De préférence, il s’agit de plasmides à haut nombre de copies notamment dérivés du plasmide pHT1030, tels que pHT3101, pHT304, pHT315 et pHT370 ; préférentiellement le pHT315.
La construction de la cassette d’expression selon l’invention et son incorporation dans un plasmide sont réalisées par les techniques de biologie moléculaire bien connues de l’homme du métier tel qu’illustré dans la partie expérimentale.
Bactéries transformées
La présente invention se rapporte encore à des bactéries transformées avec un plasmide selon l’invention.
Toute bactérie en phase stationnaire de croissance peut être utilisée.
De préférence, il s’agit de bactéries Gram+ telles que des bactéries du genreBacillus, en particulierBacillus cereus,Bacillus megaterium,Bacillus sphaericus,Bacillus subtilisetBacillus thuringiensis.
De façon encore préférée, on utilisera des souches du genreBacillus, en particulier deBacillus subtiliset Bt, asporogènes (naturelles ou mutant). Les souches asporogènes sont avantageuses en ce qu’elles ne présentent pas de lyse cellulaire, ainsi, les protéines hétérologues produites sont conservées dans la bactérie productrice (cellule mère) et protégées de la dégradation par les protéases extracellulaires.
Afin de supprimer l’activité de sporulation d’une souche de Bt, il est possible d’inactiver tout gène essentiel à la sporulation comme les gènes impliqués dans l’expression des facteurs sigma de sporulation Spo0A, SigE, SigH et SigK ; de préférence, une souche Bt ΔsigE ou ∆spo0A, préférentiellement Bt 407-ΔsigE (Bravoet al., 1996) ou Bt HD73 ∆spo0A, est utilisée.L’inactivation de ces gènes peut être obtenue par interruption ou modification de la séquence codante, ou par délétion de tout ou partie du gène. La délétion est obtenue par double crossing-over entre les régions adjacentes situées en amont et aval du gène, en utilisant des plasmides dont la réplication est thermosensible, par exemple les plasmides pRN5101 (Lereclus et al., 1992) ou pMAD (Arnaud et al., 2004), et en utilisant les protocoles décrits dans ces articles.
De préférence, lorsque le gène de sporulation inactivé estSpo 0 A, le promoteur fort utilisé est choisi parmi PpapR, PoppA, PnppC ,PnprA, PnprRet PplcB, et lorsque le gène de sporulation inactivé est sigE, le promoteur fort est PcalY ,PinhA1ou Pces.
Le plasmide selon l’invention peut être introduit dans la bactérie hôte selon les techniques connues de l’homme du métier ; en particulier, la transformation de la bactérie hôte peut être réalisée par électroporation (Lerecluset al., 1989) ou par conjugaison hétérogramique (Tieu-Cuotet al., 1987). La cassette d’expression contenant le gène d’intérêt peut aussi être introduite sur le chromosome bactérien ou sur un plasmide résident par recombinaison homologue (Lerecluset al., 1992).
Procédé de production d’une protéine hétérologue
La présente invention se rapporte aussi à un procédé de production d’une protéine hétérologue comprenant les étapes de :
- préparation d’une bactérie transformée selon l’invention ;
- culture de ladite bactérie transformée en phase stationnaire ; et
- optionnellement, purification de ladite protéine hétérologue.
La culture de la bactérie transformée est réalisée sur un milieu de culture contenant au moins une source d’azote et de glucose en des concentrations appropriées à une température comprise de préférence entre 25 et 35°C, de manière préférentielle la température est de l’ordre de 30°C ; par exemple, le milieu de culture est le milieu LB.
La purification de la protéine hétérologue peut être réalisée par centrifugation et solubilisation des cristaux ; en complément, les méthodes de chromatographie d’exclusion, de chromatographie en échange d’ions ou encore de chromatographie d’affinité peuvent être mises en œuvre.
La présente invention se rapporte encore à l’utilisation d’une séquence ayant au moins 80%, de préférence au moins 90%, encore préférentiellement au moins 95% et tout préférentiellement 100% d’identité, avec la séquence codant ORF2 de Bt dans une cassette d’expression comprenant également un promoteur fort actif en phase stationnaire et la séquence codant une protéine hétérologue, pour la production de ladite protéine hétérologue.
FIGURES
représentation schématique du plasmide pHT-Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac.
Effet de la protéine ORF2 sur la production et la condensation de protéines pendant la phase stationnaire de Bt. Observation au microscope à fluorescence de cellules de Bt407-ΔsigEtransformées avec le plasmide pHTCal’gfp-Tcry1Ac (a) et avec le plasmide pHT-Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac (b), puis avec un ajout de PEG6000 dans le milieu de culture (c).
Purification de la GFP produite en opéron avec l’ORF2. Photo de la migration sur un gel SDSPAGE 10% des fractions solubles (FS) et insolubles (FI) résultant des cultures de Bt 407ΔsigE- pHTCal’ORF2-gfp-TCry après 24 h à 30°C en milieu LB.
Effet de la protéine Helper ORF2 sur la production de GFP. Western blot : le gène codant pour la GFP est cloné en présence (ORF2-GFP) ou en absence (GFP) deorf2dans la construction montrée , à la différence que le promoteur utilisé est le PoppAau lieu du promoteur PcalY. Les extraits cytoplasmiques sont réalisés à partir d’une même densité cellulaire, et déposés sur le gel. GFP 1,5 µg est un étalon de GFP purifiée et Seeblue ladder est un marqueur de taille. La protéine GFP est détectée à l’aide d’un anticorps anti His-tag de la société GeneScript.
EXEMPLES 1. Matériel et Méthodes
1.1. Construction du plasmide selon l’invention pHT-Cal’ orf2 - gfp -Tcry1Ac et du plasmide contrôle pHTCal’ -gfp -Tcry1Ac
Plasmide pHT-Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac
La région promotrice du gènecalY(P calY ) a été amplifiée avec les oligos PcalY1 et PcalY2 à partir de l’ADN chromosomique de la souche BtkurstakiHD73. Le fragment d’ADN obtenu a été digéré par les enzymes Xba1 et Asc1, puis purifié comme fragment XbaI/AscI. La région terminatrice Tcry1aC a été amplifiée avec les oligos Tcry1 et Tcry2 à partir de l’ADN plasmidique de la souche HD73. Le fragment d’ADN obtenu a été digéré par les enzymes Kpn1 et EcoR1, puis purifié comme fragment KpnI/EcoRI. Ces deux fragments d’ADN ont été insérés entre les sites XbaI/AscI et KpnI/EcoRI, respectivement, dans un plasmide pHT315 contenant déjà la région STAB-SD entre les sites AscI et BamHI. Le gèneorf2a été amplifié avec les oligos ORF2(1) et ORF2(2) à partir de l’ADN plasmidique de la souche BtkurstakiHD1. Le gènegfpa été amplifié avec les oligos GFP1 et GFP2 à partir du plasmide pHT304-gfpbte (stock du laboratoire). Ce gènegfpcode pour une protéine GFP marqué à l’aide d’un His-tag. Ces deux fragments d’ADN ont été assemblés par “splicing by overlap extension PCR” et insérés dans le plasmide (préalablement linéarisé par PCR avec les oligos LinP1 et LinP2).
Oligonucléotides :
SEQ ID N°14 - PcalY1
5’-GCTCTAGAAAGCAAGACTAGTAATATTTATACGAG-3’ site XbaI souligné
SEQ DI N°15 - PcalY2
5’-GGCGCGCCCACAATCAATTCCCCCTAGCTTT-3’ site AscI souligné
SEQ ID N°16 - Tcry1
5’-GGGGTACCAACTCAGGTTTAAATATCGTTTTC-3’ site KpnI souligné
SEQ ID N°17 - Tcry2
5’-GGAATTCCCAAATAAAAAAAGAAAAAGCAGAG-3’ site EcoRI souligné
SEQ ID N°18 - ORF2(1)
5’-CATTTTATGGATCCCCCAAAGGATTTAACTATGCACGA-3’
SEQ ID N°19 - ORF2(2)
5’-CATTCATGGTGTCACCTCCTTAAAAATAAAGTTTTATATTAAAACTAAACTCTTTTGATA-3’
SEQ ID N°20 - GFP1
5’-TATCAAAAGAGTTTAGTTTTAATATAAAACTTTATTTTTAAGGAGGTGACACCATGAATG-3’
SEQ ID N°21 - GFP2
5’-ACCTGAGTTGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGAGA-3’
SEQ ID N°22 - LinP1
5’-GGTACCAACTCAGGTTTAAATATC-3’
SEQ ID N°23 - LinP2
5’-GGATCCATAAAATGATTTTTCAT-3’
Le plasmide pHT-Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac est représenté schématiquement à la .
Plasmide pHT-Cal’gfp-Tcry1
La région promotrice du gènecalY(P calY ) a été amplifiée avec les oligos PcalY1 et PcalY2 à partir de l’ADN chromosomique de la souche BtkurstakiHD73. Le fragment d’ADN obtenu a été digéré par les enzymes Xba1 et Asc1, puis purifié comme fragment XbaI/AscI. La région STAB-SD a été amplifiée avec les oligos StabSD1 et StabSD2 à partir d’un plasmide contenant toute la région promotrice du gènecry3A. Le fragment d’ADN obtenu a été digéré par les enzymes AscI et BamHI, puis purifié comme fragment AscI/BamHI. La région terminatrice Tcry1aC a été amplifiée avec les oligos Tcry1 et Tcry2 à partir de l’ADN plasmidique de la souche HD73. Le fragment d’ADN obtenu a été digéré par les enzymes Kpn1 et EcoR1, puis purifié comme fragment KpnI/EcoRI. Ces trois fragments d’ADN ont été insérés entre les sites XbaI/AscI, AscI/BamHI et KpnI/EcoRI, respectivement, dans un plasmide pHT315. Le gènegfpa été amplifié avec les oligos GFP1’ (GFP1 bis) et GFP2’ à partir du plasmide pHT304-gfpbte (stock du laboratoire) et inséré dans le plasmide (préalablement linéarisé par PCR avec les oligos LinP1 et LinP2).
SEQ ID N°14 - PcalY1
5’-GCTCTAGAAAGCAAGACTAGTAATATTTATACGAG-3’ site XbaI souligné
SEQ DI N°15 - PcalY2
5’-GGCGCGCCCACAATCAATTCCCCCTAGCTTT-3’ site AscI souligné
SEQ ID N°26 - StabSD1
5’-GGCGCGCCTCTTGAAAGGAGGGATGCCT-3’ site AscI souligné
SEQ ID N°27 - StabSD2
5’-CGGGATCCATAAAATGATTTTTCATAAATC-3’ site BamHI souligné
SEQ ID N°16 - Tcry1
5’-GGGGTACCAACTCAGGTTTAAATATCGTTTTC-3’ site KpnI souligné
SEQ ID N°17 - Tcry2
5’-GGAATTCCCAAATAAAAAAAGAAAAAGCAGAG-3’ site EcoRI souligné
SEQ ID N°28 - GFP1 bis
5’- TCATTTTATGGATCCGAAATAAAATGCATCTGTATTTGAA-3’
SEQ ID N°21 - GFP2
5’-ACCTGAGTTGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGAGA-3’
SEQ ID N°22 - LinP1
5’-GGTACCAACTCAGGTTTAAATATC-3’
SEQ ID N°23 - LinP2
5’-GGATCCATAAAATGATTTTTCAT-3’
1.2. Préparation et transformation de la souche asporogène Bt407-ΔsigE
Le mutant Bt 407-ΔsigE est préparé selon Bravoet al., 1996.
Les bactéries sont cultivées en milieu LB à 37°C jusqu’à DO600nm= 1 et transformées par électroporation comme décrit dans Lerecluset al., 1989.
1.3. Production de la GFP
La souche asporogène Bt407-ΔsigEest transformée avec chacun des deux plasmides construits, pHT304-18-Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac et pHTCal’-gfp-Tcry1Ac (plasmide contrôle), puis cultivée en milieu LB a 30°C.
La culture a été arrêtée 24 h après le début de la culture et les cellules fixées avec du formaldéhyde, puis observées au microscope a fluorescence ( ).
2. Résultats
L’observation au microscope à fluorescence des cellules contenant le plasmide contrôle révèle une expression diffuse de la GFP dans les cellules au bout de 24h de culture ( a). L’observation au microscope à fluorescence de la souche Bt407-ΔsigEpHTCal’orf2-gfp-Tcry1Ac quant à elle révèle l’apparition d’un début de formation de cristaux ou de pseudo-cristaux de GFP ( b). La présence de l’ORF2 permet donc de produire la GFP sous une forme cristalline ou pseudo cristalline. La co-transcription en opéron des gènes de la protéine ORF2 et de la GFP suffit à la formation de ces structures.
De façon intéressante, lorsque les cellules Bt407-ΔsigE-pHT-Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac sont centrifugées afin de stopper leur croissance au bout de 24h et qu’un précipitant connu en cristallographie, le PEG6000, est ajouté à hauteur de 20%, il est observé une augmentation de la taille des cristaux ou des pseudo-cristaux dans les cellules ( c).
A 24h de culture en milieu LB à 30°C, les cellules Bt407-ΔsigE-pHT-Cal’orf2-gfp-Tcry1Ac ainsi que les cellules témoins sont cassées à la French Press à 2 kbar de pression, puis le milieu de culture contenant les cellules cassées est centrifugé afin de séparer la fraction soluble de la fraction insoluble. 2 μg de ces fractions sont déposées sur un gel SDS-page 10% ( ). La GFP se retrouve cette fois dans la fraction soluble, signifiant que les inclusions deviennent solubles au moment du cassage des cellules dans un tampon à 200 mM NaCl, 20 mM tris pH7.5. Les mêmes résultats sont observés lorsque le milieu de cassage est acidifié jusqu’à pH5.5.
SEQUENCES SEQ ID N°1 – ORF2 de Bacillus thuringiensis
MLKYHFPNVCEDELINIYSYGDFKGQGKYICLFKIENQSFLFWRNDKGNKIYTNLESISVEIINTNNTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVYTQDLIDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVCPQDLVDTYNQSQNVCPQDLNVYTQDLIDTYNQSQNCDCGCK
SEQ ID N°2
ATGCTAAAATATCATTTTCCTAATGTATGTGAAGATGAATTAATTAATATATATTCTTATGGGGATTTTAAAGGACAAGGAAAATATATATGCCTCTTTAAAATTGAAAACCAATCATTCTTATTTTGGAGAAACGATAAAGGAAATAAAATATATACAAATTTAGAATCTATCAGTGTAGAAATAATAAACACGAATAATACGTATAATCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAATCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAATCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAACCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAATCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAACCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAACCAAAGTCAGAATGTATACACACAAGATTTAATTGATACGTATAACCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAACCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAACCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTAGTTGATACGTATAACCAAAGTCAGAATGTATGCCCACAAGATTTGAATGTATACACACAAGATTTAATTGATACGTATAATCAAAGTCAGAATTGTGATTGTGGTTGTAAG
SEQ ID N°3 - STAB-SD Bacillus thuringiensis
gaaaggaggg atgcc
SEQ ID N°4 - Tcry1Ac - Bacillus thuringiensis
aaactcaggt ttaaatatcg ttttcaaatc aattgtccaa gagcagcatt acaaatagat
aagtaatttg ttgtaatgaa aaacggacat cacctccatt gaaacggagt gatgtccgtt
ttactatgtt attttctagt aatacatatg tatagagcaa cttaatcaag cagagatatt
ttcacctatc gatgaaaata tctctgcttt ttcttttttt at
SEQ ID N°5 - P calY Région promotrice du gène calY de Bacillus thuringiensis .
5’-AAGCAAGACTAGTAATATTTATACGAGTGTGAGGGAACGTTAGCCCTCACCTCTTTGTTTTTCTTTTTTCTTATAGTATTAAATGATTTGAGTGTGAAAAAAGTTATAAATTATCATTGTTTTTTTCTGAAAAGTCTAAATGATATTGAGAAATAAAAATAACTGAAAATATTAATAAATATGTGTTGTGTTTATATAGGGTTGTTCGTTATAATGAACATAAGGTTTTTAAAAAAGAACACATATTAGCTAAGCTAATATAGTTTTCTTTACATCTCTTATTGAAAAATAAGTGATAAAAATATAAAAAAAAGCTAGGGGGAATTGATT-3’
Soulignée d’un trait : la région 10 (TATAAT) du promoteur.
Soulignée de deux traits : la région -35 (TTGTGT) du promoteur.
En gras : le +1 de transcription déterminé par RACE PCR.
SEQ ID N°6 -Région promotrice du gèneinhA1deBacillus thuringiensis - P inhA1
AATTGTGATATATTCGTATGCTAACTATGAAATTTTTACAAATATATTAAAAATATTACATGATATGACTAAATATTGAAAAAATATTGAATTTTTAATAAAATTCAATTTGTAATACATATTATTTATTAGGGGAGGAAATATGGGATG
Pces de SEQ ID N°7
AAGTAATCGTTGCCGTACCCGTATGAAATTGAAATAAATAAAATTATTAATATTCTAATAATTCGTATTGCGTGAATATTAATAATTGTTTATAATGAAAATTGTATAATTTTGGTTAATTAACTTGTGCGAAGAAAAGTTAATAATGTATTAAGGAAAATGAATGTTTTTGTATTTTACTTTTTTTAAAAGAGGG
SEQ ID N°8Région promotrice du gèneoppAdeBacillus thuringiensis - P oppA
CTAGACCGTCAAAATATTACTAGAATTATTATACTATAAAAGCTATAATAAGTACTAGGATTAATTTTTTGAAAATTATACGCAATTAAAGGTCTGATTTTAAGATGATGGTAGCAATGTTAATGTATCCCTTTACGAAAAATTTAAAATATAAATATTTTATTAAAAATTTTAACAAAAAAACAAAAAACTATATTCACAATTGTTATATTATATGTATAATGAAAATTGTAGAAACTTGGAGATTATTCTTTCAATTCTACTTTTTAACAAGTGAGGGTACAGGAAGTGCAATTAGGGGAGG
SEQ ID N°9 -Région promotrice du gènenppCdeBacillus thuringiensis - P nppC
ATTCCACTTTTATATAAAAAGATTTTTGAATATTTTTTCAACTTACCCTTGTCAAACATTGTCAATTTATATTAAAATAACAACATACAAAATATTTAGTCTTTTCAGAAAAGATGGAGGGATAGCCATG
SEQ ID N°10 -Région promotrice du gènepapRdeBacillus thuringiensis - P papR
CTAGAACCATGAATTAAAAGAATCACTTATAAAAAAAATGAAGAAATAAAAAAGACATAAAGAACAAATATGCATAATTGCATAAAGTCTGGATAATTTTTCATGATATATTTAAAGAAAAAATGCGG
SEQ ID N°11 -Région promotrice du gèneplcBdeBacillus thuringiensis - P plcB
AGCATGTGTATGCTTTACTCTTTTTTTACATTAGTTTAGACAAGCCTTAATAATAGTTTATTAAAATGAAAGTGTATTCATTCATTATATTCACTGTGTATAAAGTTATAATGATATGAACATTTGCATATTTTAATTTAGTGATAGAAATTTCGTGAAAGGTGGGATATTCTAGTCATAGGTTAACCGGACGACATCATAGGATCCTAACAAAATGTTTACAATAATTCAATTATAAAATGGAGG
SEQ ID N°12 -région promotrice du gènenprAdeBacillus thuringiensis P nprA
TTTTTTCAATATTTGTTCCTCAAAATTCTACAAAACTTGAGAAATAAATTAATTGAATTTTTAGTATATTAATAGTGGAAACATAATGCTAATATGAAACTACTCTTTTTCAAAAAAATTTTTATTAGGGGGAAGGTTCATG
SEQ ID N°13 -région promotrice du gèneinhA1deBacillus thuringiensis P nprR
GAAGTGAAGTCAAGAGAGAAAAAAATGAAATTATGCATATTTTTTAGAAAATTTATATTTATCAATTTATATTTCTCCGAATTTTATGTATTATTAGAGTAATGGGGTAATGAGAATGGAGG
oligonucléotides SEQ ID N°14 - PcalY1
5’-GCTCTAGAAAGCAAGACTAGTAATATTTATACGAG-3’
SEQ DI N°15 - PcalY2
5’-GGCGCGCCCACAATCAATTCCCCCTAGCTTT-3’
SEQ ID N°16 - Tcry1
5’-GGGGTACCAACTCAGGTTTAAATATCGTTTTC-3’
SEQ ID N°17 - Tcry2
5’-GGAATTCCCAAATAAAAAAAGAAAAAGCAGAG-3’
SEQ ID N°18 - ORF2(1)
5’-CATTTTATGGATCCCCCAAAGGATTTAACTATGCACGA-3’
SEQ ID N°19 - ORF2(2)
5’-CATTCATGGTGTCACCTCCTTAAAAATAAAGTTTTATATTAAAACTAAACTCTTTTGATA-3’
SEQ ID N°20 - GFP1
5’-TATCAAAAGAGTTTAGTTTTAATATAAAACTTTATTTTTAAGGAGGTGACACCATGAATG-3’
SEQ ID N°21 - GFP2
5’-ACCTGAGTTGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGAGA-3’
SEQ ID N°22 - LinP1
5’-GGTACCAACTCAGGTTTAAATATC-3’
SEQ ID N°23 - LinP2
5’-GGATCCATAAAATGATTTTTCAT-3’
SEQ ID N°24 - PcalY1 oligo
5’-GCTCTAGAAAGCAAGACTAGTAATATTTATACGAG-3’
SEQ ID N°25 – PcalY2 oligo
5’-GGCGCGCCCACAATCAATTCCCCCTAGCTTT-3’
SEQ ID N°26 - StabSD1
5’-GGCGCGCCTCTTGAAAGGAGGGATGCCT-3’
SEQ ID N°27 - StabSD2
5’-CGGGATCCATAAAATGATTTTTCATAAATC-3’
SEQ ID N°28 - GFP1 bis
5’- TCATTTTATGGATCCGAAATAAAATGCATCTGTATTTGAA-3’

Claims (13)

  1. Cassette d’expression comprenant :
    (i) un promoteur fort actif en phase stationnaire ;
    (ii) une séquence ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°2 du gène codant ORF2 de Bt ; et
    (iii) la séquence d’un gène codant une protéine hétérologue ;
    lesdites séquences des gènes codant ORF2 et la protéine hétérologue étant en opéron sous le contrôle dudit promoteur fort.
  2. Cassette d’expression selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit promoteur fort actif en phase stationnaire est choisi parmi PcalY, PinhA1, Pces, PoppA, PnppC, PpapR, PplcB, PnprAet PnprR .
  3. Cassette d’expression selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre une séquence stabilisatrice de l’ARNm et/ou une séquence terminatrice du gène cry1Ac.
  4. Cassette d’expression selon la revendication 3, caractérisée en ce que la séquence stabilisatrice de l’ARNm est la séquence STAB-SD.
  5. Plasmide recombinant comprenant la cassette d’expression selon l’une quelconque des revendications 1 à 4.
  6. Plasmide recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit plasmide est un plasmide à forte stabilité ségrégationnelle et/ou structurale permettant une expression dans les bactéries du genreBacillus.
  7. Plasmide recombinant selon la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisé en ce que ledit plasmide est choisi parmi pHT3101, pHT304, pHT315, pHT370, pBC16, pE194, pC194, pHT8-1, pHT73 et pBMB299 ou d’un plasmide dérivé.
  8. 8. Bactérie transformée comprenant un plasmide selon l’une quelconque des revendications 5 à 7.
  9. 9. Bactérie transformée selon la revendication 8, caractérisée en ce qu’elle est une bactérie asporogène du genreBacillus.
  10. Bactérie transformée du genreBacillusselon la revendication 9, caractérisée en ce que le gène de sporulation inactivé estSpo0Aet ledit promoteur fort actif en phase stationnaire est choisi parmi PpapR, PoppA, PnppC, PnprA, PnprRet PplcB,
  11. Bactérie transformée du genreBacillusselon la revendication 9, caractérisée en ce que le gène de sporulation inactivé est sigE et ledit promoteur fort actif en phase stationnaire est choisi parmi PcalY ,PinhA1et Pces.
  12. 12. Procédé de production d’une protéine hétérologue comprenant les étapes de :
    - préparation d’une bactérie transformée selon l’une quelconque des revendications 8 à 11 ;
    - culture de ladite bactérie transformée en phase stationnaire ; et
    - optionnellement, purification de ladite protéine hétérologue.
  13. 13. Utilisation d’une séquence ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°2 codant ORF2 de Bt dans une cassette d’expression comprenant également un promoteur fort actif en phase stationnaire et la séquence codant une protéine hétérologue, pour la production de ladite protéine hétérologue.
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