FR3119459A1 - Plaque pour une analyse par spectrometrie de masse utilisant une technique d’ionisation maldi - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une p laque d’analyse comprenant au moins une zone d’analyse destinée à recevoir une population d’au moins un micro-organisme à caractériser par spectrométrie de masse utilisant une technique d’ionisation MALDI, la plaque d’analyse étant caractérisée en ce que : tout ou partie de ladite zone d'analyse est réalisée en un matériau poreux, et ladite zone d’analyse comprend au moins un agent antimicrobien.
Description
La présente invention concerne le domaine de la microbiologie. Plus précisément, l'invention concerne la caractérisation d’une population d’au moins un micro-organisme en utilisant la spectrométrie de masse, dit MS (pourMass Spectrometry), et en particulier, la MS utilisant une technique d’ionisation MALDI (pourMatrix Assist ed Laser Desorption Ionization)
La technique MALDI associée à un analyseur de masse de type temps de vol, dit TOF (pourTime of Fly), est utilisée depuis quelques années pour réaliser une identification rapide de micro-organismes, au niveau de l’espèce. Différents appareillages adaptés à une telle caractérisation sont commercialisés par la demanderesse, et également par les sociétés Bruker Daltonics, ASTA et Bioyang.
L’identification d’un micro-organisme est réalisée à partir du spectre de masse MALDI-TOF des protéines les plus abondantes dans le micro-organisme, par comparaison avec des données de référence permettant l’identification du genre et le plus souvent de l’espèce du micro-organisme. En routine, le protocole mis en œuvre comprend le dépôt d’au moins une portion de colonie du micro-organisme sur une plaque MALDI, l’ajout d’une matrice adaptée à la technique MALDI, l’acquisition du spectre de masse et l’identification de l’espèce par comparaison avec des données de référence stockées dans une base de données (Welker M, Moore ER. Syst. Appl. Microbiol. 2011 Feb;34(1):2-11,Applications of Whole-Cell Matrix-Assisted Laser-Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry in Systematic Microbiology).
La technique MALDI-TOF a également été utilisée pour détecter la résistance d’un micro-organisme à un antibiotique. Ainsi, des procédés de détection de la résistance en MALDI-TOF après mise en contact avec un antibiotique et sans culture sont connues. Citons à titre d’exemple la détection de l’hydrolyse des bêta-lactamines par action des bêta-lactamases (WO 2018/099500 A1, WO 2011/154517 A1, WO 2012/023845 A1, ou encore WO 2016/016580 A1 de la demanderesse). Dans ce cas, restreint à la résistance aux bêta-lactamines, une modification de la masse de l’antibiotique est détectée après réaction avec les bêta-lactamases de l’échantillon bactérien. De façon intéressante, la demanderesse a proposé de fonctionnaliser la surface d’analyse par dépôt préalable de l’agent antimicrobien, le dit agent étant séché après dépôt (WO 2016/016580 A1). La surface d’analyse, dénommée plaque, ou cible, peut ainsi comporter un ensemble de zones fonctionnalisées prêtes à recevoir un échantillon microbien pour caractériser sa résistance aux bêta-lactamases par contact avec un antibiotique de la classe des bêta-lactamines. Cette fonctionnalisation permet de simplifier le mode opératoire de façon avantageuse pour l’utilisateur. Les cibles fonctionnalisées peuvent être préparées à l’avance, par exemple en usine, de façon à disposer d’un consommable prêt à l’emploi. L’échantillon contenant au moins un micro-organisme est ensuite simplement déposé sous forme liquide sur l’une des zones fonctionnalisées, incubé, séché et analysé par MALDI-TOF.
Des méthodes de détection de mécanismes de résistance par MALDI-TOF de tout type d’antibiotique sont également connus après mise en culture des micro-organismes en présence de l’antibiotique. Ces procédés mesurent, une altération du paterne protéique bactérien, comme dans la demande US 2008/0009029 A1, ou une augmentation de la biomasse bactérienne au cours de la culture lorsque le germe est résistant à l’antibiotique, comme dans les demandes EP 2 801 825 A1, WO 2014/187517 A1. Plus particulièrement, l’augmentation de biomasse peut être déterminée par comparaison de spectres de masse obtenus après croissance avec et sans antibiotique, l’une des conditions de croissance ayant été effectuée en milieu de culture avec isotopes lourds (EP 2 801 825 A1); ou encore, par comparaison du signal des pics caractéristiques du micro-organisme à analyser par rapport à une substance de référence ajoutée sous forme dosée (WO 2014/187517 A1). Cette dernière invention est utilisée dans le procédé MBT-ASTRA décrit par Sparbieret al.(Sparbier et al., 2016, Methods, 104 : 48-54,MBT-ASTRA : a suitable tool for fast antibiotic susceptibility testing ?).En pratique, 200µl de micro-organismes à 0,5 McFarland sont cultivés à 37°C avec ou sans antibiotique durant un temps prédéterminé. Après incubation, les cellules sont culotées par centrifugation et lavées successivement avec 150µl d’eau pure puis 100µl d’éthanol 70%. Elles sont ensuite lysées avec 10µl d’acide formique à 70% puis 10µl d’acétonitrile pur contenant la substance de référence. La solution de cellules lysées est déposée sur la cible MALDI-TOF pour acquérir un spectre de masse et comparer l’intensité des pics des protéines du micro-organisme à celui de la substance de référence. Un algorithme permet finalement de classer le micro-organisme comme résistant ou sensible à l’antibiotique en fonction d’un certain seuil.
Idelevichet al.ont récemment simplifié ce procédé en réalisant l’incubation de la solution de micro-organisme avec ou sans antibiotique directement sur la cible. Le nouveau procédé a été dénommé DOT-MGA pourdirect-on- target microdroplet growth assay(Idelevichet al., Clin Microbiol Infect. 2018 Jul;24(7):738-743,Rapid Detection of Antibiotic Resistance by MALDI-TOF Mass Spectrometry Using a Novel Direct-On-Target Microdroplet Growth Assay). Il présente néanmoins plusieurs désavantages rédhibitoires, notamment la nécessité d’incuber une goutte de liquide ne devant pas sécher et la nécessité d’éliminer l’excès de liquide par buvardage.
L’étape d’incubation de l’échantillon, comportant éventuellement des micro-organismes avec ou sans antibiotique, doit impérativement être réalisée en milieu liquide en maitrisant la composition du milieu. Cette incubation peut durer plusieurs heures. Or une goutte de quelques microlitres sèche d’autant plus rapidement à l’air libre que la température est élevée et que l’air est sec. Lorsque la goutte sèche, la composition du milieu liquide change : la concentration en sels et en nutriments augmente et peut finir par inhiber la croissance du micro-organisme à caractériser. Un isolat résistant pourrait ainsi ne pas pousser et donner l’illusion que le micro-organisme est sensible à l’antibiotique testé. Il est donc impératif de réaliser l’incubation sous atmosphère humide, et si possible sous atmosphère saturée en humidité, pour limiter au maximum l’évaporation.
La société Bruker a tenté de résoudre cette difficulté en proposant une chambre humide, conservant l’humidité par déliquescence d’une substance appropriée (WO 2019/011746 A2). Néanmoins, maintenir une atmosphère humide présente l’inconvénient de favoriser le développement de moisissures sporulantes qui vont contaminer l’air et toutes les surfaces de la chambre humide ou de l’étuve. Les spores ainsi formées vont contaminer les gouttes pendant leur incubation et fausser le résultat de l’analyse, soit en perturbant la croissance des micro-organismes à caractériser, soit en contribuant à l’apparition de pics artefactuels sur le spectre de masse.
L’étape de buvardage de la goutte de liquide présente sur la cible à l’issue de l’étape d’incubation est également une opération délicate. Elle demande une grande application pour ne pas contaminer deux puits adjacents, généralement très proches. Le buvard ne doit pas toucher la surface pour ne pas risquer de retirer par grattage ou essuyage les micro-organismes pouvant s’y trouver. Faute de quoi, le buvard peut entrainer une partie des micro-organismes, ce qui fausse l’analyse quantitative de leur taux de croissance. De plus, le buvard peut être contaminé par des micro-organismes pathogènes. Il doit donc être manipulé et éliminé comme potentiellement souillé par des micro-organismes infectieux, ce qui est potentiellement dangereux pour la sécurité des opérateurs.
Par ailleurs, l’étape de buvardage est actuellement réalisée à la main, ce qui demande un geste assuré, réalisé avec dextérité, sans trembler. Sa reproductibilité risque donc d’être insuffisante d’un opérateur à l’autre pour généraliser son utilisation en routine dans les laboratoires cliniques. Son automatisation nécessiterait une grande précision pour positionner correctement le ou les buvards sans risque de chevauchement entre deux spots. Ensuite le buvard devrait éponger la goutte de liquide en descendant progressivement sans toucher la surface de la cible pour ne pas altérer la couche de micro-organismes. Il faudrait enfin éliminer les buvards potentiellement infectieux sans contaminer le robot, en évitant tout particulièrement que le ou les buvards laissent tomber des gouttelettes ou que leur décharge ne crée des aérosols.
La société Bruker a tâché de résoudre ces difficultés en proposant un procédé d’extraction utilisant un matériaux absorbant comprenant un motif d’indentation ou de trous, dans la demande de brevet EP 3 376 202 A1. La disposition de ceux-ci correspond aux positions prédéfinies des gouttelettes d’échantillons sur la cible. De cette façon les bords des indentations ou des trous sont supposés rentrer en contact avec les gouttelettes de façon à les buvarder progressivement par l’un des côtés des gouttelettes. Ce procédé reste néanmoins délicat à mettre en œuvre. Les gouttelettes ne se positionnent pas nécessairement de façon parfaitement identiques d’une zone de réception à l’autre. Elles peuvent être légèrement décentrées, ce qui rend difficile un contact correct entre le matériau absorbant et la gouttelette. Par conséquent le buvardage peut être inhomogène et peu reproductible.
La même société Bruker a également proposé un procédé de dessalage sur cibles de protéines extraites d’un échantillon cellulaire cultivé sur cible (EP 3 404 417 A1). Ce procédé pourrait être utile pour faciliter l’ionisation des protéines de cellules, notamment de micro-organismes, ayant été cultivées dans un milieu de culture avec et sans antibiotique. Ce procédé ne résout toutefois pas les problèmes d’incubation ou de buvardage mentionnés ci-dessus.
Afin de résoudre les problèmes mentionnés ci-dessus, les inventeurs proposent une plaque d’analyse comprenant au moins une zone d’analyse destinée à recevoir une population d’au moins un micro-organisme à caractériser par spectrométrie de masse utilisant une technique d’ionisation MALDI, caractérisée en ce que :
- tout ou partie de ladite zone d'analyse est réalisée en un matériau poreux et
- ladite zone d’analyse comprend au moins un agent antimicrobien.
Un autre objet de la présente invention est un système comprenant :
- une plaque d’analyse selon l’invention, et
- un support réalisé en un matériau poreux ;
ladite plaque étant placée sur ledit support.
L’invention a également pour objet un procédé de caractérisation d’une population d’au moins un micro-organisme, la caractérisation comprenant au moins la détermination de la présence éventuelle d’une population d’un micro-organisme résistant à au moins un agent antimicrobien utilisant la plaque d’analyse selon l’invention.
La demanderesse a en effet découvert que de façon surprenante, quelques microlitres de liquide contenant éventuellement des micro-organismes et au moins un agent antimicrobien peuvent être incubés plusieurs heures sur une plaque d’analyse selon l’invention sans sécher.
Une plaque d’analyse MALDI présente, au moins une et, en général plusieurs zones d’analyse. La zone d’analyse forme un spot, le plus souvent de forme circulaire. Afin de favoriser l’ionisation ultérieure, au moins au niveau de la ou des zones d’analyse, la surface de la plaque est conductrice. A titre d’exemple, une telle plaque d’analyse est formée d’un polymère tel que le polypropylène, ledit polymère étant recouvert d’une couche d’acier inoxydable. Le polymère peut contenir un matériau conducteur tel que le noir de charbon. Une telle plaque peut-être, par exemple, celle commercialisée par la demanderesse, sous le nom de VITEK®MS-DS, avec la référence 410893.
Différentes plaques MALDI sont disponibles dans le commerce telles que les plaques Fleximass DS de Shimadzu (jetables ou réutilisables) et les plaques MBT Biotarget de Bruker Daltonics. De telles plaques comprennent le plus souvent de 48 à 96 zones d’analyse ou spots, et au moins une, voire deux ou trois zones d’analyse de référence, qui peuvent être de taille différente des zones d’analyse. Ces zones d’analyse de référence peuvent servir de zone de calibration et/ou de zone de validation des analyses.
Dans le cadre de l’invention, on nomme « zone d’analyse » une zone réalisée en un matériau poreux, ladite zone d’analyse comprenant au moins un agent antimicrobien.
Par « matériau poreux », on entend une matrice renfermant des pores ou des cavités de petite taille et pouvant contenir un ou plusieurs fluides (liquide ou gaz). Dans le cadre de la présente invention le matériau poreux est dit « ouvert » c’est-à-dire que les pores sont reliés entre eux, formant des canaux très fins.
Le matériau poreux selon l’invention rend ainsi possible l'absorption d'eau ou de vapeur d'eau et le passage de l'air. C’est un matériau capillo-poreux, hygroscopique et perméable à l'air.
Dans le cadre de la présente invention, la taille des pores de la zone d’analyse est inférieure à la taille dudit au moins un micro-organisme à caractériser. De telle sorte que ledit au moins un micro-organisme ne risque pas de passer à travers les pores de la zone d’analyse. Dans le cadre de la présente invention par taille de pore on entend le diamètre du pore. Tous les pores d’une même zone d’analyse n’ont pas la même taille, ou diamètre. Ainsi, dans le cadre de l’invention, le pore dont la taille est la plus élevée dans une zone d’analyse est inférieure à la taille du micro-organisme à caractériser.
Selon l’invention, un agent antimicrobien est déposé sur ladite zone d’analyse de la plaque d’analyse, formant une zone d’analyse dite fonctionnalisée.
Par « agent antimicrobien », on entend un composé capable de diminuer la viabilité d’un micro-organisme et/ou d’en diminuer la croissance ou la reproduction. De tels agents antimicrobiens peuvent être des antibiotiques, lorsqu’ils sont dirigés contre des bactéries. Néanmoins, l’invention est applicable à tout type de micro-organisme du type bactéries, levures, moisissures ou parasites et donc, aux agents antimicrobiens correspondants.
Dans le cadre de l’invention, l’agent antimicrobien peut être sélectionné de manière à permettre l’identification de la résistance à tout agent antimicrobien, par exemple un antibiotique ou un antifongique.
Le dépôt est, de préférence, réalisé à partir d’une solution aqueuse de l’agent antimicrobien.
Un tampon adapté à la solubilité de l’agent antimicrobien, ainsi qu’à une activité optimale du mécanisme à l’origine de la résistance ciblée, pourra également être utilisé pour préparer la solution de l’agent antimicrobien.
Une goutte, par exemple d’environ 1 à 2 microlitres, de la solution antimicrobienne pourra être déposée, de telle sorte que toute la zone d’analyse soit recouverte. L’eau contenue dans la solution est ensuite évaporée, par exemple par simple séchage à l’air ambiant et à température ambiante. La plaque d’analyse peut être laissée à une température appartenant, par exemple, à la gamme allant de 17 à 40°C, et notamment à température ambiante (22°C). Il est également possible de la transférer dans une enceinte thermostatée, par exemple à 37°C, pour accélérer le séchage.
De manière très simple, l’agent antimicrobien sera déposé en solution aqueuse, ce dépôt pouvant être suivi d’une opération de séchage. On obtient ainsi une zone d’analyse porteuse d’un agent antimicrobien, dite fonctionnalisée. Il est également possible que l’agent antimicrobien soit immobilisé sur la zone d’analyse par des liaisons covalentes ou des liaisons de forte affinité. A la place d’un simple dépôt, l’agent antimicrobien pourra être lié à la zone d’analyse par des liaisons électrostatiques, ioniques, covalentes, avec ou non l’utilisation d’un bras ou d’un partenaire de liaison spécifique (anticorps, protéines recombinantes de phage) ou non, par l’utilisation d’interaction biotine/streptavidine préalablement greffée à la surface de la zone d’analyse et à l’antibiotique, ou par tout type de liaison adaptée à la nature de l’agent antimicrobien et à la surface de la zone d’analyse. Le mode de liaison ou de dépôt sera néanmoins choisi de manière à ne pas gêner l’éventuelle interaction de l’agent antimicrobien avec un micro-organisme, ce qui pourrait avoir pour conséquence de masquer un phénomène de résistance. En particulier, on préférera réaliser l'immobilisation de l'agent antimicrobien par utilisation d'un agent adhésif, plutôt que par liaison covalente ou d'affinité pour éviter des changements de conformation de l'agent antimicrobien et assurer une bonne accessibilité de ce dernier au site actif de l'enzyme qui serait générée par le micro-organisme.
Dans le cas de l'utilisation d'un agent adhésif, c'est-à-dire d'un agent qui va adhérer à la plaque et donc améliorer l'immobilisation de l'agent antimicrobien sur cette dernière, on déposera alors un mélange de l'agent adhésif et de l'agent antimicrobien en solution aqueuse. L'agent adhésif sera, notamment, un polymère soluble dans l'eau. A titre d'exemple d'agent adhésif pouvant être utilisé pour l'immobilisation de l'agent antimicrobien sur la ou les zones d'analyse, on peut citer l'heptakis(2,6-di-O-méthyl)-β- cyclodextrine. L'agent adhésif sera choisi en fonction de l'agent antimicrobien à immobiliser sur la zone d'analyse. En particulier, il sera sélectionné en fonction de sa masse, de manière à ce que sa présence ne fausse pas la détection ultérieure par MALDI visant à déterminer la présence ou l'absence du micro-organisme. L'homme du métier ajustera la quantité d'agent adhésif utilisé qui ne devra pas être trop importante pour assurer l'accessibilité de l'agent antimicrobien par la population de micro-organisme(s) lorsque celle-ci aura été déposée. Par exemple, dans le cas de l'heptakis(2,6-di-O-méthyl)-β-cyclodextrine, on pourra choisir un rapport massique heptakis(2,6-di-O-méthyl)-β-cyclodextrine/agent antimicrobien de 1/20 à 1/2, de préférence de 1/10 à 1/5.
La quantité d’agent antimicrobien déposée sur une zone d’analyse sera adaptée par l’homme du métier, en fonction de l’agent antimicrobien en question. En effet, l’agent antimicrobien est usuellement testé à une concentration, ou avec une gamme de concentrations, adaptée à son usage thérapeutique. Cette concentration, ou cette gamme de concentration, est propre à chaque agent antimicrobien et est généralement choisie selon les recommandations de l’European Commitee on Antimicrobial Suceptibility Testing (EUCAST, cf. https://www.eucast.org/clinical_breakpoints/) ou du Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI, cf. https://clsi.org/meetings/microbiology/clsi-and-ast/).
II est également possible de déposer en plus de l'agent antimicrobien, un autre composé. Dans le cas des bêta-lactamines, il est également possible de déposer un inhibiteur des bêta-lactamases, afin de caractériser un phénomène BLSE (bêta-lactamase à spectre étendu), comme mis en œuvre notamment dans la demande WO 2012/023845. En particulier, on pourra déposer une combinaison d'une bêta-lactamine avec un inhibiteur de bêta-lactamase tel que l'acide clavulanique, le sulbactam ou le tazobactam. Lorsque la plaque MALDI comporte plusieurs zones d'analyse, de manière avantageuse, au moins deux zones, voire plus, seront porteuses d'un agent antimicrobien différent. Il est ainsi possible de caractériser plusieurs populations de micro-organisme(s) avec une même plaque lors d’une seule analyse. Chacune des zones pourra être porteuse d'un agent antimicrobien différent. Le plus souvent, cependant, les caractérisations sont effectuées en duplicata, de sorte qu'un même agent antimicrobien sera présent sur au moins deux zones d'analyse, voire plus.
De telles plaques MALDI, selon l’invention, fonctionnalisées pourront être directement fournies à l'utilisateur, qui n'aura donc plus qu'à y déposer la population de micro-organisme(s) à étudier, puis après une étape d'incubation, la matrice MALDI. Elles pourront être commercialisées, dans un emballage individuel ou comprenant plusieurs plaques.
Un autre objet de la présente invention est un système comprenant :
- une plaque d’analyse selon l’invention, et
- un support réalisé en un matériau poreux ;
Selon l’invention, la matériau poreux du support peut avoir un porosité équivalente ou différente de celle du matériau poreux de la zone d’analyse.
Dans le cadre de la présente invention, le support réalisé en un matériau poreux est capable d'absorber par capillarité une certaine quantité de liquide.
A titre d’exemple de support réalisé en un matériau poreux, nous pouvons citer une éponge naturelle ou synthétique, un papier buvard, de la mousse synthétique, de la fibre de verre, du coton, du sable, de la sciure. Ainsi parmi les matériaux synthétiques nous pouvons citer, à titre d’exemple, les polyéthylènes, les polyesters, tel que le polytéréphtalate d’éthylène (PET), ou encore les polyamides. Il peut s’agir également de copolymères, tels que des polymères de polyéthylène/polyester, tel qu’un copolymère de polyéthylène/ PET. Lorsqu’il s’agit d’un matériau fibreux, les fibres peuvent être constituées d’un matériau mono-composant ou bi-composant. Une fibre bi-composant peut être par exemple constituée d’un cœur en PET et d’une gaine en polyéthylène.
Des matériaux poreux naturels peuvent également être utilisés. C’est le cas notamment des fibres de coton, des fibres de papier.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le papier buvard est utilisé comme support réalisé en un matériau poreux capable d'absorber par capillarité une certaine quantité de liquide. Un papier buvard, selon la présente invention, s’entend par un matériau fibreux constitué en partie ou en totalité de fibres. Ces fibres peuvent être assemblées de manière ordonnée ou aléatoire (c’est-à-dire un tissé ou un non-tissé). Ce matériau qui a la capacité d’absorber les liquides aqueux peut être composé d’un seul type de fibre, d’un mélange de fibres appartenant ou non à la même classe. Les fibres peuvent être classées selon leur composition chimique (minérale ou organique) et leur origine (naturelle ou artificielle). A titre d’exemple on peut citer la fibre de verre comme fibre minérale artificielle ou encore la fibre cellulosique (issue de coton ou encore de bois) comme fibres organiques naturelles d’origine végétale.
De préférence le support réalisé en un matériau poreux du système selon l’invention est susceptible d’être humidifié. L’humidification du matériau poreux peut se faire à l’aide d’un milieu de culture, tel que le milieu de culture Muller-Hinton ou de tout autre milieu de culture bien connu de l’homme du métier. Il peut également se faire à l’aide d’eau ultra-pure ou d’eau physiologique, c’est-à-dire d’eau contenant des sels pour assurer une pression osmotique et un pH adaptés à la physiologie du micro-organisme à caractériser. Cette humidification par un milieu de culture permettra de favoriser la croissance microbienne lors de l’incubation de la plaque d’analyse selon l’invention.
Le procédé de caractérisation d’une population d’au moins un micro-organisme est un autre objet de la présente invention.
Ce procédé de caractérisation d’une population d’au moins un micro-organisme, la caractérisation comprenant au moins la détermination de la résistance éventuelle d’une population d’un micro-organisme à au moins un agent antimicrobien, est caractérisé en ce qu’il comprend les étapes successives suivantes :
- une étape consistant à fournir une plaque d’analyse ou un système selon l’invention, pour une caractérisation de ladite population d’au moins un micro-organisme,
- une étape de dépose de la population dudit au moins un micro-organisme sous forme liquide sur ladite au moins une zone d’analyse au contact de l’agent antimicrobien préalablement déposé sur ladite zone d’analyse,
- une étape d’incubation, consistant à conserver ladite plaque d’analyse, dans des conditions et pendant une période suffisante, pour permettre l’interaction dudit au moins un agent antimicrobien et dudit au moins un micro-organisme présent,
- une étape d’élimination du liquide contenant la population dudit au moins un micro-organisme par aspiration à travers les pores de la zone d’analyse,
- une étape de dépose sur ladite au moins une zone d’analyse, d’une matrice adaptée à la technique d’ionisation MALDI,
- une étape d’analyse par spectrométrie de masse utilisant une technique d’ionisation MALDI, d’une population dudit au moins un micro-organisme déposée sur ladite zone d’analyse permettant de conclure si une population d’un micro-organisme résistant à l’agent antimicrobien est présente sur la zone d’analyse.
Dans le cadre de ce procédé, la population de micro-organisme(s) est déposée sur une zone d'analyse d'une plaque MALDI selon la présente invention, pour ensuite procéder à sa caractérisation.
La population de micro-organisme(s) pourra provenir de différentes sources. A titre d'exemple de source de micro-organisme(s), on peut citer les échantillons d'origine biologique, notamment animale ou humaine. Un tel échantillon peut correspondre à un prélèvement de fluide biologique, du type sang total, sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien, sécrétion organique, à un prélèvement tissulaire ou à des cellules isolées. Ce prélèvement pourra être déposé tel quel, ou sera, de préférence, soumis préalablement au dépôt sur la zone d'analyse concernée, à une préparation de type enrichissement ou culture, à une concentration et/ou à une étape d'extraction ou de purification selon des méthodes connues de l'homme du métier. Néanmoins, une telle préparation ne peut pas correspondre à une étape de lyse qui entraine la désintégration des micro-organismes et une perte de leur contenu avant le dépôt sur la zone d'analyse. La population de micro-organisme(s) pourra être déposée sous la forme d'un inoculum. Dans le cadre de l'invention, la population de micro-organisme(s) déposée sur la zone d'analyse sera, de préférence, une population de micro-organisme(s) vivant(s), bien qu'il ne soit pas exclu de réaliser une extraction de la population de micro-organisme(s) à partir d'un échantillon biologique, en utilisant un détergent ce qui pourra affecter la viabilité. Dans un tel cas, il pourra être judicieux d’allonger l’étape d’incubation.
La source de la population de micro-organisme(s) peut également être un produit de l'agro-alimentaire tel que la viande, le lait, le yaourt et tout autre produit consommable susceptible d'être contaminé, ou encore un produit cosmétique ou pharmaceutique. Là encore, un tel produit pourra être soumis à une préparation de type enrichissement ou culture, à une concentration et/ou à une étape d'extraction ou de purification, afin d'obtenir la population de micro-organisme(s) à déposer.
Le plus souvent, la source de micro-organisme(s) pourra au préalable avoir été mise en culture dans un bouillon ou sur une gélose de manière à l'enrichir en micro-organismes. De tels milieux, gélosés ou en bouillon, sont bien connus de l'homme de l'art. L'enrichissement sur gélose est particulièrement favorable puisqu'il permet d'obtenir des colonies de micro-organismes qui pourront directement être déposées sur la zone d'analyse. Dans le cadre de l'invention, on pourra déposer sur la zone d'analyse, de préférence, un milieu cellulaire comprenant une population bactérienne. De préférence, la population de micro-organismes déposée contient au moins 105UFC de micro-organismes. A titre d'exemple, on pourra déposer de 105à 109UFC d'un micro-organisme. Il est, par exemple, possible de procéder directement au dépôt d'une biomasse, d'une goutte d'une suspension de micro-organismes, dans de l'eau ultra-pure, ou un tampon, ou un milieu de culture. On pourra déposer une colonie ou une fraction de colonie d'un micro-organisme.
La population déposée, comprendra, de préférence, une seule espèce de micro-organisme. Il n'est cependant pas exclu de déposer sur la zone d'analyse une population comprenant différents micro-organismes. Dans ce cas, il sera préférable que les micro-organismes soient connus pour être susceptibles de développer des mécanismes de résistance différents, de manière à savoir lequel présenterait la résistance qui serait identifiée.
Dans le cadre de l'invention, il n'est pas utile de procéder à une préparation particulière d'un échantillon qui serait déposé. En particulier, la population de micro-organisme(s) est déposée, sans avoir été préalablement mise en contact avec un agent antimicrobien. En effet, dans le cadre de l’invention, il n'est pas nécessaire de procéder à une préparation longue et fastidieuse d'un échantillon à déposer, la population de micro-organisme(s) déposée pouvant être préparée sans étape de centrifugation.
Le dépôt est réalisé de manière à ce que la population de micro-organisme(s) soit déposée de manière homogène sur la zone d'analyse. Pour cela, on pourra utiliser les procédures décrites pour la réalisation de l’identification standard de micro-organismes, dans les manuels d'utilisation des appareillages MALDI-TOF commerciaux, tels que l'appareillage VTTEK®MS commercialisé par la société bioMérieux.
II est néanmoins possible d'ajouter, en plus de la population de micro- organisme(s), un composé connu pour accélérer la croissance des micro-organismes. Ce composé peut par exemple être un milieu nutritif contenant des peptones. Ce composé peut être déposé au préalable sur la zone d'analyse en combinaison avec l'agent antimicrobien ou à tout autre moment dans la préparation de la zone d’analyse.
La vérification qu’une population d'au moins un micro-organisme soit bien déposée peut se faire au préalable par un test adapté, notamment sur gélose. De manière préférée, on déposera sur la zone d'analyse une seule population d'un seul micro-organisme.
Après dépôt de la population de micro-organisme(s), la zone d'analyse porteuse à la fois de l'agent antimicrobien et de la population d'un micro-organisme à caractériser, est soumise à une étape d'incubation pour permettre l'interaction entre le micro-organisme et l'agent antimicrobien et donc dans le cas de la présence d'une population de micro-organismes, résistants à l'agent antimicrobien, permettre au phénomène à l'origine de la résistance de se produire. En particulier, le phénomène de résistance permettra la croissance du micro-organisme, c’est-à-dire sa division et sa multiplication. Il en résultera un accroissement de la biomasse du micro-organisme, ce qui après une période d’incubation approprié permettra sa détection par analyse en MS avec une source d’ionisation MALDI.
Dans le cadre de l'invention, le phénomène responsable de la résistance à un agent antimicrobien a donc lieu directement sur la plaque MALDI. Le phénomène responsable de la résistance à un agent antimicrobien se produit dans un volume minimal correspondant à la zone de caractérisation.
Alternativement, préalablement et pendant l’incubation, la plaque d’analyse selon l’invention peut être déposée sur un support réalisé en un matériau poreux humide. L’humidification de ce support peut être effectuée à l’aide d’un milieu de culture permettant la croissance des micro-organismes.
Les conditions et la période d'incubation seront adaptés par l'homme du métier en fonction du phénomène de résistance à caractériser. La plaque d'analyse peut être laissée à une température appartenant, par exemple, à la gamme allant de 17 à 40°C, et notamment à température ambiante (22°C). Il est également possible de la mettre à incuber, par exemple à 37°C, pour favoriser la croissance et les phénomènes à l'origine de la résistance.
Dans les conditions sélectionnées, la période d'incubation devra être suffisant pour permettre la détection ultérieure par MS MALDI du phénomène de résistance à détecter. L'incubation est, le plus souvent, réalisée pendant au moins 2 heures, plus préférentiellement pendant au moins 4 heures, et encore plus préférentiellement pendant une durée de 4 à 12 heures.
Il a été constaté, dans le cadre de l'invention, que la réalisation d'une telle étape d'incubation ne gênait en rien une identification du micro-organisme. Une telle caractérisation est même particulièrement avantageuse lorsqu’elle est associée à la détection du phénomène de résistance. En effet, dans le cadre d’une population composée de plusieurs espèces de micro-organismes, il est possible qu’une partie de la population, par exemple l’espèce A, soit résistante à l’antibiotique X, alors qu’une autre partie de la population, par exemple l’espèce B, soit résistante à l’antibiotique Y. La réalisation du procédé selon l’invention permettra d’identifier la dite espèce A sur les zones d’échantillon contenant l’antibiotique X et la dite espèce B sur celles contenant l’antibiotique Y. Il sera ainsi possible de conclure que l’échantillon contient une population hétérogène de micro-organismes formée de sous-population appartenant à plusieurs espèces dont au moins une espèce est résistante à l’antibiotique X et au moins une autre espèce est résistante à l’antibiotique Y. Selon le contexte clinique, le microbiologiste pourra alors décider s’il s’agit d’un échantillon d’origine polymicrobienne ou d’un échantillon contaminé, par exemple lors de son prélèvement. Dans ce dernier cas les résultats ne sont pas fiables et le prélèvement doit être répété.
Dans un mode de réalisation de ce procédé de caractérisation selon l’invention l’étape d’incubation est réalisée dans une chambre d’incubation.
Par « chambre d’incubation », on entend une enceinte close dans laquelle l’incubation peut avoir lieu sans que les dépôts d’échantillon ne sèchent de façon néfaste à l’analyse. L’enceinte est destinée à maintenir un taux d’humidité suffisant pour que les au moins une population bactérienne de l’échantillon puisse se développer, c’est-à-dire se diviser et croitre, sans se déshydrater. Cette enceinte peut être thermostatée. Elle peut également être disposée à l’intérieure une autre enceinte, elle-même thermostatée. Dans le cadre de la présente invention, suite à l’étape d'incubation une étape d’élimination du liquide contenant la population dudit au moins un micro-organisme est réalisée par aspiration à travers les pores de la zone d’analyse.
Cette étape d’élimination du liquide peut se faire à l’aide de tout type de dispositif d’aspiration connu de l’homme du métier.
Avantageusement l’aspiration peut se faire à l’aide d’un matériaux macroporeux, tel qu’un papier buvard, placé sous la plaque d’analyse. Dans le cadre de l’invention le papier buvard a une capacité d’absorption d’un échantillon d’au moins 25 µl.cm-2 et de préférence d’au moins 60 µl.cm-2.
Alternativement, l’étape d’élimination du liquide peut se faire à l’aide de tout type de système d’aspiration, tel qu’un dispositif d’aspiration sous vide ou encore un système comprenant des ventouses. A titre d’exemple de dispositif d’aspiration sous vide, nous pouvons citer le Manifold à vide HyperSepTM pour plaque 96 puits, commercialisé par Thermo ScientificTM(référence 60103-351).
Après aspiration du liquide, la cible peut optionnellement être séchée. Ensuite une étape de dépose sur ladite au moins une zone d’analyse, d’une matrice adaptée à la technique d’ionisation MALDI est nécessaire pour l’analyse.
Généralement, les matrices utilisées dans la technique MALDI sont photosensibles et cristallisent en présence de la population de micro- organisme(s), tout en préservant l'intégrité des molécules et micro- organismes présents. De telles matrices, notamment adaptées à la technique SM MALDI, sont bien connues et, par exemple, constituées à partir d'un composé choisi parmi : l'acide 3,5-diméthoxy-4-hydroxycinnamique; l'acide a-cyano-4-hydroxycinnamique, l'acide férulique et l'acide 2,5- dihydroxybenzoîque. De nombreux autres composés sont connus de l'homme du métier. Il existe également des matrices liquides qui ne cristallisent ni à pression atmosphérique, ni même sous vide. Tout autre composé qui permettra d'ioniser les molécules présentes dans la zone d’analyse sous l'effet d'un rayon laser pourra être utilisé.
Pour la constitution de la matrice, un tel composé est mis en solution, le plus souvent dans l'eau, de préférence de qualité « ultra-pure », ou dans un mélange eau/solvant(s) organique(s). A titre d'exemple de solvants organiques classiquement utilisés, on peut citer, l'acétone, l'acétonitrile, le méthanol ou l'éthanol. L'acide formique, l’acide acétique, l’acide trifluoroacétique (TFA) peut parfois être ajouté. Un exemple de matrice est, par exemple, constituée de 20 mg/mL d'acide sinapique dans un mélange acétonitrile/eau/TFA de 50/50/0,1 (v/v). Le solvant organique permet aux molécules hydrophobes présentes de se dissoudre dans la solution, alors que l'eau permet la dissolution des molécules hydrophiles. La présence d'acide, tel que le TFA, favorise l'ionisation des molécules par captation d'un proton (H+).
La solution constitutive de la matrice est directement déposée sur la zone d'analyse et recouvre alors la population de micro-organisme(s) et l'agent antimicrobien présents sur cette dernière.
De façon optionnelle, le procédé selon l'invention contient, en outre, avant l'étape d'ionisation de la zone de caractérisation, une étape de cristallisation de la matrice présente. Le plus souvent, la cristallisation de la matrice est obtenue en laissant sécher la matrice à l'air ambiant le solvant présent dans la matrice est ainsi évaporé, par exemple, en laissant la plaque d'analyse à une température appartenant, par exemple, à la gamme allant de 17 à 30°C, et notamment à température ambiante (22°C) pendant quelques minutes, par exemple de 5 minutes à 2 heures. Cette évaporation du solvant permet la cristallisation de la matrice dans laquelle la population de micro- organisme(s) et l'agent antimicrobien sont répartis. La plaque d’analyse ainsi préparée est ainsi suffisamment sèche pour ne pas provoquer d’éclaboussure ou de projection de gouttelettes lors de sa mise sous vide au sein de la source d’ionisation MALDI.
La population de micro-organisme(s) et l'agent antimicrobien, placés au sein de la matrice MALDI, formant la zone de caractérisation, sont soumis à une ionisation douce. Le rayon laser utilisé pour l'ionisation pourra avoir tout type de longueur d'onde favorable à la sublimation ou à la vaporisation de la matrice. De préférence, une longueur d'onde ultraviolette ou même infrarouge sera utilisée. Cette ionisation pourra, par exemple, être réalisée avec un laser à azote émettant un rayon UV à 337.1 nm.
Lors de l'ionisation, la population de micro-organtsme(s) et l'agent antimicrobien sont soumis à une excitation par laser. La matrice absorbe alors l'énergie photonique et la restitution de cette énergie entraîne la sublimation de la matrice, la désorption des molécules présentes dans la population de micro-organisme(s) et de l'agent antimicrobien et l'apparition de matière dans un état qualifié de plasma. Au sein de ce plasma, il se produit des échanges de charges entre molécules de matrice, des micro- organismes et d'agent antimicrobien. Par exemple, des protons peuvent être arrachés à la matrice et transférés aux protéines, peptides et composés organiques présents au niveau de la zone de caractérisation. Cette étape permet une ionisation douce des molécules présentes sans induire leur destruction. La population de micro-organisme(s) et l'agent antimicrobien libèrent ainsi des ions de différentes tailles. Ces derniers sont alors analysés dans un analyseur de masse. Cet analyseur peut être, par exemple, un analyseur de type « temps de vol » (ou TOF pour « Time Of flight» en anglais). Dans un TOF, les ions sont accélérés par un champ électrique et volent librement dans un tube sous pression réduite, nommé tube de vol. La pression appliquée lors de l'ionisation et lors de l'accélération des ions générés appartient le plus souvent à la gamme allant de 10-6 à 10-9 millibars [mbar]. Les ions les plus petits vont alors « voyager » plus rapidement que les ions plus gros permettant ainsi leur séparation. A l'extrémité terminale du tube de vol est situé un détecteur. Le temps de parcours (ou temps de vol) des ions est utilisé pour calculer leur masse. Ainsi, un spectre de masse est obtenu, représentant l'intensité du signal correspondant au nombre de molécules ionisées d'une même masse sur charge [m/z], en fonction du rapport m/z des molécules qui frappent le détecteur. Le rapport masse sur charge [m/z] est exprimé en Thomson [Th]. Une fois la cible introduite dans le spectromètre de masse, le spectre d'une zone de caractérisation est obtenu très rapidement, le plus souvent en moins d'une minute.
Un procédé de spectrométrie de masse MALDI-TOF utilisable selon l'invention peut notamment comprendre les étapes successives suivantes pour l'obtention du spectre de masse :
- disposer d'une zone de caractérisation comprenant la population de micro-organisme(s) à étudier et au moins un agent antimicrobien dans une matrice adaptée à la spectrométrie MALDI,
- éventuellement obtenir la cristallisation de la matrice dans laquelle la population de micro-organisme(s) et l'agent antimicrobien sont disposés,
- ioniser le mélange population de micro-organisme(s)/agent antimicrobien/matrice, grâce à un rayon laser,
- accélérer les molécules ionisées obtenues grâce à une différence de potentiel,
- laisser se déplacer librement les molécules ionisées et accélérées dans un tube sous pression réduite,
- détecter au moins une partie des molécules ionisées en sortie du tube, de manière à mesurer le temps qu'elles ont mis pour parcourir le tube sous pression réduite et à obtenir un signal correspondant au nombre de molécules ionisées atteignant le détecteur à un instant donné,
- calculer le rapport masse sur charge [m/z] des molécules détectées, de manière à obtenir un signal correspondant au nombre de molécules ionisées d'une même masse sur charge [m/z], en fonction du rapport m/z des molécules détectées.
En général, le calcul du rapport m/z est obtenu, en tenant compte d'une calibration préalable du spectromètre de masse utilisé, sous la forme d'une équation liant le rapport masse sur charge [m/z] et le temps de parcours dans le tube sous pression réduite des molécules ionisées.
La calibration consiste à utiliser un ensemble de molécules ou un micro-organisme qui va fournir des molécules ionisées couvrant la gamme de masse correspondant à la caractérisation envisagée. Les rapports m/z de ces molécules ionisées vont servir de standards, afin de permettre à l'appareillage de mesurer les masses de manière adéquate.
Pour l’identification du micro-organisme, la calibration pourra être réalisée à partir d'une souche de bactéries possédant des molécules ionisées ayant des rapports m/z couvrant la gamme de masses utilisées pour l'identification (typiquement dans la gamme allant de 2000 à 20000 Da dans le cas des levures, moisissures, bactéries ou parasites).
Tout type de spectromètre de masse MALDI-TOF peut être utilisé pour l'élaboration du spectre de masse. De tels spectromètres comprennent :
- une source d'ionisation (en générai, un laser UV) destinée à ioniser le mélange population de micro-organisme(s)/agent antimicrobien/matrice ;
- un accélérateur des molécules ionisées par application d'une différence de potentiel ;
- un tube sous pression réduite dans lequel se déplacent les molécules ionisées et accélérées ;
- un analyseur de masse destiné à séparer les ions moléculaires formés, en fonction de leur ratio masse sur charge (m /z) ;
- un détecteur destiné à mesurer le signai produit directement par les ions moléculaires.
Dans le cadre de l'invention, l'analyse par MALDI-TOF est, de préférence, une analyse par MALDI-TOF linéaire, bien qu'une analyse par MALDI-TOF-TOF, MALDI-TOF avec réflectron, ou tout type d’analyseur de masse lié à une source MALDI ne soit pas exclue. A titre d’exemple, l’invention est compatible avec l’usage d’instruments à source MALDI liés à une trappe ionique (MALDI-IT) ou à des analyseurs multiples de type quadripoles (Q), trappes ioniques (IT), orbitrapes (O), tube de mobilité ionique (IM)… De tels instruments peuvent ainsi présenter des configurations hybrides de type MALDI-Q-IT-TOF, MALDI-QQQ, MALDI-Q-TOF, MALDI-IT-Q-TOF, MALDI-Q-IT-O… Une analyse par MALDI TOF-TOF, bien que plus complexe, pourra par exemple être envisagée dans certains cas, notamment pour fragmenter les ions produits et apporter une information sur la nature des dites molécules ionisées. Elle mettra en œuvre un appareillage adapté à une telle analyse.
L’étape d’analyse par spectrométrie de masse permet de conclure si la population d’un micro-organisme résistant à l’agent antimicrobien est présente sur la zone d’analyse.
Par « résistance », on entend un phénomène selon lequel un micro-organisme ne présente pas une diminution de sa viabilité, ou une stagnation ou une diminution de sa croissance ou de sa reproduction, quand il est exposé à une concentration d'un agent antimicrobien qui est reconnue comme étant cliniquement efficace vis-à-vis dudit micro-organisme en l'absence de résistance.
L'identification de la résistance, à partir du spectre de masse obtenu pour une zone de caractérisation considérée, peut se faire par la détection, sur le spectre de masse obtenu, d'un pic de masse donné, ou d'un changement de pic de masse par rapport à un spectre de masse de référence, notamment, grâce au spectre de masse de l’échantillon incubé sur la zone de référence ne comportant pas d’antimicrobien.
Elle peut également se faire par détection de la croissance du micro-organisme en présence de l’agent antimicrobien. Cette croissance peut être caractérisée par une augmentation de la biomasse bactérienne au cours de la culture comme dans les demandes EP 2 801 825 A1 ou WO 2014/187517 A1. Plus particulièrement, l’augmentation de biomasse peut être déterminée par comparaison du signal des pics caractéristiques du micro-organisme à analyser par rapport à une substance de référence ajoutée sous forme dosée comme dans le procédé de Idelevichet al.cité précédemment. Préférentiellement, la quantité de micro-organismes déposée avant l’étape d’incubation peut être ajustée de façon à générer un signal insuffisant pour identifier avec confiance le micro-organisme. La durée de l’étape d’incubation peut ensuite être optimisée pour que la croissance des micro-organismes sensibles en absence d’antimicrobien ou de micro-organismes résistants en présence ou en absence d’antimicrobien génère un signal suffisant pour identifier avec confiance ledit micro-organisme. Un tel procédé a été utilisé par T. Horsemanet al.qui ont montré, à l’aide d’un instrument commercialisé par la demanderesse, la possibilité de caractériser comme non-sensibles à un antibiotique les micro-organismes identifiés avec une probabilité supérieure ou égale à 90% et comme sensibles les micro-organismes non-identifiés (Horsemanet al.Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2020, 97(4):115093,Rapid Qualitative Antibiotic Resistance Characterization using VITEK MS).
Ainsi avantageusement, pour obtenir une classification robuste selon le procédé de l’invention, plusieurs dépôts par conditions peuvent être réalisés. En particulier, lorsque 4 dépôts par condition sont utilisés, une probabilité d’identification supérieure ou égale à 90%, pour au moins 3 dépôts sur 4, permet de caractériser l’isolat comme résistant et comme sensible dans le cas contraire.
Dans un mode réalisation particulier de la présente invention, le procédé comprend une étape de détermination de la résistance dudit micro-organisme audit agent antimicrobien par observation de la présence de protéines du micro-organisme en quantité telle qu’il est possible de conclure à la croissance du micro-organisme malgré la présence dudit agent antimicrobien durant l’étape d’incubation.
Alternativement le procédé selon l'invention pourra notamment être mis en œuvre pour déterminer la concentration minimale inhibitrice pour la population d’au moins un micro-organisme à caractériser en utilisant une gamme croissante d’antimicrobien déposé sur différentes zones d’échantillon de la plaque d’analyse.
Dans le cadre de la présente invention, la concentration minimale inhibitrice, ou CMI, est la plus faible concentration d’agent antimicrobien capable d’inhiberin vitrotoute croissance visible de la population de micro-organisme étudiée à une température donnée et pendant une période de temps définie. Cette valeur caractérise l’effet bactériostatique d’un antibiotique sur une bactérie et plus généralement d’un antimicrobien sur un micro-organisme. La CMI est spécifique d’un couple agent antimicrobien/micro-organisme, chaque souche ayant sa propre valeur, en fonction des résistances naturelles et/ou acquises pour la molécule testée.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé de caractérisation permet l’indentification du genre, ou, de préférence, de l’espèce d’une population d’un micro-organisme déposée sur la zone d’analyse.
Les micro-organismes qui peuvent être identifiés par le procédé de l'invention sont tout type de micro-organismes, pathogènes ou non, rencontrés tant dans l'industrie que dans la clinique, qui peuvent connaître des phénomènes de résistance aux agents antimicrobiens. Ce peut être, de préférence, des bactéries, des moisissures, des levures ou des parasites. L'invention est particulièrement adaptée à l'étude des bactéries. A titre d'exemple de tels micro-organismes, on peut citer les bactéries Gram- positives, Gram-négatives et lesMycobacteria. A titre d'exemple de bactéries Gram-négatives, on peut citer celles des genres :Pseudomonas,Escherichia,Salmonella,Shigella,Enterobacter,Klebsiella,Serratia,Proteus,A ci netobacter,Citrobacter,Aeromonas,Stenotrophomonas,MorganellaetProvidencia, et notammentEscherichia coli,Enterobacter cloacae,Enterobacter aerogenes,Ci trobacter sp.,Klebsiella pneumoniae,Klebsiella oxytoca,Pseudomonas aeruginosa,Providencia ret t geri,Pseudomonas putida,Stenotrophomonas maltophilia,A ci netobacter bauma n nii,Comamonas sp.,Aeromonas sp.,Morganella morganii,Proteus mirabilis,Salmonella senftenberg,Serratia marcescens,Salmonella typhimuriumetc.. A titre d'exemple de bactéries Gram-positives, on peut citer celles des genres :Enterococ c us,Streptococcus,Staphylococcus,Ba ci ll us, Listeria etClostr i d i um.
Des spectres de référence obtenus par MALDI-TOF pour de tels micro- organismes correspondant à leurs protéines majoritaires, sont disponibles et enregistrés dans des bases de données disponibles avec les appareils MALDI-TOF commerciaux, et permettent, par comparaison, l'identification de la présence de tels micro-organismes.
L’identification d'une population d'un micro-organisme présent pourra donc comprendre les étapes suivantes :
a) disposer d'un spectre de masse de référence, pour au moins un micro-organisme et le plus souvent pour une série de micro- organismes,
b) soumettre la population de micro-organisme(s) et l'agent antimicrobien déposés sur la zone d'analyse et mis en présence de la matrice (correspondant à une zone de caractérisation selon l'invention), à une ionisation,
c) acquérir un spectre de masse obtenu suite à cette ionisation, dans la gamme de masse d'intérêt pour l'identification du micro- organisme,
d) comparer le spectre de masse obtenu à l'étape c) avec le spectre de référence et en déduire le genre, ou, de préférence, l'espèce d'au moins un micro-organisme.
Dans le cas de l'identification de micro-organismes, une calibration est réalisée dans une gamme de masse correspondant à des masses élevées, typiquement dans la gamme allant de 2000 à 20000 Da, et de préférence dans la gamme allant de 3000 à 17000 Da. Le spectre de masse obtenu à l'étape c) est également compris dans cette gamme de masse.
La calibration pourra être effectuée en plaçant une population d'un micro-organisme de référence dans une zone d'analyse de référence présente sur la plaque et en procédant à son analyse par MALDI-TOF. Un tel micro-organisme de référence pourra être, par exemple, une bactérieE. c ol i. Pour cette calibration, on pourra utiliser les procédures décrites pour la réalisation de l'identification standard de micro-organismes, dans les manuels d'utilisation des appareillages MALDI-TOF commerciaux, tels que l'appareillage VITEK®MS commercialisé par la société bioMérieux.
Dans un mode de réalisation du procédé selon l’invention, le procédé met en œuvre une seule analyse par spectrométrie de masse utilisant une technique d’ionisation MALDI par une seule ionisation d’une zone d’analyse, et utilisant pour l’analyse une seule calibration.
La description ci-après, en référence aux figures annexées permet de mieux comprendre l’invention sans caractère limitatif sur l’objet de l’invention.
La représente un modèle de plaque MALDI pouvant être adaptée à la présente invention comprenant 48 zones d’analyse 1 et trois zones d'analyse de référence 2.
La représente une coupe transversale d’une plaque MALDI au niveau d’une zone d’analyse réalisée en matériau poreux. Une population de micro-organismes est déposée sur la plaque MALDI au niveau de la zone d’analyse préalablement fonctionnalisée avec un agent antimicrobien.
Les figures 3 à 5 représentent un modèle de cassette intégrant une plaque MALDI. Cette cassette comprend un couvercle, un joint ajouré sur lequel la plaque MALDI vient se positionner et un récipient pouvant recevoir un support réalisé en un matériau poreux humide, telle une éponge imbibée. Comme indiqué précédemment l’humidification de ce support peut se faire à l’aide d’un milieu de culture permettant la croissance des micro-organismes. Alternativement, et après l’étape incubation le récipient peut contenir un matériau poreux sec, tel qu’un papier buvard absorbant.
Le protocole d'utilisation de cette cassette peut être décrit par les étapes suivantes :
- enlever le couvercle de la cassette,
- positionner un matériau poreux humide à l’intérieur du récipient
- placer le joint ajouré au-dessus du récipient,
- positionner une plaque MALDI (ou cible) sur le joint ajouré,
- déposer 2 μl d’un inocula comprenant au moins une population de micro-organisme sur chaque zone d’analyse porteuse de l’antibiotique,
- remettre le couvercle en le clipsant sur le joint ajouré
- incuber la casette à 37°C pendant 2h (ou plus),
- retirer l’ensemble formé par le couvercle, le joint ajouré et la plaque MALDI et le poser sur un deuxième récipient contenant un matériau poreux absorbant sec, tel qu’un papier buvard absorbant,
- laisser le papier buvard aspirer par capillarité l’ensemble des gouttes de liquides présentes sur la plaque MALDI,
- enlevé le couvercle,
- ajouter 1 μl d'une matrice d'HCCA sur les zones d'analyse porteuses, à la fois, de l'antibiotique et des bactéries,
- retirer la plaque MALDI et finaliser son séchage à l’air libre
- introduire la plaque MALDI dans une source d’ionisation MALDI pour une analyse par spectrométrie de masse.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif. Les analyses ont été effectuées avec l'appareillage VITEK®MS commercialisé par la société bioMérieux. Les analyses ont été réalisées, dans chacun des exemples ci-après, à la fin de l'acquisition. Les spectres ont été acquis sur toutes les zones de caractérisation et ensuite analysés :
- pour l'identification, l'analyse du spectre a été réalisée à l'aide du moteur de calcul VITEK MS et de la base de données V3.2.0.
Exemple 1: Isolement de micro-organismes bactériens et identification à l’aide de VITEK-MS
L'expérience a été réalisée en mettant en œuvre les étapes ci-dessous :
- 12 micro-organismes ont été isolés sur gélose Columbia au sang (référence 43041, bioMérieux) après culture d’une nuit à 37°C,
- Ces micro-organismes ont été déposés sur les zones d'analyse d’une plaque d’analyse VITEK®MS (référence 410893, bioMérieux)
- 1µl de matrice HCCA, acide alpha-cyano 4 hydroxycinnamique (VITEK®MS-CHCA, référence bioMérieux 411071) a été déposé sur les zones d’analyse comprenant déjà les micro-organismes.
- Les plaques sont laissés sécher selon les recommandations du fournisseur.
- Une analyse par spectromètre de masse MALDI-TOF a été réalisée avec un appareillage VITEK®MS (référence 4700563, bioMérieux).
Les résultats ont été relevés dans Myla (bioMérieux) et reportés dans le TABLEAU 1.
[TABLEAU 1] : Micro-organismes identifiés
| Isolat | Micro - organismes identifiés | Probabilité d’identification (%) |
| Isolat 1 | Echerichia coli | 99.9 |
| Isolat 2 | Echerichia coli | 99.9 |
| Isolat 3 | Echerichia coli | 99.9 |
| Isolat 4 | Echerichia coli | 99.9 |
| Isolat 5 | Echerichia coli | 99.9 |
| Isolat 6 | Klebsiella pneumoniae | 99.9 |
| Isolat 7 | Klebsiella pneumoniae | 99.9 |
| Isolat 8 | Klebsiella pneumoniae | 99.9 |
| Isolat 9 | Staphylococcus aureus | 99.9 |
| Isolat 10 | Staphylococcus aureus | 99.9 |
| Isolat 11 | Staphylococcus aureus | 99.9 |
| Isolat 12 | Staphylococcus epidermidis | 99.9 |
Exemple 2: Préparation de plaques d’analyse selon l’invention avec des antibiotiques à différentes concentrations
Différentes solutions d’antibiotique ont été déposées sur des plaques d’analyse ayant la même géométrie que les cibles VITEK®MS (référence 410893, bioMérieux), mais ayant des zones d’analyse réalisées en un matériau poreux. Plus précisément, 48 zones d’analyse, réalisées en matériau poreux, réparties en 3 groupes de 16 zones. Ces zones sont disposées en 4 colonnes de 12 lignes. Chaque colonne est identifiée par un chiffre de 1 à 4. Chaque ligne est identifiée par une lettre de A à L. Ainsi la zone d’analyse I3 se trouve à l’intersection de la 9ème ligne et de la 3ème colonne. La plaque d’analyse comporte également 3 positions de calibration, respectivement au centre des 3 groupes de 16 zones d’analyse. Contrairement aux zones destinées aux échantillons, ces zones de calibration ne sont pas réalisées en matériau poreux.
Les solutions suivantes d’antibiotique ont été préparées dans de l’eau :
- solution d’Oxacilline (référence Sigma 28221) à 0.125 µg/ml, 0.25 µg/ml, 0.5 µg/ml, 1 µg/ml, 2 µg/ml, 4 µg/ml, 8 µg/ml, 16 µg/ml, 32 µg/ml, 64 µg/ml, 128 µg/ml et 256 µg/ml ;
- solution d’Amoxicilline (référence Sigma A8523) à 2 µg/ml ;
- solution de Ceftriaxone (référence Sigma C5793) à 24 µg/ml ;
- solution de Méropénème (référence Sigma M2574) à 2 µg/ml.
2 µl de chaque solution d’antibiotique ont été déposés sous la forme d’une goutte, sur les zones d’analyse de plaques d’analyse. Les plaques ont été incubées à 37°C en atmosphère sèche, jusqu’à ce que les gouttes soient complètement sèches. Ces plaques d’analyse ainsi fonctionnalisées ont été conservée à 4°C dans un blister plastique à l’abris de l’humidité et de la lumière jusqu’à utilisation.
Certaines plaques ont été entièrement fonctionnalisées uniquement avec de l’Oxacilline à 2 µg/ml.
D’autres plaques ont été fonctionnalisées avec 4 dépôts d’Oxacilline à 0.125 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 0.25 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 0.5 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 1 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 2 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 4 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 8 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 16 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 32 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 64 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 128 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 256 µg/ml.
Enfin certains plaques ont été fonctionnalisées avec 16 dépôts d’Amoxicilline à 2 µg/ml, 16 dépôts de Ceftriaxone à 24 µg/ml, 16 dépôts de Méropénème à 2 µg/ml.
Cette fonctionnalisation préalable des plaques est ainsi particulièrement avantageux puisqu’elle permet de disposer d’une cible prête à l’emploi, préférablement fabriquée de façon industrielle.
Il est également possible de fabriquer à l’avance des plaques comportant 48 zones activées avec le même antibiotique afin de tester plusieurs micro-organismes simultanément. Il est même possible de fabriquer des plaques fonctionnalisées avec des combinaisons et des concentrations d’antibiotique adaptées à la nature des micro-organismes et/ou au contexte réglementaire et épidémique d’une région, voire d’un laboratoire donné, comme cela est classiquement pratiqué pour les cartes VITEK®2 de la demanderesse. Une plaque avec une combinaison de différents antibiotiques permet ainsi de caractériser simultanément les propriétés de résistance/sensibilité d’un micro-organisme à une pluralité d’antibiotique. De façon analogue, la présence de zones d’analyse avec différentes concentrations d’antibiotique permet de prédire la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’un micro-organisme.
Exemple 3: optimisation de la caractérisation de la résistance aux antibiotiques selon l’invention
Des plaques d’analyses, fonctionnalisées selon l’exemple 2, ont été placées dans une cassette, telle qu’illustrée aux figures 3 à 5, pour permettre leur manipulation. Cette cassette comprend un joint ajourée de façon à pouvoir disposer la plaque sur une éponge imbibée à saturation de milieu de culture Muller-Hinton. L’éponge imbibée d’un milieu de culture fait office de support, elle est en matériau poreux tel que décrit dans la description.
La concentration minimale inhibitrice (CMI en µg/ml) a été déterminée par microdilution en bouillon, technique très largement utilisée par l’homme du métier.
Les souches de référence figurant dans le Tableau 2 ont été analysées.
[TABLEAU 2]:Caractéristiques des souches de référence utilisées.
| Souche de référence N° | Espèces | Concentration minimale inhibitrice (CMI en µg/ml) | Phénotype (R=résistant, S=sensible) | Mécanisme de résistance identifié par PCR | |||
| Oxacilline (O) | Amoxicilline (A) | Ceftriaxone (C) | Méropénème (M) | ||||
| Réf 1 | K. pneumoniae | - | >128 | 64 | 64 | RA, RC, RM | KPC-2 |
| Réf 2 | K. pneumoniae | - | 64 | 32 | 0.25 | RA, RC, SM | OXA-48 |
| Réf 3 | E. coli | - | 32 | 16 | 0.5 | RA, RC, SM | TEM-2 |
| Réf 4 | E. coli | - | 1 | 0.25 | 0.06 | SA, SC, SM | - |
| Réf 5 | E. coli | - | >128 | 8 | 0.5 | RA, RC, SM | CTX-M |
| Réf 6 | S. aureus | 0.25 | - | - | - | SO | - |
| Réf 7 | S. aureus | 128 | - | - | - | RO | mecA |
Dans la colonne Phénotype, RA signifie résistance à l’Amoxiciline, RC signifie résistance à la Ceftriaxone, RM signifie résistance à la Méropénème, RO résistance à l’Oxacilline, SA signifie sensible à l’Amoxiciline, SC signifie sensible à la Ceftriaxone, SM signifie sensible à la Méropénème, SO sensible à l’Oxacilline.
Les souches de référence N°1 à 7 ont été diluées à 0.5 McFarland (McF) en milieu Muller-Hinton (référence bioMérieux AEB 110699), puis rediluées au 1/10°, 1/50° et 1/100°, toujours en milieu Muller-Hinton.
Pour chaque dilution de micro-organismes, des gouttes de 2µl ont été déposées sur 4 zones d’analyse d’une plaque selon l’invention. Les dilutions d’E. coliet deK. pneumoniaeont été analysées sur des plaques d’analyse avec 16 dépôts d’Amoxicilline, 16 dépôts de Ceftriaxone et 16 dépôts de Méropénème. Les dilutions deS. aureusont été analysées sur des plaques avec 2 µg/ml d’Oxacilline.
Des plaques d’analyse témoins, c’est-à-dire non fonctionnalisées (sans antibiotique), ont également été préparées. Les témoins négatifs ont été traités comme expliqué ci-dessous en supprimant l’étape d’incubation à l’étuve. Autrement dit, les gouttes ont été aspirées aussitôt après le dépôt. Les témoins positifs ont été traités en tout point comme expliqué ci-dessous.
Un couvercle a été placé sur la cassette contenant la plaque d’analyse de façon à se clipser sur la cassette et à fermer le dispositif sans toucher le haut des gouttes.
Les cassettes d’analyse ainsi préparées ont été mises à incuber à l’étuve à 37°C pendant 2, 3, 4 ou 5 heures.
A l’issue de l’étape d’incubation, les plaques d’analyse sont placées sur un papier buvard très absorbant sec, ayant une capacité d’absorption de 25 µL.cm-2. De telle sorte que les gouttes présentes sur la plaque d’analyse soient aspirées par capillarité à travers les zones d’analyse réalisées en matériau poreux.
Le couvercle est ensuite déclipsé.
Un calibrant (souche d’E. coliATCC 8739 cultivée sur gélose Columbia au sang, référence 43041, bioMérieux) a été déposé sur les zones de calibration.
1µl de matrice HCCA, acide alpha-cyano 4 hydroxycinnamique (VITEK®MS-CHCA, référence bioMérieux 411071) a été déposé sur les zones d’analyse, comprenant les micro-organismes et l’agent antimicrobien, et sur les zones de calibration comprenant le calibrant.
La plaque d’analyse est ensuite séchée et analysée avec le VITEK®MS comme décrit dans l’exemple 1.
La dilution des micro-organismes a été choisie pour conduire à une probabilité d’identification inférieure ou égale à 60% sur les plaques témoins négatifs, voir même, le plus souvent, à une absence d’identification (quelle qu’en soit la raison indiquée par VITEK®MS). Aucune identification à une autre espèce que celles étudiées n’a été observée, sinon elle aurait été considérée comme un résultat invalide. Des dilutions au 1/100° et au 1/10° ont été retenues respectivement pour les souches à Gram négatif et pour les souches à Gram positif.
La période d’incubation a été choisie pour conduire à une probabilité d’identification supérieure à 80% sur les cibles témoins positif. En général, une telle probabilité a été observée après 2 heures d’incubation pour les souches à Gram négatif et après 4 h pour les souches à Gram positif. Cependant des résultats conformes ont été obtenus pour toutes les souches après 4h d’incubation et il a semblé plus simple d’utiliser la même période d’incubation pour tous les micro-organismes.
Dans ces conditions, à savoir 4h d’incubation pour respectivement une dilution au 1/100° et au 1/10° des souches à Gram négatif et positif, des identifications avec une probabilité supérieure ou égale à 90% ont été observées pour au moins 3 dépôts sur 4 lorsque le micro-organisme de référence était résistant à l’antibiotique. A l’inverse, des absences d’identification ou des identifications avec une probabilité inférieure à 90% ont été observées pour au moins 3 dépôts sur 4 lorsque le micro-organisme de référence était sensible à l’antibiotique testé. Ces résultats indiquent que de façon avantageuse, une probabilité d’identification supérieure ou égale à 90% pour au moins 3 dépôts sur 4 peut être utilisé comme seuil pour différencier les souches résistantes des souches sensibles.
Il est cependant possible que certaines espèces aient un comportement différent et nécessitent une optimisation des conditions d’analyses (dilutions, période d’incubation) ou d’interprétation (probabilité d’identification) différentes de celles observées pour les espèces étudiées ici.
Exemple 4: Caractérisation de la résistance aux antibiotiques selon l’invention
Les isolats identifiés dans l’exemple 1 ont été dilués à 0.5 McFarland (McF) en milieu Muller-Hinton (référence bioMérieux AEB 110699), puis redilués au 1/100° pour les bactéries à Gram négatif et au 1/10° pour les bactéries à Gram positifs, toujours en milieu Muller-Hinton.
Des gouttes de 2µl des dilutions finales ont été déposées sur les zones d’analyse des plaques selon l’invention tel que décrit dans l’exemple 2. Comme précédemment, les dilutions d’E. coliet deK. pneumoniaeont été analysés sur les cibles avec 16 dépôts d’Amoxicilline, 16 dépôts de Ceftriaxone et 16 dépôts de Méropénème. Les dilutions de Staphylocoques ont été analysés sur les cibles avec 2 µg/ml d’Oxacilline.
Lorsque aucun dépôt d’échantillon n’a été prévu sur une zone d’analyse, cette zone est recouverte par un film plastique Parafilm M (Bemis North America) avant de placer la plaque dans la cassette. De cette façon, la zone d’analyse n’a pas été mise en contact avec le milieu de culture contenu dans l’éponge imbibée à saturation. Les positions non utilisées dans la première analyse sont ainsi restées utilisables pour une analyse ultérieure.
L’analyse a été conduite selon le même mode opératoire que dans l’exemple 3 avec une incubation de 4h pour tous les micro-organismes. De même, les résultats ont été interprétés comme dans l’exemple 3, c’est-à-dire avec un seuil de probabilité d’identification supérieure ou égale à 90% pour au moins 3 dépôts sur 4.
Les résultats sont reportés dans les TABLEAUX 3 à 6 ci-dessus. Ces résultats montrent, qu’une identification correcte des bactéries par MALDI-TOF a pu être obtenue à partir de la première série d’acquisitions pour toutes les zones d’analyse, avec un niveau de confiance de 99,9%, montrant que les conditions expérimentales permettent encore de discriminer les différentes espèces.
[TABLEAU 3] : Analyse des isolats 1 à 4 avec une cible Amoxicilline, Ceftriaxone et Méropénème
| Position | Antibiotique | Concentration (µg/ml) | Echantillon | Dilution | Micro-organismes identifiés | Probabilité d’identification (%) |
| A1 | Amoxicilline | 2 | Isolat 1 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| A2 | Amoxicilline | 2 | Isolat 1 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| A3 | Amoxicilline | 2 | Isolat 1 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| A4 | Amoxicilline | 2 | Isolat 1 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| B1 | Amoxicilline | 2 | Isolat 2 | 1/100° | - | - |
| B2 | Amoxicilline | 2 | Isolat 2 | 1/100° | E. coli | 60 |
| B3 | Amoxicilline | 2 | Isolat 2 | 1/100° | - | - |
| B4 | Amoxicilline | 2 | Isolat 2 | 1/100° | - | - |
| C1 | Amoxicilline | 2 | Isolat 3 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| C2 | Amoxicilline | 2 | Isolat 3 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| C3 | Amoxicilline | 2 | Isolat 3 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| C4 | Amoxicilline | 2 | Isolat 3 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| D1 | Amoxicilline | 2 | Isolat 4 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| D2 | Amoxicilline | 2 | Isolat 4 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| D3 | Amoxicilline | 2 | Isolat 4 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| D4 | Amoxicilline | 2 | Isolat 4 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| E1 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 1 | 1/100° | - | - |
| E2 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 1 | 1/100° | - | - |
| E3 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 1 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| E4 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 1 | 1/100° | - | - |
| F1 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 2 | 1/100° | - | - |
| F2 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 2 | 1/100° | - | - |
| F3 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 2 | 1/100° | - | - |
| F4 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 2 | 1/100° | - | - |
| G1 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 3 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| G2 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 3 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| G3 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 3 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| G4 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 3 | 1/100° | - | - |
| H1 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 4 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| H2 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 4 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| H3 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 4 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| H4 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 4 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| I1 | Méropénème | 2 | Isolat 1 | 1/100° | - | - |
| I2 | Méropénème | 2 | Isolat 1 | 1/100° | - | - |
| I3 | Méropénème | 2 | Isolat 1 | 1/100° | - | - |
| I4 | Méropénème | 2 | Isolat 1 | 1/100° | - | - |
| J1 | Méropénème | 2 | Isolat 2 | 1/100° | - | - |
| J2 | Méropénème | 2 | Isolat 2 | 1/100° | - | - |
| J3 | Méropénème | 2 | Isolat 2 | 1/100° | - | - |
| J4 | Méropénème | 2 | Isolat 2 | 1/100° | - | - |
| K1 | Méropénème | 2 | Isolat 3 | 1/100° | - | - |
| K2 | Méropénème | 2 | Isolat 3 | 1/100° | - | - |
| K3 | Méropénème | 2 | Isolat 3 | 1/100° | - | - |
| K4 | Méropénème | 2 | Isolat 3 | 1/100° | - | - |
| L1 | Méropénème | 2 | Isolat 4 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| L2 | Méropénème | 2 | Isolat 4 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| L3 | Méropénème | 2 | Isolat 4 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| L4 | Méropénème | 2 | Isolat 4 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
Les résultats du Tableau 3 montrent que l’isolat 1 est caractérisé comme résistant à l’Amoxicilline, mais sensible au Ceftriaxone et au Méropénème. L’isolat 2 est, quant à lui, sensible aux trois antibiotiques. L’isolat 3 est résistant à l’Amoxicilline et au Ceftriaxone mais sensible au Méropénème. Enfin l’isolat 4 est résistant aux trois antibiotiques.
Ces résultats démontrent qu’il est possible de caractériser la résistance de plusieurs micro-organismes, vis-à-vis de plusieurs antibiotiques, sur une même plaque d’analyse de l’invention.
[TABLEAU 4] : Analyse des isolats 5 à 8 avec une cible Amoxicilline, Ceftriaxone et Méropénème
| Position | Antibiotique | Concentration (µg/ml) | Echantillon | Dilution | Micro-organismes identifiés | Probabilité d’identification (%) |
| A1 | Amoxicilline | 2 | Isolat 5 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| A2 | Amoxicilline | 2 | Isolat 5 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| A3 | Amoxicilline | 2 | Isolat 5 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| A4 | Amoxicilline | 2 | Isolat 5 | 1/100° | E. coli | 99.9 |
| B1 | Amoxicilline | 2 | Isolat 6 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| B2 | Amoxicilline | 2 | Isolat 6 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| B3 | Amoxicilline | 2 | Isolat 6 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| B4 | Amoxicilline | 2 | Isolat 6 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| C1 | Amoxicilline | 2 | Isolat 7 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| C2 | Amoxicilline | 2 | Isolat 7 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| C3 | Amoxicilline | 2 | Isolat 7 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| C4 | Amoxicilline | 2 | Isolat 7 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| D1 | Amoxicilline | 2 | Isolat 8 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| D2 | Amoxicilline | 2 | Isolat 8 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| D3 | Amoxicilline | 2 | Isolat 8 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| D4 | Amoxicilline | 2 | Isolat 8 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| E1 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 5 | 1/100° | - | - |
| E2 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 5 | 1/100° | - | - |
| E3 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 5 | 1/100° | - | - |
| E4 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 5 | 1/100° | - | - |
| F1 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 6 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| F2 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 6 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| F3 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 6 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| F4 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 6 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| G1 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 7 | 1/100° | - | - |
| G2 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 7 | 1/100° | - | - |
| G3 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 7 | 1/100° | - | - |
| G4 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 7 | 1/100° | - | - |
| H1 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 8 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| H2 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 8 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| H3 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 8 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| H4 | Ceftriaxone | 24 | Isolat 8 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| I1 | Méropénème | 2 | Isolat 5 | 1/100° | - | - |
| I2 | Méropénème | 2 | Isolat 5 | 1/100° | - | - |
| I3 | Méropénème | 2 | Isolat 5 | 1/100° | - | - |
| I4 | Méropénème | 2 | Isolat 5 | 1/100° | - | - |
| J1 | Méropénème | 2 | Isolat 6 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| J2 | Méropénème | 2 | Isolat 6 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| J3 | Méropénème | 2 | Isolat 6 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| J4 | Méropénème | 2 | Isolat 6 | 1/100° | K. pneumoniae | 99.9 |
| K1 | Méropénème | 2 | Isolat 7 | 1/100° | - | - |
| K2 | Méropénème | 2 | Isolat 7 | 1/100° | - | - |
| K3 | Méropénème | 2 | Isolat 7 | 1/100° | - | - |
| K4 | Méropénème | 2 | Isolat 7 | 1/100° | - | - |
| L1 | Méropénème | 2 | Isolat 8 | 1/100° | - | - |
| L2 | Méropénème | 2 | Isolat 8 | 1/100° | - | - |
| L3 | Méropénème | 2 | Isolat 8 | 1/100° | - | - |
| L4 | Méropénème | 2 | Isolat 8 | 1/100° | - | - |
L’isolat 5 est ainsi caractérisé comme un isolat d’E. colirésistant à l’Amoxicilline, mais sensible au Ceftriaxone et au Méropénème. L’isolat 6 est un isolat deK. pneumoniaerésistant aux 3 antibiotiques. L’isolat 7 est un isolat deK. pneumoniaerésistant à l’Amoxicilline, mais sensible au Ceftriaxone et au Méropénème. L’isolat 8 est un isolat deK. pneumoniaerésistant à l’Amoxicilline et au Ceftriaxone, mais sensible au Méropénème.
Là encore, les inventeurs ont caractérisé la résistance de plusieurs micro-organismes, y compris d’espèce différentes, vis-à-vis de plusieurs antibiotiques, sur une même plaque d’analyse.
Il est également possible de caractériser plusieurs micro-organismes sur une cible partiellement utilisée, comme présenté dans le Tableau 5 ci-dessous.
[TABLEAU 5] : Analyse des isolats 9 à 12 avec une cible Oxacilline
| Position | Antibiotique | Concentration (µg/ml) | Echantillon | Dilution | Micro-organismes identifiés | Probabilité d’identification (%) |
| A1 | Oxacilline | 2 | Isolat 9 | 1/10° | S. aureus | 99.9 |
| A2 | Oxacilline | 2 | Isolat 9 | 1/10° | S. aureus | 99.9 |
| A3 | Oxacilline | 2 | Isolat 9 | 1/10° | S. aureus | 99.9 |
| A4 | Oxacilline | 2 | Isolat 9 | 1/10° | S. aureus | 99.9 |
| B1 | Oxacilline | 2 | Isolat 10 | 1/10° | - | - |
| B2 | Oxacilline | 2 | Isolat 10 | 1/10° | - | - |
| B3 | Oxacilline | 2 | Isolat 10 | 1/10° | - | - |
| B4 | Oxacilline | 2 | Isolat 10 | 1/10° | - | - |
| C1 | Oxacilline | 2 | Isolat 11 | 1/10° | - | - |
| C2 | Oxacilline | 2 | Isolat 11 | 1/10° | - | - |
| C3 | Oxacilline | 2 | Isolat 11 | 1/10° | - | - |
| C4 | Oxacilline | 2 | Isolat 11 | 1/10° | - | - |
| D1 | Oxacilline | 2 | Isolat 12 | 1/10° | - | - |
| D2 | Oxacilline | 2 | Isolat 12 | 1/10° | - | - |
| D3 | Oxacilline | 2 | Isolat 12 | 1/10° | - | - |
| D4 | Oxacilline | 2 | Isolat 12 | 1/10° | - | - |
| E1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| E2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| E3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| E4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| F1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| F2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| F3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| F4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| G1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| G2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| G3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| G4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| H1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| H2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| H3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| H4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| I1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| I2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| I3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| I4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| J1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| J2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| J3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| J4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| K1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| K2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| K3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| K4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| L1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| L2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| L3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| L4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
L’isolat 9 est ainsi caractérisé comme un isolat deS. aureusrésistant à l’Oxacilline, alors que les isolats 10 et 11 deS. aureuset l’isolat 12 deS. epidermidisy sont sensibles.
A noter que les positions E1 à L4 n’ont pas été utilisées dans cette analyse. Elles ont été protégées par un film plastique Parafilm M et sont utilisables pour une nouvelle analyse (cf. TABLEAU 6).
[TABLEAU 6] : Deuxième analyse des isolats 9 à 12 avec la même plaque d’analyse que pour le TABLEAU 4.
| Position | Antibiotique | Concentration (µg/ml) | Echantillon | Dilution | Micro-organismes identifiés | Probabilité d’identification (%) |
| A1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| A2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| A3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| A4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| B1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| B2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| B3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| B4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| C1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| C2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| C3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| C4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| D1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| D2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| D3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| D4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| E1 | Oxacilline | 2 | Isolat 9 | 1/10° | S. aureus | 99.9 |
| E2 | Oxacilline | 2 | Isolat 9 | 1/10° | S. aureus | 99.9 |
| E3 | Oxacilline | 2 | Isolat 9 | 1/10° | S. aureus | 99.9 |
| E4 | Oxacilline | 2 | Isolat 9 | 1/10° | S. aureus | 99.9 |
| F1 | Oxacilline | 2 | Isolat 10 | 1/10° | - | - |
| F2 | Oxacilline | 2 | Isolat 10 | 1/10° | - | - |
| F3 | Oxacilline | 2 | Isolat 10 | 1/10° | - | - |
| F4 | Oxacilline | 2 | Isolat 10 | 1/10° | - | - |
| G1 | Oxacilline | 2 | Isolat 11 | 1/10° | - | - |
| G2 | Oxacilline | 2 | Isolat 11 | 1/10° | - | - |
| G3 | Oxacilline | 2 | Isolat 11 | 1/10° | - | - |
| G4 | Oxacilline | 2 | Isolat 11 | 1/10° | - | - |
| H1 | Oxacilline | 2 | Isolat 12 | 1/10° | - | - |
| H2 | Oxacilline | 2 | Isolat 12 | 1/10° | - | - |
| H3 | Oxacilline | 2 | Isolat 12 | 1/10° | - | - |
| H4 | Oxacilline | 2 | Isolat 12 | 1/10° | - | - |
| I1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| I2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| I3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| I4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| J1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| J2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| J3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| J4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| K1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| K2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| K3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| K4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| L1 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| L2 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| L3 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
| L4 | Oxacilline | 2 | - | - | - | - |
Les mêmes résultats ont été obtenus dans les Tableaux 5 et 6 dans deux analyses successives avec les mêmes isolats sur la même plaque d’analyse, ce qui prouve la possibilité de réutiliser une deuxième fois une cible partiellement utilisée une première fois, ce qui est avantageux pour éviter de gaspillage les plaques d’analyse. Par la même occasion, cette expérience démontre la reproductibilité de la technique.
Exemple 5: Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) selon l’invention
Les dilutions deStaphylocoquesdes souches de référence et des isolats ont été analysées sur les plaques selon l’invention avec 4 dépôts d’Oxacilline à 0.125 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 0.25 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 0.5 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 1 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 2 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 4 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 8 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 16 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 32 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 64 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 128 µg/ml, 4 dépôts d’Oxacilline à 256 µg/ml.
La souche de référence N°6 a été identifiée avec une probabilité de plus de 99.9% commeS. aureusdans 3 dépôts sur 4 avec une concentration d’Oxacilline de 0.125 µg/ml, pour un dépôt sur 4 pour une concentration de 0.25 µg/ml mais n’a pas été identifiée pour les concentrations supérieures d’Oxacilline. Cette souche a une CMI de 0.25 µg/ml (cf. TABLEAU 2), ce qui correspond à la plus faible concentration inhibitrice de croissance observée par le procédé de la présente invention.
De façon surprenante, un phénomène similaire a été observé avec la souche de référence N° 7.S. aureusa été identifié avec une probabilité de 99.9% de 0.125 à 64 µg/ml d’Oxacilline mais n’a pas été identifié pour les concentrations de 128 et 256 µg/ml. Une CMI de 128, conforme à celle du TABLEAU 2, est ainsi mise en évidence.
Les isolats 9 à 12 ont été analysés de la même façon et une CMI de 16 µg/ml a été observée pour l’isolat 9, de 0.25, 0.5 et 0.125 respectivement pour les isolats 10 à 12. Ces observations sont conformes aux prédictions de résistance à l’Oxacilline de l’Exemple 4, l’isolat 9 est résistant contrairement aux isolats 10 à 12. Elles permettent de surcroit une caractérisation plus fine des propriétés de résistance ou de sensibilité des micro-organismes en estimant la concentration minimale inhibitrice (CMI).
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Sparbier et al., 2016, Methods, 104 : 48-54,MBT-ASTRA : a suitable tool for fast antibiotic susceptibility testing ?
Welker M, Moore ER. Syst. Appl. Microbiol. 2011 Feb;34(1):2-11,Applications of Whole-Cell Matrix-Assisted Laser-Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry in Systematic Microbiology
Claims (21)
- Plaque d’analyse comprenant au moins une zone d’analyse destinée à recevoir une population d’au moins un micro-organisme à caractériser par spectrométrie de masse utilisant une technique d’ionisation MALDI, la plaque d’analyse étant caractérisée en ce que :
- tout ou partie de ladite zone d'analyse est réalisée en un matériau poreux, et
- ladite zone d’analyse comprend au moins un agent antimicrobien.
- Plaque d’analyse selon revendication 1, caractérisée en ce que la taille des pores de ladite zone d’analyse est inférieure à la taille dudit au moins un micro-organisme à caractériser.
- Plaque d’analyse selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la plaque est au moins partiellement réalisée en polymère recouvert d’une couche d’acier inoxydable ledit polymère contenant préférentiellement un matériau conducteur.
- Plaque d’analyse selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la plaque comporte une pluralité de zones d’analyse, chaque zone d’analyse étant porteuse d’au moins un agent antimicrobien.
- Plaque d’analyse selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu’au moins une première zone d’analyse parmi la pluralité, est porteuse d’un premier agent antimicrobien, et une seconde zone d’analyse parmi la pluralité et distincte de la première zone d’analyse, est porteuse d’un second agent antimicrobien différent du premier agent antimicrobien.
- Plaque d’analyse selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu’elle comporte au moins une zone d’analyse de référence, configurée pour recevoir au moins une population d’un micro-organisme de référence, la zone d’analyse de référence présentant une surface dépourvue d’agent antimicrobien.
- Système comprenant :
- une plaque d’analyse selon l’une des revendications 1 à 6, et
- un support réalisé en un matériau poreux ;
- Procédé de caractérisation d’une population d’au moins un micro-organisme, la caractérisation comprenant au moins la détermination de la résistance éventuelle d’une population d’un micro-organisme à au moins un agent antimicrobien,
caractérisé en ce que le procédé comprend les étapes successives suivantes :- une étape consistant à fournir une plaque d’analyse selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 ou un système selon la revendication 7, pour une caractérisation de ladite population d’au moins un micro-organisme,
- une étape de dépose de la population dudit au moins un micro-organisme sous forme liquide sur ladite au moins une zone d’analyse au contact de l’agent antimicrobien préalablement déposé sur ladite zone d’analyse,
- une étape d’incubation, consistant à conserver ladite plaque d’analyse, dans des conditions et pendant une période suffisante, pour permettre l’interaction dudit au moins un agent antimicrobien et dudit au moins un micro-organisme présent,
- une étape d’élimination du liquide contenant la population dudit au moins un micro-organisme par aspiration à travers les pores de la zone d’analyse,
- une étape de dépose sur ladite au moins une zone d’analyse, d’une matrice adaptée à la technique d’ionisation MALDI,
- une étape d’analyse par spectrométrie de masse utilisant une technique d’ionisation MALDI, d’une population dudit au moins un micro-organisme déposée sur ladite zone d’analyse permettant de conclure si une population d’un micro-organisme résistant à l’agent antimicrobien est présente sur la zone d’analyse.
- Procédé de caractérisation selon la revendication 8, caractérisé en ce que le support réalisé en matériau poreux du système selon la revendication 7 est humide.
- Procédé de caractérisation selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit support réalisé en matériau poreux est humidifié par un milieu de culture.
- Procédé de caractérisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que l’étape d’incubation est réalisée dans une chambre d’incubation.
- Procédé de caractérisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que l’étape d’incubation est réalisée pendant au moins 2 heures, de préférence pendant au moins 4 heures, et plus préférentiellement pendant une période de 4 à 12 heures.
- Procédé de caractérisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de détermination de la résistance dudit micro-organisme audit agent antimicrobien par observation de la présence de protéines du micro-organisme en quantité telle qu’il est possible de conclure à la croissance du micro-organisme malgré la présence dudit agent antimicrobien durant l’étape d’incubation.
- Procédé de caractérisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisé en ce qu’une population d’un seul micro-organisme à caractériser est déposée.
- Procédé de caractérisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 14, caractérisé en ce que la population de micro-organisme(s) est obtenue après une étape de concentration, enrichissement et/ou purification et/ou correspond à une colonie ou à une fraction de colonie obtenue après croissance sur un milieu adapté, notamment un milieu gélosé.
- Procédé de caractérisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 15, caractérisé en ce que la caractérisation comprend, en plus, l’identification du genre, ou de préférence, de l’espèce d’une population d’un micro-organisme déposée sur la zone d’analyse.
- Procédé de caractérisation selon la revendication 16, caractérisé en ce que l’identification du genre, ou, de préférence, de l’espèce d’une population d’un micro-organisme déposée sur la zone d’analyse et la détermination de la présence éventuelle sur la zone d’analyse d’une population d’un micro-organisme résistant à l'agent antimicrobien, met en œuvre une seule analyse par spectrométrie de masse utilisant une technique d’ionisation MALDI par une seule ionisation d’une zone d’analyse, et utilisant pour l’analyse une seule calibration.
- Procédé de caractérisation selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que l’identification du genre, ou, de préférence, de l’espèce d’une population d’un micro-organisme, et la détermination de la résistance éventuelle à l’agent antimicrobien concerne le même micro-organisme.
- Procédé de caractérisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 18, caractérisé en ce que l’étape d’élimination du liquide est réalisée par aspiration par capillarité.
- Procédé de caractérisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 19, caractérisé en ce que l’étape d’élimination du liquide est réalisée à l’aide d’un matériau poreux sec placé sous la plaque d’analyse.
- Procédé de caractérisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 18, caractérisé en ce que l’étape d’élimination du liquide est réalisée par extraction sous-vide.
TITRE
« Plaque pour une analyse par spectrométrie de masse utilisant une technique d’ionisation MALDI »
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