FR3118169A1

FR3118169A1 - Procédé de caractérisation de spermatozoïdes

Info

Publication number: FR3118169A1
Application number: FR2013979A
Authority: FR
Inventors: Cédric Allier; Olivier CIONI; Ondrej Mandula; Agnès CAMUS; Eric Schmitt
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: US20240044771A1; WO2022136325A1; EP4268120A1; FR3118169B1

Abstract

Procédé de caractérisation d’une particule mobile dans un échantillon (10), le procédé comportant: acquisition d’au moins une image () de l’échantillon durant une période d’acquisition, à l’aide d’un capteur d’image (20) et formation d’une série d’images, la série d’images comportant au moins une image;utilisation de chaque image de la série d’images résultant de a) en tant qu’image d’entrée () d’un réseau de neurones convolutif de détection (CNNd), le réseau de neurones convolutif de détection étant configuré pour détecter les particules et pour produire, à partir de chaque image, une image de sortie () sur laquelle à chaque particule détectée est assignée une distribution d’intensité, centrée sur la particule et s’étendant autour de la particule ;pour chaque particule détectée, à partir de chaque image de sortie () résultant de b), estimation d’une position de chaque particule détectée dans chaque image de la série d’images ; caractérisation de chaque particule détectée à partir de l’estimation de la position résultant de c), établie à partir de chaque image de la série d’images.

Description

Procédé de caractérisation de spermatozoïdes

Le domaine technique de l’invention est l’observation de particules microscopiques mobiles ou motiles dans un échantillon, en vue de leur caractérisation. Une application visée est la caractérisation de spermatozoïdes.

ART ANTERIEUR

L’observation de particules cellulaires motiles, telles des spermatozoïdes, dans un échantillon, est usuellement effectuée à l’aide d’un microscope. Le microscope comporte un objectif définissant un plan objet, s’étendant dans l’échantillon, ainsi qu’un plan image, confondu avec un plan de détection d’un capteur d’image. Le microscope effectue des images des spermatozoïdes selon une configuration focalisée. Le choix d’une telle modalité suppose un compromis entre la résolution spatiale, le champ observé et la profondeur de champ. Plus l’ouverture numérique de l’objectif est élevée, meilleure est la résolution spatiale, au détriment de la taille du champ observé. De même, une ouverture numérique élevée diminue la profondeur de champ.

On comprend que l’observation de particules motiles suppose une optimisation de l’objectif, sachant que, dans une telle configuration, il n’est pas possible d’obtenir à la fois une bonne résolution spatiale, un champ observé large et une grande profondeur de champ. Or, ces propriétés sont particulièrement importantes lors de l’observation de particules microscopiques motiles, notamment lorsque ces dernières sont nombreuses :

la taille des particules nécessite une bonne résolution spatiale ;
leur nombre justifie un champ observé étendu, de façon à pouvoir maximiser le nombre de particules observées sur une même image ;
leur mouvement requiert une profondeur de champ importante, de façon que les particules apparaissent nettement sur l’image.

Compte tenu de ces impératifs, il est usuel d’utiliser un microscope à fort grossissement. La faible taille du champ observée est compensée par le recours à une platine de translation. Cette dernière permet une acquisition d’images en déplaçant l’objectif relativement à l’échantilllon, parallèlement à ce dernier. La faible profondeur de champ est compensée en limitant l’épaisseur de l’échantillon : ce dernier est par exemple disposé dans une chambre fluidique de faible épaisseur, typiquement inférieure à 20 µm, de façon à limiter le déplacement des particules selon une direction perpendiculaire au plan objet. Par ailleurs, l’objectif peut être rapproché ou éloigné de l’échantillon, de façon à déplacer le plan objet dans l’échantillon, selon son épaisseur. Il en résulte un dispositif complexe et couteux, nécessitant un déplacement précis de l’objectif.

Une alternative à la microscopie classique a été proposée par l’imagerie sans lentille. Il est connu que l’imagerie sans lentille, couplée à des algorithmes de reconstruction holographique, permet une observation de cellules en conservant un champ d’observation élevé, ainsi qu’une grande profondeur de champ. Les brevets US9588037 ou US8842901 décrivent par exemple le recours à l’imagerie sans lentille pour l’observation de spermatozoïdes. Les brevets US10481076 ou US10379027 décrivent également le recours à l’imagerie sans lentille, couplée à des algorithmes de reconstruction, pour caractériser des cellules.

On sait que le recours à des algorithmes de reconstruction numérique permet d’obtenir des images nettes de particules. De tels algorithmes sont par exemple décrits dans US10564602, US20190101484 ou US20200124586. Dans ce type d’algorithme, à partir d’un hologramme acquis dans un plan de détection, on reconstruit une image de l’échantillon dans un plan de reconstruction, distant du plan de détection. Il est usuel que le plan de reconstruction d’étende à travers l’échantillon. Cependant, ce type d’algorithme peut nécessiter un temps de calcul relativement long.

Une telle contrainte est acceptable lorsque les particules sont considérées comme immobiles dans l’échantillon. Cependant, lorsque l’on souhaite caractériser des particules mobiles, et en particulier des particules motiles, le temps de calcul peut devenir trop important. En effet, la caractérisation de particules mobiles nécessite une acquisition de plusieurs images, à des fréquences élevées, de façon à pouvoir caractériser le mouvement des particules dans l’échantillon.

Les inventeurs proposent une alternative aux brevets précédemment cités, permettant de caractériser des particules motiles, et en particulier des spermatozoïdes, en utilisant un procédé d’observation simple. Le procédé conçu par les inventeurs permet la caractérisation d’un grand nombre de particules sans nécessiter de déplacement d’un objectif relativement à l’échantillon.

Un premier objet de l’invention est un procédé de caractérisation d’au moins une particule mobile dans un échantillon, le procédé comportant:

acquisition d’au moins une image de l’échantillon durant une période d’acquisition, à l’aide d’un capteur d’image et formation d’une série d’images à partir des images acquises ;
utilisation de chaque image de la série d’images résultant de a) en tant qu’image d’entrée d’un réseau de neurones convolutif de détection, le réseau de neurones convolutif de détection étant configuré pour détecter les particules et pour produire, à partir de chaque image, une image de sortie sur laquelle à chaque particule détectée est assignée une distribution d’intensité centrée sur la particule et s’étendant autour de la particule ;
pour chaque particule détectée, à partir de chaque image de sortie résultant de b), estimation d’une position de chaque particule détectée dans chaque image de la série d’images ;
caractérisation de chaque particule détectée à partir de l’estimation de la position résultant de c), établie à partir de chaque image de la série d’images.

Selon une possibilité, les étapes a) à d) peuvent être effectuées avec une seule image. Dans ce cas, la série d’images comporte une seule image.

Selon une possibilité, sur l’image de sortie, chaque particule peut être représentée sous la forme d’un point.

La particule (ou chaque particule) peut notamment être un spermatozoïde.

L’étape d) peut comporter une caractérisation, notamment morphologique, de chaque spermatozoïde détecté. L’étape d) comporte alors :

pour chaque du spermatozoïde détecté, à partir de chaque image résultant de a), et des positions résultant de c), extraction d’une vignette comportant le spermatozoïde détecté, la position du spermatozoïde détecté dans la vignette étant prédéterminée, de façon à obtenir, pour spermatozoïde détecté, une série de vignettes, la taille de chaque vignette étant inférieure à la taille de chaque image acquise lors de l’étape a) ;
- pour chaque spermatozoïde détecté, utilisation de la série de vignettes en tant que donnée d’entrée d’un réseau de neurones de classification, le réseau de neurones de classification étant configuré pour classifier le spermatozoïde parmi des classes prédéterminées. Il peut notamment s’agir de classes morphologiques.

Le procédé peut être tel que chaque spermatozoïde détecté est centré par rapport à chaque vignette.

L’étape d) peut comporter une caractérisation de la motilité du spermatozoïde. L’étape d) peut alors comporter, à partir des positions du spermatozoïde résultant de l’étape c) :

une détermination d’une trajectoire du spermatozoïde durant la période d’acquisition;
un calcul d’une vitesse du spermatozoïde à partir de la trajectoire ;
une classification du spermatozoïde en fonction de la vitesse.

Le procédé peut comporter :

une détermination d’une distance, en ligne droite, entre un premier point et un dernier point de la trajectoire, et un calcul d’une vitesse de trajectoire linéaire à partir de ladite distance ;
et/ou une détermination de distances parcourues entre chaque image acquise, et un calcul d’une vitesse de la trajectoire curvilinéaire à partir desdites distances ;
et/ou une détermination d’une trajectoire lissée, et un calcul d’une vitesse de la trajectoire moyenne à partir de la trajectoire lissée.

Selon un mode de réalisation,

l’échantillon s’étend selon un plan de l’échantillon ;
le capteur d’image s’étend selon un plan de détection ;
un système optique s’étend entre l’échantillon et le capteur d’image, le système optique définissant un plan objet et un plan image ;
le plan objet est décalé par rapport au plan de l’échantillon d’une distance de défocalisation objet et/ou le plan image est décalé par rapport au plan de l’échantillon d’une distance de défocalisation image.

Dans un tel mode de réalisation, le procédé peut être tel que:

l’échantillon est disposé sur un support d’échantillon, reposant sur au moins un ressort, le ressort étant configuré pour pousser le support d’échantillon vers le système optique ;
le système optique est relié à au moins une butée, s’étendant, à partir du système optique, vers le support d’échantillon ;
de telle sorte que durant l’étape a), sous l’effet du ressort, le support d’échantillon s’appuie sur la butée.

Selon un mode de réalisation, aucune optique de formation d’image ne s’étend entre l’échantillon et le capteur d’image.

Selon un mode de réalisation, l’étape a) comporte une normalisation de chaque image acquise par une moyenne de ladite image ou par une moyenne d’images de la série d’images. Dans ce cas, la série d’images est effectuée à partir de chaque image acquise, après normalisation.

Selon un mode de réalisation, l’étape a) comporte une application d’un filtre passe-haut à chaque image acquise. Dans ce cas, la série d’images est effectuée à partir de chaque image acquise, après application du filtre passe-haut.

Avantageusement, lors de l’étape b), la distribution d’intensité assignée à chaque particule est décroissante, de telle sorte que l’intensité décroît en fonction de la distance par rapport à la particule.

Avantageusement, lors de l’étape b), La distribution d’intensité assignée à chaque particule peut être une distribution statistique paramétrique bidimensionnelle.

Un deuxième objet de l’invention est un dispositif d’observation d’un échantillon, l’échantillon comportant des particules mobiles, le dispositif comportant :

une source de lumière, configurée pour illuminer l’échantillon ;
un capteur d’image, configuré pour former une image de l’échantillon ;
une structure de maintien, configurée pour maintenir l’échantillon entre la source de lumière et le capteur d’image ;
une unité de traitement, reliée au capteur d’image, et configurée pour mettre en œuvre les étapes a) à d) d’un procédé selon le premier objet de l’invention à partir d’au moins une image acquise par le capteur d’image.

Selon un mode de réalisation, aucune optique de formation d’image ne s’étend entre le capteur d’image et l’échantillon. La structure de maintien peut être configurée pour maintenir une distance fixe entre le capteur d’image et l’échantillon.

Selon un mode de réalisation,

le capteur d’image s’étend selon un plan de détection ;
le dispositif comporte un système optique, s’étendant entre le capteur d’image et le plan support, le système optique définissant un plan image et un plan objet, le dispositif étant tel que :
- le plan image est décalé par rapport au plan de détection d’une distance de défocalisation image ;
- et/ou le plan support et décalé par rapport au plan objet d’une distance de défocalisation objet .

L'invention sera mieux comprise à la lecture de l'exposé des exemples de réalisation présentés, dans la suite de la description, en lien avec les figures listées ci-dessous.

FIGURES

La représente un premier mode de réalisation de dispositif permettant une mise en œuvre de l’invention.

La est une vue tridimensionnelle du dispositif schématisé sur la .

La montre un montage permettant de maintenir l’échantillon à distance fixe d’un système optique.

La montre le montage représenté sur la dans une position d’observation.

La représente un deuxième mode de réalisation de dispositif permettant une mise en œuvre de l’invention.

La montre les principales étapes d’un procédé de caractérisation de particules mobiles dans l’échantillon.

Les figures 4A, 4B et 4C représentent respectivement une image acquise, une image de référence et une image résultant du réseau de neurones de détection.

La figure 5A est un exemple d’image d’un échantillon obtenue en mettant en œuvre un dispositif selon le premier mode de réalisation de l’invention. La figure 5B montre l’image représentée sur la figure 5A après un traitement par un réseau de neurones de détection. La figure 5C montre un exemple d’obtention de trajectoires de particules détectées sur l’image 5B.

La montre des vignettes centrées sur un même spermatozoïde, les vignettes étant extraites d’une série de neuf images acquises selon une modalité d’imagerie défocalisée.

Les figures 7A, 7B et 7C représentent respectivement une image acquise, une image de référence et une image résultant du réseau de neurones de détection.

Les figures 8A, 8B et 8C représentent respectivement une image acquise, une image de référence et une image résultant du réseau de neurones de détection. Sur cette série d’images, la figure 8A a fait l’objet d’un traitement par un filtre passe-haut.

Les figures 9A et 9B représentent des performances de détection de particules par le réseau de neurones de détection, dans différentes conditions. Les performances sont la sensibilité ( ) et la spécificité ( ).

Les figures 10A à 10C représentent des matrices de confusion, exprimant les performances de classification de spermatozoïdes, à l’aide d’images acquises selon la modalité défocalisée, la classification étant effectuée respectivement :

en mettant en œuvre un algorithme de reconstruction holographique à partir d’une image obtenue par reconstruction holographique et traitée par un réseau de neurones ;
en mettant en œuvre un réseau de neurones de classification dont la couche d’entrée comporte une unique image acquise selon une configuration défocalisée, sans reconstruction holographique ;
en mettant en œuvre un réseau de neurones de classification, dont la couche d’entrée comporte une série d’images d’une particule, chaque image étant acquise selon une configuration défocalisée, sans reconstruction holographique.

EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS

On a représenté, sur la , un premier mode de réalisation d’un dispositif 1 permettant une mise en œuvre de l’invention. Selon ce premier mode de réalisation, le dispositif permet l’observation d’un échantillon 10 interposé entre une source de lumière 11 et un capteur d’image 20. La source de lumière 11 est configurée pour émettre une onde lumineuse incidente 12 se propageant jusqu’à l’échantillon parallèlement à un axe de propagation Z.

Le dispositif comporte un support d'échantillon 10s configuré pour recevoir l’échantillon 10, de sorte que l'échantillon soit maintenu sur le support 10s. L’échantillon ainsi maintenu s’étend selon un plan, dit plan d’échantillon P₁₀. Le plan de l’échantillon correspond par exemple à un plan moyen autour duquel s’étend l’échantillon 10. Le support d’échantillon peut être une lame de verre, par exemple d’épaisseur 1mm.

L’échantillon comprend notamment un milieu liquide 10_mdans lequel baignent des particules mobile et éventuellement motiles 10_i. Le milieu 10_mpeut être un liquide biologique ou un liquide tampon. Il peut par exemple comporter un liquide corporel, à l'état pur ou dilué. Par liquide corporel, on entend un liquide généré par un corps vivant. Il peut en particulier s'agir, à titre non limitatif, de sang, d'urine, de liquide céphalorachidien, de sperme, de lymphe.

L’échantillon 10 est de préférence contenu dans une chambre fluidique 10_c. La chambre fluidique est par exemple une chambre fluidique d'épaisseur, comprise entre 20 µm et 100 µm. L’épaisseur de la chambre fluidique, et donc de l’échantillon 10, selon l’axe de propagation Z, varie typiquement entre 10 µm et 200µm, et est de préférence comprise entre 20 µm et 50 µm µm.

Un des objectifs de l’invention est la caractérisation de particules en mouvement dans l’échantillon. Dans l’exemple de réalisation décrit, les particules mobiles sont des spermatozoïdes. Dans ce cas, l’échantillon comporte du sperme, éventuellement dilué. Dans ce cas, la chambre fluidique 10_cpeut être une chambre de comptage dédiée à l’analyse de la mobilité ou de la concentration de cellules. Il peut par exemple s’agir d’une chambre de comptage commercialisées par Leja, d’épaisseur comprise entre 20 µm et 100 µm.

Selon d’autres applications, l’échantillon comporte des particules mobiles, par exemple des microorganismes, par exemple microalgues ou plancton, ou des cellules, par exemple des cellules en cours de sédimentation.

La distance D entre la source de lumière 11 et l’échantillon 10 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. Avantageusement, la source de lumière 11, vue par l’échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre l’échantillon et la source de lumière.

La source de lumière 11 est par exemple une diode électroluminescente. Elles est de préférence associée à un diaphragme 14, ou filtre spatial. L’ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 µm et 1 mm, de préférence entre 50 µm et 1 mm. Dans cet exemple, le diaphragme a un diamètre est de 400 µm. Selon une autre configuration, le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière et dont une deuxième extrémité est placée en regard de l’échantillon 10. Le dispositif peut également comporter un diffuseur 13, disposé entre la source de lumière 13 et le diaphragme 14. Le recours à un assemblage diffuseur/diaphragme est par exemple décrit dans US10418399

Le capteur d’image 20 est configuré pour former une image de l'échantillon selon un plan de détection P₂₀. Dans l’exemple représenté, le capteur d’image 20 comporte une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Le plan de détection P₂₀s’étend de préférence perpendiculairement à l’axe de propagation Z. De préférence, le capteur d’image présente une surface sensible élevée, typiquement supérieure à 10 mm². Dans cet exemple, le capteur d’image est un capteur IDS-UI-3160CP-M-GL comportant des pixels de 4.8x4.8 µm², la surface sensible étant de 9.2 mm x 5.76 mm, soit 53 mm².

Dans l’exemple représenté sur la , le capteur d'image 20 est optiquement couplé à l'échantillon 10 par un système optique 15. Dans l'exemple représenté, le système optique comporte un objectif 151 et une lentille de tube 152. Cette dernière est destinée à projeter une image formée, sur la surface sensible du capteur d’image 20 (surface de 53 mm²).

Dans cet exemple :

l'objectif 15₁est un objectif Motic CCIS EF-N Plan Achromat 10x, d'ouverture numérique 0.25 ;
la lentille 15₂est une lentille Thorlabs LBF254-075-A – focale 75 mm.

Un tel montage confère un champ d’observation de 3 mm², avec une résolution spatiale de 1 µm. La courte focale de la lentille permet d’optimiser l’encombrement du dispositif 1 et d’ajuster le grossissement à la dimension du capteur d’image.

Le capteur d’image est configuré pour acquérir des images de l’échantillon , selon une fréquence d’acquisition de quelques dizaines d’images par seconde, par exemple 60 images par seconde. La fréquence d’échantillonnage est typiquement comprise entre 5 et 100 images par seconde.

Le système optique 15 définit un plan objet Po et un plan image Pi. Dans le mode de réalisation représenté sur la , le capteur d’image 20 est configuré pour acquérir une image selon une configuration défocalisée. Le plan image Pi est confondu avec le plan de détection P20, tandis que le plan objet Po est décalé d’une distance de focalisation objet δ comprise entre 10 µm et 500 µm, par rapport à l’échantillon. La distance de focalisation est de préférence comprise entre 50 µm et 100 µm, par exemple 70 µm. Le plan objet Po s’étend en dehors de l’échantillon 10. Selon une autre possibilité, le plan objet s’étend dans l’échantillon, tandis que le plan image est décalé par rapport au plan de détection, d’une distance de défocalisation image. La distance de focalisation image est de préférence comprise entre 50 µm et 100 µm, par exemple 70 µm. Selon une autre possibilité, le plan objet Po et le plan image Pi sont tous les deux décalés respectivement par rapport au plan de l’échantillon et par rapport au plan de détection. Quelle que soit la configuration retenue, la distance de défocalisation est de préférence supérieure à 10 µm et inférieure à 1 mm, voire à 500 µm, et de préférence entre 50 µm et 150 µm. L’observation d’un échantillon cellulaire selon une configuration défocalisée a été décrit dans le brevet US10545329.

Selon une telle modalité, le capteur d'image 20 est exposé à une onde lumineuse, dite onde lumineuse d'exposition. L'image acquise par le capteur d’image comporte des figures d'interférence, pouvant également être désignées par le terme "figures de diffraction", formées par :

une partie de l’onde lumineuse 12 émise par la source de lumière 11, et ayant traversé l'échantillon sans interagir avec ce dernier ;
des ondes de diffraction, formées par la diffraction d'une partie de l’onde lumineuse 12 émise par la source de lumière dans l'échantillon.

Une unité de traitement 30, comportant par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image acquise par le capteur d’image 20. En particulier, l’unité de traitement comporte une mémoire programmable 31 dans laquelle est stockée une séquence d’instructions pour effectuer les opérations de traitement d’images et de calculs décrites dans cette description. L’unité de traitement 30 peut être couplée à un écran 32 permettant l’affichage d’images acquises par le capteur d’image 20 ou résultant du traitement effectué par l’unité de traitement 30.

L’image acquise par le capteur d’image 20, selon une modalité d’imagerie défocalisée, est une figure de diffraction de l’échantillon, parfois appelé hologramme. Elle ne permet pas d’obtenir une représentation précise de l’échantillon observé. De façon usuelle dans le domaine de l'holographie, on peut appliquer, à chaque image acquise par le capteur d’image, un opérateur de reconstruction holographique de façon à calculer une expression complexe représentative de l’onde lumineuse à laquelle est exposé le capteur d'image, et cela en tout point de coordonnées de l’espace, et en particulier dans un plan de reconstruction correspondant au plan de l’échantillon. L’expression complexe permet d’obtenir l’intensité ou la phase de l’onde lumineuse d’exposition. Une telle reconstruction holographique est décrite en lien avec l’art antérieur, ainsi que dans US10545329.

Cependant, pour des raisons de rapidité de traitement, les inventeurs ont suivi une approche différente de celle suggérée par l’art antérieur, sans recours à un algorithme de reconstruction holographique appliqué aux images acquises par le capteur d’image. Le procédé mis en œuvre par le capteur est décrit par la suite, en lien avec la .

La est une représentation d’un exemple de dispositif tel que schématisé sur la . Les figures 1C et 1D représentent un détail de la disposition de l’échantillon 10 face au système optique 15, et plus précisément face à l’objectif 151. Le support de l’échantillon 10s est relié à des moyens de rappel élastiques 16a, par exemple des ressorts. Les ressorts tendent à rapprocher le support d’échantillon 10s de l’objectif 151. Le dispositif comporte également des butées 16b, solidaires de l’objectif 151. L’objectif 151 et les butées 16b sont fixes par rapport au capteur d’image 20. Les butées 16b et les moyens de rappel 16a forment une structure de maintien 16, destinée à maintenir l’échantillon entre la source de lumière 11 et le capteur d’image 20.

Les figures 1C et 1D représentent le maintien de l’échantillon sur le support d’échantillon respectivement durant la mise en place de l’échantillon et durant son observation. Une liaison rigide 16c relie l’objectif 151 aux butées 16b. Durant la mise en place de l’échantillon ( ), les ressorts 16a sont comprimés. Durant l’observation de l’échantillon ( ), sous l’effet d’une détente des ressors 16a, le support de l’échantillon 10s vient en appui contre les butées 16b. Cela permet de maîtriser la distance Δ entre l’objectif 151 et l’échantillon 10, indépendamment de l’épaisseur du support d’échantillon 10s. Cela permet de s’affranchir de variations de l’épaisseur du support d’échantillon. Par exemple, lorsque ce dernier est une lame de verre d’épaisseur 1mm, l’épaisseur peut fluctuer selon une plage relativement importante, par exemple ± 100 µm. Le montage décrit en lien avec les figures 1C et 1D permet de maîtriser la distance Δ entre l’objectif 151 et l’échantillon 10, à ± 5 µm près, indépendamment de telles fluctuations d’épaisseur de la lame 10s. Les inventeurs estiment qu’un tel montage permet d’éviter le recours à un système autofocus pour effectuer des images

Sur le figures 1C et 1D, on a également représenté une résistance chauffante 19 reliée à un contrôleur de température 18. La fonction de ces éléments est de maintenir une température de la chambre fluidique 10_cà 37°C.

La représente un deuxième mode de réalisation de dispositif 1’ convenant à la mise en œuvre de l’invention. Le dispositif 1’ comporte une source de lumière 11, un diffuseur 13, un diaphragme 14, un capteur d’image 20, une structure de maintien 17 et une unité de traitement 30 tels que décrits en lien avec le premier mode de réalisation. La structure de maintien 17 est configurée pour définir une distance fixe entre l’échantillon et le capteur d’image. Selon ce mode de réalisation, le dispositif ne comporte pas de lentille de formation d’image entre le capteur d’image 20 et l’échantillon 10. Le capteur d’image 20 est de préférence rapproché de l’échantillon, la distance entre le capteur d’image 20 et l’échantillon 10 étant typiquement comprise entre 100 µm et 3 mm. Selon ce mode de réalisation, le capteur d’image acquiert des images selon une modalité d’imagerie sans lentille. L’échantillon est de préférence contenu dans une chambre fluidique 10c, par exemple une chambre « Leja » telle que décrite en lien avec le premier mode de réalisation. L’avantage d’un tel mode de réalisation est qu’il ne nécessite pas un positionnement précis d’un système optique 15 par rapport à l’échantillon 10, et qu’il confère un champ d’observation élevé. L’inconvénient est l’obtention d’images de moindre qualité, mais qui demeurent exploitables.

De préférence, la structure de maintien est agencée façon que la distance entre l’échantillon, lorsque l’échantillon 10 est disposé sur la structure de maintien 17, et le capteur d’image 20, est constante. Dans l’exemple représenté sur la , la structure de maintien 17 est reliée à une base 20’, sur laquelle s’étend le capteur d’image 20. La base peut par exemple être une plaque de type PCB (Printed Circuit Board – Circuit imprimé), sur laquelle est posé le capteur d’image 20. L’échantillon 10, contenu dans la chambre fluidique 10c, est maintenu, par le support d’échantillon 10s, sur la structure de maintien 17. Le support d’échantillon est par exemple une lame transparente. L’échantillon s’étend entre le support d’échantillon 10s et le capteur d’image. Ainsi, la distance entre l’échantillon 10 et le capteur d’image 20 n’est pas affectée par une fluctuation de l’épaisseur du support 10s.

La schématise les principales étapes d’un procédé de traitement de plusieurs images acquises par un capteur d’image selon la modalité d’imagerie défocalisée (premier mode de réalisation) ou d’imagerie sans lentille (deuxième mode de réalisation). Le procédé est décrit en lien avec l’observation de spermatozoïdes, étant entendu qu’il peut s’appliquer à l’observation d’autres types de particules motiles.

Etape 100: Acquisition d’une série d’images

Au cours de cette étape, on acquiert une série d’images selon l’une des modalités précédemment décrites. est un entier naturel désignant le rang de chaque image acquise, avec 1 , étant le nombre total d’images acquises. Les images acquises sont des images acquises soit selon une modalité d’imagerie défocalisée, soit selon une modalité d’imagerie sans lentille. Le nombre d’images acquises peut être compris entre 5 et 50. Comme précédemment indiqué, les images peuvent être acquises selon une fréquence d’acquisition de 60 Hz.

Dans les résultats présentés ci-après, les images ont été acquises en utilisant une modalité d’imagerie défocalisée, telle que décrite en lien avec les figures 1A à 1D.

Etape 110 : Prétraitement

L’objectif est d’effectuer un prétraitement de chaque image acquise, de façon à limiter les effets d’une fluctuation de l’intensité de l’onde lumineuse incidente ou de la sensibilité de la caméra. Le prétraitement consiste à normaliser chaque image acquise par une moyenne de l’intensité d’au moins une image acquise, et de préférence de l’ensemble des images acquises.

Ainsi, à partir de chaque image , la normalisation permet d’obtenir une image normalisée , telle que ou où est une moyenne d’une ou plusieurs images de la série d’images, et de préférence de chaque image de la série d’images.

Selon une possibilité, le prétraitement peut inclure une application d’un filtre passe-haut à chaque image, éventuellement normalisée. Le filtre passe-haut permet d’éliminer les basses fréquences de l’image.

Selon une possibilité, on applique un filtre gaussien, en effectuant un produit de convolution de l’image par un noyau gaussien . La largeur à mi-hauteur du noyau gaussien est par exemple de 20 pixels. Le prétraitement consiste alors à soustraire, à l’image , l’image résultant de l’application du filtre gaussien, de telle sorte que l’image résultant du prétraitement est : = . * est l’opérateur produit de convolution.

L’effet d’un tel filtrage est décrit par la suite, en lien avec les figures 7A à 7C et 8A à 8C.

Etape 120 : Détection de particules

Cette étape consiste à détecter et à positionner précisément les spermatozoïdes, et cela sur chaque image , résultant de l’étape 100 ou de chaque image prétraitée lors de l’étape 110. Cette étape est effectuée à l’aide d’un réseau de neurones convolutif de détection CNN_d. Le réseau de neurones CNN_dcomporte une couche d’entrée, sous la forme d’une image d’entrée . L’image d’entrée est soit une image acquise , soit une image prétraitée A partir de l’image d’entrée , le réseau de neurones de détection CNN_dgénère une image de sortie . L’image de sortie est telle que chaque spermatozoïde 10_idétecté sur l’image d’entrée , en une position apparaît sous la forme d’une distribution d’intensité centrée autour de ladite position. Autrement dit, à partir d’une image d’entrée , le réseau de neurones CNN_dpermet :

une détection de spermatozoïdes ;
une estimation de la position de chaque spermatozoïde 10_idétecté;
une génération d’une image de sortie comportant une distribution d’intensité prédéterminée autour de chaque position .

Ainsi,

Chaque position est une position bidimensionnelle, dans le plan de détection P₂₀. La distribution d’intensité est telle que l’intensité est maximale au niveau de chaque position et que l’intensité soit considérée comme négligeable au-delà d’un voisinage de chaque position. Par voisinage , on entend une région s’étendant selon un nombre de pixels, prédéterminé, par exemple entre 5 et 20 pixels, autour de chaque position . La distribution peut être de type créneau, auquel cas dans le voisinage , chaque pixel est d’intensité constante est élevée, et au-delà du voisinage , chaque pixel a une intensité nulle.

De préférence, la distribution est centrée sur chaque position et est strictement décroissante autour de cette dernière. Il peut par exemple s’agir d’une distribution d’intensité gaussienne bidimensionnelle, centrée sur chaque position . La largeur à mi hauteur est par exemple inférieure à 20 pixels, et de préférence inférieure à 10 ou 5 pixels. Toute autre forme de distribution paramétrique peut être envisagée, sachant qu’il est préférable que la distribution soit symétrique autour de chaque position, et de préférence strictement décroissante à partir de la position . Le fait d’assigner une distribution d’intensité à chaque position permet d’obtenir une image de sortie dans laquelle chaque spermatozoïde est simple à détecter. En cela, l’image de sortie est une image de détection, sur la base de laquelle chaque spermatozoïde peut être détecté.

L’image de sortie du réseau de neurones est formée par une résultante de chaque distribution d’intensité définie respectivement autour de chaque position .

Dans l’exemple implémenté par les inventeurs, le réseau de neurones convolutif de détection comportait 20 couches comportant soit 10, soit 32 caractéristiques (plus usuellement désignées par le terme « features ») par couche. Le nombre de caractéristiques était déterminé de façon empirique. Le passage d’une couche à une autre est effectué en appliquant un noyau de convolution de taille 3x3. L’image de sortie est obtenue en combinant les caractéristiques de la dernière couche de convolution. Le réseau de neurones a été programmé sous environnement Matlab (éditeur : The Mathworks). Le réseau de neurones a préalablement fait l’objet d’un apprentissage (étape 80), de façon à paramétrer les filtres de convolution. Au cours de l’apprentissage, on a utilisé des jeux d’apprentissage, chaque jeu comportant :

une image d’entrée, obtenue par le capteur d’image et prétraitée par normalisation et éventuellement filtrage, en utilisant des semences d’animaux.
une image de sortie, sur laquelle la position de chaque spermatozoïde était annotée manuellement.

L’apprentissage a été effectuée en utilisant 10000 ou 20000 positions annotées (soit entre 1000 et 3000 positions annotées par image). L’effet de la taille du jeu d’apprentissage (10000 ou 20000 annotations) est discuté en lien avec les figures 9A et 9B.

Les figures 4A, 4B et 4C sont un jeu d’images de test, comportant respectivement :

une image d’un échantillon de semences de bovin acquise par le capteur d’image et ayant fait l’objet d’une normalisation et filtrage passe haut selon l’étape 110 ;
une image annotée manuellement, qui correspond à une image de référence, usuellement désignée par le terme « ground truth » (réalité) ;
une image résultant de l’application du réseau de neurones convolutif de détection.

L’image de la figure 4C est cohérente avec l’image de référence (figure 4B) ce qui atteste de la performance de détection du réseau de neurones CNNd. Les inventeurs ont noté que la figure 4C montre une position non représentée sur l’image de référence : une vérification a montré qu’il s’agissait d’un oubli d’annotation sur l’image de référence.

Ainsi, sur la base d’un hologramme, et moyennant d’éventuels prétraitements de type normalisation ou filtre passe haut, pour faire ressortir les fréquences hautes, l’application du réseau de neurones convolutif de détection CNN_dpermet une détection et un positionnement précis de spermatozoïdes. Et cela sans recourir à une reconstruction d’image mettant en œuvre un opérateur de propagation holographique, comme suggéré dans l’art antérieur. L’image d’entrée du réseau de neurones est une image formée dans le plan de détection, et non dans un plan de reconstruction distant du plan de détection. En outre, le réseau de neurones de détection génère des images de sorties peu bruitées : le rapport signal à bruit associé à chaque détection de spermatozoïde est élevé, ce qui facilite les opérations ultérieures.

L’étape 120 est réitérée pour différentes images d’une même série d’images, de façon à obtenir une série d’images de sortie ….. .

Au cours de l’étape 120, à partir de chaque image de sortie ….. , on applique un algorithme de détection de maximum local, de façon à obtenir, pour chaque image, une liste de coordonnées 2D, chaque coordonnée correspondant à une position d’un spermatozoïde. Ainsi, à partir de chaque image de sortie ….. , on établit une liste ….. .Chaque liste comporte correspond aux positions 2D, dans le plan de détection, de spermatozoïdes détectés dans une image .

La figure 5A représente une image acquise lors de l’étape 100. Plus précisément, il s’agit d’un détail d’une image acquise selon une modalité défocalisée. Il s’agit d’une image d’un échantillon comportant du sperme de bovin. Une telle image est difficilement interprétable par un utilisateur. La figure 5B montre une image résultant de l’application du réseau de neurones de détection à la figure 5A, après normalisation et application d’un filtre passe-haut. La comparaison entre les images 5A et 5B montre le gain apporté par le réseau de neurones convolutif de détection en matière de rapport signal à bruit.

Etape 130 : suivi de position

Au cours de cette étape, à partir des listes ….. respectivement établies à partir des images de sortie ….. , résultant d’une même série d’images , on applique un algorithme de suivi de position, usuellement désigné par le terme « algorithme de tracking ». Pour chaque spermatozoïde détecté suite à l’étape 120, on met en œuvre un algorithme permettant un suivi de la position du spermatozoïde, parallèlement au plan de détection, entre les différentes images de la série d’images. La mise en œuvre de l’algorithme de suivi de position est performante du fait qu’il est effectué à partir des listes ….. résultant de l’étape 120. Comme précédemment indiqué, ces images présentent un rapport signal sur bruit élevé, ce qui facilite la mise en œuvre de l’algorithme de suivi de position. L’algorithme de suivi de position peut être un algorithme de type « plus proche voisin ». L’étape 130 permet une détermination d’une trajectoire de chaque spermatozoïde parallèlement au plan de détection.

Sur la figure 5C, on a superposé des images de sortie ….. en considérant une pile d’images de 30 images. On observe que la trajectoire, parallèlement au plan de détection, de chaque spermatozoïde, peut être déterminée de façon précise.

Etape 140 : caractérisation de la motilité

Au cours de l’étape 140, pour chaque spermatozoïde, chaque trajectoire peut être caractérisée sur la base de métriques appliquées aux trajectoires résultant de l’étape 130. Connaissant la fréquence d’acquisition des images, il est possible de quantifier des vitesses de déplacement de chaque spermatozoïde détecté, et en particulier :

une vitesse de la trajectoire linéaire VSL , usuellement désignée par le terme « velocity straighline path », qui correspond à la vitesse calculée sur la base d’une distance, en ligne droite, entre les premier et dernier points de la trajectoire (le premier point est déterminé à partir de première image acquise de la série d’images, et le dernier point est déterminé à partir de la dernière image acquise de la série d’images)
une vitesse de la trajectoire curvilinéaire VCL, usuellement désignée par le terme « velocity curvilinear path » : il s’agit d’une vitesse établie en sommant les distances parcourues entre chaque image, et en divisant par la durée de la période d’acquisition ;
une vitesse de la trajectoire moyenne VAP, usuellement désignée par le terme « velocity average path » : il s’agit d’une vitesse établie après lissage de la trajectoire d’une particule : la distance parcourue selon la trajectoire lissée (ou trajectoire moyenne) est divisée par la durée de la période d’acquisition.

A partir des vitesses calculées, il est possible de définir des indicateurs permettant de caractériser la motilité des spermatozoïdes, connus de l’homme du métier. Il s’agit par exemple d’indicateurs de type :

indicateur de rectitude STR, obtenu par un ratio entre VSL et VAP, usuellement désigné par le terme « straightness ». Cet indicateur est d’autant plus élevé que le spermatozoïde se déplace en ligne droite ;
indicateur de linéarité LIN, obtenu par un ratio entre VSL et VCL, usuellement désigné par le terme « linearity ». Cet indicateur est également d’autant plus élevé que le spermatozoïde se déplace en line droite.
indicateur d’oscillation WOB, obtenu par un ratio VAP/VCL, usuellement désigné par le terme wobble.

La quantification des vitesses ou paramètres listés ci-dessus permet de catégoriser les spermatozoïdes en fonction de leur motilité. Par exemple, un spermatozoïde est considéré comme :

motile si la longueur de la trajectoire est supérieure à un premier seuil, par exemple 10 pixels, et que son déplacement le long de la trajectoire moyenne (VAPx Δt, Δt étant la période d’acquisition) est supérieure à une longueur prédéfinie, correspondant par exemple à la longueur d’une tête de spermatozoïde ;
progressif si la longueur de la trajectoire est supérieure au premier seuil, et si la rectitude STR et la vitesse de la trajectoire moyenne VAP sont respectivement supérieures à deux valeurs seuils STR_thet VAP_th ₁;
lent si la longueur de la trajectoire est supérieure au premier seuil et si la vitesse de la trajectoire linéaire VSL et la vitesse de la trajectoire moyenne VAP sont respectivement inférieures à deux valeurs seuils VSL_th ₂et VAP_th ₂;
statique si la longueur de la trajectoire est supérieure au premier seuil et si la vitesse de la trajectoire linéaire VSL et la vitesse de la trajectoire moyenne VAP sont respectivement inférieures à deux valeurs seuils VSL_th ₃et VAP_th ₃.
non catégorisé si la longueur de la trajectoire est inférieure au premier seuil.

Les valeurs seuils STR_th, VSL_th ₂ _,VSL_th ₃sont préalablement déterminées, avec VSL_th2≥VSL_th ₃. Il en est de même des valeurs VAP_th ₁, VAP_th ₂et VAP_th ₃avec VAP_th ₁≥VAP_th ₁≥VAP_th ₃.

Etape 150: Extraction de vignettes pour chaque spermatozoïde.

Au cours de cette image, on extrait, pour chaque spermatozoïde détecté par le réseau de détection CNN_d, une vignette , et cela dans chaque image acquise par le capteur d’image lors de l’étape 100.

Chaque vignette est une portion d’une image acquise par le capteur d’image. Pour chaque spermatozoïde détecté 10_i _,à partir de chaque image , on extrait une vignette autour de la position assignée au spermatozoïde. La position du spermatozoïde 10_i, dans chaque image , est obtenue suite à la mise en œuvre de l’algorithme de suivi de position (étape 130).

La taille de chaque vignette est prédéterminée. Relativement à chaque vignette , la position du spermatozoïde 10_iconsidéré est fixe : de préférence, la position du spermatozoïde 10_iest centrée dans chaque vignette .

Une vignette peut par exemple comporter quelques dizaines voire quelques centaines de pixels, typiquement entre 50 et 500 pixels. Dans cet exemple, une vignette comporte 64 x 64 pixels. Du fait de la taille, et de la concentration des spermatozoïdes dans l’échantillon, une vignette peut comporter plusieurs spermatozoïdes à caractériser. Cependant, seul le spermatozoïde 10_ioccupant une position prédéterminée dans la vignette , par exemple au centre de la vignette, est caractérisé en utilisant ladite vignette.

La figure 6 montre neuf vignettes extraites à partir d’images résultant de l’étape 100, en utilisant les positions résultant du suivi de trajectoire d’un spermatozoïde résultant de l’étape 130.

Etape 160Classification de la morphologie de chaque spermatozoïde

Au cours de cette étape, on utilise un réseau de neurones de classification CNN_c, de façon à classifier chaque spermatozoide 10_ipréalablement détecté par le réseau de neurones convolutif de détection CNN_d. Pour chaque spermatozoïde 10_i, le réseau de neurones est alimentée par les vignettes extraites lors de l’étape 150.

Le réseau de neurones convolutif de classification CNN_cpeut par exemple comporter 6 couches convolutives, comportant entre 16 et 64 caractéristiques : 16 caractéristiques pour les quatre premières couches, 32 caractéristiques pour la cinquième couche, et 64 caractéristiques pour la sixième couche. Le passage d’une couche à une autre est effectué en appliquant un noyau de convolution de taille 3 par 3 La couche de sortie comporte des nœuds, chaque nœud correspondant à une probabilité d’appartenance à une classe morphologique. Chaque classe morphologique correspond à une morphologie du spermatozoïde analysé. Il peut par exemple s’agit d’une classification connue, les classes étant :

0 : indéfini
1 : normal
2 : stump (moignon)
3 : gouttelette distale
4 : décapité
5 : microcéphale
6 : gouttelette proximale
7 : DMR (Distal Midpiece reflex,usuellement désigné Courbure de l’extrémité distale de la pièce intermédiaire)
8 : anomalie de la tête
9 : anomalie du flagelle : flagelle courbé ou enroulé
10 : agrégats.

La couche de sortie peut ainsi compter 11 classes.

Le réseau de neurones est programmé sous environnement Matlab (éditeur : The Mathworks). Le réseau de neurones a préalablement fait l’objet d’un apprentissage (étape 90), de façon à paramétrer les filtres de convolution. Au cours de l’apprentissage, on a utilisé des jeux d’apprentissage, chaque jeu comportant :

des vignettes, extraites d’images acquises par le capteur d’image ;
une annotation manuelle de la morphologie de chaque spermatozoïde analysé. L’annotation a été effectuée sur la base de vignettes ayant fait l’objet d’une reconstruction holographique.

Essais expérimentaux

Différents tests ont été effectués pour examiner les performances du réseau de neurones de détection CNN_d. On a testé la sensibilité de la détection par rapport à l’application d’un filtre passe-haut au cours de l’étape 110. Les figures 7A, 7B et 7C représentent respectivement une image acquise par le capteur d’image, une image de référence, annotée manuellement, et une image résultant du réseau de neurones de détection. L’image 7C a été obtenue sans mise en œuvre du filtre durant l’étape 110.

Les figures 8A, 8B et 8C représentent respectivement une image acquise par le capteur d’image, une image de référence, annotée manuellement, et une image résultant du réseau de neurones de détection. L’image 8C a été obtenue en mettant en œuvre d’un filtre passe haut durant l’étape 110.

On observe que l’image 8C comporte des spermatozoïdes détectés, repérés par des flèches, qui n’apparaissent pas sur l’image 7C. L’application du filtre améliore la performance de détection du réseau de neurones de classification.

Les figures 9A et 9B représentent respectivement la sensibilité de détection et la spécificité de détection du réseau de neurones de détection CNN_d(courbes a, b et c), en comparaison avec un algorithme classique (courbe d). L’algorithme classique était basé sur des opérations morphologiques de traitement d’image de type érosion/dilatation.

Sur chacune des figures 9A et 9B, les courbes a, b et c correspondent respectivement :

au réseau de neurones entraîné avec 10000 annotations ;
au réseau de neurones entraîné avec 20000 annotations ;
au réseau de neurones entraîné avec 20000 annotations, chaque image acquise par le capteur ayant fait l’objet d’un filtrage passe-haut.

La sensibilité et la spécificité (axes des ordonnées) ont été déterminées sur 14 échantillons différents (axe des abscisses) de sperme dilué de bovin (facteur 10). On observe que les performances du réseau de neurones, quel que soit la configuration (courbes a, b et c) sont supérieures à celle de l’algorithme classique, ce qui est remarquable. Par ailleurs, la meilleure performance est obtenue dans la configuration c, selon laquelle le réseau de neurones est entraîné avec 20000 annotations et est alimenté avec une image ayant fait l’objet d’un prétraitement avec un filtre passe-haut.

On rappelle que la sensibilité correspond au taux de vrais positifs sur la somme des taux de vrais positifs et de faux négatifs, et que la spécificité correspond au taux de vrais positifs sur la somme des taux de vrais et faux positifs.

La est une matrice de confusion représentant les performances de classification d’un réseau de neurones de classification CNNc paramétré pour recevoir, en tant qu’image d’entrée, une image résultant d’une reconstruction holographique. Le réseau de neurones est un réseau de neurones convolutif, tel que précédemment décrit, entraîné à l’aide d’images acquises à l’aide d’un dispositif défocalisé, tel que précédemment décrit. En utilisant ce réseau de neurones, chaque image acquise fait l’objet d’une reconstruction holographique, dans un plan d’échantillon s’étendant à travers l’échantillon, en utilisant un algorithme de reconstruction holographique tel que décrit dans US20190101484. A partir de l’image reconstruite, on extrait une vignette centrée sur le spermatozoïde à caractériser. La vignette forme une image d’entrée du réseau de neurone.

La est une matrice de confusion représentant les performances de classification d’un réseau de neurones de classification paramétré pour recevoir, en tant qu’image d’entrée, une seule vignette, centrée sur le spermatozoïde à caractériser, et extraite d’une image acquise selon une configuration défocalisée. Le réseau de neurones est un réseau de neurones convolutif, structuré comme décrit lors de l’étape 160, si ce n’est que le réseau de neurones est alimenté par une seule vignette.

La est une matrice de confusion représentant les performances de classification d’un réseau de neurones de classification tel que décrit dans l’étape 160, alimenté par une série de 5 vignettes extraites d’images acquises en configuration défocalisée.

Les axes de chaque matrice de confusion correspondent aux classes 1 à 10 précédemment décrites.

On remarque que les performances de classification des algorithmes décrits en lien avec les figures 10B et 10C sont supérieures à celui décrit sur la . Par exemple que s’agissant de la classe 6 (anomalie « goutelette proximale »), la performance de classification passe de 31% ( ), à 61% ( ), et à 96,9% ( ).

On remarque également qu’une seule image d’entrée permet d’obtenir une performance de classification satisfaisante. Aussi, pour la classification morphologique, il n’est pas nécessaire de disposer d’une série d’images comportant plusieurs d’images. Une seule image peut suffire. Cependant, la performance de classification est meilleure lorsqu’on utilise plusieurs images.

L’invention permet une analyse d’un échantillon comportant des spermatozoïdes sans recourir à une platine de translation. Par ailleurs, elle permet une caractérisation directement à partir de l’image acquise par le capteur d’image, c’est-à-dire sur la base de figures de diffraction des différents spermatozoïdes, et cela sans nécessiter le recours à des algorithmes de reconstruction numérique. Actuellement, le recours à un tel algorithme se traduit par une durée de traitement de 10 secondes par image. Soit 300 secondes pour une série de 30 images. Par ailleurs, comme représenté sur les figures 10A à 10C, l’invention permet une classification plus précise qu’une classification basée sur un réseau de neurones de structure identique, alimenté par des images reconstruites.

Un autre avantage de l’invention est la tolérance à l’égard d’une défocalisation. Les inventeurs estiment que l’invention tolère des décalages de ± 25 µm entre le système optique et l’échantillon.

Claims

Procédé de caractérisation d’au moins une particule mobile (10_i) dans un échantillon (10), le procédé comportant:
acquisition d’au moins une image ( ) de l’échantillon durant une période d’acquisition, à l’aide d’un capteur d’image (20) et formation d’une série d’images, la série d’images comportant au moins une image;

utilisation de chaque image de la série d’images résultant de a) en tant qu’image d’entrée ( ) d’un réseau de neurones convolutif de détection (CNN_d), le réseau de neurones convolutif de détection étant configuré pour détecter les particules et pour produire, à partir de chaque image, une image de sortie ( ) sur laquelle à chaque particule détectée est assignée une distribution d’intensité, centrée sur la particule et s’étendant autour de la particule ;

pour chaque particule détectée, à partir de chaque image de sortie ( ) résultant de b), estimation d’une position de chaque particule détectée dans chaque image de la série d’images ;

caractérisation de chaque particule détectée à partir de l’estimation de la position résultant de c), établie à partir de chaque image de la série d’images.
Procédé selon la revendication 1, dans lequel la particule est un spermatozoïde.
Procédé selon la revendication 2, dans lequel l’étape d) comporte une caractérisation morphologique de chaque spermatozoïde détecté, l’étape d) comportant :
pour chaque du spermatozoïde détecté, à partir de chaque image résultant de a), et des positions résultant de c), extraction d’une vignette ( ) comportant le spermatozoïde détecté, la position du spermatozoïde détecté dans la vignette étant prédéterminée, de façon à obtenir, pour spermatozoïde détecté, une série de vignettes, la taille de chaque vignette étant inférieure à la taille de chaque image acquise lors de l’étape a) ;

pour chaque spermatozoïde détecté, utilisation de la série de vignettes en tant que donnée d’entrée d’un réseau de neurones de classification (CNN_c), le réseau de neurones de classification étant configuré pour classifier le spermatozoïde parmi des classes morphologiques prédéterminées.
Procédé selon la revendication 3, dans lequel chaque spermatozoïde détecté est centré par rapport à chaque vignette.
Procédé selon la revendication 3 ou la revendication 4, dans lequel l’étape d) comporte une caractérisation de la motilité du spermatozoïde, l’étape d) comportant, à partir des positions du spermatozoïde résultant de l’étape c) :
une détermination d’une trajectoire du spermatozoïde durant la période d’acquisition;

un calcul d’une vitesse du spermatozoïde à partir de la trajectoire ;

une classification du spermatozoïde en fonction de la vitesse.
Procédé selon la revendication 5, comportant :
une détermination d’une distance, en ligne droite, entre un premier point et un dernier point de la trajectoire, et un calcul d’une vitesse de trajectoire linéaire à partir de ladite distance ;

et/ou une détermination de distances parcourues entre chaque image acquise, et un calcul d’une vitesse de la trajectoire curvilinéaire à partir desdites distances ;

et/ou une détermination d’une trajectoire lissée, et un calcul d’une vitesse de la trajectoire moyenne à partir de la trajectoire lissée.
Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel :
l’échantillon s’étend selon un plan de l’échantillon (P₁₀);

le capteur d’image s’étend selon un plan de détection (P₂₀);

un système optique (15) s’étend entre l’échantillon et le capteur d’image, le système optique définissant un plan objet (P_o) et un plan image (P_i);

le plan objet est décalé par rapport au plan de l’échantillon d’une distance de défocalisation objet et/ou le plan image est décalé par rapport au plan de l’échantillon d’une distance de défocalisation image.
Procédé selon la revendication 7, dans lequel :
l’échantillon est disposé sur un support d’échantillon (10s), reposant sur au moins un ressort (16a), le ressort étant configuré pour pousser le support d’échantillon vers le système optique ;

le système optique est relié à au moins une butée (16b), s’étendant, à partir du système optique, vers le support d’échantillon ;

de telle sorte que durant l’étape a), sous l’effet du ressort, le support d’échantillon s’appuie sur la butée.
Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel aucune optique de formation d’image ne s’étend entre l’échantillon et le capteur d’image.
Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape a) comporte une normalisation de chaque image acquise par une moyenne de ladite image ou par une moyenne d’images de la série d’images.
Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape a) comporte une application d’un filtre passe-haut à chaque image acquise.
Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l’étape b), la distribution d’intensité assignée à chaque particule est décroissante, de telle sorte que l’intensité décroît en fonction de la distance par rapport à la particule.
Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l’étape b), la distribution d’intensité assignée à chaque particule est une distribution statistique paramétrique bidimensionnelle.
Dispositif (1, 1’) d’observation d’un échantillon, l’échantillon comportant des particules mobiles, le dispositif comportant :
une source de lumière (11), configurée pour illuminer l’échantillon ;

un capteur d’image (20), configuré pour former une image de l’échantillon ;

une structure de maintien (16, 17), configurée pour maintenir l’échantillon entre la source de lumière et le capteur d’image ;

une unité de traitement (30), reliée au capteur d’image, et configurée pour mettre en œuvre les étapes a) à d) d’un procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 13 à partir d’au moins une image acquise par le capteur d’image.
Dispositif selon la revendication 14, dans lequel aucune optique de formation d’image ne s’étend entre le capteur d’image et l’échantillon.
Dispositif selon la revendication 15, dans lequel la structure de maintien (17) est configurée pour maintenir une distance fixe entre le capteur d’image et l’échantillon.
Dispositif selon la revendication 14, dans lequel :
le capteur d’image s’étend selon un plan de détection ;

le dispositif comporte un système optique (15), s’étendant entre le capteur d’image et le plan support, le système optique définissant un plan image et un plan objet, le dispositif étant tel que :

le plan image est décalé par rapport au plan de détection d’une distance de défocalisation image ;

et/ou le plan support et décalé par rapport au plan objet d’une distance de défocalisation objet .