FR3101875A1 - Analogue fluorescent de la vancomycine - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un nouvel analogue fluorescent de la vancomycine et son utilisation pour la détection de bactéries Gram+, en particulier dans une méthode de diagnostic rapide pour identifier la présence de bactéries Gram+ in vivo, par exemple des kératites infectieuses, ou encore in vitro sur des fluides ou tissus prélevés sur un sujet, humain ou animal.
Description
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un nouvel analogue fluorescent de la vancomycine et son utilisation pour la détection de bactéries Gram+, en particulier dans une méthode de diagnostic rapide pour identifier la présence de bactéries Gram+in vivo, par exemple des kératites infectieuses, ou encorein vitrosur des fluides ou tissus prélevés sur un sujet, humain ou animal.
ARRIERE PLAN DE L'INVENTION
La vancomycine est un antibiotique bien connu dont le spectre se limite aux bactéries Gram positif (staphylocoques, streptocoques par exemple). Il inhibe la synthèse des peptidoglycanes constituant leur paroi. Des dérivés colorés ou fluorescents de la vancomycine sont également connus, employés notamment comme sondes indicatrices de la présence de colonies de bactéries Gram+ (Kocaoglu & Carlson, 2016, Gao & al., 2006). On citera également le produit BODIPY (marque enregistrée) FL Vancomycin commercialisé par la société ThermoFisher Scientific comme réactif de laboratoire.
La vancomycine est un antibiotique bien connu dont le spectre se limite aux bactéries Gram positif (staphylocoques, streptocoques par exemple). Il inhibe la synthèse des peptidoglycanes constituant leur paroi. Des dérivés colorés ou fluorescents de la vancomycine sont également connus, employés notamment comme sondes indicatrices de la présence de colonies de bactéries Gram+ (Kocaoglu & Carlson, 2016, Gao & al., 2006). On citera également le produit BODIPY (marque enregistrée) FL Vancomycin commercialisé par la société ThermoFisher Scientific comme réactif de laboratoire.
Ces analogues de l’état de la technique présentent des problèmes de stabilité et de purification et aucun de ces analogues n’est adapté ni indiqué pour un usage dans une méthode de diagnostic simplifiéein vitroouin vivo, et en particulierin vivo, et notamment pour détecter rapidement les kératites infectieuses.
BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION
L’invention concerne un nouvel analogue fluorescent de la vancomycine de formule B-L-CO-V dans laquelle
B est un fluorophore dérivé de BODIPY,
L est un bras de liaison, et
-CO-V est la vancomycine, la liaison du L-CO-V étant une liaison sur le résidu acide carboxylique de la vancomycine, en particulier une liaison amide.
L’invention concerne aussi une composition, en particulier une composition stérile, comprenant ledit analogue fluorescent de la vancomycine et un véhicule approprié à son utilisation, en particulier pour son application topique.
L’invention concerne un nouvel analogue fluorescent de la vancomycine de formule B-L-CO-V dans laquelle
B est un fluorophore dérivé de BODIPY,
L est un bras de liaison, et
-CO-V est la vancomycine, la liaison du L-CO-V étant une liaison sur le résidu acide carboxylique de la vancomycine, en particulier une liaison amide.
L’invention concerne aussi une composition, en particulier une composition stérile, comprenant ledit analogue fluorescent de la vancomycine et un véhicule approprié à son utilisation, en particulier pour son application topique.
L’invention concerne également une méthode pour détecter la présence de bactéries Gram+ dans un échantillon biologique, ladite méthode comprenant l’ajout d’une quantité appropriée dudit analogue fluorescent de la vancomycine à l’échantillon biologique puis à observer la persistance d’une émission de fluorescence, marqueur de la présence de bactéries Gram+ dans l’échantillon biologique. La persistance de cette émission de fluorescence vient du fait que l’analogue fluorescent de la vancomycine s’est lié à la paroi cellulaire des bactéries Gram+ présentes.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Le nouvel analogue fluorescent de vancomycine B-L-CO-V selon l’invention comprend un fluorophore dérivé de BODIPY (B) lié au groupe acide carboxylique de la vancomycine (V) par un bras de liaison (L) également appelé « Linker ».
Les fluorophores dérivés de BODIPY (dipyrrométhènes-bore) sont connus de l’homme du métier. On citera en particulier les fluorophores décrits dans la demande WO 2006/0875459 et en particulier des dérivés hydrophiles tels que décrits dans les demandes WO 2010/076516 et WO 2014/013205. Il s’agit notamment de composés B de formule I
(I)
dans laquelle
S1représente un groupe de formule -CΞC-L'-A, où L' est un groupement de liaison qui est une liaison simple (auquel cas S1est un groupe de formule -CΞC-A) ; ou un groupement hydrocarboné divalent choisi dans le groupe consistant en les alkylènes linéaires ou ramifiées, comprenant éventuellement un ou plusieurs oxygène, azote ou soufre au sein de leur chaîne (comme les groupements poly(éthylène glycol), poly(éthoxy) ou poly(propoxy), par exemple) ; les alcénylènes linéaires ou ramifiés ; les alcynylènes linéaires ou ramifiés, et les arylènes ; ou une chaîne hydrocarbonée divalente constituée par un enchaînement d'au moins deux groupements hydrocarbonés divalents du type précité ; et A est un groupement fonctionnel polaire choisi parmi les groupes sulfonate, sulfate, phosphate, ammonium, carboxylate, hydroxyle, phosphonate, sulfate d'alkylammonium et polyoxyéthylène;
S2représente un groupe -CΞC-L'-A identique ou différent de S1, où L' et A ont les significations précitées; F; H; ou une chaîne hydrocarbonée, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs atomes d'oxygène, d'azote ou de soufre, éventuellement cyclisée en totalité ou en partie, éventuellement aromatique, et éventuellement fonctionnalisée, et
chacun des groupes R1, R2, R3, R4, R5, R6ou R7désigne, indépendamment des autres, H ou une chaîne hydrocarbonée, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs atomes d'oxygène, éventuellement cyclisée en totalité ou en partie, éventuellement aromatique et éventuellement fonctionnalisée, étant entendu que tout ou partie des groupes R1, R2, R3, R4, R5, R6et R7, peuvent être reliés entre eux pour former une forme pontée (à savoir qu'au moins deux des groupes R1, R2, R3, R4, R5, R6et R7peuvent former ensemble un cycle avec les carbones auxquels ils sont reliés).
Selon un mode particulier de réalisation de l’invention, S1et S2sont identiques ou différents, choisis parmi F, ou les dérivés alcynes de formules
n étant 1, 2, ou 3, en particulier 1. Avantageusement, S1et S2sont identiques.
La liaison du dérivé de BODIPY avec le bras de liaison L se fait par l’un des substituants R1à R7, en particulier par l’un de R1, R3ou R6, plus particulièrement R1. On choisira en particulier pour cette liaison un substituant tel que défini plus haut porteur d’un groupe carbonyle, la liaison avec le linker se faisant par une liaison ester, amide ou thioester.
Selon un autre mode particulier de réalisation de l’invention, la liaison du linker avec le substituant du BODIPY se fait par une liaison alcynyle (-CΞC-).
En particulier la liaison B-L- (fluorophore-linker) se fait par l’un de R1, R3ou R6, plus particulièrement R1de formule -Ar-CO-L- ou -Ar-L-, dans laquelle Ar est un radical divalent aromatique hydrocarboné, de 1 à 4 cycles fusionnés ou non, ayant notamment de 4 à 16 atomes de carbone de préférence de 4 à 10 atomes de carbone, et pouvant contenir dans leur cycle des atomes d'azote, de soufre ou d'oxygène (hétérocycles). Les groupes aryles sont éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes alkyle ou alkoxy, notamment par méthyle ou méthoxy. Parmi les radicaux aryles, on peut notamment citer le radical phényle, naphtyle, pyrényle, pérylényle, anthracényle, thiényle, pyrolyle, pyridinyle ou furanyle, en particulier phényle ou thiényle.
R2et R5sont généralement identiques, en particulier choisis parmi les groupes H, méthyle ou éthyle.
R3, R4, R6et R7, identiques ou différents sont généralement choisis parmi les groupes H, alkyle, en particulier méthyle, éthyle ou propyle, et les aryles de formules
dans lesquelles, R9, R10, R11, R12et R13représentent, indépendamment l’un de l’autre les groupes H, alkyles ou alkoxy comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, en particulier méthyle, éthyle, propyle.
Selon un mode particulier de l’invention, R3et R6sont identiques et/ou R4et R7sont identiques.
Parmi les dérivés de BODIPY préférés on emploiera les dérivés décrits dans les demandes WO 2006/087459, WO 2010076516 et WO 2014/013205 et leurs exemples.
Le bras de liaison L est un dérivé bifonctionnel qui permet de se lier à la fois au dérivé de BODIPY B et au groupe acide carboxylique de la vancomycine V. Il peut être représenté par la formule -Z1-R8-Z2-.
R8est une chaîne hydrocarbonée divalente, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs atomes d'oxygène, éventuellement cyclisée en totalité ou en partie. R8est plus particulièrement choisi parmi les chaines alkylènes divalentes linéaires ou ramifiée, comprenant éventuellement un ou plusieurs atomes d’oxygène, azote ou soufre au sein de leur chaîne (comme les groupements poly(éthylène glycol), poly(éthoxy) ou poly(propoxy), par exemple) ; les alcénylènes linéaires ou ramifiés ; les alcynylènes linéaires ou ramifiés, et les arylènes ; ou une chaîne hydrocarbonée divalente constituée par un enchaînement d'au moins deux groupements hydrocarbonés divalents du type précité. On citera plus particulièrement des groupes alkylènes en C3à C6, en particuliers les groupes éthylène, 1,3-propylène, 1,4-butylène, 1,5-pentylène, éventuellement substitués, ou encore des groupes -alk1-(O-alk2)n-O-alk3- n allant de 1 à 10, en particulier de 1 à 5, plus particulièrement 1, 2 ou 3, chaque groupe alk1 et alk3 étant indépendamment l’un de l’autre choisi parmi un groupe méthylène ou éthylène et alk2 étant un alkylène choisi parmi l’éthylène et le propylène (1,2- ou 1,3-).
Z1est le groupe permettant la liaison avec le dérivé BODIPY décrit précédemment, soit directement, soit par l’intermédiaire d’un groupe carbonyle porté par l’un des substituants tel que décrits précédemment. Z1est particulièrement choisi parmi les groupes -CΞC-, -O-, -NH- et –S-, plus particulièrement -CΞC- et -NH-.
Z2est le groupe permettant la liaison avec l’acide carboxylique de la vancomycine. On citera en particulier les groupes -O-, -NH- et –S-, plus particulièrement -NH pour former une liaison amide.
De préférence Z1et Z2sont des groupes -NH-. Le bras de liaison L est en particulier choisi parmi les groupes divalents suivants
-HN-(CH2-CH2)n-CH2-NH-
-HN-CH2-(O-CH2-CH2)n-O-CH2-NH-, et
-CΞC-(CH2-CH2)n-CH2-NH-
n étant un entier de 1 à 6, de préférence 1, 2 ou 3, plus préférentiellement 1.
L’invention concerne également un intermédiaire B-L-H pour la préparation d’un analogue de la vancomycine, B et L étant définis plus haut. En particulier, l’intermédiaire B-L-H selon l’invention est représenté par la formule II, dans laquelle l’un de R1, R2, R3, R4, R5, R6et R7est un substituant sur lequel le bras de liaison L est attaché, et plus particulièrement de formule -Ar-CO-Z1-R8-Z2-H ou -Ar-Z1-R8-Z2-H dans laquelle Ar, Z1, R8et Z2sont définis précédemment. De préférence, la liaison B-L se fait par le substituant R1.
Selon un mode particulier, l’intermédiaire est représenté par la formule II
(II)
dans laquelle L, S1, S2, R2, R3, R4, R5, R6et R7sont décrits plus haut.
Selon un mode préféré, R1est un substituant de formule –Ar-CO-Z1-R8-Z2-H.
Un exemple représentatif des intermédiaires préférés est représenté par la formule III
(III)
dans laquelle Z est -Z1-R8-Z2- et Z1, Z2, S1, S2, R2, R3, R4, R5, R6, R7et R8sont définis plus haut.
L’analogue fluorescent de la vancomycine selon l’invention est préparé par les méthodes usuelles de couplage des différentes parties qui le constituent, en particulier par couplage de l’intermédiaire B-L-H ci-dessus avec la vancomycine de manière à greffer l’intermédiaire sur le groupe acide carboxylique de la vancomycine. Pour ces méthodes de couplage on citera en particulier Silverman & al. (2016).
L’invention concerne aussi une composition, en particulier une composition stérile, comprenant ledit analogue fluorescent de la vancomycine et un véhicule approprié à son utilisation, en particulier pour son application topique.
La composition, ses constituants, en particulier le véhicule, et ses propriétés physicochimiques, notamment de viscosité et de transparence, dépendront de l’usage de la composition.
La composition est avantageusement une composition transparente au rayonnement du fluorophore. Il s’agira avantageusement de solutions aqueuses ou hydroalcooliques. Ces solutions peuvent être conditionnées sous une forme multidoses, pour des usages répétés, ou bien unidose pour un usage unique.
Pour une application topique sur la peau ou les muqueuses d’un sujet afin d’identifier rapidement la présence ou l’absence de bactéries Gram+, la composition sera une composition stérile qui a les caractéristiques d’une composition pharmaceutique, en particulier en matière de stérilité et d’innocuité vis à vis des sujets.
La composition à usage topique selon l’invention peut comprendre des additifs usuels de ce type de compositions, comme des agents viscosants ou encore des régulateurs de pH, tampons ou encore acides ou bases, des sels, ou des antioxydants ou autres agents de stabilité ou encore des conservateurs. Lesdits additifs seront choisis de manière à ne pas interférer de manière substantielle, seuls ou en association, avec le rayonnement du fluorophore mais aussi avec la capacité de la vancomycine à se lier aux bactéries Gram+.
Selon un mode particulier de réalisation de l’invention, la composition à usage topique et en particulier pour une application dans l’œil, ne comprend pas de conservateurs.
La viscosité de solution dépendra du site d’application. Ainsi, pour une application dans l’œil, la composition sera avantageusement sous la forme d’un collyre. Sa viscosité pourra aller de 1,5-2mPa.s (faible viscosité) à 105-106 mPa.s (forte viscosité) en passant par une semie-viscosité (viscosité 10 à 100 fois plus élevée que les collyres de faible viscosité)
Pour une application sur la peau la composition est avantageusement une solution de viscosité 1000 à 100000 mPa.s.
La composition à usage topique selon l’invention comprend avantageusement de 0,01 à 3% en masse d’analogue fluorescent de la vancomycine de formule B-L-CO-V, de préférence de 0,5 à 1% en poids, et de l’eau.
L’invention concerne également une méthode pour détecter la présence de bactéries Gram+ dans un échantillon biologique, ladite méthode comprenant l’ajout d’une quantité appropriée dudit analogue fluorescent de la vancomycine à l’échantillon biologique puis à observer la présence d’une émission de fluorescence, marqueur de la présence de bactéries Gram+ dans l’échantillon biologique. La persistance de cette émission de fluorescence vient du fait que l’analogue fluorescent de la vancomycine s’est lié à la paroi cellulaire des bactéries Gram+ présentes.
Cette détection peut être faitein vitro, sur des échantillons biologiques préalablement prélevés chez l’homme ou l’animal, ou encorein vivosur un sujet humain ou animal, sur des sites, peau ou muqueuses où l’on peut suspecter la présence de bactéries Gram+ responsables de pathologies.
On citera en particulier les bactéries Gram+ sensibles à la Vancomycine et pouvant être pathogènes pour l’être humain et l’animal comme par exemple, le genreStaphylococcus, en particulierS. aureusou les staphylocoques à coagulase négative, le genreStreptococcus,en particulierS. pneumoniae,S. viridans , S. pyogenes ou S. agalactiae ,mais aussiCorynebacterium spp , Propionibacterium acnesouActinomyces spp .
Ainsi, l’invention concerne une méthode de détection de la présence ou de l’absence de bactéries Gram+ susceptibles d’être responsables de kératites infectieuses chez un sujet humain ou animal qui consiste à appliquer sur l’œil du sujet une quantité appropriée d’analogue fluorescent de la vancomycine puis à observer la persistance d’une émission de fluorescence, marqueur de la présence de bactéries Gram+.
L’observation de la persistance de l’émission de fluorescence se fait par des méthodes usuelles et bien connues de l’homme du métier.
Selon l’application du composé, l’analogue fluorescent de la vancomycine pourra être détecté à l’aide de microscopes à fluorescence classiques de laboratoire dans le cas d’une utilisationin vitro, ou à l’aide d’un dispositif médical adapté utilisable en clinique, doté d’une source lumineuse d’excitation à l’instar de la lampe à fente d’ophtalmologie utilisée en pratique courante pour l’observation de la fluorescéine ou du microscope confocalin vivoà fluorescence utilisé en dermatologie mais aussi adapté pour l’ophtalmologie.
L’invention concerne aussi l’utilisation d’analogue fluorescent selon l’invention pour contrôler l’absence de bactéries Gram +, et en particulier de bactéries Gram+ pathogènes sur des aliments. Elle concerne une méthode de détection de la présence ou de l’absence de bactéries Gram+ susceptibles de contaminer des aliments, qui consiste à appliquer sur ledit aliment à tester une quantité appropriée d’analogue fluorescent de la vancomycine puis à observer la persistance d’une émission de fluorescence, marqueur de la présence de bactéries Gram+.
Les images obtenues pourront être post-traitées par un logiciel ou un algorithme (gestion des contrastes, filtrage spatial) afin d’éliminer le bruit de fond ou l’éventuelle coloration non spécifique générée par l’analogue, notamment en utilisant un filtrage spatial passe haut de type Butterworth.
L’auto-fluorescence des tissus biologiques ou des cellules (composés essentiellement d’eau et d’hémoglobine) peut générer un important bruit de fond d’auto-fluorescence, masquant ainsi un réel signal de fluorescence. Pour écarter une telle auto-fluorescence on pourra employer des méthodes usuelles d’extinction de cette auto-fluorescence. On citera par exemple l’ajout de bleu Trypan, colorant reconnu pour éteindre l’auto-fluorescence des tissus biologiques ou des cellules.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation d’un analogue « vert » de la vancomycine – VancomBod FL
Fluorophore : acide 4-(5,5-bis(3-(2-methoxyethoxy)prop-1-yn-1-yl)-1,3,7,9-tetramethyl-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-10-yl)benzoique
Les étapes de la préparation de cet analogue vert sont représentées sur la figure 2.
Etape 1 : Préparation du 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-(5,5-bis(3-(2-methoxyethoxy)prop-1-yn-1-yl)-1,3,7,9-tetramethyl-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-10-yl)benzoate
On agite un mélange d’acide 4-(5,5-bis(3-(2-methoxyethoxy)prop-1-yn-1-yl)-1,3,7,9-tetramethyl-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-10-yl)benzoic (405 mg, 0.71 mmol, 1 eq), de N-hydroxysuccinimide (173 mg, 1.4 mmol, 2 eq), de N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (224 mg, 1.4 mmol, 2 eq) et de 4-(Dimethylamino)pyridine (176 mg, 1.4 mmol, 2 eq) dans du DCM sec (100 ml) à température ambiante pendant 16h. On ajoute de l’eau et le mélange est extrait avec du DCM. La phase organique est lavée deux fois à l’eau, séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée. Le résidu est purifié par chromatographie sur colonne (SiO2; DCM/AcOEt : 8/2) pour obtenir le produit désiré sous forme de poudre orange (455 mg ; 100%).
1H NMR (400 MHz, Chloroforme-d) δ ppm : 8.28 (d,J=8.3 Hz, 2 H), 7.54 (d,J=8.1 Hz, 2 H), 6.04 (s, 2 H), 4.22 (s, 4 H), 3.63 - 3.73 (m, 4 H), 3.52 - 3.60 (m, 4 H), 3.38 (s, 6 H), 2.96 (s, 4 H), 2.74 (s, 6 H), 1.37 (s, 6 H).
Etape 2 : Préparation du N-(2-aminoethyl)-4-(5,5-bis(3-(2-methoxyethoxy)prop-1-yn-1-yl)-1,3,7,9-tetramethyl-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-10-yl)benzamide
On ajoute de l’éthylène diamine (0.09 mL, 1.3 mmol, 6 eq). à une solution de 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-(5,5-bis(3-(2-methoxyethoxy)prop-1-yn-1-yl)-1,3,7,9-tetramethyl-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-10-yl)benzoate (140 mg, 0.22 mmol, 1 eq) obtenu à l’étape 1 dans du DMF sec. Le mélange est mélangé à température ambiante pendant 4h. On ajoute de l’eau et la phase organique est extraite avec de l’acétate d’éthyle, lavée cinq fois avec de l’eau, séchée sur MgSO4et filtrée. Le solvant est ensuite enlevé sous pression réduite pour obtenir une poudre orange (127 mg ; 97%) employée sans qutre purification dans l’étape suivante.
1H NMR (300 MHz, Chloroforme-d) δ ppm : 7.96 (d,J=7.9 Hz, 2 H), 7.41 (d,J=7.9 Hz, 2 H), 7.01 (s, 1 H), 6.01 (s, 2 H), 4.20 (s, 4 H), 3.62 - 3.71 (m, 4 H), 3.51 - 3.60 (m, 4 H), 3.36 (s, 6 H), 3.01 (s, 2 H), 2.73 (s, 6 H), 1.92 (s, 4 H), 1.34 (s, 6 H).
Etape 3 : Couplage avec l’hydrochlorure de vancomycine
On ajute successivement à 0°C du N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (20 mg, 0.05 mmol, 1.5 eq) et du DIEA (30 µl, 0.17 mmol, 5 eq) à un mélange de Vancomycin hydrochloride (50 mg, 0.03 mmol, 1 eq) et de N-(2-aminoethyl)-4-(5,5-bis(3-(2-methoxyethoxy)prop-1-yn-1-yl)-1,3,7,9-tetramethyl-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-10-yl)benzamide (43 mg, 0.07 mmol, 2 eq) obtenu à l’étape 2 dans un mélange DMF/DMSO (2 mL, 1/1, v/v) sec. Le mélange est laissé sous agitation à température ambiante pendant 16 h. Après évaporation du DMF, on ajoute de l’ACN. Le précipité est centrifugé, lavé trois fois avec de l’ACN puis 3 fois avec du DCM et 1 fois avec du diéthyle cétone. Le produit cru est solubilisé dans du DMF sec (3 mL) et on ajoute de la Ps-trisamine (70 mg).La suspension obtenue est agitée 64 h. La suspension est ensuite filtrée sur un filtre de verre fritté et le rétentat est lavé avec du DCM sec. Le solvant est éliminé par évaporation sous pression réduite pour obtenir une poudre orange (38 mg, 55%).
ESI-HRMS,m/zcalculé pour C100H117BCl2N13O29: 1015.8848[M+H]+; trouvé: 1015.8835 [M+H]+.
Exemple 2 : Préparation d’un analogue « rouge » de la vancomycine - VancomBod rouge
Fluorophore : acide 4-(5,5-bis(3-(2-methoxyethoxy)prop-1-yn-1-yl)-2,8-dimethyl-3,7-di(thiophen-2-yl)-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-10-yl)benzoique
Les étapes de la préparation de cet analogue vert sont représentées sur la figure 4.
Etape 1 : Préparation du N-(2-aminoethyl)-4-(5,5-bis(3-(2-methoxyethoxy)prop-1-yn-1-yl)-2,8-dimethyl-3,7-di(thiophen-2-yl)-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-10-yl)benzamide
On agite un mélange d’acide 4-(5,5-bis(3-(2-methoxyethoxy)prop-1-yn-1-yl)-2,8-dimethyl-3,7-di(thiophen-2-yl)-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-10-yl)benzoique (116 mg, 0.16 mmol, 1 eq), de N-Hydroxysuccinimide (38 mg, 0.33 mmol, 2 eq), de N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (52 mg, 0.33 mmol, 2 eq) et de 4-Dimethylaminopyridine (41 mg, 0.33 mmol, 2 eq) dans du DCM sec (5 mL) pendant 16h à température ambiante. On ajoute ensuite de l’acide chlorhydrique (1M) et la phase organique est extraite 3 fois avec du DCM. Les phases organiques réunies sont lavées à l’eau (3 fois), séchée sur MgSO4, filtrée et le solvant est ensuite enlevé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne (SiO2; DCM/EtOH : 85/15 to 80/20) pour obtenir une cire bleue (54 mg ; 45%).
1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ ppm : 7.97 (d,J=7.9 Hz, 2 H), 7.84 (dd,J=3.4, 0.9 Hz, 2 H), 7.64 (d,J=8.2 Hz, 2 H), 7.45 (dd,J=4.9, 0.9 Hz, 2 H), 7.12 (dd,J=4.9, 3.7 Hz, 2 H), 7.04 (t,J=5.2 Hz, 1 H), 6.57 (s, 2 H), 3.93 (s, 4 H), 3.59 (q,J=5.5 Hz, 4 H), 3.43 - 3.48 (m, 4 H), 3.37 - 3.42 (m, 4 H), 3.34 (s, 6 H), 3.02 (t,J=5.8 Hz, 3 H), 2.08 (s, 6 H).
Etape 2 : Couplage avec l’hydrochlorure de vancomycine
On ajute successivement à 0°C du N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (27 mg, 0.07 mmol, 1.5 eq) et du DIEA (30 µl, 0.17 mmol, 3 eq) à un mélange de Vancomycin hydrochloride (70 mg, 0.05 mmol, 1 eq) et de N-(2-aminoethyl)-4-(5,5-bis(3-(2-methoxyethoxy)prop-1-yn-1-yl)-2,8-dimethyl-3,7-di(thiophen-2-yl)-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-10-yl)benzamide (53 mg, 0.07 mmol, 1.5 eq) obtenu à l’étape 1 dans un mélange DMF/DMSO (2 mL, 1/1, v/v) sec. Le mélange est laissé sous agitation à température ambiante pendant 16 h. Le produit brut est précipité par l’addition de DCM. Le précipité est centrifugé, lavé 3 fois avec du DCM. Le résidu est solubilisé dans du DMF sec (3 mL) et on ajoute de la Ps-trisamine (210 mg). La suspension obtenue est agitée 120 h. La suspension est ensuite filtrée sur un filtre de verre fritté et le rétentat est lavé avec du DCM sec et le filtrat concentré à 1-2 mL. On ajoute du DCM au filtrat concentré pour précipiter le produit. Le solide est lavé avec du DCM (3 fois) et une fois avec du pentane pour obtenir une poudre bleue foncée (40 mg ; 39%).
Exemple 3 : Mesures de photo-blanchiment
Les essais sont réalisés avec l’analogue de l’exemple 1 (VancomBod FL) d’une part et le produit BODIPY™ FL Vancomycin commercialisé par la société ThermoFisher Scientific (VancoBODIPY Fisher) d’autre part.
Les mesures ont été́ réalisées avec un microscope confocal (Olympus, FV1200) doté d’un laser d’excitation à 473nm et d’un filtre d’émission passe-bande 490-525nm. La puissance du laser a été définie à 20% tout au long de l’expérience. Le gain et l’Offset sont restés inchangés.
Mesures à 1 μ g/ mL :Une série de 50 images par champ a été prise. Intensité du laser pour la prise d’image de la bactérie marquée au VancomBod FL : 600/1000 et celle marquée au VancoBODIPY Fisher: 500/1000.
La décroissance de la fluorescence obéit à une loi de décroissance exponentielle de premier ordre. Dans des conditions d’illumination identiques, le VancoBODIPY Fisher a une dynamique de blanchiment plus rapide. Il perd 95% de sa fluorescence en 29,4 s contre 38,7 s pour le VancomBod FL.
Mesures à 10 μ g/ mL :Une série de 100 images par champ a été prise. Intensité du laser pour la prise d’image de la bactérie marquée au VancomBod FL : 600/1000 et celle marquée au VancoBODIPY Fisher: 500/1000.
Dans des conditions d’illumination identiques, le VancoBODIPY Fisher a une dynamique de blanchiment 2 fois plus rapide. Il perd 95% de sa fluorescence en 52,5 s contre 115,8 s pour le VancomBod FL.
Exemple 4 : Spécificité du marquage – testin vitrosur culture bactérienne
Des bactéries Wild TypeS. aureus(Gram +) ATCC 29213 (souche de référence) et des bactéries Wild TypeE. Coli(Gram -) DH5α (souche de référence) sont cultivées sur gélose pendant 24h à 37°C. Une colonie isolée de chaque bactérie est incubée dans du milieu de culture nutritif sans antibiotiques pendant 18h à 37°C sous agitation. Puis, une solution bactérienne est préparée à environ 108UFC/mL (densité optique à 0,5 à 600nm). Les bactéries sont alors marquées 20 min à température ambiante soit avec l’analogue de la vancomycine à une concentration finale de 1 et 10µg/mL, soit avec le produit BODIPY™ FL Vancomycin commercialisé par la société ThermoFisher Scientific à une concentration finale de 1 et 10µg/mL. Après centrifugation 10min à 8000g, le surnageant est éliminé et le culot est repris dans 1mL de milieu de culture. Les bactéries sont observées en microscopie confocale (Olympus FV1200)
Tout comme le produit commercialisé par la société ThermoFisher Scientific, le VancomBod FL est spécifique des bactéries à Gram + avec un marquage au niveau de la paroi bactérienne (marquage en couronne) quelle que soit la concentration. Aucun marquage des bactériesE. Colin’est observé. La position du B sur le groupe acide carboxylique de la Vancomycine n’altère pas sa spécificité.
Exemple 5 : Tests ex-vivo sur cornées
Test 1
Des bactéries Wild TypeS. aureus(Gram +) ATCC 29213 (souche de référence) sont cultivées selon le protocole énoncé à l’exemple 4. Une cornée rebue de banque conservée en organoculture est sélectionnée. A l’aide d’une aiguille 30G ½’’, des rayures sont réalisées afin de générer des lésions de l’épithélium. La cornée est ensuite placée épithélium vers le bas sur un support plastique concave et la solution bactérienne est placée entre la cornée et le support. La cornée et le support sont ensuite placés en chambre humide à 37°C durant 2h. Puis, la cornée est coupée en deux. Une moitié est marquée avec le VancomBod FL à 1µg/mL + Hoechst 33342 (5µg/mL) + Ethidium (4µM) durant 20min à 37°C et l’autre moitié avec le produit BODIPY™ FL Vancomycin commercialisé par la société ThermoFisher Scientific à 1µg/mL + Hoechst 33342 (5µg/mL) + Ethidium (4µM) durant 20min à 37°C. Après rinçage, les morceaux sont observés en microscopie à épifluorescence (Olympus IX81) et en microscopie confocale (Olympus FV1200).
Le VancomBod FL permet d’imager les bactéries de façon intense aux forts grossissements (x400 ou x600) malgré la coloration non spécifique localisée dans le cytoplasme des cellules mortes (marquées à Ethidium) présentes surtout dans les lésions. Cette coloration non désirable est observable également avec le composé commercial. Elle peut dans la majorité des cas être éliminée par post-traitement. Dans le cas où elle est trop intense pour être éliminée par post-traitement, les bactéries marquées par VancomBod FL restent aisément visibles. Une atténuation de la coloration non spécifique par le Bleu Trypan est possible et a été testée (voir test 2).
Test 2 : ajout de Bleu Trypan
Le bleu Trypan est un colorant reconnu pour éteindre l’auto-fluorescence des tissus biologiques ou des cellules (composés essentiellement d’eau et d’hémoglobine) pouvant générer un important bruit de fond d’auto-fluorescence, masquant ainsi un réel signal de fluorescence (réf PMID : 21777584).
Le protocole de préparation des bactériesS. aureuset le protocole d’infection de la cornée reste le même que pour le test 1. Avant marquage de l’épithélium avec le composé VancoBod FL à 1µg/mL + Hoechst 33342 (5µg/mL) + Ethidium (4µM), la cornée infectée est coupée en deux. Une moitié est préalablement marquée au Bleu Trypan 0,4% pendant 2min. Après rinçage, les morceaux sont observés en microscopie à épifluorescence (Olympus IX81) et en microscopie confocale (Olympus FV1200).
Les images sans bleu Trypan montrent comme dans le test 1 une coloration non spécifique des cellules qui est parfois non éliminable par post-traitement. L’ajout du bleu Trypan avant le marquage au VancomBod FL permet d’éteindre la fluorescence dans ces cellules et de plus aisément visualiser les bactéries marquées.
Exemple 6 : Marquage d’un ulcère sur cornée humaine non infectée avec l’analogue décrit à l’exemple 2 et un composé Bodipy (AP343A)
Le Bodipy Composé du COMBO AP343A est représenté sur la figure 5.
Une cornée rebue de banque conservée en organoculture est sélectionnée. A l’aide d’une aiguille 30G ½’’, une lésion d’environ 1mm est réalisée. La cornée est alors placée sur une chambre artificielle Moria (Moria Surgical) puis imagée sans coloration préalable à l’aide d’une source d’excitation à 633nm et d’une caméra ultra-sensible EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) (Ixon Ultra 888 1024 x 1024px, ANDOR). Le temps d’exposition est défini à 300ms/image. Puis la cornée est marquée 20min à l’abri de la lumière avec le VancomBod rouge de l’exemple 2 à 1mg/mL. Aucune infection n’étant présente, aucun marquage n’est détecté avec l’EMCCD (même en faisant une succession de 10 images compilées). La même cornée est alors marquée 20min à l’abri de la lumière avec un Bodipy « rouge » (AP343A, abs : 591nm et em : 646nm dans H2O) à 500µg/mL puis de nouveau imagée.
Les images obtenues en absence de marquage, ou avec un marquage par l’analogue « rouge » de l’exemple 2 sont donc comparées aux images obtenues avec un marquage par un BODIPY « rouge » AP343A.
Les résultats montrent une absence de marquage des parois de l’ulcère avec l’analogue selon l’invention avec des images comparables à celles obtenues en l’absence de marquage, sans ou avec post-traitement d’image.
En revanche, les images obtenues avec le BODIPY AP343A montrent un marquage des parois de l’ulcère.
Cet exemple confirme bien la spécificité du produit qui ne signale pas de faux positifs en l’absence de bactéries Gram+.
REFERENCES
Kocaoglu & Carlson, 2016 ;
Gao & al., 2006
WO 2006/087459, WO 2010076516 et WO 2014/013205.
Claims (14)
- Analogue fluorescent de la vancomycine de formule B-L-CO-V dans laquelle
B est un fluorophore dérivé de BODIPY,
L est un bras de liaison, et
-CO-V est la vancomycine, la liaison du L-CO-V étant une liaison sur le résidu acide carboxylique de la vancomycine. - Analogue selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fluorophore B est un composé de formule I
(I)
dans laquelle
S1représente un groupe de formule -CΞC-L'-A, où L' est un groupement de liaison qui est une liaison simple (auquel cas S1est un groupe de formule -CΞC-A) ; ou un groupement hydrocarboné divalent choisi dans le groupe consistant en les alkylènes linéaires ou ramifiée, comprenant éventuellement un ou plusieurs atomes d’oxygène, azote ou soufre au sein de leur chaîne (comme les groupements poly(éthylène glycol), poly(éthoxy) ou poly(propoxy), par exemple) ; les alcénylènes linéaires ou ramifiés ; les alcynylènes linéaires ou ramifiés, et les arylènes ; ou une chaîne hydrocarbonée divalente constituée par un enchaînement d'au moins deux groupements hydrocarbonés divalents du type précité ; et A est un groupement fonctionnel polaire choisi parmi les groupes sulfonate, sulfate, phosphate, ammonium, carboxylate, hydroxyle, phosphonate, sulfate d'alkylammonium et polyoxyéthylène;
S2représente un groupe -CΞC-L'-A identique ou différent de S1, où L' et A ont les significations précitées; F; H; ou une chaîne hydrocarbonée, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs atomes d'oxygène, d'azote ou de soufre, éventuellement cyclisée en totalité ou en partie, éventuellement aromatique, et éventuellement fonctionnalisée, et
chacun des groupes R1, R2, R3, R4, R5, R6ou R7désigne, indépendamment des autres, H ou une chaîne hydrocarbonée, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs atomes d'oxygène, éventuellement cyclisée en totalité ou en partie, éventuellement aromatique et éventuellement fonctionnalisée, étant entendu que tout ou partie des groupes R1, R2, R3, R4, R5, R6et R7, peuvent être reliés entre eux pour former une forme pontée (à savoir qu'au moins deux des groupes R1, R2, R3, R4, R5, R6et R7peuvent former ensemble un cycle avec les carbones auxquels ils sont reliés). - Analogue selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que L est un dérivé bifonctionnel de formule
Z1-R8-Z2-.
Dans laquelle
R8est une chaîne hydrocarbonée divalente, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs atomes d'oxygène, éventuellement cyclisée en totalité ou en partie,
Z1est le groupe permettant la liaison avec le fluorophore B, particulièrement choisi parmi les groupes -CΞC-, -O-, -NH- et –S-, plus particulièrement -CΞC- et -NH-, et
Z2est le groupe permettant la liaison avec l’acide carboxylique de la vancomycine, en particulier choisi parmi les groupes -O-, -NH- et –S-, plus particulièrement -NH-. - Analogue selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que L est choisi parmi les groupes divalents suivants
-HN-(CH2-CH2)n-CH2-NH-
-HN-CH2-(O-CH2-CH2)n-O-CH2-NH-, et
-CΞC-(CH2-CH2)n-CH2-NH-
n étant un entier de 1 à 6, de préférence 1, 2 ou 3, plus préférentiellement 1. - Analogue selon l’une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la liaison B-L- se fait par R1de formule -Ar-CO-L- ou -Ar-L-, dans laquelle Ar est un radical divalent aromatique hydrocarboné, de 1 à 4 cycles fusionnés ou non, ayant notamment de 4 à 16 atomes de carbone de préférence de 4 à 10 atomes de carbone, et pouvant contenir dans leur cycle des atomes d'azote, de soufre ou d'oxygène (hétérocycles).
- Dérivé de BODIPY de formule B-L-H, B et L étant définis selon l’une des revendications 1 à 5.
- Dérivé de BODIPY selon la revendication 6 de formule II
(II)
dans laquelle L, S1, S2, R2, R3, R4, R5, R6et R7sont définis selon l’une des revendications 2 à 4. - Composition liquide caractérisée en ce qu’elle comprend un analogue fluorescent de la vancomycine selon l’une des revendications 1 à 5 et un véhicule approprié pour son utilisation.
- Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce qu’elle est sous une forme appropriée pour son application sur la peau et les muqueuses.
- Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce qu’elle est un collyre pour une application sur l’œil.
- Utilisation d’un analogue fluorescent de la vancomycine selon l’une des revendications 1 à 5 pour la détection de bactéries Gram+ dans un échantillon biologique.
- Utilisation selon la revendication 11, caractérisé en ce que les bactéries Gram+ sont des bactéries pathogènes du genreStaphylococcus.
- Méthode pour détecter la présence de bactéries Gram+ dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu’elle comprend l’ajout d’une quantité appropriée d’un analogue fluorescent de la vancomycine selon l’une des revendications 1 à 5 à l’échantillon biologique puis à observer la persistance d’une émission de fluorescence, marqueur de la présence de bactéries Gram+.
- Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que les bactéries Gram+ sont des bactéries pathogènes du genreStaphylococcus.
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Non-Patent Citations (2)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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