FR3155061A1 - Appareil et procédé de micro-spectrométrie Raman confocal avec système de mise au point - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un appareil de micro-spectrométrie Raman confocal (100) comprenant une source laser (1), un objectif de microscope (3) arrangé pour focaliser le faisceau laser d’excitation (10) en direction d’un échantillon (5) et un système de mise au point sur l’échantillon. Selon l’invention, le système de mise au point comprend un séparateur optique de faisceau (11), un détecteur d’image (13), un système optique astigmatique (12), un processeur comprenant un système de traitement d’image (15) et un dispositif de rétroaction (16), le séparateur optique de faisceau (11) étant adapté pour extraire une fraction (21) du faisceau réfléchi, le système optique astigmatique (12) étant adapté pour projeter la fraction (21) du faisceau réfléchi en un spot sur le détecteur d’image (13), et le système de traitement d’image (15) étant adapté pour calculer un signal d’erreur de focalisation à partir de l’image du spot. Figure pour l’abrégé : Figure 1

Description

Appareil et procédé de micro-spectrométrie Raman confocal avec système de mise au point Domaine technique de l'invention

La présente invention concerne le domaine technique des méthodes et appareils de micro-spectrométrie Raman.

Elle concerne plus précisément un système et une méthode de mise au point pour un appareil de micro-spectrométrie Raman confocal.

Etat de la technique

De manière connue, un appareil de spectrométrie Raman permet d’analyser la composition chimique d’échantillons de façon non invasive. Combiné à un microscope conventionnel, on obtient un appareil de micro-spectrométrie Raman offrant la possibilité d’examiner chimiquement des objets de taille submicronique en alliant résolution spatiale et spectrale. L’utilisation d’un diaphragme confocal disposé entre le microscope optique et l’entrée du spectromètre Raman permet de ne laisser passer que la lumière provenant du plan focal de l’objectif de microscope : on obtient ainsi un appareil de micro-spectrométrie Raman confocal.

Il existe de nombreux dispositifs et méthodes de mise au point (ou autofocus) utilisés dans les appareils de microscopie.

Les méthodes d’autofocus actives reposent sur un ou plusieurs dispositifs optiques auxiliaires pour évaluer la distance entre l’échantillon et le plan focal de l’objectif du microscope. Les méthodes d’autofocus actives les plus répandues sont basées sur l’utilisation d’un masque de phase ou d’une source de lumière polychromatique combinée à un système optique hyperchromatique ou encore sur l’utilisation d’une lentille liquide de focale variable.

Contrairement aux méthodes d’autofocus actives, les méthodes d’autofocus passives ne nécessitent pas de dispositif optique auxiliaire. Les méthodes d’autofocus passives reposent sur des algorithmes d’analyse d’images prises à différentes distances objectif-échantillon. Les méthodes DFF (Depth From Focus) et DFD (Depth From Defocus) sont les plus couramment utilisées. Différents algorithmes ont été proposés afin de modéliser la fonction de focus tels que le gradient de Sobel, le filtre passe bande, l’énergie de Laplacien ou la transformée en ondelettes. Les méthodes d’autofocus passives permettent d’obtenir une très grande précision. Cependant, compte tenu du grand nombre d’images nécessaires à différentes distances pour construire la fonction de focus, ces méthodes sont très consommatrices en énergie, en capacités de stockage et en temps de calcul ce qui limite leur application. De plus, ces méthodes sont lentes : la durée nécessaire pour déterminer et positionner l’échantillon au point d’autofocus est en général de plusieurs secondes.

De plus, ces méthodes nécessitent en général des adaptations selon le grossissement de l’objectif de microscope utilisé. Or, il est en général souhaitable d’analyser un échantillon à différentes échelles en changeant le grossissement de l’objectif, par exemple pour passer d’un objectif ayant un grossissement x5, à x10, x50 ou x100. Or, la distance de travail entre l’échantillon et l’objectif varie selon l’objectif utilisé. Lorsque la distance de travail est faible, le faisceau laser d’excitation et le faisceau Raman rétrodiffusé sont fortement divergents, ce qui rend les réglages encore plus complexes.

Pour un échantillon présentant une rugosité de surface, tel qu’une roche ou un médicament sous forme de comprimé, la mise au point doit être effectuée au plus près du point de mesure de micro-spectrométrie Raman et idéalement sur le point de mesure.

Un des buts de l’invention est de proposer un dispositif de mise au point intégrable sur un appareil de micro-spectrométrie Raman confocal, qui soit rapide, d’excellente précision pour la mise au point du microscope au point de la mesure Raman et qui ne perturbe pas la détection du signal Raman dont l’intensité est très faible.

Présentation de l'invention

Afin de remédier aux inconvénients précités de l’état de la technique, la présente invention propose un appareil de micro-spectrométrie Raman confocal comprenant une source laser apte à émettre un faisceau laser d’excitation, un porte-échantillon apte à recevoir un échantillon à analyser, un objectif de microscope ayant un axe optique arrangé pour recevoir et focaliser le faisceau laser d’excitation dans un plan focal en direction de l’échantillon, l’objectif de microscope étant adapté pour collecter un faisceau réfléchi par l’échantillon et transmettre le faisceau réfléchi à travers une ouverture confocale vers un spectromètre Raman, un système de déplacement adapté pour modifier une distance entre l’objectif de microscope et le porte-échantillon suivant l’axe optique et un système de mise au point sur l’échantillon.

Selon l’invention, le système de mise au point comprend un séparateur optique de faisceau disposé sur un trajet du faisceau réfléchi entre l’objectif de microscope et l’ouverture confocale, un détecteur d’image à matrice de pixels comprenant au moins NxM pixels, où N est un nombre entier supérieur à 2 et M est un nombre entier supérieur à 2, un système optique astigmatique disposé entre le séparateur optique de faisceau et le détecteur d’image et un processeur comprenant un système de traitement d’image et un dispositif de rétroaction, le séparateur optique de faisceau étant adapté pour extraire une fraction du faisceau réfléchi, le système optique astigmatique étant adapté pour projeter la fraction du faisceau réfléchi en un spot sur le détecteur d’image, le détecteur d’image étant configuré pour acquérir une image du spot et le système de traitement d’image étant adapté pour calculer un signal d’erreur de focalisation et le dispositif de rétroaction étant adapté pour déduire du signal d’erreur de focalisation une valeur et une direction du déplacement à appliquer au système de déplacement suivant l’axe optique pour mettre au point le faisceau laser d’excitation sur l’échantillon.

Un tel système de mise au point permet de déterminer rapidement et précisément la mise au point sur l’échantillon, en utilisant la même source d’excitation que la mesure de spectrométrie Raman.

D’autres caractéristiques non limitatives et avantageuses du conteneur conforme à l’invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes :

- le signal d’erreur est comparé à une courbe de calibration obtenue par balayage du déplacement à une série de distances suivant l’axe optique et par un calcul du signal d’erreur de focalisation pour chaque position de la série ;

- le système de traitement d’image est adapté pour déterminer une ellipse correspondant au spot dans l’image et le processeur est adapté pour en déduire une mesure du grand axe V1 de l’ellipse, du petit axe V2 de l’ellipse et dans lequel le signal d’erreur de focalisation est égal à 4/π.tan^-1(V1/V2) – 1 ;

- le système de traitement d’image est basé sur une analyse en composantes principales de l’image du spot ;

- le système de traitement d’image est basé sur une détection de contour dans l’image du spot ;

- le système de traitement d’image est configuré pour appliquer un filtrage à l’image du spot pour générer une image filtrée, déterminer un plus grand contour du spot sur l’image filtrée et déterminer l’ellipse à partir du plus grand contour ;

- le filtrage appliqué à l’image du spot pour générer une image filtrée est un filtrage Gaussien ou un filtrage par gradient morphologique ;

- le séparateur optique de faisceau comporte une lame à faces planes et parallèles, une lame à faces planes en forme de coin ou un cube séparateur ;

- l’appareil comprend un masque spatial disposé entre le séparateur optique de faisceau et le système optique astigmatique, le masque étant disposé et configuré pour obturer un faisceau de réflexion interne dans la lame ;

- le système optique astigmatique comporte une lentille cylindrique ou deux lentilles cylindriques ayant des axes optiques croisés, au moins un miroir sphérique concave ou convexe orienté avec un angle d'incidence non nul, au moins un miroir torique, au moins un miroir parabolique, au moins une lentille simple pivotée sur son axe optique, au moins une lentille décentrée par rapport à l'axe optique, une pluralité de lentilles cylindrique, une pluralité de lentilles sphériques et cylindriques, au moins une lentille de Powell, au moins un prisme, ou une matrice de microlentilles ;

- l’appareil comprend un dispositif à champ proche à sonde locale ayant une pointe, le dispositif à champ proche étant combiné au faisceau laser d’excitation focalisé sur la pointe, l’appareil étant configuré pour détecter une interaction locale entre l’échantillon, la pointe et le faisceau laser d’excitation.

L’invention concerne aussi un procédé de micro-spectrométrie Raman confocal comprenant les étapes suivantes :

- émission d’un faisceau laser d’excitation,

- focalisation du faisceau laser d’excitation dans un plan focal d’un objectif de microscope en direction d’un échantillon à analyser disposé sur un porte-échantillon,

- collection, via l’objectif de microscope, d’un faisceau réfléchi par l’échantillon et transmission du faisceau réfléchi à travers une ouverture confocale vers un spectromètre Raman,

- mise au point sur l’échantillon en utilisant un système de déplacement adapté pour modifier une distance entre l’objectif de microscope et le porte-échantillon, l’étape de mise au point comprenant les étapes suivantes :

- séparation du faisceau réfléchi au moyen d’un séparateur optique de faisceau disposé entre l’objectif de microscope et l’ouverture confocale, pour extraire une fraction du faisceau réfléchi et la diriger vers un système optique astigmatique disposé entre le séparateur optique de faisceau et un détecteur d’image à matrice de pixels, le détecteur d’image comprenant au moins NxM pixels, où N est un nombre entier supérieur à 2 et M est un nombre entier supérieur à 2,

- projection via le système optique astigmatique de la fraction du faisceau réfléchi en un spot sur le détecteur d’image,

- acquisition d’une image du spot sur le détecteur d’image

- traitement de l’image pour calculer un signal d’erreur de focalisation et détermination d’un signal d’erreur de focalisation comprenant une valeur et une direction d’un déplacement à appliquer au système de déplacement pour mettre au point le faisceau laser d’excitation sur l’échantillon.

Bien entendu, les différentes caractéristiques, variantes et formes de réalisation de l'invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres.

Description détaillée de l'invention

De plus, diverses autres caractéristiques de l'invention ressortent de la description annexée effectuée en référence aux dessins qui illustrent une forme, non limitative, de réalisation de l'invention et où :

FIG. 1est une vue schématique d’un appareil de micro-spectrométrie Raman confocal avec système de mise au point selon la présente divulgation;

FIG. 2est une vue en perspective de la formation de l’image d’une croix à travers une lentille astigmatique ;

FIG. 3est un exemple d’une image du spot du faisceau réfléchi sur le détecteur d’image combiné au système optique astigmatique ;

FIG. 4est une courbe théorique illustrant le signal d’erreur de focalisation (FES) en fonction de la défocalisation suivant l’axe optique ;

FIG. 5illustre une méthode d’analyse en composantes principales de l’image du spot, avec un exemple de détection de contour du spot (image A) et une vue agrandie du spot (image B) ;

FIG. 6illustre schématiquement différentes étapes d’une deuxième méthode d’analyse d’image du spot ;

FIG. 7; illustre un exemple d’application de la méthode de laFIG. 6sur une image de spot (image C), après le filtrage Gaussien (image D), après un tri par seuil adaptatif (image E), après détermination d’un plus grand contour (image F), d’approximation du plus grand contour par une ellipse (image G), de vérification par une boîte entourant le spot (image H) ;

FIG. 8est une courbe expérimentale de signal d’erreur de focalisation (FES) en fonction de l’erreur de focalisation suivant l’axe optique.

LaFIG. 1représente schématiquement un appareil de micro-spectrométrie Raman confocal 100. L’appareil de micro-spectrométrie Raman confocal 100 comprend une source laser 1, un objectif de microscope 3, un porte-échantillon 4 apte à recevoir un échantillon 5 à analyser, une ouverture confocale 7 et un spectromètre Raman 8. L’objectif de microscope 3 a un axe optique 6 disposé parallèlement à l’axe Z d’un repère orthonormé XYZ.

L’appareil 100 comporte un système de déplacement 9 disposé et configuré pour modifier une distance entre l’objectif de microscope 3 et le porte-échantillon 4 suivant l’axe optique 6. Par exemple, le système de déplacement 9 comprend une platine motorisée adaptée pour déplacer le porte-échantillon 4 suivant l’axe Z avec une résolution spatiale sub-micrométrique. Dans un exemple de réalisation, le porte-échantillon 4 est monté sur une platine de déplacement multi-axe, pour déplacer l’échantillon 5 suivant les axes X, Y et Z afin de permettre une mesure Raman de l’échantillon séquentiellement en plusieurs points.

Nous allons tout d’abord expliquer brièvement le fonctionnement du micro-spectromètre Raman confocal. La source laser 1 émet un faisceau laser d’excitation 10. L’objectif de microscope 3 focalise le faisceau laser d’excitation 10 dans un plan focal 24 en direction de l’échantillon 5. Par réflexion sur l’échantillon 5 en un point 18, on obtient un faisceau réfléchi se propageant en direction inverse du faisceau d’excitation 10. L’objectif de microscope 3 collecte le faisceau réfléchi 20 par l’échantillon. A titre d’exemple non limitatif, un filtre 2 permet de séparer le faisceau d’excitation 10 et le faisceau réfléchi 20 de façon à transmettre le faisceau réfléchi 20 à travers une ouverture confocale 7 vers le spectromètre Raman 8.

Selon un mode de réalisation particulier, l’appareil de micro-spectrométrie Raman comporte en outre un dispositif à champ proche à sonde locale ayant une pointe. En effet, la spectroscopie Raman exaltée de pointe (ou TERS) permet d’amplifier un signal Raman à l’aide d’une onde électromagnétique évanescente confinée à l’extrémité d’une pointe métallique (voir le document de brevet FR1653182). Le dispositif à champ proche est combiné au faisceau laser d’excitation focalisé sur la pointe, l’appareil étant configuré pour détecter une interaction locale entre l’échantillon, la pointe et le faisceau laser d’excitation. A titre d’exemple, un microscope STM-TERS (ou Scanning Tunneling Microscope) combine un microscope à effet tunnel à balayage et un spectromètre Raman exalté par pointe. Dans un autre exemple, un microscope AFM-Raman combine un microscope à forces atomiques (AFM) et un spectromètre Raman. Il existe différents types de pointes adaptées en fonction de chaque type de microscope à champ proche ou de chaque appareil de spectroscopie exaltée par pointe, et éventuellement en fonction de l’application.

L’appareil 100 comporte aussi un système de mise au point sur l’échantillon. Le système de mise au point comprend ici un séparateur optique de faisceau 11 disposé sur un trajet du faisceau réfléchi 20 entre l’objectif de microscope 3 et l’ouverture confocale 7, un détecteur d’image 13 à matrice de pixels, un système optique astigmatique 12 disposé entre le séparateur optique de faisceau 11 et le détecteur d’image 13 et un processeur comprenant un système de traitement d’image 15 et un dispositif de rétroaction 16. Le séparateur optique de faisceau 11 est intégré au corps du microscope. De préférence, le système optique astigmatique 12 et le détecteur d’image 13 sont reliés mécaniquement au corps du microscope par une monture opto-mécanique opaque à la lumière ambiante. Un module comprenant le système optique astigmatique 12 et le détecteur d’image 13 dans leur monture opto-mécanique peut ainsi être aisément installé sur un microscope Raman confocal existant. Le module comporte par exemple des liaisons filaires pour alimenter électriquement le détecteur d’image 13 et pour transmettre les images acquises par le détecteur d’image 13 au processeur pour le traitement d’image.

De façon plus détaillée, le séparateur optique de faisceau 11 comprend par exemple une lame disposée sur le trajet du faisceau réfléchi 20. La lame est inclinée, par exemple de 45 degrés, par rapport à l’axe optique du faisceau réfléchi 20. Le séparateur optique de faisceau 11 est disposé et configuré pour extraire une fraction 21 du faisceau réfléchi. Le séparateur optique de faisceau 11 comporte par exemple une lame. Dans un exemple de réalisation, la lame est à faces planes et parallèles. Toutefois, une telle lame est susceptible de générer des interférences parasites. De façon alternative, le séparateur optique de faisceau 11 comporte une lame prismatique à faces planes. Par exemple, l’angle entre les deux faces planes est compris entre 0.5 degrés et 10 degrés. En option, la lame comporte un traitement anti-reflet sur la face de la lame orientée vers la source laser et éventuellement sur les deux faces de la lame. Le traitement anti-reflet est adapté de façon à ce que la lame présente un coefficient de transmission élevé pour le faisceau réfléchi et un coefficient de réflexion faible pour extraire une petite fraction du faisceau réfléchi.

De façon avantageuse, le système de mise au point comporte un masque 17 spatial disposé entre le séparateur optique de faisceau 11 et le système optique astigmatique 12, le masque 17 étant disposé et configuré pour obturer un faisceau de réflexion interne dans la lame. En particulier, lorsque le séparateur optique de faisceau 11 comporte une lame à faces planes et parallèles ou prismatique, les réflexions internes du faisceau réfléchi à l’intérieur de la lame sont susceptibles de perturber l’image du spot en générant des interférences parasites. Le faisceau lumineux étant un faisceau laser monochromatique, les faisceaux issus de la lame par réfraction directe et par réflexion interne sont cohérents entre eux, d’où la formation d’interférence lorsque les deux faisceaux se superposent sur le détecteur d’image. De façon avantageuse, le masque 17 est configuré et disposé en sortie de la lame séparatrice 11, de façon à obturer une partie du faisceau ayant subi une réflexion interne dans la lame, tout en laissant passer le faisceau réfléchi uniquement sur la face la lame orientée vers l’objectif de microscope.

Le masque 17 permet de supprimer les interférences parasites dans l’image du spot sur le détecteur d’images 13. A titre d’exemple nullement limitatif, la lame 11 est une lame de verre ayant une épaisseur moyenne de 5mm avec des faces parallèles et sans traitement anti-reflet. La lame est inclinée de 45 degrés par rapport au faisceau réfléchi 20. La lame présente avantageusement un facteur de réflexion par exemple de 3% du faisceau réfléchi 20. De cette manière, le séparateur optique de faisceau 11 ne prélève qu’une petite fraction du faisceau réfléchi, tandis que la majeure partie du faisceau réfléchi est transmise à travers la lame pour être dirigée vers l’ouverture confocale 7 et le spectromètre Raman 8.

En variante, le séparateur optique de faisceau 11 comporte un cube séparateur.

Dans tous les exemples de réalisation, le séparateur optique de faisceau 11 extrait une fraction 21 du faisceau réfléchi pour la diriger vers le système optique astigmatique 12.

Le système optique astigmatique 12 comprend par exemple une lentille cylindrique. En variante, le système optique astigmatique 12 comprend deux lentilles cylindriques disposées en série sur le chemin optique et dont les axes optiques sont croisés, c’est-à-dire orientés perpendiculairement entre eux et perpendiculaires à l’axe optique de la fraction 21 du faisceau réfléchi. De façon alternative ou complémentaire, le système optique astigmatique 12 comprend au moins un miroir sphérique concave ou convexe orienté avec un angle d'incidence non nul, au moins un miroir torique, au moins un miroir parabolique, au moins une lentille simple pivotée sur son axe optique, au moins une lentille décentrée par rapport à l'axe optique, une pluralité de lentilles cylindrique, une pluralité de lentilles sphériques et cylindriques, au moins une lentille de powell, au moins un prisme ou encore une matrice de microlentilles. De façon avantageuse, le système optique astigmatique 12 est placé à une distance optique d’environ 20 cm de l’objectif de microscope. Dans un exemple, on utilise deux lentilles cylindriques plan-convexes disposées en série, ayant une longueur focale de 50 mm, placées à une distance de 20cm de l’objectif de microscope.

Le système optique astigmatique 12 est disposé à une distance fixe du détecteur d’image 13. Le système optique astigmatique 12 est configuré pour projeter la fraction 21 du faisceau réfléchi en un spot sur le détecteur d’image 13. Le détecteur d’image 13 est à matrice de pixels et comprend au moins NxM pixels, où N est un nombre entier supérieur à 2 et M est un nombre entier supérieur à 2. Par exemple, le détecteur d’image 13 est une caméra comprenant 3088*2064 pixels Le détecteur d’image 13 comprend par exemple une caméra vidéo Basler placée à 45 mm du système optique astigmatique. Le détecteur d’image comprend par exemple une caméra de type CCD permet l’acquisition d’image à une fréquence de 50 Hz, c’est-à-dire une image toutes les 20 ms.

LaFIG. 2illustre schématiquement le fonctionnement du système optique astigmatique 12. On suppose, pour l’explication de laFIG. 2, que l’échantillon comporte une croix au point 18 éclairé par le faisceau d’excitation 10. L’objectif de microscope 3 n’est ici pas représenté. Le système optique astigmatique présente une puissance optique différente selon un axe tangentiel et selon un axe sagittal. Le système optique astigmatique forme l’image du point 18. L’image d’une branche de la croix est nette dans un plan sagittal S tandis que l’image de l’autre branche de la croix est nette dans un plan tangentiel T. Le plan sagittal et le plan tangentiel sont à une distance D l’un de l’autre suivant l’axe optique longitudinal du faisceau. Par conséquent, lorsque le détecteur d’image 13 est dans le plan tangentiel T, l’image de la croix est nette, par exemple sur la branche horizontale et floue sur la branche verticale de la croix. Au contraire, lorsque le détecteur d’image 13 est dans le plan sagittal S, l’image de la croix est nette sur la branche verticale et floue sur la branche horizontale de la croix. Lorsque le détecteur d’image 13 est à mi-distance entre plan tangentiel T et le plan sagittal S, l’image de la croix présente la même netteté sur les deux branches.

Comme indiqué plus haut, le détecteur d’image 13 est disposé à une distance fixe du système optique astigmatique 12. Par exemple, le détecteur d’image 13 à matrice de pixels est disposé à mi-distance du plan sagittal S et du plan tangentiel T qui sont conjugués optiquement avec le plan de focalisation 24 de l’objectif de microscope. Avantageusement, les lignes de pixels du détecteur d’image sont parallèles à l’axe sagittal et les colonnes de pixels sont parallèles à l’axe tangentiel du système optique astigmatique 12. On éclaire l’échantillon avec le faisceau d’excitation 10 via l’objectif de microscope 3, de façon à former un faisceau réfléchi 20 provenant d’un point 18 circulaire. Le détecteur d’image 13 est configuré pour acquérir une image 14 du spot formé par la fraction 21 du faisceau réfléchi à travers le système optique astigmatique 12. Lorsque le point 18 de l’échantillon est situé dans le plan focal 24 de l’objectif de microscope 3, l’image 14 du spot sur le détecteur d’image 13 est circulaire. Au contraire, lorsque le point 18 de l’échantillon est décalé d’une distance Z par rapport au plan focal 24 de l’objectif de microscope 3, l’image 14 du spot sur détecteur d’image 13 est de forme généralement elliptique. La distance Z est aussi appelée erreur de focalisation. L’orientation de l’ellipse varie selon le signe de l’erreur de focalisation par rapport au plan focal 24.

Contrairement à la plupart des systèmes d’autofocus, on utilise ici la même source laser 1 pour la mesure Raman confocale et pour la mise au point. Cette configuration présente plusieurs avantages. Premièrement, cette configuration permet de faire la mise au point exactement au point de mesure de microspectrométrie Raman confocale. L'utilisation de la même source laser évite aussi toute perturbation du signal Raman par une autre source de lumière, contrairement à d’autres systèmes d’autofocus. De plus, la mise au point peut être effectuée pendant la mesure ou juste avant la mesure, avec une durée très réduite pour la mise au point. Cette solution ne nécessite pas de pré-scan contrairement à des systèmes antérieurs d’autofocus. De plus, la détermination du signe de l’erreur de focalisation permet de déterminer le sens et la valeur de la rétroaction à appliquer, ce qui permet une mise au point plus rapide, par comparaison avec d’autres techniques antérieures.

LaFIG. 3représente un exemple d’image 14 du spot acquise par le détecteur d’image 13. La fraction 21 du faisceau réfléchi qui est projeté sur le détecteur d’image 13 forme ici un nuage 19 de points lumineux représentés ici par des points gris sur fond clair.

L’image 14 est transmise au système de traitement d’image 15 d’un processeur.

Selon la présente divulgation, l’analyse de l’image 14 du spot permet de calculer les paramètres d’une ellipse approchant la forme du spot dans l’image détectée et d’en déduire un signal d’erreur de focalisation, noté FES. On note V1 le grand axe de l’ellipse, V2 le petit axe de l’ellipse et ALPHA l’angle entre le grand axe de l’ellipse et un axe X des pixels du détecteur d’image 13.

Le signal d’erreur de focalisation dépend du rapport V1/V2 selon la formule suivante : FES = 4/π.tan^-1(V1/V2) – 1. Le signal d’erreur de focalisation est compris entre la valeur -1 et la valeur +1. Pour un système optique astigmatique parfait et un échantillon réfléchissant non diffusant, l’image du point 18 est circulaire lorsque le microscope est au point de meilleure focalisation, qui correspond à une valeur de FES égale à 0.

LaFIG. 4illustre une courbe 23 théorique du signal d’erreur de focalisation FES en fonction de la distance du point 18 de l’échantillon par rapport au plan focal 24 de l’objectif de microscope 3. Le signal d’erreur de focalisation FES se situe au point A, respectivement au point B, de la courbe 23 lorsque le point 18 éclairé sur l’échantillon est dans un plan conjugué optiquement avec le plan sagittal, respectivement le plan tangentiel, du système optique astigmatique 12. Entre les points A et B, il est possible de déterminer la position de l’échantillon par rapport au point de meilleure focalisation (FES = 0) à partir du signal d’erreur de focalisation, en inversant la courbe 23. Il est ainsi possible de calculer la valeur et la direction du déplacement à appliquer au système de déplacement 9 suivant l’axe optique 6 pour mettre au point le faisceau laser d’excitation 10 sur l’échantillon. De façon particulièrement avantageuse, la zone de focalisation de longueur L qui s’étend entre les points C1 et C2 correspond au déplacement axial pour lequel les variations de FES sont linéaires. L est calculée pour un grossissement donné. La courbe 23 peut être obtenue pour un échantillon qui présente une surface réfléchissante, comme par exemple une plaque de silicium polie, une plaque de métal poli, une plaque de verre.

Pour le système optique astigmatique 12 constitué d’une première lentille cylindrique de longueur focale 50 mm et d’une deuxième lentille cylindrique de longueur focale de 50 mm, placé à la distance optique de 20 cm de l’objectif de microscope x100, la zone de travail, notée Δz, suivant l’axe Z entre le point A et le point B sur la courbe 23 est d’environ 8 µm. A la position de meilleure focalisation (« best focus » en anglais), un logiciel de calcul optique, tel que Zemax, permet d’évaluer le diamètre du spot laser au point de meilleure focalisation (FES=0).

Toutefois, le même principe peut être utilisé avec différents objectifs, la plage de déplacement étant adaptée en fonction du grossissement de l’objectif de microscope. Ainsi, avec un objectif de microscope x50, la zone de travail Δz suivant l’axe Z est d’environ 39 µm. Avec un objectif de microscope x10, la zone de travail Δz suivant l’axe Z est d’environ 1000 µm. Enfin, avec un objectif de microscope x5, la zone de travail Δz suivant l’axe Z est d’environ 3700 µm.

A partir des paramètres de l’ellipse, le processeur permet de calculer le signal d’erreur de focalisation FES. Le signal d’erreur de focalisation est préalablement calibré pour obtenir une courbe 23 qui dépend, d’une part, de l’objectif de microscope et du système optique astigmatique, et, d’autre part, de l’échantillon considéré, en particulier de sa rugosité de surface. A partir du calcul du signal d’erreur de focalisation FES et de la courbe 23 de calibration, le processeur calcule un signal de rétroaction à appliquer au système de déplacement 9 de façon à modifier la distance entre l’objectif de microscope 3 et le porte-échantillon 4 suivant l’axe optique 6, pour placer l’échantillon au point de meilleure focalisation (FES = 0). La mise au point du faisceau laser d’excitation peut ainsi être réalisée en un seul déplacement. La mesure Raman est ensuite effectuée immédiatement au point 18 qui correspond à la meilleure focalisation (FES = 0), sans changement de système optique et sans changement de source lumineuse (et sans déplacement de la table XY). La mise au point est ainsi très rapide : elle peut être effectuée en moins d’une seconde, par exemple en 200 ms ou 300 ms.

Nous allons maintenant décrire différentes méthodes de traitement d’image permettant de déterminer les paramètres de l’ellipse.

Dans un premier mode de réalisation, on utilise une analyse en composantes principales (ou PCA pour « Principal Component Analysis » en anglais). L’analyse PCA est une méthode qui mesure comment chaque variable (ici un pixel) est associée aux autres variables (ici, les autres pixels de l’image) à l'aide d'une matrice de covariance, qui comprend les directions de propagation des données à l'aide de vecteurs propres. Les valeurs propres sont des coefficients appliqués aux vecteurs propres qui donnent aux vecteurs leur longueur. L’analyse en composantes principales est ici adaptée pour déterminer les paramètres de l’ellipse de l’image 14 du spot acquise par le détecteur d’image 13.

Plus précisément, on utilise un seuil adaptatif basé sur l’algorithme OTSU pour éliminer les pixels qui ne sont pas assez lumineux dans l’image 14. On obtient une liste des pixels de coordonnées (X,Y) qui ont une intensité supérieure ou égale au seuil, correspondants au pixels du spot lumineux. Les paramètres (X, Y) sont ici les coordonnées dans des pixels du détecteur d’image 13.

Les composantes principales sont les vecteurs propres de la matrice de covariance des données. La matrice de covariance est une matrice carrée donnant la covariance entre X et Y après application du seuil adaptatif.

Soit A une transformation linéaire représentée par une matrice A. S'il existe un vecteur tel que A X = λ X alors λ est appelé la valeur propre de A avec le vecteur propre X correspondant (droit).

Nous calculons les vecteurs propres et les trions par valeurs propres.

Les deux valeurs propres ainsi déterminées sont :

• V1 la plus grande valeur propre, correspondant au grand axe de l’ellipse, et

• V2 la plus petite valeur propre, correspondant au petit axe de l’ellipse.

On calcule alors l’angle ALPHA du grand axe de l’ellipse par rapport à l’horizontale (sur le détecteur d’image 13):

ALPHA = 90 – rad2deg( arctan( V1/V2 ) )

Où rad2deg représente la conversion de l’angle en radians vers les degrés.

On note A la matrice de covariance des pixels (liste X,Y sélectionnés précédemment).

Le ratio V1/V2 obtenu est le ratio du grand axe sur le petit axe de l’ellipse.

Si l’angle ALPHA est inférieur à 90 degrés, les valeurs de V1 et V2 sont inchangées. Si l’angle ALPHA est supérieur à 90 degrés, alors les valeurs de V1 et V2 sont interchangées.

LaFIG. 5illustre un exemple de traitement de l’image 14 d’un spot par la méthode PCA. L’image 5A) montre une boite rectangulaire à l’intérieur de laquelle est inscrit le spot et une ellipse de grand axe V1, de petit axe V2 et d’angle ALPHA déterminée par l’algorithme PCA. La boîte rectangulaire entoure l’ellipse. Sur l’image 5B) de laFIG. 5, on a représenté en zoom la zone de l’image du spot acquise par le détecteur d’image, avec l’intensité des pixels acquis correspondant à la boîte dans laquelle est inscrit le spot. Autrement dit, l’image 5B correspond à l’image brute rognée pour enlever les zones dans lesquelles tous les pixels ont une intensité inférieure au seuil. Tous les pixels les plus lumineux, c’est-à-dire d’intensité supérieure ou égale au seuil, sont situés à l’intérieur de la boîte. Sur l’image 5A), la visualisation de cette boîte rectangulaire et de l’ellipse déterminée par PCA superposée à cette boîte permettent de valider visuellement le calcul des paramètres de l’ellipse.

L’analyse en composantes principales (PCA) permet d’obtenir de bons résultats notamment pour des échantillons qui présentent une surface réfléchissante, comme par exemple une plaque de silicium polie, une plaque de métal poli, une plaque de verre.

Dans un deuxième mode de réalisation, on utilise un autre algorithme de traitement d’image. LaFIG. 6représente schématiquement différentes étapes de la méthode selon le deuxième mode de réalisation. La méthode comporte une première étape 30 d’acquisition d’une image 14 du spot par le détecteur d’image 13. Cette première étape est identique dans tous les modes de réalisation.

On applique ensuite à l’image 14 du spot, une étape 40 de filtrage, par exemple un filtrage Gaussien de façon à obtenir une image filtrée. Ce filtrage permet d’uniformiser les parties d’une image en les floutant et donc en harmonisant les détails de celle-ci.

En option, l’étape de filtrage 40 comporte une étape 45 de tri par seuil adaptatif. L’étape 45 comprend par exemple la construction d’un histogramme de l’intensité des pixels de l’image filtrée, par exemple sur une échelle s’étendant de 0 à 255. L’histogramme présente généralement deux pics : un premier pic correspond aux pixels les plus sombres et un second pic correspond aux pixels les plus lumineux (c’est-à-dire le spot). Ensuite, on conserve uniquement le 2^ndpic en mettant au maximum 255 l’intensité des pixels du 2^ndpic et à 0 l’intensité de tous les autres pixels. On obtient ainsi une image filtrée par tri adaptatif.

A l’étape 50, on applique ensuite à l’image filtrée ou, respectivement, à l’image filtrée par tri adaptatif, une étape de traitement d’image pour déterminer un plus grand contour du spot. A cet effet, on calcule tous les contours possibles en utilisant par exemple la fonction FindContours de la bibliothèque OpenCV, on trie les contours ainsi obtenus en fonction de leur surface et on garde le contour le plus grand en fonction de la surface.

A l’étape 60, on détermine une ellipse approchant le plus grand contour en utilisant la fonction fitEllipse de la bibliothèque OpenCV. Cet algorithme est décrit dans la publication Andrew W. Fitzgibbon, R.B.Fisher. A Buyer’s, Guide to Conic Fitting, Proc.5th British Machine Vision Conference, Birmingham, pp. 513-522, 1995. On déduit les paramètres ALPHA, V1 et V2 de cette ellipse.

A l’étape 70, on calcule le ratio V1/V2 et on en déduit le signal d’erreur de focalisation FES.

En option, on valide le calcul les paramètres V1 et V2 de l’ellipse par la méthode de la boîte qui entoure le spot de manière à prendre en compte tous les pixels du spot (décrit en lien avec le premier mode de réalisation).

A l’étape 75, le processeur calcule un signal de rétroaction à appliquer au système de déplacement 9.

A l’étape 80, le système de déplacement modifie la distance entre l’objectif de microscope 3 et le porte-échantillon 4 suivant l’axe optique 6, pour placer l’échantillon au point de meilleure focalisation (FES = 0).

A l’étape 90, l’échantillon est au point de meilleure focalisation (FES = 0) et on acquiert une mesure de spectrométrie Raman au point de focalisation.

Le cas échéant, à l’étape 95, le système de déplacement modifie la position en (X, Y) du faisceau laser d’excitation sur l’échantillon. Le procédé de mise au point est répété au nouveau point de mesure.

LaFIG. 7montre un exemple des principales étapes du traitement d’une image de spot selon le deuxième mode de réalisation. L’image 7 A) montre une image 14 de spot acquise par le détecteur d’image 13. L’image 7 B) montre l’image filtrée obtenue après application d’un filtrage gaussien (étape 40) à l’image 6 A). L’image 7 C) montre l’image obtenue après tri adaptatif (étape 45) appliqué à l’image filtrée 7 B). L’image 7D) montre le plus grand contour obtenu après l’étape 50 de calcul du plus grand contour à l’image filtrée (et éventuellement triée par tri adaptatif). L’image 7 E) montre une ellipse déterminée à l’étape 60 pour approcher le plus grand contour. L’image 7 F) compare l’ellipse ainsi obtenue avec la boîte rectangulaire entourant le spot.

Le procédé de traitement d’image selon le deuxième mode de réalisation donne de meilleurs résultats que le premier mode de réalisation sur des échantillons réfléchissants. Toutefois, les contours peuvent être difficiles à déterminer aux extrémités de la plage de fonctionnement (points A et B sur la courbe 23 de laFIG. 4).

Selon une variante du deuxième mode de réalisation, l’étape 45 de tri par seuil adaptatif est remplacée par une étape 46 de gradient morphologique. Un gradient morphologique est la différence entre une dilatation et une érosion.

La dilatation consiste à convoluer une image A avec un noyau (B), qui peut avoir n'importe quelle forme ou taille, généralement un carré. Le noyau B a un point d'ancrage défini, généralement le centre du noyau.

Lorsque le noyau B est balayé sur l'image non filtrée, nous calculons la valeur de pixel maximale recouverte par le noyau B et remplaçons le pixel d'image à la position du point d'ancrage par cette valeur maximale. L’opération de dilatation a pour effet de provoquer la croissance des régions lumineuses d'une image.

L'opération d’érosion est l’inverse de la dilatation. L'opération d’érosion repose sur le calcul d’un minimum local sur la surface d'un noyau donné.

Lorsque le noyau B est balayé sur l'image dilatée, nous calculons la valeur de pixel minimale recouverte par B et remplaçons le pixel d'image sous le point d'ancrage par cette valeur minimale. On obtient une image dite de gradient morphologique en calculant la différence entre les valeurs de pixels de l’image dilatée et les valeurs de pixels de l’image érodée .

Les étapes suivantes sont analogues.

Cette variante du deuxième mode de réalisation donne de très bons résultats, notamment sur des échantillons réfléchissants mais aussi sur des échantillons rugueux ou diffusants, tels que les tablettes pharmaceutiques, les roches.

Le traitement selon la présente divulgation permet d’obtenir une mise au point avec une excellente précision, inférieure à la profondeur du champ de l'objectif. LaFIG. 8représente une courbe expérimentale de signal d’erreur de focalisation (FES) en fonction de l’erreur de focalisation suivant l’axe optique en utilisant un objectif x100. Par exemple avec l’objectif x100, ayant une profondeur de champ de 190 nm, on obtient une précision de la mise au point suivant l’axe Z de l’ordre de 40 nm. De plus, la mise au point est très rapide. On obtient le résultat du calcul de signal d’erreur de focalisation avec une valeur et une direction du déplacement à appliquer au système de déplacement en une seule étape. Selon le type de système de déplacement utilisé, la valeur du déplacement à effectuer et la vitesse de déplacement accessible, il est possible d’effectuer la mise au point en moins d’une seconde, par exemple en 200ms à 500 ms . Le système et procédé de mise au point de la présente divulgation sont à la fois très précis et très rapides. Le système et procédé de mise au point donnent de bons résultats y compris pour les forts grossissements d’objectif de microscope (par exemple x50 ou x100) dans lesquels le faisceau réfléchi est pourtant fortement divergent.

Claims (12)

1. Appareil de micro-spectrométrie Raman confocal (100) comprenant une source laser (1) apte à émettre un faisceau laser d’excitation (10), un porte-échantillon (4) apte à recevoir un échantillon (5) à analyser, un objectif de microscope (3) ayant un axe optique (6) arrangé pour recevoir et focaliser le faisceau laser d’excitation (10) dans un plan focal (24) en direction de l’échantillon (5), l’objectif de microscope (3) étant adapté pour collecter un faisceau réfléchi (20) par l’échantillon et transmettre le faisceau réfléchi à travers une ouverture confocale (7) vers un spectromètre Raman (8), un système de déplacement (9) adapté pour modifier une distance entre l’objectif de microscope (3) et le porte-échantillon (4) suivant l’axe optique (6) et un système de mise au point sur l’échantillon,
   caractérisé en ce que :
   le système de mise au point comprend un séparateur optique de faisceau (11) disposé sur un trajet du faisceau réfléchi (20) entre l’objectif de microscope (3) et l’ouverture confocale (7), un détecteur d’image (13) à matrice de pixels comprenant au moins NxM pixels, où N est un nombre entier supérieur à 2 et M est un nombre entier supérieur à 2, un système optique astigmatique (12) disposé entre le séparateur optique de faisceau (11) et le détecteur d’image (13) et un processeur comprenant un système de traitement d’image (15) et un dispositif de rétroaction (16), le séparateur optique de faisceau (11) étant adapté pour extraire une fraction (21) du faisceau réfléchi, le système optique astigmatique (12) étant adapté pour projeter la fraction (21) du faisceau réfléchi en un spot sur le détecteur d’image (13), le détecteur d’image (13) étant configuré pour acquérir une image (14) du spot et le système de traitement d’image (15) étant adapté pour calculer un signal d’erreur de focalisation et le dispositif de rétroaction (16) étant adapté pour déduire du signal d’erreur de focalisation une valeur et une direction du déplacement à appliquer au système de déplacement (9) suivant l’axe optique (6) pour mettre au point le faisceau laser d’excitation (10) sur l’échantillon (5).
2. Appareil selon la revendication 1, dans lequel le signal d’erreur est comparé à une courbe de calibration (23) obtenue par balayage du déplacement à une série de distances suivant l’axe optique et par un calcul du signal d’erreur de focalisation pour chaque position de la série.
3. Appareil selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le système de traitement d’image (15) est adapté pour déterminer une ellipse correspondant au spot dans l’image (14) et le processeur est adapté pour en déduire une mesure du grand axe V1 de l’ellipse, du petit axe V2 de l’ellipse et dans lequel le signal d’erreur de focalisation est égal à 4/π.tan^-1(V1/V2) – 1.
4. Appareil selon la revendication 3, dans lequel le système de traitement d’image (15) est basé sur une analyse en composantes principales de l’image (14) du spot.
5. Appareil selon la revendication 3, dans lequel le système de traitement d’image (15) est basé sur une détection de contour dans l’image (14) du spot.
6. Appareil selon la revendication 3, dans lequel le système de traitement d’image (15) est configuré pour appliquer un filtrage (40) à l’image (14) du spot pour générer une image filtrée, déterminer un plus grand contour (50) du spot sur l’image filtrée et déterminer l’ellipse (60) à partir du plus grand contour.
7. Appareil selon la revendication 6, dans lequel le filtrage (40) appliqué à l’image du spot pour générer une image filtrée est un filtrage Gaussien ou un filtrage par gradient morphologique.
8. Appareil selon l’une des revendications 1 à 7, dans lequel le séparateur optique de faisceau (11) comporte une lame à faces planes et parallèles, une lame à faces planes en forme de coin ou un cube séparateur.
9. Appareil selon la revendication 8 comprenant un masque spatial (17) disposé entre le séparateur optique de faisceau (11) et le système optique astigmatique (12), le masque étant disposé et configuré pour obturer un faisceau de réflexion interne dans la lame.
10. Appareil selon l’une des revendications 1 à 9, dans lequel le système optique astigmatique (12) comporte une lentille cylindrique ou deux lentilles cylindriques ayant des axes optiques croisés, au moins un miroir sphérique concave ou convexe orienté avec un angle d'incidence non nul, au moins un miroir torique, au moins un miroir parabolique, au moins une lentille simple pivotée sur son axe optique, au moins une lentille décentrée par rapport à l'axe optique, une pluralité de lentilles cylindrique, une pluralité de lentilles sphériques et cylindriques, au moins une lentille de powell, au moins un prisme, ou une matrice de microlentilles.
11. Appareil selon l’une des revendications 1 à 10, comprenant un dispositif à champ proche à sonde locale ayant une pointe, le dispositif à champ proche étant combiné au faisceau laser d’excitation focalisé sur la pointe, l’appareil étant configuré pour détecter une interaction locale entre l’échantillon, la pointe et le faisceau laser d’excitation.
12. Procédé de micro-spectrométrie Raman confocal (100) comprenant les étapes suivantes :
    - émission d’un faisceau laser d’excitation (10),
    - focalisation du faisceau laser d’excitation (10) dans un plan focal (24) d’un objectif de microscope (3) en direction d’un échantillon (5) à analyser disposé sur un porte-échantillon (4),
    - collection, via l’objectif de microscope (3), d’un faisceau réfléchi (20) par l’échantillon et transmission du faisceau réfléchi à travers une ouverture confocale (7) vers un spectromètre Raman (8),
    - mise au point sur l’échantillon en utilisant un système de déplacement (9) adapté pour modifier une distance entre l’objectif de microscope (3) et le porte-échantillon (4), l’étape de mise au point comprenant les étapes suivantes :
    - séparation du faisceau réfléchi au moyen d’un séparateur optique de faisceau (11) disposé entre l’objectif de microscope (3) et l’ouverture confocale, pour extraire une fraction (21) du faisceau réfléchi et la diriger vers un système optique astigmatique (12) disposé entre le séparateur optique de faisceau (11) et un détecteur d’image (13) à matrice de pixels, le détecteur d’image (13) comprenant au moins NxM pixels, où N est un nombre entier supérieur à 2 et M est un nombre entier supérieur à 2,
    - projection via le système optique astigmatique (12) de la fraction (21) du faisceau réfléchi en un spot sur le détecteur d’image (13),
    - acquisition d’une image (14) du spot sur le détecteur d’image (13)
    - traitement de l’image (14) pour calculer un signal d’erreur de focalisation et détermination d’un signal d’erreur de focalisation comprenant une valeur et une direction d’un déplacement à appliquer au système de déplacement (9) pour mettre au point le faisceau laser d’excitation (10) sur l’échantillon (5).