FR3148595A1

FR3148595A1 - Utilisation d’un extrait de microalgues pour inhiber les processus de nitrification, nitrification-dénitrification et/ou de dénitrification des nitrates dans un sol

Info

Publication number: FR3148595A1
Application number: FR2304740A
Authority: FR
Inventors: Rozenn TREPOS; Arkoun MUSTAPHA; Catherine HENAULT
Original assignee: DIJON BOURGOGNE, University of; UNIVERSITE DIJON BOURGOGNE; Agro Innovation International SAS; Institut National Superieur des Sciences Agronomiques de lAlimentation et de lEnvironnement; Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Current assignee: DIJON BOURGOGNE, University of; UNIVERSITE DIJON BOURGOGNE; Agro Innovation International SAS; Institut National Superieur des Sciences Agronomiques de lAlimentation et de lEnvironnement; Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Priority date: 2023-05-12
Filing date: 2023-05-12
Publication date: 2024-11-15
Anticipated expiration: 2043-05-12
Also published as: FR3148595B1; WO2024236247A1

Abstract

Utilisation d’extraits de microalgue pour inhiber la nitrification ou la dénitrification dans un sol La présente invention trouve application dans le domaine agricole et porte que l’utilisation d’extraits de microalgue pour contrôler la nitrification dans les sols et réduire les pertes d’azote gazeux sous forme de N2O. L’invention concerne également un produit à usage agricole comprenant un extrait de microalgue et un procédé de fertilisation d’un sol. Figure pour l’abrégé : Fig. 1.

Description

Utilisation d’un extrait de microalgues pour inhiber les processus de nitrification, nitrification-dénitrification et/ou de dénitrification des nitrates dans un sol

L’invention concerne l’utilisation d’extraits de microalgues pour inhiber le processus de nitrification et/ou le processus de nitrification-dénitrification dans les sols ainsi que le processus de dénitrification des nitrates. Ces extraits ont la propriété de contrôler le fonctionnement des bactéries nitrifiantes et/ou des bactéries nitrifiantes-dénitrifiantes qui sont responsables de la transformation de l’azote ammoniacal (NH₄ ⁺) en azote nitrique (NO₃ ^-) avec libération de protoxyde d’azote (N₂O) au cours de ce processus. Ces extraits ont aussi la propriété d’inhiber le fonctionnement de l’enzyme nitrate-réductase.

L’invention permet de développer un nouvel additif permettant de contrôler à la fois la fourniture en azote du sol et l’apport des fertilisants vers la plante, mais aussi de limiter les émissions du gaz à effet de serre N₂O.

La fertilisation azotée joue un rôle essentiel pour la croissance et le rendement des cultures. L’azote est le constituant caractéristique des acides aminés et des protéines, c’est donc un facteur de croissance et de qualité très important. Comme il est soumis à un cycle naturel dans l'air, le sol et l'eau, il subit différentes transformations chimiques et biologiques, c’est le cycle de l'azote.

Le cycle global de l’azote décrit les transformations de l’azote gazeux, minéral et des composés organiques riches en azote présents sur terre. C’est un ensemble de processus impliquant les microorganismes du sol. Cela inclut la fixation biologique de l’azote, l’assimilation, l’ammonification, la nitrification et la dénitrification.

Parmi l’ensemble de ces processus, la nitrification correspond à l’oxydation de l’ammonium (NH₄ ⁺) en nitrate (NO₃ ^-), elle passe par plusieurs étapes. Tout d’abord les bactéries et archées du groupe Nitrosomas, AOB (Ammonia-Oxidising Bacteria) et AOA (Ammonia-Oxidising archaea) permettent d’oxyder l’ammonium en hydroxylamine (NH₂OH) puis en nitrite (NO₂ ^-). Enfin ce sont les Nitrite-Oxidising Bacteria (NOB),NitrobacteretNitrospira, qui permettent d’oxyder les nitrites en nitrate. Afin de transformer l’ammonium en nitrites, quatre protons sont relâchés ainsi que deux molécules d’eau, ce phénomène provoque une acidification du milieu, notamment autour des racines. L’activité des bactéries, AOB et AOA dépend fortement de l’environnement, si bien que l’humidité, le pH, la température et la disponibilité de l’ammonium ont une grande influence sur le processus. Enfin, des émissions de protoxyde d’azote (N₂O) provoquées par la nitrification peuvent être observées lors de l’oxydation de l’ammonium en nitrite.

La nitrification est une étape biologique importante dans le cycle de l’azote dans le sol. Du point de vue agronomique, son fonctionnement est considéré comme une étape limitante de la fourniture en azote par les sols. Trop lente ou trop rapide par rapport aux besoins des plantes, elle peut être à l’origine d’une faible efficience d’utilisation de l’azote et peut contribuer à la pollution des eaux souterraines et des émissions de gaz à effet de serre (N₂O). Le taux de nitrification peut varier selon la nature du sol. Parmi les facteurs régulant le processus de nitrification il y a le pH du sol, la température, l’humidité, l’engrais azoté apporté au sol, les microorganismes et la nature physique du sol.

Une nitrification mal synchronisée avec l’assimilation d’azote par les plantes entraine une perte de l'azote appliqué au sol via le lessivage des nitrates et l'émission d'oxyde nitreux (N₂O). Ces pertes peuvent concerner un cinquième de l’azote appliqué. Cela entraîne une augmentation du coût de la production agricole, une pollution de l'environnement (eaux superficielles et eaux profondes), des maladies humaines et animales, une dégradation de la couche d’ozone et des émissions de gaz à effet de serre qui participent au changement climatique. Par conséquent, le contrôle du processus de nitrification est devenu un enjeu majeur en agriculture.

Un autre processus important du cycle de l’azote repose sur la transformation des nitrates issue de la nitrification en diazote. Ce deuxième mécanisme biologique constituant la dénitrification correspond à la réduction des nitrates (NO₃ ^-) en azote gazeux (N₂) par des bactéries en situation d'anoxie. Les bactéries dénitrifiantes réduisent l'ion nitrate (NO₃ ^-) successivement en ion nitrite (NO₂ ^-), puis en monoxyde d'azote (NO, en protoxyde d'azote (N₂O), et enfin en diazote (N₂).

La dénitrification constitue donc une autre source d’émission du gaz à effet de serre N₂O par utilisation bactérienne des nitrates, qui entre en compétition avec l’utilisation des nitrates par les plantes.

Il existe également un processus de nitrification-dénitrification réalisé par des organismes nitrifiants également capables de dénitrification, ou réalisé conjointement par des organismes nitrifiants et des organismes dénitrifiants distincts, processus dans lequel les nitrates produits par les organismes nitrifiants sont immédiatement dénitrifiés par les organismes dénitrifiants. Des émissions de N₂O peuvent également être observées au stade du processus de nitrification-dénitrification.

Pour les plantes non fixatrices d’azote, l’azote est absorbé par les plantes principalement sous forme nitrique (NO₃ ^-) ou ammoniacale (NH₄ ⁺). En fonction des besoins de la plante, cette dernière est capable d’absorber des quantités importantes pour soutenir sa croissance et son développement. Par ailleurs, un manque en azote engendré par une déficience de fourniture par le sol ou par des pertes dans l’environnement, via la volatilisation ammoniacale, le lessivage des nitrates ou la dénitrification, peut provoquer des carences azotées et avoir un impact négatif sur la croissance de la plante.

Apporter des solutions fertilisantes moins sujettes à des pertes environnementales permet d’éviter certains risques de carences et de limiter les impacts environnementaux des fertilisants. Ainsi, les quantités d’azote ajouté par fertilisation peuvent être réduites, ce qui peut présenter un gain financier pour les agriculteurs, permettre de diminuer les pertes d’azote et de réduire les risques sur l’environnement.

Afin que la plante utilise de manière plus efficace l’azote présent dans les compositions fertilisantes et de contrôler le processus de transformation de l’azote dans le sol, des formulations comprenant des inhibiteurs de la nitrification sont intéressantes à développer dans l’objectif de contrôler la fourniture en nitrate en fonction des besoins de la plante et optimiser son utilisation par les cultures. Cela permet une meilleure valorisation de l’azote par la plante, tout en réduisant les conséquences négatives vis-à-vis de l’environnement.

Il existe aujourd’hui plusieurs molécules chimiques capables d’inhiber le processus de nitrification dans le sol et de limiter les émissions de gaz à effet de serre. Cependant, ce sont des molécules de synthèse pouvant présenter une dangerosité vis-à-vis de l’environnement et de la vie du sol.

C’est dans ce contexte que le demandeur a mis en évidence, et ceci constitue le fondement de la présente invention, que certains extraits naturels de microalgues permettent d’inhiber le processus de nitrification et/ou de nitrification-dénitrification dans un sol et par conséquent d’améliorer le bilan agro-environnemental des cultures. Le demandeur a aussi mis en évidence que ces extraits de microalgues permettent d’inhiber le fonctionnement de l’enzyme Nitrate réductase.

Ainsi, la présente invention, qui trouve application dans le domaine agricole, vise à proposer l’utilisation d’extraits naturels de microalgues comme solution pour ralentir la nitrification et ainsi mieux réguler la fourniture en azote aux plantes, réduire les pertes d’azote gazeux sous forme de N₂O. On peut aussi envisager réduire ainsi les pertes de nitrate par lessivage.

L’utilisation d’extraits de microalgues en agriculture pour contrôler un voire plusieurs processus du cycle de l’azote constitue une approche innovante. Ceci est le challenge agronomique principal de l’invention.

C’est ainsi qu’un premier objet de la présente invention concerne l’utilisation d’un extrait aqueux d’au moins une microalgue unicellulaire eucaryote pour induire une inhibition d’au moins une étape du cycle de l’azote dans un sol, ladite étape étant choisie parmi un processus de nitrification, un processus de dénitrification et un processus de nitrification-dénitrification.

Un deuxième objet de la présente invention porte sur un procédé de fertilisation agricole comprenant une étape d’apport à une plante d’un extrait aqueux d’au moins une microalgue, ledit extrait pouvant être appliqué sur un sol apporté par un support de culture ou apporté par une solution de culture.

Un troisième objet de la présente invention concerne un produit à usage agricole comprenant un extrait aqueux d’une microalgue et au moins un ingrédient nutritif du sol ou un ingrédient nutritif de la plante choisi notamment parmi un engrais, un amendement, un biostimulant et un micronutriment.

Enfin, un quatrième objet de la présente invention concerne un procédé de préparation d’un extrait aqueux d’une microalgue comprenant une étape d’extraction par introduction de la microalgue dans un milieu d’extraction liquide comprenant de l’eau, une étape de filtration, et une étape de récupération du filtrat contenant l’extrait aqueux.

La représente l’évolution des teneurs en ammonium
(NH₄ ⁺; mg N-NH₄ ⁺.g^-1Sol) dans le sol (i) avec un sol qui comprend un extrait de microalgue fonctionnalisé, (ii) avec un sol qui comprend un extrait de microalgue (Extrait), et (iii) avec un sol qui ne comprend pas d’extrait (Témoin). Le graphique montre une diminution progressive des teneurs en ammonium entre 0 et 12 jours d’incubation dans le sol qui ne comprend pas d’extrait (Témoin) : ces teneurs passent de 0.4 à 0.12 mg N-NH₄ ⁺.g^-1Sol. Les teneurs en ammonium passent de 0.4 à 0.31 mg N-NH₄ ⁺.g^-1Sol dans le sol qui comprend l’extrait de microalgue, et de 0.4 à 0.42 mg N-NH₄ ⁺.g^-1Sol dans le sol qui comprend l’extrait de microalgue fonctionnalisé, indiquant une inhibition du processus de nitrification dans le sol.

La représente l’évolution des teneurs en nitrate (NO₃ ^-; mg N-NO₃ ^-.g^-1Sol) dans le sol (i) avec un sol qui comprend un extrait de microalgue fonctionnalisé, (ii) avec un sol qui comprend un extrait de microalgue (Extrait), et (iii) avec un sol qui ne comprend pas d’extrait (Témoin). Le graphique montre une augmentation progressive des teneurs en nitrate entre 0 et 12 jours d’incubation dans le sol qui ne comprend pas d’extrait (Témoin) : ces teneurs passent de 0 à 0.22 mg N- NO₃ ^-.g^-1Sol dans le sol. Les teneurs en ammonium passent de 0 à 0.15 mg N- NO₃ ^-.g^-1Sol dans le sol qui comprend l’extrait de microalgue, et de 0 à 0.09 mg N- NO₃ ^-.g^-1Sol dans le sol qui comprend l’extrait de microalgue fonctionnalisé, indiquant une inhibition du processus de nitrification dans le sol.

La représente l’évolution des teneurs en protoxyde d’azote (N₂O ; représentées par la surface du Pic de l’analyse GC (chromatographie en phase gazeuse) dans le sol (i) avec un sol qui comprend un extrait de microalgue fonctionnalisé (Extrait Fonctionnalisé), et (ii) avec un sol qui ne comprend pas d’extrait (Témoin). Le graphique montre une augmentation progressive de la surface du pic associée à une augmentation des teneurs en N₂O dans l’air entre 0 et 216 heures d’incubation dans le sol qui ne comprend pas d’extrait (Témoin) : la surface du pic passe de 0 à 1200. La surface du pic passe de 0 à 600 dans le sol qui comprend l’extrait de microalgue fonctionnalisé, indiquant une inhibition de la production de N₂O grâce à l’extrait de microalgue fonctionnalisé.

La représente le pourcentage d’inhibition (%) du fonctionnement de la nitrate réductase (i) avec une solution qui comprend un extrait de microalgue fonctionnalisé, (ii) avec une solution qui comprend un extrait de microalgue (Extrait), et (iii) avec une solution qui ne comprend pas d’extrait (Témoin). Le graphique montre une inhibition de l’activité nitrate réductase de 24% dans la solution qui comprend l’extrait de microalgue, et de 99% dans la solution qui comprend l’extrait de microalgue fonctionnalisé, par rapport à la solution qui ne comprend pas d’extrait (Témoin).

Un premier objet de l’invention porte sur l’utilisation d’un extrait aqueux d’au moins une microalgue unicellulaire eucaryote pour induire une inhibition d’au moins une étape du cycle de l’azote dans un sol, ladite étape étant choisie parmi un processus de nitrification, un processus de dénitrification et un processus de nitrification-dénitrification.

On entend par microalgues, des micro-organismes unicellulaires qui ont la capacité de réaliser une photosynthèse.

On entend par « processus de nitrification» l’ensemble des réactions biochimiques conduisant à la formation de nitrates à partir d’ammonium qui sont induites par les bactéries nitrifiantes telles que les bactéries oxydant l'ammoniac (AOB) et/ou par les bactéries oxydant les nitrites (NOB), par exempleNitrosomonas spp.,Nitrosospira spp.etNitrosococcus spp. Nitrosomonas spp., Nitrosospira spp.etNitrosococcus spp.,par exemple choisie parmiNitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha, Nitrosomonas communis, Nitrosospira multiformisetNitrosospira lacus.

Le terme « inhibiteur du processus de nitrification », encore appelé inhibiteur de nitrification, désigne un produit dont l’activité ralentit une des réactions biochimiques du processus de nitrification. Un inhibiteur de nitrification permet avantageusement de mieux synchroniser la fourniture en azote du sol aux besoins de la plante et par voie de conséquence de réduire les pertes d’engrais azotés (lessivage des nitrates du sol par exemple). De plus, le fonctionnement de la nitrification pouvant produire du N₂O, un inhibiteur de la nitrification peut diminuer les émissions de N₂O par les sols.

L’inhibition d’un processus de nitrification dans le cadre de l’invention peut avoir au moins un effet choisi parmi une inhibition de l’activité de bactéries nitrifiantes présentes dans le sol, une réduction de la perte en engrais du sol, une diminution du lessivage des nitrates dans le sol, une augmentation de la quantité d’ammonium disponible dans le sol, une amélioration de la croissance d’une plante cultivée sur le sol, une diminution des émissions de protoxyde d’azote, et une augmentation de la quantité d’azote assimilable par une plante cultivée sur le sol

Un extrait aqueux de microalgues visé par la présente invention peut être un inhibiteur de nitrification au sens de l’invention. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention un extrait aqueux de microalgues est un inhibiteur de nitrification lorsqu’il diminue d’au moins 5% la quantité d’azote nitrate (N-NO₃ ^-) dans un sol amendé en comparaison du même sol non amendé avec l’extrait, et/ou lorsqu’il augmente d’au moins 5% la quantité d’azote ammoniacal (N-NH₄ ⁺) dans un sol amendé en comparaison du même sol non amendé avec l’extrait, après une durée d’au moins 2 jours après application de l’extrait sur le sol, de préférence d’au moins 6 jours ou 10 jours. Plusieurs méthodes permettant de mesurer l’activité d’inhibition de nitrification d’un extrait aqueux de microalgue sont détaillées dans les exemples. La diminution de la quantité d’azote nitrate ou l’augmentation de la quantité d’azote ammoniacal peuvent être indépendamment l’une de l’autre supérieure ou égale à une valeur choisie parmi 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% et 250%, après une durée par exemple d’au moins 2 jours après application de l’extrait sur le sol, de préférence d’au moins 6 jours ou 10 jours.

Le terme « processus de dénitrification » désigne la réduction des nitrates (NO₃ ^-) en azote gazeux (N₂) par des bactéries en situation d'anoxie. Plus précisément, les bactéries dénitrifiantes réduisent l'ion nitrate (NO₃ ^-) successivement en ion nitrite (NO₂ ^-) par action de l’enzyme N₂O réductase, en monoxyde d'azote (NO), en protoxyde d'azote (N₂O), puis en diazote (N₂).

Un « inhibiteur de dénitrification » est un produit permettant de ralentir au moins une étape du processus de dénitrification. Dans un mode de réalisation particulier, un inhibiteur de dénitrification diminue d’au moins 5% l’activité de l’enzyme Nitrate Réductase dans un milieu supplémenté en inhibiteur de dénitrification en comparaison du même milieu non supplémenté au bout d’une durée d’au moins 10 minutes. La diminution de l’activité de l’enzyme Nitrate Reductase peut être supérieure à une valeur choisie parmi 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% et 95%, au bout d’une durée par exemple d’au moins 10 minutes.

L’inhibition d’un processus de dénitrification peut avoir au moins un effet choisi parmi une inhibition de l’activité de bactéries dénitrifiantes présentes dans le sol., une inhibition du processus de réduction des nitrates, une inhibition de l’activité de l’enzyme nitrate réductase, et une réduction de l’émission de protoxyde d’azote.

On entend par « processus de nitrification-dénitrification », un processus réalisé par des organismes capables de nitrification et de dénitrification simultanée, ou un processus réalisé conjointement par des organismes nitrifiants et des organismes dénitrifiants distincts, dans lequel les nitrates produits par les organismes nitrifiants sont immédiatement dénitrifiés par les organismes dénitrifiants.

Le terme « inhibiteur du processus de nitrification-dénitrification» désigne l’activité de limiter le processus de nitrification-dénitrification qui peut se traduire par une inhibition de la production de N₂O. Aussi, l’inhibition d’un processus de nitrification-dénitrification peut avoir comme effet une diminution de la production de protoxyde d’azote. La diminution de la production de protoxyde d’azote peut être supérieure ou égale à une valeur choisie parmi 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, au bout d’une durée par exemple d’au moins 100 heures, 150 heures ou 200 heures.

Dans un mode de réalisation de l’invention un extrait aqueux de microalgue est un inhibiteur de nitrification-dénitrification lorsqu’il diminue d’au moins 5% la quantité de protoxyde d’azote dans un sol amendé en extrait de microalgue en comparaison du même sol non amendé en conditions de nitrification (milieu aéré).

Le terme « extrait de microalgue » désigne un produit résultant d’un procédé réalisé par l’homme pour isoler une partie d’une microalgue. La microalgue est de préférence une microalgue unicellulaire eucaryote délimitée par une membrane qui contient des organites, dont un cytoplasme et un noyau.

Le terme « extrait aqueux de microalgue » désigne un produit résultant de l’extraction du contenu cellulaire d’une microalgue avec un liquide contenant de l’eau. Un extrait aqueux ne contient pas nécessairement de l’eau, car l’étape d’extraction peut être suivie d’une étape d’élimination de l’eau utilisée comme solvant d’extraction. L’extrait aqueux contient de préférence les molécules hydrophiles contenues à l’intérieur de la microalgue. L’extrait aqueux est donc susceptible d’être obtenu par extraction des molécules que la microalgue renferme, avec un milieu liquide contenant de l’eau.

L’extrait aqueux d’au moins une microalgue unicellulaire eucaryote peut être obtenu par une étape d’extraction des organites contenus dans la cellule, en utilisant un milieu d’extraction liquide de préférence constitué d’eau, de préférence encore d’eau distillée, et l’étape d’extraction étant de préférence réalisée à une température allant de 4°C à 300°C. L’extrait aqueux peut être fonctionnalisé par ajout d’au moins une enzyme choisie parmi les carbohydrases et les pectinases dans le milieu liquide.

La microalgue qui peut être utilisée dans le cadre de la présente invention est avantageusement choisie dans le groupe constituée parNannochloropsis sp., Amphora sp., Chaetoceros sp., Chlamydomonas sp., Chlorella sp., Dunaliella sp., Euglena sp., Fragilaria sp., Haematococcus sp., Isochrysis sp. Iisochrysis sp., Nannochloris sp., Nitzchi sp., Odonthella sp., Porphyridium sp., Phaeodacylum sp., Scenedesmus sp., Schyzotrium sp., Skeletonema sp., Thalassosira sp.etTetraselmis sp.

Procédé de fertilisation agricole

L’invention, dans son deuxième objet, porte sur un procédé de fertilisation agricole comprenant une étape d’apport à une plante d’un extrait aqueux d’au moins une microalgue choisie dans le groupe constitué parNannochloropsis sp., Amphora sp., Chaetoceros sp., Chlamydomonas sp., Chlorella sp., Dunaliella sp., Euglena sp., Fragilaria sp., Haematococcus sp., Isochrysis sp. Tisochrysis sp., Nannochloris sp., Nitzchi sp., Odonthella sp., Porphyridium sp., Phaeodacylum sp., Scenedesmus sp., Schyzotrium sp., Skeletonema sp.,Thalassosira sp.etTetraselmis sp.,ledit extrait pouvant être appliqué sur un sol apporté par un support de culture ou apporté par une solution de culture.

Le terme « sol » désigne le substrat exploré par les racines des plantes cultivées. Le terme sol comprend tout type de substrat sur lequel une plante peut se développer, tel que par exemple un sol artificiel, un sol agricole cultivé, un sol agricole non cultivé, de la tourbe, du terreau, de la laine de roche ou de la fibre de coco. Le terme sol couvre donc également les supports de cultures qui peuvent notamment être utilisés pour de la culture dite « hors sol », par exemple dans des pots. Le sol peut avoir un pH acide ou basique. Dans un mode de réalisation particulier, le sol a un pH supérieur ou égal à une valeur choisie parmi 6, 7, ou 8.

Au sens de la présente invention, on entend par « support de culture » tout sol ou support sur lequel une culture peut se développer tel que par exemple sol artificiel, sol agricole cultivé, sol agricole non cultivé, tourbe, terreau, laine de roche ou fibre de coco.

Au sens de la présente invention, on entend par « solution de culture » toute solution qui permet la culture d’une plante telle que par exemple eau d’irrigation, solution liquide destinée à la fertigation par aspersion ou goutte à goutte, bain d’hydroponie ou solution d’aéroponie.

L’extrait aqueux de microalgue faisant l’objet de l’utilisation de l’invention, ou le produit agricole de l’invention, peuvent être appliqués sur un sol ou sur une plante par voie racinaire, en plein champ ou hors-sol. Ils peuvent être appliqués sur la surface du sol ou être mélangés avec le sol, par exemple avec les premières couches du sol. L’application peut être réalisée directement sur le sol, sur toute la surface du sol ou de façon localisée au niveau des racines de plantes, par tout moyen de distribution approprié.

L’application peut être effectuée avant et/ou pendant la croissance des plantes cultivées, avant et/ou après la germination des plantes, ou lors du repiquage dans le cas des plantes nécessitant un repiquage.

Le procédé de fertilisation de l’invention peut comprendre une étape d’application de l’extrait aqueux de microalgue, et une étape d’application d’un fertilisant, par exemple un engrais, solide ou liquide, un amendement, et/ou un biostimulant. Il peut s’agir, par exemple, d’un engrais azoté, les deux étapes étant simultanées ou séquentielles. La personne du métier saura adapter la séquence d’étapes et le nombre de répétition des étapes en fonction de la nature du sol et/ou de la plante cultivée.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé de fertilisation agricole comprend en outre une étape d’application d’au moins un engrais azoté sur le sol ou sur la plante cultivée sur le sol, ladite étape d’application étant antérieure, concomitante ou postérieure à l’étape d’apport de l’extrait aqueux. L’engrais azoté peut être un engrais azoté comprenant une forme ammoniacale d’azote, un engrais azoté libérant de l’ammonium dans le sol, ou un engrais azoté comprenant du nitrate

Produit à usage agricole

L’invention a pour troisième objet un produit à usage agricole comprenant un extrait aqueux d’au moins une microalgue choisie dans le groupe constitué parNannochloropsis sp., Amphora sp., Chaetoceros sp., Chlamydomonas sp., Chlorella sp., Dunaliella sp., Euglena sp., Fragilaria sp., Haematococcus sp., Isochrysis sp. Tisochrysis sp., Nannochloris sp., Nitzchi sp., Odonthella sp., Porphyridium sp., Phaeodacylum sp., Scenedesmus sp., Schyzotrium sp., Skeletonema sp.,Thalassosira sp.etTetraselmis sp.,et au moins un ingrédient nutritif du sol et/ou un ingrédient nutritif d’une plante cultivé sur le sol choisi parmi un engrais, un amendement, un biostimulant et un micronutriment.

Le terme « engrais » désigne des matières fertilisantes dont la fonction principale est d’apporter aux plantes des éléments directement utiles à leur nutrition (éléments fertilisants majeurs, éléments fertilisants secondaires et oligo-éléments). Le terme « amendement » désigne une substance destinée à améliorer la qualité des sols, et notamment destinée à améliorer le pH des sols. Avantageusement, l’amendement est choisi parmi les amendements minéraux basiques de type calcaire et/ou calcaires et magnésiens, les amendements humifères de type composts ou les fumiers.

L’engrais est avantageusement un engrais solide simple, binaire ou ternaire, organo-minéral ou engrais organique, liquide ou un engrais hydrosoluble.

Dans un mode de réalisation, l’engrais est un engrais azoté. Il est de préférence un engrais azoté comprenant une forme ammoniacale d’azote, un engrais azoté libérant de l’ammonium dans le sol, ou un engrais azoté comprenant du nitrate.

Dans des modes de réalisation particuliers, l’engrais azoté contient de l’ammonium, du nitrate, de l’ammoniac et/ou de l’urée. Des exemples d'engrais contenant de l'ammonium sont le nitrate d'ammonium calcique, le nitrate de calcium et d'ammonium, le nitrate de sulfate d'ammonium, le sulfate d'ammonium et le phosphate d'ammonium. Un exemple d'engrais contenant de d'ammoniac est le nitrate d'ammoniac. L’engrais azoté peut également fournir d'autres nutriments, par exemple, du potassium (K) et/ou du phosphore (P).

L’amendement peut être un amendement organique ou un amendement minéral, tel que le carbonate de calcium.

Des micronutriments tels que le molybdène, le zinc, le bore et le cuivre sont de préférence fournis sous forme de sels solubles dans l'eau ou les acides organiques.

Un biostimulant peut être par exemple. un biostimulant liquide racinaire ou foliaire

Le produit agricole peut également comprendre au moins un auxiliaire de formulation choisi parmi un solvant, un support solide, un dispersant ou un émulsifiant, un épaississant organique ou inorganique, un agent pesticide, un agent antigel, un agent anti-mousse, le cas échéant un colorant, un agent collant ou un liant.

Le produit agricole de l’invention peut être sous forme d’un fertilisant, d’un support de culture ou d’une solution de culture.

Dans des modes de réalisations particuliers, le produit agricole selon l’invention est une solution de culture telle qu’une eau d’irrigation, une solution destinée à la fertigation par aspersion ou goutte à goutte, un bain d’hydroponie ou une solution d’aéroponie.

Le produit agricole selon l’invention peut se trouver sous forme solide, en particulier sous forme de poudre, de granulés ou de microgranulés, sous forme de suspension liquide ou sous forme de gel ou sous forme hydrosoluble.

Par l'expression « plante » on entend désigner dans la présente demande la plante considérée dans son ensemble, incluant son appareil racinaire, son appareil végétatif, les graines, semences et fruits.

Le procédé agricole ou l’utilisation selon l’invention trouve application dans le traitement d'un sol dans lequel peut être planté une très grande variété de plantes. Parmi celles-ci, on citera en particulier les plantes de grande culture telles que les céréales (blé, maïs, orge), les protéagineux (pois), les oléagineux (soja, tournesol), les cultures de solanacées (pomme de terre), les cultures d’amaranthaceae (betterave), les cultures spécialisées telles qu'en particulier le maraîchage (laitue, épinard, oignon, échalote, tomate, melon), la vigne, l'arboriculture (poire, pomme, nectarine), ou l'horticulture.

En particulier, la plante peut appartenir à l’ordre des monocotylédones, de préférence à la famille des poacées. Les poacées, communément appelés les graminées, renferment notamment la plupart des espèces appelées communément « herbes » et « céréales ». On peut citer parmi les poacées, le blé, le riz, l’orge, l’avoine, le seigle, la canne à sucre, la prairie et le maïs.

Procédé de préparation de l’extrait

Le quatrième objet de l’invention concerne un procédé de préparation d’un extrait aqueux d’au moins une microalgue choisie dans le groupe constitué parNannochloropsis sp., Amphora sp., Chaetoceros sp., Chlamydomonas sp., Chlorella sp., Dunaliella sp., Euglena sp., Fragilaria sp., Haematococcus sp., Isochrysis sp.Tisochrysis sp., Nannochloris sp., Nitzchi sp., Odonthella sp., Porphyridium sp ; Phaeodacylum sp., Scenedesmus sp., Schyzotrium sp., Skeletonema sp.,Thalassosira sp.etTetraselmis sp.,ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
- Une étape d’extraction par introduction de la microalgue dans un milieu d’extraction liquide comprenant de l’eau, l’extraction étant réalisée à une température allant de 4°C à 300°C pendant une durée suffisante pour extraire les molécules que la microalgue renferme,
- Une étape de filtration pour éliminer les solides, et
- Une étape de récupération du filtrat comprenant l’extrait aqueux.

L’extraction de l’extrait aqueux de la microalgue peut être alternativement réalisée par tout mode d’extraction bien connue de l’homme du métier telle que la décoction à chaud, la macération, l’extrusion, l’extraction en conditions subcritiques, l’extraction assistée par des ultrasons, avec ou sans le broyage tel que le broyage aux ultrasons ou à l’aide d’un mixeur. L’extraction pourra être réalisée à une température allant de 4°C à 300°C, de préférence à une température allant de 19°C à 25°C.

Le milieu d’extraction liquide comprenant de l’eau comprend de préférence de l’eau distillée et éventuellement un alcool aliphatique, par exemple l’éthanol ou un glycol.

Après l’étape d’extraction, les solides peuvent être éliminés par centrifugation ou par filtration, pour récupérer un filtrat, qui peut être séché, par exemple par lyophilisation ou évaporation.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de préparation d'un extrait de la microalgueNannochloropsis sp., ledit procédé comprenant une étape d'extraction deNannochloropsis sp.avec de l’eau distillée, suivie d’une étape de filtration pour récupérer le filtrat contenant l’extrait aqueux et éliminer les résidus solides de la microalgue. Le procédé peut comprendre une étape de concentration du filtrat à sec par lyophilisation ou par évaporation à 20°C à 80°C. Dans ce procédé,Nannochloropsis sp.peut-êtreNannochloropsis salina, Nannochloropsis oculata ou Nannochloropsis oceanica.

Dans un mode de réalisation plus particulier, le procédé comprend une étape d’extraction deNannochloropsis sp.dans un milieu liquide constitué d’eau distillée à une température de 4°C à 300°C, pendant une durée allant de 30 minutes à 24 heures.

L’étape d’extraction peut comprendre l’ajout dans le milieu liquide d’extraction d’au moins une enzyme permettant de la dégradation de la paroi des microalgues et la libération de leur contenu dans le milieu d’extraction liquide. Au moins une enzyme choisie parmi les pectinases et les carbohydrases peut ainsi être ajoutée dans le milieu d’extraction liquide pendant l’étape d’extraction pour obtenir un extrait aqueux fonctionnalisé. Des exemples de carbohydrases sont les cellulases, les hemicellulases, les bêta-glucanases, et les xylanases.

L’invention est illustrée par les exemples suivants. Sauf mention contraire la température est la température ambiante comprise entre 20°C et 25°C et la pression est la pression atmosphérique.

Exemple 1 : Préparation d’extraits de microalgue

Premier extrait :

Dans un réacteur en verre, on introduit de l’eau distillée et une microalgueNannochloropsis salina, Nannochloropsis oculata ou Nannochloropsis oceanicacultivée en phototrophie, à une concentration massique de 2.5%. Après agitation (pendant 4 heures) et décantation, le filtrat est récupéré et constitue l’« Extrait ».

Deuxième extrait :

Dans un réacteur en verre, on introduit de l’eau et la microalgueNannochloropsis sp. à une concentration massique de 2.5%. Après agitation (pendant 4 heures), le complexe enzymatique Viscozyme® L est ajouté à une concentration de 0.1% (enzyme/poids matière première). La fonctionnalisation enzymatique de l’extrait dure 5 heures sous agitation. Après décantation, le filtrat est récupéré et constitue l’« Extrait fonctionnalisé ».

Exemple 2 : Mesure de l’inhibition de la nitrification par le dosage de l’ammonium dans un sol

Préparation d’un sol qui comprend un extrait de microalgue (Extrait ou Extrait fonctionnalisé) et d’un sol qui ne comprend pas un extrait de microalgue (Témoin)
5 g de sol sec (dont les caractéristiques sont détaillées au tableau 1) tamisé avec un tamis dont le diamètre des mailles est de 2 mm, sont placés dans des flacons en verre de 60 ml auxquels sont ajoutés 0.8 ml d’eau contenant le traitement (Extrait ou Extrait fonctionnalisé de l’Exemple 1) à une dose de 50 mg/Flacon ou n’en contenant pas (Témoin).

Tableau 1 : principales caractéristiques du sol

Texture	Argile limoneuse
pH	8,1
Matière organique (%)	1.9
Capacité d'échange cationique (meq/Kg)	187

Après 24h d’incubation, 0.4 mg de N-NH₄ ⁺.g^-1Sol, sous forme d’ammonium sulfate, sont ajoutés dans 1.8 ml d’eau. Ce volume permettant d’atteindre 80% de la capacité au champ du sol étudié.

Les flacons sont ensuite hermétiquement fermés, puis mis à incuber à la température de 20°C à 22°C pendant une période allant jusqu’à 12 jours. Au cours de cette période, les cinétiques de nitrification dans le sol sont établies en effectuant des dosages d’ammonium à 2 ; 6 ; 9 et 12 jours.

Extraction et dosage de l’ammonium du sol
L’extraction se fait en ajoutant 15 mL d’une solution de KCl à 1M dans chaque flacon puis en agitant à l’aide d’un agitateur rotatif pendant une heure. Les fioles sont laissées décanter pendant 10 min. Le surnageant est récupéré et centrifugé à 11000 rpm (rotation par minute) pendant 5 min à 4°C puis filtré grâce à un filtre de 0,25 μm afin d’éliminer toute particule.

Le dosage de l’ammonium est réalisé à l’aide du kit Ammonium test-Spectroquant (Supelco). Après dilution du filtrat, 5 ml sont utilisés pour effectuer le dosage. La Densité Optique (DO) des échantillons est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à 692 nm et la teneur en NH₄ ⁺a été estimée à partir d’une courbe d’étalonnage.

Pour chacune des conditions d’incubation (Témoin, Extrait et Extrait fonctionnalisé), quatre lots de sol ont été constitués (1 lot = 1 répétition biologique).

L'ensemble des traitements ont été réalisés systématiquement pour chacune des répétitions biologiques, c’est-à-dire en quadruplât. Les données obtenues ont été présentées sous forme de moyenne et la variabilité des résultats a été donnée sous la forme de l’écart-type de la moyenne pour n=4.

Le dosage de l’ammonium est présenté dans la .

Conclusion: Les sols traités avec l’Extrait ou l’Extrait Fonctionnalisé présentent des teneurs en azote ammoniacal (N-NH₄ ⁺), i.e. la masse de l’élément azote présent sous forme d’ammonium, plus élevée que celle retrouvée dans le sol témoin. Une augmentation de +158% en présence de l’extrait et de +250% en présence de l’extrait fonctionnalisé est observée après 12 jours d’incubation, traduisant une diminution de l’activité nitrifiante appelée aussi inhibition de la nitrification.

Exemple 3 : Mesure de l’inhibition de la nitrification par le dosage des nitrates dans un sol

Préparation d’un sol qui comprend un extrait de microalgue (Extrait ou Extrait fonctionnalisé) et d’un sol qui ne comprend pas un extrait de microalgue (Témoin)

On a préparé des flacons dans les mêmes conditions que celles décrites dans l’Exemple 2.

Les cinétiques de nitrification associée à l’apparition du nitrate dans le sol ont été établies en effectuant des dosages de nitrate à 2 ; 6 ; 9 et 12 jours.
Extraction et dosage des nitrates du sol
L’extraction se fait en ajoutant 15 mL d’eau pure dans chaque flacon puis en agitant à l’aide d’un agitateur rotatif pendant une heure. Les fioles sont laissées décanter pendant 10 min. Le surnageant est récupéré et centrifugé à 11000 rpm (rotation par minute) pendant 5 min à 4°C puis filtré grâce à un filtre de 0,25 μm afin d’éliminer toute particule.

Le dosage des nitrates est réalisé à l’aide du kit Nitrate test-Spectroquant (Supelco). Après dilution du filtrat, 5 ml sont utilisés pour effectuer le dosage. La Densité Optique (DO) des échantillons est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à 692 nm et la teneur en azote nitrate (N-NO₃ ^-), i.e. la masse de l’élément azote présent dans le nitrate, a été estimée à partir d’une courbe d’étalonnage.

L'ensemble des traitements ont été réalisés systématiquement pour chacune des répétitions biologiques, c’est-à-dire en quadruplât. Les données obtenues ont été présentées sous forme de moyenne et la variabilité des résultats a été donnée sous la forme de l’erreur standard de la moyenne pour n=4.

Le résultat du dosage des ions nitrates est présenté dans la .

Conclusion: Les sols traités avec l’Extrait ou l’Extrait Fonctionnalisé présentent des teneurs en azote nitrate (N-NO₃ ^-) plus faibles que celles retrouvées dans le sol témoin. Une diminution de -31% en présence de l’Extrait et de -59% en présence de l’Extrait fonctionnalisé est observée après 12 jours d’incubation, traduisant une diminution de l’activité nitrifiante appelée aussi inhibition de la nitrification.

Exemple 4 : Dosage du Protoxyde d’Azote (N ₂ O) dans un sol

Préparation d’un sol qui comprend un extrait de microalgue (Extrait fonctionnalisé) et d’un sol qui ne comprend pas un extrait de microalgue (Témoin)
4.4 g de sol sec (conservé à 15% d’humidité massique) tamisé avec un tamis dont le diamètre des mailles est de 1 mm, sont placés dans des flacons en verre de 37 ml auxquels sont ajoutés 0.6 ml d’eau contenant 0.4 mg de N-NH₄ ⁺.g^-1Sol, sous forme d’ammonium sulfate. L’extrait de microalgue préparé selon l’Exemple 1 a été appliqué à la dose de 25 mg/Flacon.

Les flacons sont ensuite hermétiquement fermés, puis mis à incuber à une température de 20°C pendant une période allant jusqu’à 216 heures. Au cours de cette période, les cinétiques de nitrification associé à l’apparition du N₂O sont établies en effectuant des dosages de N₂O à 0 ; 48 ; 120 ; 168 et 216 heures.

Les cinétiques de nitrification ont également été évaluées dans les mêmes conditions que précédemment sur le même sol ne comprenant aucun extrait de microalgue utilisé comme Témoin.

Prélèvement et dosage du Gaz N ₂ O
Le gaz est prélevé à la seringue de l’atmosphère gazeuse des fioles, et le dosage est réalisé sur une microGC (Agilent 990) équipée d’un détecteur TCD et d’une colonne Porapak Q.
Pour chacune des conditions d’incubation (Témoin et Extrait fonctionnalisé), trois lots de sol ont été constitués (1 lot = 1 répétition biologique).

L'ensemble des traitements ont été réalisés systématiquement pour chacune des répétitions biologiques, c’est-à-dire en tripliquât. Les données obtenues ont été présentées sous forme de moyenne et la variabilité des résultats a été donnée sous la forme de l’écart-type de la moyenne pour n=3.

Le dosage du N₂O est présenté dans la .

Conclusion: Les sols traités avec l’Extrait Fonctionnalisé présentent des teneurs en Protoxyde d’Azote (N₂O, ici représentées par la surface du pic) plus faibles que celles retrouvées dans le sol témoin. Une diminution de -50% en présence de l’extrait fonctionnalisé est observée après 216 heures d’incubation.

Exemple 5 : Mesure de l’inhibition du processus de dénitrification par mesure de l’activité de l’enzyme Nitrate Réductase

Dans une plaque à fond rond de 96 puits sont placés un tampon phosphate 10 mM pH 7,5, l’enzyme nitrate réductase (Sigma Aldrich, N0163), et un tampon substrat pH 7,5 (contenant 37,5 mM tampon phosphate pH 7,5, nitrate de potassium 15 mM, EDTA 0,075 mM, 0,15 mM NADH) auxquels sont ajoutés 0.8 ml d’eau contenant le traitement (Extrait ou Extrait fonctionnalisé de l’Exemple 1) à une dose de 50 mg/Flacon ou n’en contenant pas (Témoin). La plaque a ensuite été incubée à 30 ° C pendant 40 minutes avec agitation dans l'obscurité et suivie de l'ajout de 58 mM de sulfanilamide (Sigma Aldrich, S9251) avec du dichlorhydrate de N- (1-naphtyl) éthylènediamine fraîchement préparé (Sigma Aldrich, 222488). La plaque a de nouveau été incubée pendant 20 minutes à température ambiante dans l'obscurité pour un développement complet de la couleur. Ensuite, l'absorbance a été mesurée à 540 nm dans un spectrophotomètre UV (ClarioStar Plus, BMG Labtech). Les résultats sont présentés sur la .

Conclusion: L’enzyme traitée avec l’Extrait ou l’Extrait Fonctionnalisé présente une inhibition de l’activité de l’enzyme nitrate réductase plus importante que celle retrouvée dans la solution témoin. Une inhibition de la dénitrification de 24% en présence de l’Extrait et de 99% en présence de l’Extrait fonctionnalisé est observée, traduisant une inhibition de l’activité dénitrifiante.

Claims

Utilisation d’un extrait aqueux d’au moins une microalgue unicellulaire eucaryote pour induire une inhibition d’au moins une étape du cycle de l’azote dans un sol, ladite étape étant choisie parmi un processus de nitrification, un processus de dénitrification et un processus de nitrification-dénitrification, la microalgue est choisie dans le groupe constitué parNannochloropsis sp., Amphora sp., Chaetoceros sp., Chlamydomonas sp., Chlorella sp., Dunaliella sp., Euglena sp., Fragilaria sp., Haematococcus sp., Isochrysis sp.Tisochrysis sp., Nannochloris sp., Nitzchi sp., Odonthella sp., Porphyridium sp., Phaeodacylum sp., Scenedesmus sp., Schyzotrium sp., Skeletonema sp., Thalassosira sp.etTetraselmis sp.
Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l’inhibition d’un processus de nitrification est choisie parmi une inhibition de l’activité de bactéries nitrifiantes présentes dans le sol, une réduction de la perte en engrais du sol, une diminution du lessivage des nitrates dans le sol, une augmentation de la quantité d’ammonium disponible dans le sol, une amélioration de la croissance d’une plante cultivée sur le sol, une diminution des émissions de protoxyde d’azote, et une augmentation de la quantité d’azote assimilable par une plante cultivée sur le sol.
Utilisation selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que l’inhibition d’un processus de dénitrification est choisie parmi une inhibition de l’activité de bactéries dénitrifiantes présentes dans le sol, une inhibition du processus de réduction des nitrates, une inhibition de l’activité de l’enzyme nitrate réductase, et une réduction de l’émission de protoxyde d’azote.
Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’extrait aqueux est susceptible d’être obtenu par extraction des molécules que la microalgue renferme, avec un milieu liquide contenant de l’eau.
Utilisation selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l’extrait aqueux est fonctionnalisé par ajout d’au moins une enzyme choisie parmi les carbohydrases et les pectinases dans le milieu liquide.
Procédé de fertilisation agricole comprenant une étape d’apport à une plante d’un extrait aqueux d’au moins une microalgue choisie dans le groupe constitué parNannochloropsis sp., Amphora sp., Chaetoceros sp., Chlamydomonas sp., Chlorella sp., Dunaliella sp., Euglena sp., Fragilaria sp., Haematococcus sp., Isochrysis sp. Tisochrysis sp., Nannochloris sp., Nitzchi sp., Odonthella sp., Porphyridium sp., Phaeodacylum sp., Scenedesmus sp., Schyzotrium sp., Skeletonema sp.,Thalassosira sp.etTetraselmis sp.,ledit extrait pouvant être appliqué sur un sol apporté par un support de culture ou apporté par une solution de culture.
Procédé de fertilisation agricole selon la revendication précédente, comprenant en outre une étape d’application d’au moins un engrais azoté sur le sol ou sur la plante cultivée sur le sol, ladite étape d’application étant antérieure, concomitante ou postérieure à l’étape d’apport de l’extrait aqueux.
Procédé de fertilisation agricole selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l’engrais azoté est un engrais azoté comprenant une forme ammoniacale d’azote, un engrais azoté libérant de l’ammonium dans le sol, ou un engrais azoté comprenant du nitrate.
Produit à usage agricole comprenant un extrait aqueux d’au moins une microalgue choisie dans le groupe constitué parNannochloropsis sp., Amphora sp., Chaetoceros sp., Chlamydomonas sp., Chlorella sp., Dunaliella sp., Euglena sp., Fragilaria sp., Haematococcus sp., Isochrysis sp. Tisochrysis sp., Nannochloris sp., Nitzchi sp., Odonthella sp., Porphyridium sp., Phaeodacylum sp., Scenedesmus sp., Schyzotrium sp., Skeletonema sp.,Thalassosira sp.etTetraselmis sp.,et au moins un ingrédient nutritif du sol et/ou un ingrédient nutritif d’une plante cultivé sur le sol choisi parmi un engrais, un amendement, un biostimulant et un micronutriment.
Produit à usage agricole selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’il est sous forme d’un fertilisant, d’un support de culture ou d’une solution de culture.
Procédé de préparation d’un extrait aqueux d’au moins une microalgue choisie dans le groupe constitué parNannochloropsis sp., Amphora sp., Chaetoceros sp., Chlamydomonas sp., Chlorella sp., Dunaliella sp., Euglena sp., Fragilaria sp., Haematococcus sp., Isochrysis sp.Tisochrysis sp., Nannochloris sp., Nitzchi sp., Odonthella sp., Porphyridium sp., Phaeodacylum sp., Scenedesmus sp., Schyzotrium sp., Skeletonema sp.,Thalassosira sp.etTetraselmis sp.,ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
Une étape d’extraction par introduction de la microalgue dans un milieu d’extraction liquide comprenant de l’eau, l’extraction étant réalisée à une température allant de 4°C à 300°C pendant une durée suffisante pour extraire les molécules que la microalgue renferme,

Une étape de filtration pour éliminer les solides, et

Une étape de récupération du filtrat comprenant l’extrait aqueux.
Procédé selon la revendication précédente caractérisée en ce qu’au moins une enzyme choisie parmi les pectinases et les carbohydrases est ajoutée dans le milieu d’extraction liquide pendant l’étape d’extraction pour obtenir un extrait aqueux fonctionnalisé.