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FR3147292A1 - Cellules genetiquement modifiees dans lesquelles un acide nucleique codant pour des variantes de la proteine stefine a se liant specifiquement au tnfr2 ou une proteine de fusion comprenant celle-ci a ete introduite, et leurs utilisations - Google Patents

Cellules genetiquement modifiees dans lesquelles un acide nucleique codant pour des variantes de la proteine stefine a se liant specifiquement au tnfr2 ou une proteine de fusion comprenant celle-ci a ete introduite, et leurs utilisations Download PDF

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FR3147292A1
FR3147292A1 FR2303188A FR2303188A FR3147292A1 FR 3147292 A1 FR3147292 A1 FR 3147292A1 FR 2303188 A FR2303188 A FR 2303188A FR 2303188 A FR2303188 A FR 2303188A FR 3147292 A1 FR3147292 A1 FR 3147292A1
Authority
FR
France
Prior art keywords
cell
protein
stefin
genetically modified
cancer
Prior art date
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Pending
Application number
FR2303188A
Other languages
English (en)
Inventor
KyongHoon Ahn
Sung Hyun CHOI
Kinam Kim
Jong Sang Ryu
SengHo Jeon
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Affyxell Therapeutics Co Ltd
Original Assignee
Affyxell Therapeutics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Affyxell Therapeutics Co Ltd filed Critical Affyxell Therapeutics Co Ltd
Priority to FR2303188A priority Critical patent/FR3147292A1/fr
Publication of FR3147292A1 publication Critical patent/FR3147292A1/fr
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Abstract

La présente invention concerne une cellule génétiquement modifiée dans laquelle un acide nucléique codant pour une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou une protéine de fusion comprenant celle-ci est introduit dans une cellule hôte, le milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci, les préparations pharmaceutiques de la cellule génétiquement modifiée, et les utilisations de la cellule génétiquement modifiée dans le traitement de maladies immunitaires, y compris les maladies inflammatoires, l'auto-immunité et le cancer.

Description

CELLULES GENETIQUEMENT MODIFIEES DANS LESQUELLES UN ACIDE NUCLEIQUE CODANT POUR DES VARIANTES DE LA PROTEINE STEFINE A SE LIANT SPECIFIQUEMENT AU TNFR2 OU UNE PROTEINE DE FUSION COMPRENANT CELLE-CI A ETE INTRODUITE, ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention porte sur une cellule génétiquement modifiée dans laquelle un acide nucléique codant pour une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou une protéine de fusion incluant celle-ci est introduit(e) dans une cellule hôte, et l’utilisation de celle-ci.
Le système immunitaire est un réseau biologique composé de diverses cellules et organes construits pour protéger un organisme contre les invasions de l'extérieur. Le système immunitaire opère sur la base des fonctions spécifiques des organes et des cellules qui le forment et de la signalisation et de l'interaction entre les cellules. Le système immunitaire maintient l'homéostasie immunitaire en équilibrant entre la tolérance immunitaire qui régule et module l'immunité et la réponse immunitaire qui renforce l'immunité. Un déséquilibre entre la tolérance immunitaire et la réponse immunitaire peut être provoqué par diverses causes, et ce déséquilibre de l'immunité mène au développement de diverses maladies. Par exemple, lorsque le mécanisme de tolérance immunitaire est renforcé, la survenue d'un cancer ou l'invasion d'agents infectieux externes est facilitée, provoquant ainsi un cancer, des maladies infectieuses et similaires. A l'inverse, lorsque le mécanisme de réponse immunitaire est renforcé, des maladies inflammatoires telles que des maladies auto-immunes et allergies peuvent survenir.
Récemment, des recherches approfondies sur les synapses immunitaires, qui sont des systèmes de signalisation entre les cellules immunitaires constituant le système immunitaire ou entre les cellules cibles et les cellules immunitaires, sont poursuivies. Les synapses immunitaires sont composées de diverses cytokines et transmetteurs de signaux sécrétés par les cellules, ainsi que de divers récepteurs et molécules costimulateurs exprimés à la surface des cellules. Alors que divers facteurs impliqués dans le maintien de l'homéostasie du système immunitaire ont été rapportés, l'intérêt pour les agents immunothérapeutiques pour la régulation des réponses immunitaires en ciblant de tels facteurs va en augmentant. La plupart des agents immunothérapeutiques développés à ce jour sont des médicaments à anticorps dirigés contre des cytokines ou des molécules de surface cellulaire, mais leur utilisation est très limitée en raison d'une efficacité insuffisante ou d'effets secondaires. Récemment, afin de traiter plus efficacement les maladies immunitaires, des agents de thérapie cellulaire utilisant des cellules immunitaires différenciées telles que les lymphocytes T, de lymphocytes NK, etc. ou des cellules souches capables de se différencier en diverses cellules immunitaires sont en cours de développement. Les agents thérapeutiques cellulaires basés sur des cellules immunitaires différenciées telles que CAR-T ou CAR-NK sont coûteux en raison de l'utilisation de cellules autologues et ont des cibles limitées, et les cellules stromales mésenchymateuses ont un effet thérapeutique faible par rapport au coût du traitement et présentent des limites en ce qu'il est difficile d'expliquer un mécanisme d'action clair (Blood Cancer J. 11, 69 (2021); World J. Stem Cells. 2019;11(4):212-221). Le maintien du contrôle des réponses immunitaires à médiation cellulaire et humorales est une dimension importante de l'activité d'un système immunitaire sain. La régulation anormale des réactions immunitaires induites par les lymphocytes T et les lymphocytes B a été associée à un large éventail de maladies humaines, car l'augmentation inappropriée d'une réponse immunitaire contre divers autoantigènes (de l’anglais « self antigens ») et antigènes étrangers joue un rôle causal dans des pathologies telles que les troubles auto-immuns, l'asthme, les réactions allergiques, maladie du greffon contre l'hôte (GvHD, de l’anglais « graft versus host disease »), le rejet d’un greffon de transplantation et une variété d'autres troubles immunologiques incluant le cancer.
Ces maladies sont médiées par les lymphocytes T et B qui font preuve d’une réactivité contre les auto-antigènes et ceux dérivés de sources non menaçantes, telles que les allergènes ou les allogreffes de transplantation. Les lymphocytes T régulateurs (Tregs) ont évolué pour inhiber l'activité des cellules immunitaires qui réagissent de manière croisée avec les protéines du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) « du soi » (de l’anglais « self ») et d'autres antigènes bénins. Les populations de Tregs les mieux connues sont les Tregs CD4+, CD25+, FoxP3+ et les Tregs CD17+.
Les sous-types 1 et 2 du récepteur du facteur de nécrose tumorale (TNFR, de l’anglais « Tumor Necrosis Factor Receptor ») ont été identifiés spécifiquement sur la surface des Tregs. L'activation du TNFR1 par le TNF-alpha soluble amplifie la cascade de signalisation par la caspase conduisant à l'apoptose des Treg. D'autre part, l'activation du TNFR2 par le TNF-alpha principalement lié à la membrane induit une signalisation par la voie de signalisation à protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK, de l’anglais « Mitogen Activated Protein Kinase »), qui orchestre la transcription médiée par TRAF2/3 et NF-κB des gènes qui favorisent la prolifération cellulaire et échappent à l'apoptose.
L'importance du rôle du TNFR2 dans la prolifération et la fonction des Treg a été démontrée dans diverses études. Les souris déficientes en TNFR2 ont montré des nombres réduits de Tregs thymiques et périphériques (2013_Chen X, et al. PMID: 23277487), et les Tregs TNFR2 -/- n'ont pas été capables de contrôler la réponse inflammatoire in vivo (2008_Van Mierlo GJ, et al. PMID: 18292492). Chez l'humain, il a été démontré que les Treg expriment un niveau plus élevé de TNFR2 que les lymphocytes effecteurs T (2013_Okubo Y, et al. PMID: 24193319 & 2002_ Annunziato F, et al. PMID: 12163566) et les Tregs TNFR2+ ont manifesté la suppression la plus puissante de la prolifération et de la production de cytokines des lymphocytes répondeurs T cocultivés (en anglais « co-cultured T-responder cells ») (2010_Chen X, et al. PMID: 20127680). De plus, il a été démontré que TNFR2 joue un rôle dans la carcinogenèse et la croissance tumorale en médiant les réponses TNF dans les cellules immunosuppressives, permettant l'évasion immunitaire et le développement tumoral (Sheng Y., et al. doi: 10.3389/fimmu.2018.01170).
De plus, dans les maladies auto-immunes affectant le système nerveux central (SNC), en particulier la sclérose en plaques (SEP), des lymphocytes pathogènes sont générés en périphérie pour infiltrer le SNC et provoquer des inflammations locales et une démyélinisation. La démyélinisation est l'endommagement de la couche protectrice (gaine de myéline) qui entoure les fibres nerveuses dans le cerveau. Protéger contre la démyélinisation ou l'inverser sont des stratégies explorées pour lutter contre la SEP. De manière intéressante, plusieurs études ont rapporté l'implication du TNFR2 dans la neuroprotection. Par exemple, dans un modèle murin de démyélinisation induit par la cuprizone, il a été démontré que le TNFR2 est essentiel à la régénération des oligodendrocytes, les cellules principalement responsables du maintien et de la génération de la gaine de myéline qui entoure les axones, alors que la signalisation du TNF via TNFR1 favorisait la démyélinisation des nerfs (2001_HA Arnett, et al. PMID: 11600888).
En raison de son rôle dans la direction de la survie et de la croissance des cellules, le TNFR2 représente une cible attrayante pour le traitement de maladies telles que les maladies auto-immunes, la GvHD, le rejet d'allogreffe, les réactions allergiques, l’asthme et le cancer.
AFFIMER®, développé par Avacta Life Sciences Limited, est une petite molécule protéique stable d’ingénierie à partir d'une protéine stéfine A (en anglais « Stéfine A »), qui est une protéine in vivo. AFFIMER® comprend deux courtes séquences peptidiques ayant une séquence aléatoire et une séquence N-terminale, et est capable de se lier à un matériau cible avec une affinité et une spécificité élevées d'une manière similaire à un anticorps monoclonal. AFFIMER® montre une affinité et une spécificité de liaison remarquablement améliorées par rapport à la bibliothèque de peptides libres, et a une très petite taille et une stabilité élevée par rapport aux anticorps, et fait donc l'objet d'une grande attention en tant que plateforme pharmaceutique alternative de prochaine génération pour remplacer les anticorps (Brevets US n° 9447170, 8853131, etc.).
Avacta Life Sciences Limited développe des polypeptides qui se lient spécifiquement au TNFR2 par ingénierie de la protéine naturelle Stéfine A, aboutissant au développement de polypeptides AFFIMER® capables de se lier au TNFR2 avec d’excellentes affinité et spécificité.
Dans ce contexte, les présents inventeurs ont fait de grands efforts pour développer de nouveaux types d'agents thérapeutiques cellulaires qui démontrent des effets immunomodulateurs supérieurs et des effets thérapeutiques sur les maladies liées au système immunitaire sur la base de la technologie à variante de la protéine Stéfine A et d’agents immunothérapeutiques à base cellulaire, et ont ainsi développé des cellules modifiées génétiquement qui expriment la variante de la protéine Stéfine A lier spécifiquement au TNFR2 en introduisant un gène codant pour la variante de la protéine Stéfine A lier spécifiquement au TNFR2 dans les cellules immunitaires, les cellules souches ou les cellules somatiques, et ont constaté que les cellules génétiquement modifiées peuvent non seulement présenter une activité immunomodulatrice grandement amplifiée par rapport aux cellules hôtes, mais également réduisent la réponse de rejet immunitaire due à la greffe de cellules allogéniques, et également que les cellules génétiquement modifiées peuvent présenter d'excellents effets thérapeutiques sur les maladies liées au système immunitaire telles que les maladies inflammatoires et les maladies auto-immunes, ou le cancer, aboutissant ainsi dans la présente invention.
Résumé
Un objet de la présente invention est de fournir une cellule génétiquement modifiée dans laquelle un acide nucléique codant pour une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 ou une protéine de fusion incluant celle-ci est introduit(e) dans une cellule hôte.
Un autre objet de la présente invention est de fournir un milieu de culture cellulaire conditionné de la cellule génétiquement modifiée.
Un autre objet, encore, de la présente invention est de fournir un agent thérapeutique cellulaire comprenant la cellule génétiquement modifiée ou le milieu de culture cellulaire conditionné de celui-ci.
Un autre objet, toujours, de la présente invention est de fournir une utilisation de la cellule génétiquement modifiée ou de son milieu de culture cellulaire conditionné pour la fabrication d'un agent thérapeutique cellulaire.
Un autre objet, encore et toujours, de la présente invention est de fournir une utilisation de la cellule génétiquement modifiée ou de son milieu de culture cellulaire conditionné pour la prévention ou le traitement d'une maladie immunitaire ou d'un cancer.
Un autre objet, toujours, de la présente invention est de proposer une utilisation de la cellule génétiquement modifiée ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci pour une immunomodulation.
Un autre objet, toujours, de la présente invention est de proposer une utilisation de la cellule génétiquement modifiée ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci pour une culture de lymphocytes T régulateurs.
Un autre objet, toujours, de la présente invention est de proposer une utilisation de la cellule génétiquement modifiée ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci pour fabriquer une composition ou un milieu pour une culture de lymphocytes T régulateurs.
Encore un autre objet de la présente invention est de proposer une composition pour une délivrance de médicament comprenant la cellule génétiquement modifiée de la présente invention ou le milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci.
Un autre encore objet de la présente invention est de proposer l’utilisation de la cellule génétiquement modifiée de la présente invention ou le milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci pour la délivrance d’un médicament.
Afin d'accomplir les objets de la présente invention, la présente invention propose une cellule génétiquement modifiée dans laquelle un acide nucléique codant pour une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou une protéine de fusion incluant celle-ci est introduit(e) dans une cellule hôte, ou une culture de celle-ci.
La présente invention propose également un agent thérapeutique cellulaire comprenant la cellule génétiquement modifiée et/ou le milieu de culture cellulaire conditionné de celui-ci.
La présente invention propose également l’utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou de son milieu de culture cellulaire conditionné pour la fabrication d'un agent thérapeutique cellulaire.
La présente invention propose également une composition pharmaceutique pour prévenir ou traiter une maladie immunitaire ou un cancer incluant la cellule génétiquement modifiée et/ou le milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci.
La présente invention propose également l’utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou de son milieu de culture cellulaire conditionné pour la prévention ou le traitement d'une maladie immunitaire ou d'un cancer.
La présente invention propose également l’utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou de son milieu de culture cellulaire conditionné pour la fabrication d'une composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement d'une maladie immunitaire ou d'un cancer.
La présente invention propose également un procédé de prévention ou de traitement d’une maladie immunitaire ou un cancer incluant l’administration de la cellule génétiquement modifiée et/ou le milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci à un sujet.
La présente invention propose également une composition pour l’immunomodulation comprenant la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci.
La présente invention propose également une utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci pour immunomodulation.
La présente invention propose également un procédé pour l’immunomodulation comprenant l’administration de la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci à un sujet.
La présente invention propose également une composition ou milieu pour la culture d’une lymphocyte T régulateur comprenant la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci.
La présente invention propose également un procédé de culture d'un lymphocyte T régulateur comprenant, la culture de lymphocytes T régulateurs en présence de la cellule génétiquement modifiée.
La présente invention propose également une utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci pour la culture de lymphocytes T régulateurs.
La présente invention propose également une utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci pour fabriquer une composition ou un milieu pour une culture de lymphocytes T régulateurs.
La présente invention propose également une composition pour une délivrance de médicament comprenant la cellule génétiquement modifiée de la présente invention ou le milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci.
La présente invention propose également l’utilisation de la cellule génétiquement modifiée de la présente invention ou le milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci pour une délivrance du médicament.
 Fig. 1
Schéma de la stratégie de sélection pour la campagne de sélection du TNFR2 humain. Les deux bibliothèques ont subi des sélections par solution et passives. Une stringence a été introduite en diminuant la concentration en hTNFR2 au fur et à mesure que les cycles ont progressé et en augmentant le nombre d'étapes de lavage entre le cycle 1 (5x PBS/0,1 % Tween 20, 2x PBS) et le cycle 2 (15x PBS/0,1 % Tween 20, 2x PBS). (PBS, de l’anglais « Phosphate-buffered saline », soit « solution saline tamponnée ») Pour les sélections passives à l'aide de la bibliothèque de phages AFFIMER® de type 3 propriétaire d'Avacta (Brevet US n° 9.932.575), les approches par désélection et par concurrence ont été simultanément explorées. Pour l'approche de désélection, la concentration en Fc au cycle n+1 était la concentration en hTNFR2 au cycle n. Pour l'approche par concurrence, la concentration en Fc était de 10 fois l'excès molaire de la concentration en hTNFR2 spécifiée dans le cycle donné. Pour les sélections passives à l'aide de la bibliothèque de phages AFFIMER® de type 1 propriétaire d'Avacta (Brevet US n° 8 841 491), l'approche par désélection a été exclusivement réalisée et un cycle 4 a été introduit puisque le dépistage à un stade précoce des résultats du cycle 3 indiquait une diversité et un taux de succès (en anglais « hit rate ») élevés. Pour les sélections par solution, les deux bibliothèques ont subi l'approche par concurrence pour réduire l'enrichissement des polypeptides AFFIMER® présentés sur un phage de liaison au Fc. On a alterné des billes recouvertes de streptavidine et de neutravidine entre les cycles pour réduire l'enrichissement en peptides présentés sur les phages de liaison à la streptavidine et/ou à la neutravidine ;
Fig. 2
Variante de la protéine Stéfine A se liant aux cellules Expi293F™ surexprimant le TNFR2 humain ;
Fig. 3
Compilation des données des expériences de titrage. % d'inhibition à 3 µM et IC50 pour les meilleurs bloqueurs ;
Fig. 4
Résultats SEAP en double, classement de 20 clones ;
Fig. 5
Réactivité croisée de clones de la variante de la protéine Stéfine A se liant au hTNFR2 avec le TNFR2 de cynomolgus, en triple exemplaire ;
Fig. 6 et Fig. 7
et Caractérisation des eMSC (cellules stromales mésenchymateuses d’ingénierie, de l’anglais « engineered Mesenchymal Stromal Cells ») Expression de marqueurs spécifiques des cellules stromales mésenchymateuses par les eMSC CD29, CD44, CD73, CD90 et CD105 ( ), mais pas les marqueurs cellulaires CD45, CD14, CD19, HLA-DR, SSEA-3, TRA-1-60 et TRA-1-81 ( ) (les données représentent une expérience représentative) ;
Fig. 8
Analyse de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 exprimée à la surface cellulaire. L'expression de surface de lysats cellulaires des eMSC transduits avec la variante de la protéine Stéfine A a été testée par transfert Western (de l’anglais « Western blotting ») et comparés à des signaux de chaque clone de la variante de la protéine Stéfine A sur le même gel. Le transfert Western de β-actine (de l’anglais « β-actine Western blot ») sert de témoin de chargement pour les lysats de protéines de diverses eMSC ;
Fig. 9
[Fig. 9] Quantification de la variante de la protéine Stéfine A à la surface des cellules. Le nombre de variantes de la protéine Stéfine A sur la surface cellulaire a été quantifié par le kit de quantification de fluorescence QuantiBRITE PE pour une analyse par cytométrie en flux. Un anticorps pour la variante de la protéine Stéfine A conjuguée à la phycoérythrine (PE) ont été utilisés pour l'analyse par cytométrie en flux ;
Fig. 10
Une libération de SEAP (phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée, de l’anglais « Secreted embryonic alkaline phosphatase ») de HEK-Blue TNFα lignée cellulaire rapporteur déclenchée par les 7 meilleures variantes de la protéine Stéfine A à la surface des eMSC. Les cellules HEK-Blue TNFα peuplent à 20.000 cellules/puits. Les populations d’eMSC à 1/2 dilution en série à partir de 40.960 cellules/puits. Les données représentent la moyenne d’un triple exemplaire (Moyenne ± SD).
 Description détaillée
Sauf indication contraire, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont les mêmes significations que celles généralement comprises par les personnes du métier auquel appartient la présente invention. En général, la nomenclature utilisée ici est bien connue dans l'art et est typique.
Le terme, « protéine » ou « polypeptides » sont des polymères d'acides aminés de toute longueur. Le polymère peut être linéaire ou ramifié, il peut comprendre des acides aminés modifiés, et il peut être interrompu par des acides non aminés. Les termes englobent également un polymère d'acides aminés qui a été modifié naturellement ou par intervention ; par exemple, par formation de liaisons disulfure, glycosylation, lipidation, acétylation, phosphorylation, ou toute autre manipulation ou modification, telle qu’une conjugaison avec un composant de marquage. Sont également inclus dans la définition, par exemple, des polypeptides contenant au moins un analogue d'un acide aminé (y compris, par exemple, des acides aminés non naturels), ainsi que d'autres modifications connues dans le métier.
Pour la plupart, les acides aminés et séquences d’acides aminés utilisés dans l’application sont les acides aminés d’occurrence naturelle trouvés dans les protéines, ou les produits anaboliques ou cataboliques d’occurrence naturelle de tels acides aminés qui contiennent des groupes amino et carboxyle, et les isomères de ceux-ci (par ex. les stéréoisomères D- ou L-).
Les résidus d'acides aminés comprennent en outre des analogues, des dérivés et des congénères de tout acide aminé spécifique auquel il est ici fait référence, tel par exemple, le polypeptide AFFIMER® sujet (en particulier s'il est généré par synthèse chimique) peut inclure un analogue d'acide aminé tel que, par exemple, la cyanoalanine, la canavanine, l’acide djenkolique, la norleucine, la 3-phosphosérine, l’homosérine, la dihydroxy-phénylalanine, le 5-hydroxytryptophane, la 1-méthylhistidine, la 3-méthylhistidine, l’acide diaminiopimélique, l’ornithine ou l’acide diaminobutyrique.
Les termes "identique" ou pourcentage "d'identité" dans le contexte de deux ou plus acides nucléiques ou polypeptides, font référence à deux ou plus séquences ou sous-séquences qui sont les mêmes ou ont un pourcentage spécifié de nucléotides ou de résidus d'acides aminés qui sont les mêmes, lorsqu'ils sont comparés et alignés (en introduisant des intervalles, si nécessaire) pour une correspondance maximale, sans tenir compte des substitutions conservatrices d'acides aminés dans le cadre de l'identité de séquence. Dans la présente invention, deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés peuvent être « substantiellement identiques », ce qui signifie que les deux séquences sont au moins à 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % identiques. Dans certains modes de réalisation, une identité peut exister sur une longueur d'au moins environ 10, 20, 40-60, 60-80, 80-100 ou plus résidus. Lors du calcul du pourcentage d'identité, tous les résidus définis comme « Xaa » ou « X » dans une séquence de référence sont inclus dans le calcul du pourcentage d'identité, c'est-à-dire que tout acide aminé à cette position dans une séquence de comparaison correspond à la séquence de référence.
La protéine ou le polypeptide décrit ici, par exemple, une variante de la protéine Stéfine A, une protéine de fusion ou une configuration de protéine de fusion, peut comprendre non seulement la séquence d'acides aminés décrite à cet égard, mais également une protéine ou un polypeptide dans lequel une partie de la séquence d'acides aminés est substituée par substitution conservatrice.
Tel qu'utilisé ici, « substitution conservatrice » fait référence à une modification d'un polypeptide comprenant la substitution d'un ou plus acides aminés par des acides aminés ayant des propriétés biochimiques similaires qui ne provoquent pas de perte de fonctions biologiques ou biochimiques du polypeptide.
Une substitution conservatrice d'acide aminé est une substitution dans laquelle un résidu d'acide aminé est remplacé par un autre résidu d'acide aminé ayant une chaîne latérale similaire. Des familles de résidus d'acides aminés ayant des chaînes latérales similaires ont généralement été définies dans l'art, y compris des chaînes latérales basiques (par ex. lysine, arginine, histidine), des chaînes latérales acides (par ex. acide aspartique, acide glutamique), des chaînes latérales polaires non chargées (par ex. glycine, asparagine, glutamine, sérine, thréonine, tyrosine, cystéine), chaînes latérales non polaires (p. ex., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phénylalanine, méthionine, tryptophane), chaînes latérales à ramification bêta (p. ex., thréonine, valine, isoleucine) et des chaînes latérales aromatiques (par ex. tyrosine, phénylalanine, tryptophane, histidine). Par exemple, la substitution d'une phénylalanine à une tyrosine est une substitution conservatrice. Généralement, les substitutions conservatrices dans les séquences des polypeptides, protéines de la présente invention n'entraînent pas de perte fonctionnelle, par exemple, une variante de la protéine Stéfine A qui se lie spécifiquement au TNFR2 n'abroge pas sa liaison au TNFR2 par sa substitution conservatrice. Les procédés d'identification de substitutions conservatrices d'acides aminés qui n'éliminent pas la liaison sont bien connus dans le métier.
Un polypeptide, une protéine soluble, un anticorps, un polynucléotide, un vecteur, une cellule ou une composition "isolé(e)" est un polypeptide, une protéine soluble, un anticorps, un polynucléotide, un vecteur, une cellule ou une composition qui se présente sous une forme non trouvée dans la nature. Les polypeptides, protéines solubles, anticorps, polynucléotides, vecteurs, cellules ou compositions isolé(e)s incluent ceux ou celles qui ont été purifiés à un degré tel qu'ils ne sont plus sous une forme dans laquelle ils se trouvent dans la nature. Dans certains modes de réalisation, un polypeptide, une protéine soluble, un anticorps, un polynucléotide, un vecteur, une cellule ou une composition qui est isolé(e) est sensiblement pur(e).
Le TNFR2, avec le TNFR1, est un récepteur de Type 1 lié à la membrane qui se lie au TNFα. TNFR2, également connu sous le nom de p75, TNF Receptor Superfamily Member 1B ou CD120b, est codé chez l’humain sous le nom de TNFRSF1B qui exprime une protéine de 48 kDa de 461 acides aminés de longueur (UniProt P20333). Chez la souris, la protéine TNFR2 a une longueur de 474 acides aminés et une masse de 50 kDa. Il est entendu que partout où des modes de réalisation sont décrits ici avec le terme "comprenant", des modes de réalisation autrement analogues décrits avec les termes "consistant en" et/ou "consistant essentiellement en" sont également proposés. Il est également entendu que partout où des modes de réalisation sont décrits ici avec le langage "consistant essentiellement en", des modes de réalisation autrement analogues décrits avec les termes "consistant en" sont également proposés.
Telle qu'utilisée ici, la référence à « environ » ou « approximativement » une valeur ou un paramètre inclut (et décrit) des modes de réalisation qui concernent cette valeur ou ce paramètre. Par exemple, la description faisant référence à "environ X" inclut la description de "X".
Le terme "et/ou" tel qu'il est utilisé dans une phrase telle que "A et/ou B" ici est destiné à inclure à la fois A et B ; A ou B ; A (seul) ; et B (seul). De même, le terme "et/ou" tel qu'utilisé dans une phrase telle que "A, B et/ou C" est destiné à englober chacun des modes de réalisation suivants : A, B et C ; A, B ou C ; A ou C ; A ou B ; B ou C ; A et C ; A et B ; B et C ; A (seul) ; B (seul) ; et C (seul).
L'expression « au moins un » peut être utilisée de manière interchangeable avec « un ou plus ». Il convient de comprendre que "un" n'est pas limité à un mais signifie plutôt "au moins un".
Avacta a criblé des variantes de la protéine Stéfine A qui peuvent se lier au TNFR2 avec d’excellentes affinité et spécificité en utilisant la technologie de la plateforme Affimer®, et a déposé une demande de brevet pour une protéine Stéfine A qui se lie spécifiquement au TNFR2.
En conséquence, les inventions suivantes sont revendiquées dans la demande de brevet déposée par Avacta Life Sciences Limited pour les variantes de la protéine Stéfine A qui se lient spécifiquement au TNFR2, et sont exclues du champ d'application de la présente invention :
(i) une cellule modifiée par ingénierie génétique pour une utilisation uniquement dans la fabrication d'une variante de la protéine Stéfine A qui se lie spécifiquement au TNFR2 ou à une protéine de fusion comprenant celle-ci ;
(ii) une utilisation uniquement pour la fabrication d'une variante de la protéine Stéfine A qui se lie spécifiquement au TNFR2 des cellules modifiées par ingénierie génétique ou d'une protéine de fusion ou d'un conjugué contenant celle-ci ; et
(iii) un procédé pour la fabrication d'une variante de la protéine Stéfine A qui se lie spécifiquement au TNFR2 utilisant les cellules modifiées par ingénierie génétique, ou d'une protéine de fusion ou d'un conjugué contenant celle-ci.
Tel qu'il est utilisé ici, le terme "fabrication" signifie la production pour fabriquer des variantes de la protéine Stéfine A qui se lient spécifiquement au TNFR2 ou une protéine de fusion contenant celles-ci en tant que produit final.
Dans la présente invention, afin de développer des cellules ayant une excellente activité immunomodulatrice par modification génétique, une cellule génétiquement modifiée qui exprime de manière stable des variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 par introduction d’un gène codant pour les variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 a été produite.
En particulier, dans les exemples de la présente invention, il a été confirmé que des cellules modifiées par ingénierie génétique exprimant des variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 présentaient un excellent effet agoniste sur le TNFR2. La capacité de liaison spécifique au TNFR2 des variantes de la protéine Stéfine A de la présente invention peut être utilement utilisée pour cultiver ou activer une régulation des Treg et du système immunitaire (de préférence une suppression) en remplaçant le TNF-alpha.
En conséquence, dans un aspect, la présente invention porte sur une cellule génétiquement modifiée dans laquelle un acide nucléique codant pour une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 ou une protéine de fusion incluant celle-ci est introduit(e) dans une cellule hôte.
Variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TFNR2
Tel qu'utilisé ici, le terme « variante de la protéine Stéfine A (ou variantes de la protéine Stéfine A) » est un échafaudage basé sur un polypeptide de Stéfine A, ce qui signifie qu'il a une séquence qui est dérivée d'un polypeptide de Stéfine A, par exemple, un polypeptide de Stéfine A de mammifère, par exemple, un polypeptide de Stéfine A humain. Dans la présente invention, la "variante de la protéine Stéfine A" peut être utilisée de manière interchangeable sensiblement dans le même sens que "variantes de la protéine Stéfine A" ou "protéine AFFIMER®". Dans la présente invention, la "variante de la protéine Stéfine A" peut être utilisée de manière interchangeable sensiblement dans le même sens que "variantes du polypeptide Stéfine A" ou "AFFIMER®". Sauf indication contraire, la variante de la protéine Stéfine A fait référence à la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention.
Dans un mode de réalisation de la présente invention, une variante de la protéine Stéfine A qui se lie spécifiquement au TNFR2 a été développée. La « variante de la protéine Stéfine A qui se lie spécifiquement au TNFR2 » peut être utilisée de manière interchangeable avec « variante de la protéine Stéfine A » et « TNFR2 AFFIMER » dans sensiblement la même signification.
Tel qu'utilisé ici, le terme « protéine Stéfine A » ou (polypeptides Stéfine)» englobent un sous-groupe de protéines dans la superfamille de la cystatine, une famille qui englobe des protéines qui contiennent de multiples séquences de type cystatine. Le sous-groupe Stéfine (en anglais « Stefin ») de la famille des cystatines inclut des protéines à domaine unique relativement petites (environ 100 acides aminés). Elles ne subissent aucune modification post-traductionnelle connue et sont dépourvues de liaison disulfure, ce qui suggère qu'elles seront capables de se replier de manière identique dans une large gamme d'environnements extracellulaires et intracellulaires. La Stéfine A elle-même est une protéine monomérique, à chaîne unique et à domaine unique de 98 acides aminés. La structure de Stéfine A a été déterminée, facilitant la mutation rationnelle de la Stéfine A en polypeptide AFFIMER®. La seule activité biologique connue des cystatines est l'inhibition de l'activité des cathepsines, ce qui a permis de tester de manière exhaustive l'activité biologique résiduelle des protéines d’ingénierie.
Tel qu'utilisé ici, le terme « variante de la protéine Stéfine A » fait référence à une petite protéine très stable qui est une variante d’ingénierie d'un polypeptide de Stéfine. Les protéines AFFIMER® présentent deux boucles peptidiques et une séquence N-terminale qui peuvent toutes être randomisées pour se lier aux protéines cibles souhaitées avec une affinité et une spécificité élevées, d’une manière similaire aux anticorps monoclonaux. La stabilisation des deux peptides par l'échafaudage protéique de la Stéfine A limite les conformations possibles que les peptides peuvent prendre, augmentant l'affinité et la spécificité de liaison par rapport aux bibliothèques de peptides libres. Ces protéines de liaison non anticorps d’ingénierie sont conçues pour imiter les caractéristiques de reconnaissance moléculaire des anticorps monoclonaux dans différentes applications. Des variations d'autres parties de la séquence polypeptidique de Stéfine A peuvent être effectuées, de telles variations améliorant les propriétés de ces réactifs d'affinité, permettant par exemple une augmentation de la stabilité, de les rendre robustes sur une plage de températures et de pH, etc. Dans certains modes de réalisation, un polypeptide AFFIMER® inclut une séquence dérivée de Stéfine A, partageant une identifier substantielle avec une séquence de type sauvage de Stéfine A, telle que la Stéfine A humaine. Il apparaîtra à une personne du métier que des modifications peuvent être apportées à la séquence d'échafaudage sans s'écarter de la divulgation. En particulier, un polypeptide AFFIMER® peut avoir une séquence d'acides aminés qui est au moins à 25%, 35%, 45%, 55% ou 60% d'identité avec les séquences correspondantes à la Stéfine A humaine, par exemple au moins 70%, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 92 %, au moins 94 %, au moins 95 % identiques, par ex. lorsque les variations de séquence n'affectent pas négativement la capacité de l'échafaudage à se lier à la cible souhaitée (telle que TNFR2), et par ex. qui ne restaurent pas ou ne génèrent pas de fonctions biologiques telles que celles qui sont possédées par la Stéfine A de type sauvage mais qui sont abolies dans les modifications mutationnelles décrites ici. Une plate-forme de liaison spécifique à une protéine cible, utilisant une telle variante de la protéine Stéfine A est décrite en détail dans les brevets US n° 9447170 et n° 8853131. Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A peut être le fragment de la variante de la protéine Stéfine A peut se lier spécifiquement au TNFR2 comprenant une partie de la variante de la protéine Stéfine A qui se lie au TNFR2 humain.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A peut se lier spécifiquement au TNFR2, une protéine cible, avec une affinité et une spécificité élevées par ingénierie de la protéine Stéfine A.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A ne peut pas se lier au TNFR1.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peut présenter un effet agoniste sur le TNFR2.
"Agoniste" et "agoniste" font référence à des agents qui sont capables de/d’, directement ou indirectement, induire, activer, promouvoir, augmenter ou amplifier sensiblement l'activité biologique d'une cible ou d'une voie cible. "Agoniste" est utilisé ici pour inclure tout agent qui induit, active, favorise, augmente ou amplifie partiellement ou totalement l'activité d'une protéine ou d'une autre cible d'intérêt.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peut se lier au TNFR2, activant ainsi la sous-voie TNFR2.
Tel qu'utilisé ici, le terme « TNFR2 », avec TNFR1, est un récepteur de Type 1 lié à la membrane qui se lie au TNFα. TNFR2, également connu sous le nom de p75, TNF Receptor Superfamily Member 1B ou CD120b. Pour exemples, sans s’y limiter, TNFR2 est codé chez l'humain sous le nom de TNFRSF1B qui exprime une protéine de 48 kDa de 461 acides aminés de longueur (UniProt P20333). Chez la souris, la protéine TNFR2 a une longueur de 474 acides aminés et une masse de 50 kDa. Dans certains modes de réalisation, les séquences TNFR2 provenant de divers organismes sont bien connues, et une personne du métier peut facilement prédire et modifier la séquence à partir de celles-ci.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peut comprendre au moins une des boucles accessibles à solvant de la protéine Stéfine A de type sauvage ayant la capacité de se lier au TNFR2.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peut se lier au TNFR2 avec un Kd de 10-6M ou moins.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 est dérivée du polypeptide Stéfine A humain de type sauvage ayant une séquence de squelette et dans lequel l'une ou les deux parmi la boucle 2 [désignée (Xaa)n] et de la boucle 4 [désignée (Xaa)m] sont remplacés par des séquences de boucles alternatives (Xaa)n et (Xaa)m. Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se lie spécifiquement au TNFR2 peut comprendre une séquence d'acides aminés représentée par la Formule (I) :
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I)
où
FR1 comprend ou est une séquence représentée par MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TGETYGKLEA VQYKTQVX (SEQ ID NO: 1) ou une séquence polypeptidique ayant au moins 70 % (par ex. au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % ou 100 %) d'identité avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, où X est n'importe quel nombre d'acides aminés sélectionnés indépendamment, plus convenablement trois ou moins acides aminés sélectionnés indépendamment, ou plus convenablement X est V, D ou LA ; et/ou
FR2 comprend une séquence comprenant la séquence d'acides aminés de GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (SEQ ID NO : 2) ou une séquence polypeptidique ayant au moins 70 % (par ex. au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % ou 100 %) d'identité avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 2 ;
FR3 comprend ou est une séquence comprenant la séquence d'acides aminés de EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (SEQ ID NO : 3) ou une séquence polypeptidique ayant au moins 70 % (par ex. au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % ou 100 %) d'identité avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3 ; et
Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est un résidu d'acide aminé ; et
n et m sont chacun, indépendamment, un nombre entier de 3 à 20.
Dans certains modes de réalisation, FR1 est une séquence polypeptidique ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'homologie avec SEQ ID NO : 1. Dans certains modes de réalisation, FR1 est une séquence polypeptidique ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec SEQ ID NO : 1 ; dans certains modes de réalisation, FR2 est une séquence polypeptidique ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou même 98 % d'homologie avec SEQ ID NO : 2. Dans certains modes de réalisation, FR2 est une séquence polypeptidique ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec SEQ ID NO : 2 ; dans certains modes de réalisation, FR3 est une séquence polypeptidique ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou même 98 % d'homologie avec SEQ ID NO : 3. Dans certains modes de réalisation, FR3 est une séquence polypeptidique ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec SEQ ID NO: 3.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 comprend une séquence d'acides aminés représentée dans la Formule générale (II) :
MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQV-Xaa2-(Xaa)n-Xaa3-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Xaa)m-Xaa7-D-Xaa8-VLTGYQVDKNKDDELTGF (SEQ ID NO: 4)
où
Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est un résidu d'acide aminé, et
n et m sont chacun, indépendamment, un nombre entier de 3 à 20.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 comprend une séquence d'acides aminés ayant au moins 90 % (par ex. au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, au moins 99 %, ou 100 %) d'identité avec la séquence d'acides aminés de :
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVD-(Xaa)n-GTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSL-(Xaa)m-EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF (SEQ ID NO: 5), où
Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est n'importe quel nombre de résidus d'acides aminés, de manière plus appropriée trois ou moins acides aminés sélectionnés indépendamment, et
n et m sont chacun, indépendamment, un nombre entier de 3 à 20.
Dans certains modes de réalisation, Xaa1 est Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp ou Glu, plus préférablement Gly, Ala, Arg ou Lys, et plus encore plus préférablement Gly ou Arg ; Xaa2 est Val, Asp ou ‘Leu-Ala’; Xaa3 est Gly, Ala, Val, Ser ou Thr, plus préférablement Gly ou Ser ; Xaa4 est Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr, plus préférablement Arg, Lys, Asn ou Gln, et encore plus préférablement Lys ou Asn ; Xaa5 est Gly, Ala, Val, Ser ou Thr, plus préférablement Gly ou Ser ; Xaa6 est Ala, Val, Ile, Leu, Gly ou Pro, plus préférablement Ile, Leu ou Pro, et encore plus préférablement Leu ou Pro ; Xaa7 est Gly, Ala, Val, Asp ou Glu, plus préférablement Ala, Val, Asp ou Glu, et encore plus préférablement Ala ou Glu ; et Xaa8 est Ala, Val, Ile, Leu, Arg ou Lys, plus préférablement Ile, Leu ou Arg, et encore plus préférablement Leu ou Arg.
Dans certains modes de réalisation, n est de 3 à 15, 3 à 12, 3 à 9, 3 à 7, 5 à 7, 5 à 9, 5 à 12, 5 à 15, 7 à 12 ou 7 à 9.
Dans certains modes de réalisation, m est de 3 à 15, 3 à 12, 3 à 9, 3 à 7, 5 à 7, 5 à 9, 5 à 12, 5 à 15, 7 à 12 ou 7 à 9.
Dans certains modes de réalisation, Xaa, indépendamment pour chaque occurrence, est un acide aminé qui peut être ajouté à un polypeptide par expression recombinante dans une cellule procaryote ou eucaryote, et encore plus préférablement l'un des 20 acides aminés d’occurrence naturelle.
Dans certains modes de réalisation des séquences et formules ci-dessus, (Xaa)n comprend ou est une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 6 à 102, ou est une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'homologie avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 6 à 102. Dans certains modes de réalisation, (Xaa)n est une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 6 à 102.
Dans certains modes de réalisation des séquences et formules ci-dessus, (Xaa)n comprend ou est une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 6, 11, 24 à 65, ou est une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'homologie avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 6 à 102. Dans certains modes de réalisation, (Xaa)n est une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 6, 11, 24 et 65.
Dans certains modes de réalisation des séquences et formules ci-dessus, (Xaa)m comprend ou est une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 103 à 199, ou est une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'homologie avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 103 à 199. Dans certains modes de réalisation, (Xaa)m est une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 103 à 199.
Dans certains modes de réalisation des séquences et formules ci-dessus, (Xaa)m comprend ou est une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 103, 108, 121 à 162, ou est une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'homologie avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 103 à 199. Dans certains modes de réalisation, (Xaa)m est une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 103, 108, 121 et 162.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 comprend ou est une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 200 à 296, où la séquence exclut optionnellement un ou plus des vingt-et-un résidus carboxy terminaux. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide TNFR2 AFFIMER® a une séquence d'acides aminés ayant au moins 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 200 à 296, où la séquence exclut optionnellement un ou plus des vingt-et-un résidus carboxy terminaux.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 comprend ou est, plus préférablement, une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 200, 205, 218 and 259. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide TNFR2 AFFIMER® a une séquence d'acides aminés ayant au moins 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % d'identité avec une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 200, 205, 218 and 259.
Tableau 1. Variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à des séquences de TNFR2 Les 21 acides aminés C-terminaux sont des séquences supplémentaires ajoutées à des fins de clonage et d’essais : Lieur 3xAla, étiquette à dix acides aminés Myc, lieur 2xAla et étiquette 6xHis, qui sont tous facultatifs et non nécessaires pour la présente invention.
Nom du clone Boucle 2 Boucle 2
SEQ ID NO : 		Boucle 4 SEQ ID NO de Boucle 4 : Séquence protéique SEQ ID NO de protéine :
CLONE 001 GQDQWGNYA 6 PDIPHNHWH 103 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVGQDQWGNYAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLPDIPHNHWHEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 200
CLONE 003 GEDKWLNYA 7 ESEDHGQNT 104 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVGEDKWLNYAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLESEDHGQNTEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 201
CLONE 004 RNLGNIYQW 8 SLNARYALD 105 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVRNLGNIYQWGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSLNARYALDEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 202
CLONE 005 KLSYDLPPV 9 SLNKESIIV 106 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVKLSYDLPPVGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSLNKESIIVEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 203
CLONE 006 VYWDILVEL 10 ISGGYSAQT 107 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVVYWDILVELGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLISGGYSAQTEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 204
CLONE 007 GLDIWGNNA 11 ADTARTEEA 108 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVGLDIWGNNAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLADTARTEEAEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 205
CLONE 008 FVLDTNLWQ 12 RGFGNVKKV 109 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVFVLDTNLWQGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLRGFGNVKKVEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 206
CLONE 009 RLFHIWRWW 13 IHIYTDSIQ 110 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVRLFHIWRWWGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLIHIYTDSIQEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 207
CLONE 010 QEPGVWWWW 14 REGDFDYDI 111 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVQEPGVWWWWGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLREGDFDYDIEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 208
CLONE 011 LNWNDIYEH 15 SLTDQYKIS 112 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVLNWNDIYEHGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSLTDQYKISEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 209
CLONE 012 YWGVQGALD 16 NWNHEFDLV 113 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVYWGVQGALDGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLNWNHEFDLVEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 210
CLONE 013 AHDYDGYKW 17 LLSNRASEH 114 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVAHDYDGYKWGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLLLSNRASEHEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 211
CLONE 014 WQDYQWRGQ 18 YQHIDPPYS 115 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVWQDYQWRGQGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLYQHIDPPYSEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 212
CLONE 015 EWEVGDVWG 19 WWVRGFFEP 116 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVEWEVGDVWGGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLWWVRGFFEPEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 213
CLONE 016 AETAKWFFY 20 VSYIEGAWK 117 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAAETAKWFFYSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPVSYIEGAWKADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 214
CLONE 021 GELGEWQWY 21 QPPDWGWTF 118 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAGELGEWQWYSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPQPPDWGWTFADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 215
CLONE 022 GHTDHYWYL 22 THERETGFT 119 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAGHTDHYWYLSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPTHERETGFTADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 216
CLONE 023 GHTDQFWLT 23 IWQGDYDRY 120 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAGHTDQFWLTSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPIWQGDYDRYADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 217
CLONE 026 LEIPSAIIY 24 YFWGDQEHW 121 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLALEIPSAIIYSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPYFWGDQEHWADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 218
CLONE 027 NQLGNGWDA 25 YQAKPNWRH 122 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLANQLGNGWDASTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPYQAKPNWRHADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 219
CLONE 032 DSNGVSAVI 26 TWNIKPQWP 123 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLADSNGVSAVISTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPTWNIKPQWPADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 220
CLONE 035 KWHQKQLPL 27 SLNNNFKIQ 124 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVKWHQKQLPLGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSLNNNFKIQEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 221
CLONE 036 HDEHISHPV 28 DWWANINGT 125 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVHDEHISHPVGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLDWWANINGTEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 222
CLONE 037 AVNDFEPSL 29 FQLPDYSVN 126 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVAVNDFEPSLGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLFQLPDYSVNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 223
CLONE 038 QHAFDGYAW 30 LQSAIKGIF 127 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVQHAFDGYAWGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLLQSAIKGIFEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 224
CLONE 042 VGDETFDAQ 31 AIQVIGYGT 128 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVVGDETFDAQGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLAIQVIGYGTEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 225
CLONE 043 HYHERHRIQ 32 SLDKQYNII 129 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVHYHERHRIQGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSLDKQYNIIEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 226
CLONE 044 LFPEAVYWV 33 IWNDNAAQH 130 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVLFPEAVYWVGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLIWNDNAAQHEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 227
CLONE 045 VNDEGDHIA 34 YNVTGYVHW 131 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVVNDEGDHIAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLYNVTGYVHWEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 228
CLONE 049 YDTDWQQDA 35 AYWYDVQGW 132 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVYDTDWQQDAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLAYWYDVQGWEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 229
CLONE 051 WLVHAKTWL 36 LEPQYNVAN 133 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVWLVHAKTWLGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLLEPQYNVANEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 230
CLONE 052 KRELVHYWW 37 DEDVSYAYE 134 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVKRELVHYWWGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLDEDVSYAYEEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 231
CLONE 056 EWNQHAVWL 38 LEHPYDQYG 135 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVEWNQHAVWLGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLLEHPYDQYGEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 232
CLONE 057 KGWGEKTWE 39 QLDGWAEYFG 136 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVKGWGEKTWEGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLQLDGWAEYFGEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 233
CLONE 058 EWGFGLSIS 40 EYQRYWFEF 137 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVEWGFGLSISGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLEYQRYWFEFEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 234
CLONE 059 FNVQDIWNH 41 ALNHQYTIQ 138 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVFNVQDIWNHGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLALNHQYTIQEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 235
CLONE 060 TESFEQLGY 42 STGGFSWKV 139 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLATESFEQLGYSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPSTGGFSWKVADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 236
CLONE 063 EETGYHVSY 43 SLNRQYAVI 140 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVEETGYHVSYGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSLNRQYAVIEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 237
CLONE 064 HQPEVKHAW 44 PINPWNLLP 141 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVHQPEVKHAWGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLPINPWNLLPEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 238
CLONE 065 EQWDKSVDV 45 RQYYDEET 142 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVEQWDKSVDVGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLRQYYDEETEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 239
CLONE 067 VEGHEHWDW 46 DDWQQQTEV 143 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAVEGHEHWDWSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPDDWQQQTEVADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 240
CLONE 069 GPFQLQLED 47 WELVNAYFP 144 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAGPFQLQLEDSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPWELVNAYFPADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 241
CLONE 071 EPYNRLSVH 48 SLNKDYFIE 145 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVEPYNRLSVHGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSLNKDYFIEEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 242
CLONE 072 KSVHDVQQH 49 TLTRGYAVE 146 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLKSVHDVQQHGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLTLTRGYAVEEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 243
CLONE 073 DDYDDLHWW 50 TSVEYWWDA 147 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVDDYDDLHWWGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLTSVEYWWDAEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 244
CLONE 076 AWHDDDSLQ 51 NWPEVDIRW 148 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAAWHDDDSLQSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPNWPEVDIRWADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 245
CLONE 077 TEEQVLGIS 52 TLTRHYLIH 149 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVTEEQVLGISGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLTLTRHYLIHEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 246
CLONE 078 SIYDDEVND 53 FLNNAYQIF 150 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVSIYDDEVNDGTNYYIKVRADDNKYMHLKVFKSLFLNNAYQIFEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 247
CLONE 079 RWWDEEHPI 54 SLDSLYHKV 151 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVRWWDEEHPIGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSLDSLYHKVEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 248
CLONE 080 WWVEWEPEI 55 FQDNDYHIF 152 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVWWVEWEPEIGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLFQDNDYHIFEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 249
CLONE 081 FWEHTWVEQ 56 SLSEEYTII 153 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVFWEHTWVEQGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSLSEEYTIIEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 250
CLONE 085 HVWSEKHHV 57 SLTAKYEIL 154 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVHVWSEKHHVGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSLTAKYEILEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 251
CLONE 087 QHQKSLHAI 58 NLNRDYVII 155 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVQHQKSLHAIGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLNLNRDYVIIEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 252
CLONE 088 YFHYLGYEW 59 GPPWQYQKG 156 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVYFHYLGYEWGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLGPPWQYQKGEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 253
CLONE 089 YHDVDPTTT 60 NKLPTGYGV 157 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVYHDVDPTTTGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLNKLPTGYGVEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 254
CLONE 093 WIDDEQFPV 61 TLDFDYVIQ 158 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVWIDDEQFPVGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLTLDFDYVIQEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 255
CLONE 095 IKQYPAELAWW 62 FTDKNPASV 159 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVIKQYPAELAWWGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLFTDKNPASVEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 256
CLONE 096 DAHLDIHWY 63 DRIEYWFGN 160 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVDAHLDIHWYGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLDRIEYWFGNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 257
CLONE 097 WDNPKELWE 64 KEHPYDEKF 161 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVWDNPKELWEGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLKEHPYDEKFEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 258
CLONE 100 QSWDKHYQLRE 65 EVPHHAHGV 162 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAQSWDKHYQLRESTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPEVPHHAHGVADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 259
CLONE 102 WAEVAWVED 66 WETYDSYGF 163 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVWAEVAWVEDGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLWETYDSYGFEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 260
CLONE 103 DYHWLWVVG 67 SLTREYTTQ 164 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVDYHWLWVVGGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSLTREYTTQEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 261
CLONE 105 KWSQNSVTQ 68 TLERTFRVV 165 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVKWSQNSVTQGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLTLERTFRVVEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 262
CLONE 108 YWSDLWFVY 69 WKINLFAED 166 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAYWSDLWFVYSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPWKINLFAEDADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 263
CLONE 109 DQIRFQAHH 70 SLDKLYQVI 167 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVDQIRFQAHHGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSLDKLYQVIEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 264
CLONE 110 YPGEGDFAV 71 ALNRDYYII 168 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVYPGEGDFAVGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLALNRDYYIIEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 265
CLONE 111 LWLESLINQ 72 NLSRNYQLW 169 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVLWLESLINQGTNYYIKVRAGNNKYMHLKVFKSLNLSRNYQLWEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 266
CLONE 112 YFRKHVHPV 73 SIDKYYQII 170 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVYFRKHVHPVGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSIDKYYQIIEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 267
CLONE 113 DEDEYLLVS 74 FLDYFYNIG 171 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVDEDEYLLVSGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLFLDYFYNIGEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 268
CLONE 115 DHYAEHWDD 75 YKADIQWKH 172 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLADHYAEHWDDSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPYKADIQWKHADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 269
CLONE 116 WPQGQDKTH 76 DDGSLEWLHG 173 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAWPQGQDKTHSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPDDGSLEWLHGADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 270
CLONE 117 WLLDGLLWK 77 LEHQYDEFL 174 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVWLLDGLLWKGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLLEHQYDEFLEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 271
CLONE 118 KWQQLGPIQ 78 ALAKDYTLI 175 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVKWQQLGPIQGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLALAKDYTLIEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 272
CLONE 119 KDHQASHTL 79 SLSGEYIVI 176 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVKDHQASHTLGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSLSGEYIVIEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 273
CLONE 120 HYLYSLPVL 80 QDVKYWVIE 177 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVHYLYSLPVLGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLQDVKYWVIEEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 274
CLONE 124 YWAGKQLVL 81 NLALQFDTV 178 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAYWAGKQLVLSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPNLALQFDTVADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 275
CLONE 125 FWIEPGYIY 82 IHLDPELTW 179 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAFWIEPGYIYSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPIHLDPELTWADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 276
CLONE 129 LEGAQYYIS 83 FEQLYFSPK 180 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLALEGAQYYISSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPFEQLYFSPKADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 277
CLONE 130 DWAGLSFNE 84 IFPDVWEWG 181 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLADWAGLSFNESTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPIFPDVWEWGADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 278
CLONE 133 ADHGQGIIW 85 AQLWVSPDW 182 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAADHGQGIIWSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPAQLWVSPDWADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 279
CLONE 139 HQLGDYVRI 86 WLIILINND 183 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLAHQLGDYVRISTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPWLIILINNDADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 280
CLONE 141 NEEPWGEWY 87 WDPYTQLIS 184 MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLANEEPWGEWYSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPWDPYTQLISADRVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 281
CLONE 145 VYEKWLAVV 88 IPNNDIILA 185 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVVYEKWLAVVGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLIPNNDIILAEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 282
CLONE 157 DHRVPDIGI 89 GPSLYFNHF 186 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVDHRVPDIGIGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLGPSLYFNHFEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 283
CLONE 160 VSLHYVSAV 90 SEWAFFFND 187 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVVSLHYVSAVGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSEWAFFFNDEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 284
CLONE 162 VWRVSWAVE 91 WGVYEESKW 188 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVVWRVSWAVEGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLWGVYEESKWEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 285
CLONE 163 PRVEYVNNE 92 GGPNGWLYA 189 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVPRVEYVNNEGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLGGPNGWLYAEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 286
CLONE 164 IDRQSFSVV 93 WFFPPKYHP 190 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVIDRQSFSVVGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLWFFPPKYHPEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 287
CLONE 165 VDLQYVQVI 94 FNDANQIHW 191 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVVDLQYVQVIGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLFNDANQIHWEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 288
CLONE 166 VGWEGDIEE 95 SDQWPYVAI 192 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVVGWEGDIEEGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSDQWPYVAIEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 289
CLONE 171 LQWHGYLNG 96 FPIQEGIVH 193 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVLQWHGYLNGGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLFPIQEGIVHEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 290
CLONE 172 WAEQAPYVHHF 97 LTFPVREAW 194 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVWAEQAPYVHHFGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLLTFPVREAWEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 291
CLONE 174 AHGQYLIVW 98 SNEVHAGDG 195 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVAHGQYLIVWGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLSNEVHAGDGEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 292
CLONE 175 IDPIPFAVY 99 DYFKFNHEH 196 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVIDPIPFAVYGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLDYFKFNHEHEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 293
CLONE 176 WDYWRELHA 100 RYLGQAADD 197 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVWDYWRELHAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLRYLGQAADDEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 294
CLONE 177 YHLEWLQQW 101 YFDSLGWDP 198 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVYHLEWLQQWGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLYFDSLGWDPEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 295
CLONE 179 PYERWLVST 102 VDIANLFEY 199 MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVPYERWLVSTGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLVDIANLFEYEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH 296
* La séquence C' terminale des SEQ ID NO : 200 à 296, AAAEQKLISEEDL AHHHHHH, est une séquence pour la purification de la variante de la protéine Stéfine A.
Dans certains modes de réalisation, la séquence d'acides aminés ’AAAEQKLISEEDLAAHHHHHH’ exclut optionnellement parmi les SEQ ID NO : 200 à 296.
Acides nucléiques codant pour les variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2
Tel qu'utilisé ici, « acide nucléique » est un polynucléotide de n'importe quelle longueur et peut comprendre de l'ADN, de l'ARN ou une combinaison d'ADN et d'ARN. Les nucléotides peuvent être des désoxyribonucléotides, des ribonucléotides, des nucléotides ou bases modifiés, et/ou leurs analogues, ou tout substrat qui peut être incorporé dans un polymère par ADN ou ARN polymérase. Dans la présente invention, les acides nucléiques est, par exemple, mais sans s’y limiter, les acides ribonucléiques (ARN), les acides désoxyribonucléiques (ADN), les acides nucléiques à thréose (ANT), les acides nucléiques à glycol (ANG), les acides nucléiques peptidiques (PNA, de l’anglais « peptide nucleic acids »), les acides nucléiques bloqués (LNA, de l’anglais « locked nucleic acids » ; y compris les LNA ayant une configuration β-D-ribo, les a-LNA ayant une configuration a-L-ribo (un diastéréoisomère de LNA), les 2'-amino-LNA ayant une fonctionnalisation 2'-amino, et les 2'-amino-a-LNA ayant une fonctionnalisation 2'-amino), les acides nucléiques d'éthylène (ENA, de l’anglais « ethylene nucleic acids »), les acides nucléiques de cyclohexényle (CeNA, de l’anglais « cyclohexenyl nucleic acids ») ou les hybrides ou combinaisons de ceux-ci.
Tel qu'utilisé ici, « acide nucléique codant ~ » est une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine ou un polypeptide spécifique. Tel qu'utilisé ici, « acide nucléique codant ~ » est une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine ou un polypeptide spécifique. Dans l'art, lorsque la séquence d'une protéine ou d'un polypeptide spécifique est connue, les procédés de conception ou de dérivation d'un acide nucléique codant pour celle-ci sont bien connus.
Par conséquent, l'acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention peut être facilement compris à partir de la description de la « variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 ».
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 comprend une séquence d'acides aminés qui est codée par un acide nucléique ayant une séquence codante d'au moins 70 %, 75 % 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % identique à une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 297 à 393, en excluant optionnellement les nucléotides codant pour vingt-et-un acides aminés carboxy-terminaux. Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 comprend une séquence d'acides aminés qui est codée par un acide nucléique qui ayant une séquence codante qui s’hybride à une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 297 à 393, en excluant optionnellement les nucléotides codant pour les vingt-et-un acides aminés carboxy-terminaux dans des conditions strictes (tel qu’en présence de chlorure de sodium/citrate de sodium (SSC) 6X à 45 °C suivi d'un lavage dans du SSC 0,2X à 65 °C.
Tableau 2 : Séquences d'acides nucléiques codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2. Les 5' 63 nucléotides codant pour les 21 acides aminés C-terminaux sont des séquences supplémentaires ajoutées à des fins de clonage et d’essai : Lieur 3xAla, étiquette à dix acides aminés Myc, lieur 2xAla et étiquette 6xHis, qui sont tous facultatifs et non nécessaires pour la présente invention.
Nom du clone Séquence d'ADN SEQ ID NO d’ADN:
CLONE 001 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGGTCAGGATCAGTGGGGTAACTACGCAGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGCCAGATATCCCACATAACCATTGGCATGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 297
CLONE 003 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGGTGAAGATAAATGGCTGAACTACGCAGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGGAATCTGAAGATCATGGTCAGAACACCGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 298
CLONE 004 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCCGTAACCTGGGTAACATCTACCAGTGGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTCTCTGAACGCAAGATACGCACTGGATGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 299
CLONE 005 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCAAACTGTCTTACGATCTGCCACCAGTTGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTCTCTGAACAAAGAATCTATCATCGTTGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 300
CLONE 006 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGTTTACTGGGATATCCTGGTTGAACTGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGATCTCTGGTGGTTACTCTGCACAGACCGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 301
CLONE 007 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGGTCTGGATATCTGGGGTAACAACGCAGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGGCAGATACCGCAAGAACCGAAGAAGCAGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 302
CLONE 008 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCTTCGTTCTGGATACCAACCTGTGGCAGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGAGAGGTTTCGGTAACGTTAAAAAAGTTGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 303
CLONE 009 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCCGTCTGTTCCATATCTGGCGTTGGTGGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGATCCATATCTACACCGATTCTATCCAGGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 304
CLONE 010 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCCAGGAACCAGGTGTTTGGTGGTGGTGGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGAGAGAAGGTGATTTCGATTACGATATCGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 305
CLONE 011 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCCTGAACTGGAACGATATCTACGAACATGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTCTCTGACCGATCAGTACAAAATCTCTGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 306
CLONE 012 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCTACTGGGGTGTTCAGGGTGCACTGGATGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGAACTGGAACCATGAATTCGATCTGGTTGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 307
CLONE 013 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGCACATGATTACGATGGTTACAAATGGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGCTGCTGTCTAACAGAGCATCTGAACATGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 308
CLONE 014 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCTGGCAGGATTACCAGTGGCGTGGTCAGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTACCAGCATATCGATCCACCATACTCTGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 309
CLONE 015 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGAATGGGAAGTTGGTGATGTTTGGGGTGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTGGTGGGTTAGAGGTTTCTTCGAACCAGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 310
CLONE 016 ATGATCCCGAGGGGACTGTCCGAGGCCAAGCCTGCCACCCCTGAGATCCAGGAAATTGTCGACAAAGTCAAGCCGCAGCTGGAAGAGAAAACGGGCGAAACCTACGGTAAGCTGGAAGCGGTCCAGTACAAAACCCAAGTGCTAGCAGCAGAAACCGCAAAATGGTTTTTTTACTCCACCAACTATTACATTAAGGTTCGTGCCGGTGACAATAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTCAACGGCCCGGTTTCTTACATCGAAGGTGCATGGAAAGCGGACCGTGTTCTGACCGGTTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 311
CLONE 021 ATGATCCCGAGGGGACTGTCCGAGGCCAAGCCTGCCACCCCTGAGATCCAGGAAATTGTCGACAAAGTCAAGCCGCAGCTGGAAGAGAAAACGGGCGAAACCTACGGTAAGCTGGAAGCGGTCCAGTACAAAACCCAAGTGCTAGCAGGTGAACTGGGTGAATGGCAGTGGTACTCCACCAACTATTACATTAAGGTTCGTGCCGGTGACAATAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTCAACGGCCCGCAGCCACCAGATTGGGGTTGGACCTTTGCGGACCGTGTTCTGACCGGTTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 312
CLONE 022 ATGATCCCGAGGGGACTGTCCGAGGCCAAGCCTGCCACCCCTGAGATCCAGGAAATTGTCGACAAAGTCAAGCCGCAGCTGGAAGAGAAAACGGGCGAAACCTACGGTAAGCTGGAAGCGGTCCAGTACAAAACCCAAGTGCTAGCAGGTCATACCGATCATTACTGGTACCTGTCCACCAACTATTACATTAAGGTTCGTGCCGGTGACAATAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTCAACGGCCCGACCCATGAACGTGAAACCGGTTTTACCGCGGACCGTGTTCTGACCGGTTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 313
CLONE 023 ATGATCCCGAGGGGACTGTCCGAGGCCAAGCCTGCCACCCCTGAGATCCAGGAAATTGTCGACAAAGTCAAGCCGCAGCTGGAAGAGAAAACGGGCGAAACCTACGGTAAGCTGGAAGCGGTCCAGTACAAAACCCAAGTGCTAGCAGGTCATACCGATCAGTTTTGGCTGACCTCCACCAACTATTACATTAAGGTTCGTGCCGGTGACAATAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTCAACGGCCCGATCTGGCAGGGTGATTACGATCGTTACGCGGACCGTGTTCTGACCGGTTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 314
CLONE 026 ATGATCCCGAGGGGACTGTCCGAGGCCAAGCCTGCCACCCCTGAGATCCAGGAAATTGTCGACAAAGTCAAGCCGCAGCTGGAAGAGAAAACGGGCGAAACCTACGGTAAGCTGGAAGCGGTCCAGTACAAAACCCAAGTGCTAGCACTGGAAATCCCATCTGCAATCATCTACTCCACCAACTATTACATTAAGGTTCGTGCCGGTGACAATAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTCAACGGCCCGTACTTTTGGGGTGATCAGGAACATTGGGCGGACCGTGTTCTGACCGGTTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 315
CLONE 027 ATGATCCCGAGGGGACTGTCCGAGGCCAAGCCTGCCACCCCTGAGATCCAGGAAATTGTCGACAAAGTCAAGCCGCAGCTGGAAGAGAAAACGGGCGAAACCTACGGTAAGCTGGAAGCGGTCCAGTACAAAACCCAAGTGCTAGCAAACCAGCTGGGTAACGGTTGGGATGCATCCACCAACTATTACATTAAGGTTCGTGCCGGTGACAATAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTCAACGGCCCGTACCAGGCAAAACCAAACTGGCGTCATGCGGACCGTGTTCTGACCGGTTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 316
CLONE 032 ATGATCCCGAGGGGACTGTCCGAGGCCAAGCCTGCCACCCCTGAGATCCAGGAAATTGTCGACAAAGTCAAGCCGCAGCTGGAAGAGAAAACGGGCGAAACCTACGGTAAGCTGGAAGCGGTCCAGTACAAAACCCAAGTGCTAGCAGATTCTAACGGTGTTTCTGCAGTTATCTCCACCAACTATTACATTAAGGTTCGTGCCGGTGACAATAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTCAACGGCCCGACCTGGAACATCAAACCACAGTGGCCAGCGGACCGTGTTCTGACCGGTTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 317
CLONE 035 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCAAATGGCATCAGAAACAGCTGCCACTGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTCTCTGAACAACAACTTCAAAATCCAGGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 318
CLONE 036 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCCATGATGAACATATCTCTCATCCAGTTGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGGATTGGTGGGCAAACATCAACGGTACCGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 319
CLONE 037 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGCAGTTAACGATTTCGAACCATCTCTGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTTCCAGCTGCCAGATTACTCTGTTAACGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 320
CLONE 038 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCCAGCATGCATTCGATGGTTACGCATGGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGCTGCAGTCTGCAATCAAAGGTATCTTCGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 321
CLONE 042 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGTTGGTGATGAAACCTTCGATGCACAGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGGCAATCCAGGTTATCGGTTACGGTACCGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 322
CLONE 043 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCCATTACCATGAACGTCATCGTATCCAGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTCTCTGGATAAACAGTACAACATCATCGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 323
CLONE 044 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCCTGTTCCCAGAAGCAGTTTACTGGGTTGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGATCTGGAACGATAACGCAGCACAGCATGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAAGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 324
CLONE 045 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGTTAACGATGAAGGTGATCATATCGCAGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTACAACGTTACCGGTTACGTTCATTGGGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 325
CLONE 049 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCTACGATACCGATTGGCAGCAGGATGCAGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGGCATACTGGTACGATGTTCAGGGTTGGGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 326
CLONE 051 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCTGGCTGGTTCATGCAAAAACCTGGCTGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGCTGGAACCACAGTACAACGTTGCAAACGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 327
CLONE 052 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCAAACGTGAACTGGTTCATTACTGGTGGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGGATGAAGATGTTTCTTACGCATACGAAGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 328
CLONE 056 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGAATGGAACCAGCATGCAGTTTGGCTGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGCTGGAACATCCATACGATCAGTACGGTGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 329
CLONE 057 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCAAAGGTTGGGGTGAAAAAACCTGGGAAGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGCAGCTGGATGGTTGGGCAGAATACTTCGGTGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 330
CLONE 058 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGAATGGGGTTTCGGTCTGTCTATCTCTGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGGAATACCAGAGATACTGGTTCGAATTCGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 331
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CLONE 125 ATGATCCCGAGGGGACTGTCCGAGGCCAAGCCTGCCACCCCTGAGATCCAGGAAATTGTCGACAAAGTCAAGCCGCAGCTGGAAGAGAAAACGGGCGAAACCTACGGTAAGCTGGAAGCGGTCCAGTACAAAACCCAAGTGCTAGCATTTTGGATCGAACCAGGTTACATCTACTCCACCAACTATTACATTAAGGTTCGTGCCGGTGACAATAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTCAACGGCCCGATCCATCTGGATCCAGAACTGACCTGGGCGGACCGTGTTCTGACCGGTTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 373
CLONE 129 ATGATCCCGAGGGGACTGTCCGAGGCCAAGCCTGCCACCCCTGAGATCCAGGAAATTGTCGACAAAGTCAAGCCGCAGCTGGAAGAGAAAACGGGCGAAACCTACGGTAAGCTGGAAGCGGTCCAGTACAAAACCCAAGTGCTAGCACTGGAAGGTGCACAGTACTACATCTCTTCCACCAACTATTACATTAAGGTTCGTGCCGGTGACAATAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTCAACGGCCCGTTTGAACAGCTGTACTTTTCTCCAAAAGCGGACCGTGTTCTGACCGGTTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 374
CLONE 130 ATGATCCCGAGGGGACTGTCCGAGGCCAAGCCTGCCACCCCTGAGATCCAGGAAATTGTCGACAAAGTCAAGCCGCAGCTGGAAGAGAAAACGGGCGAAACCTACGGTAAGCTGGAAGCGGTCCAGTACAAAACCCAAGTGCTAGCAGATTGGGCAGGTCTGTCTTTTAACGAATCCACCAACTATTACATTAAGGTTCGTGCCGGTGACAATAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTCAACGGCCCGATCTTTCCAGATGTTTGGGAATGGGGTGCGGACCGTGTTCTGACCGGTTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 375
CLONE 133 ATGATCCCGAGGGGACTGTCCGAGGCCAAGCCTGCCACCCCTGAGATCCAGGAAATTGTCGACAAAGTCAAGCCGCAGCTGGAAGAGAAAACGGGCGAAACCTACGGTAAGCTGGAAGCGGTCCAGTACAAAACCCAAGTGCTAGCAGCAGATCATGGTCAGGGTATCATCTGGTCCACCAACTATTACATTAAGGTTCGTGCCGGTGACAATAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTCAACGGCCCGGCACAGCTGTGGGTTTCTCCAGATTGGGCGGACCGTGTTCTGACCGGTTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 376
CLONE 139 ATGATCCCGAGGGGACTGTCCGAGGCCAAGCCTGCCACCCCTGAGATCCAGGAAATTGTCGACAAAGTCAAGCCGCAGCTGGAAGAGAAAACGGGCGAAACCTACGGTAAGCTGGAAGCGGTCCAGTACAAAACCCAAGTGCTAGCACATCAGCTGGGTGATTACGTTCGTATCTCCACCAACTATTACATTAAGGTTCGTGCCGGTGACAATAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTCAACGGCCCGTGGCTGATCATCCTGATCAACAACGATGCGGACCGTGTTCTGACCGGTTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 377
CLONE 141 ATGATCCCGAGGGGACTGTCCGAGGCCAAGCCTGCCACCCCTGAGATCCAGGAAATTGTCGACAAAGTCAAGCCGCAGCTGGAAGAGAAAACGGGCGAAACCTACGGTAAGCTGGAAGCGGTCCAGTACAAAACCCAAGTGCTAGCAAACGAAGAACCATGGGGTGAATGGTACTCCACCAACTATTACATTAAGGTTCGTGCCGGTGACAATAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTCAACGGCCCGTGGGATCCATACACCCAGCTGATCTCTGCGGACCGTGTTCTGACCGGTTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 378
CLONE 145 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGTTTACGAAAAATGGCTGGCAGTTGTTGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGATCCCAAACAACGATATCATCCTGGCAGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 379
CLONE 157 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGATCATCGTGTTCCAGATATCGGTATCGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGGGTCCATCTCTGTACTTCAACCATTTCGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 380
CLONE 160 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGTTTCTCTGCATTACGTTTCTGCAGTTGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTCTGAATGGGCATTCTTCTTCAACGATGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 381
CLONE 162 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGTTTGGCGTGTTTCTTGGGCAGTTGAAGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTGGGGTGTTTACGAAGAATCTAAATGGGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 382
CLONE 163 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCCCACGTGTTGAATACGTTAACAACGAAGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGGGTGGTCCAAACGGTTGGCTGTACGCAGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 383
CLONE 164 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCATCGATCGTCAGTCTTTCTCTGTTGTTGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTGGTTCTTCCCACCAAAATACCATCCAGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 384
CLONE 165 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGTTGATCTGCAGTACGTTCAGGTTATCGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTTCAACGATGCAAACCAGATCCATTGGGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 385
CLONE 166 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGTTGGTTGGGAAGGTGATATCGAAGAAGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTCTGATCAGTGGCCATACGTTGCAATCGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 386
CLONE 171 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCCTGCAGTGGCATGGTTACCTGAACGGTGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTTCCCAATCCAGGAAGGTATCGTTCATGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 387
CLONE 172 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCTGGGCAGAACAGGCACCATACGTTCATCATTTCGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGCTGACCTTCCCAGTTAGAGAAGCATGGGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 388
CLONE 174 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCGCACATGGTCAGTACCTGATCGTTTGGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTCTAACGAAGTTCATGCAGGTGATGGTGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 389
CLONE 175 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCATCGATCCAATCCCATTCGCAGTTTACGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGGATTACTTCAAATTCAACCATGAACATGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 390
CLONE 176 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCTGGGATTACTGGCGGGAACTGCATGCAGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGAGATACCTGGGTCAGGCAGCAGATGATGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 391
CLONE 177 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCTACCATCTGGAATGGCTGCAGCAGTGGGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGTACTTCGATTCTCTGGGTTGGGATCCAGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 392
CLONE 179 ATGATTCCCGGCGGACTTTCGGAAGCCAAGCCAGCCACTCCGGAGATTCAGGAAATCGTGGACAAGGTCAAACCGCAGCTGGAAGAGAAAACCGGCGAAACCTACGGCAAACTGGAAGCCGTCCAGTATAAGACTCAAGTCGTCCCATACGAACGTTGGCTGGTTTCTACCGGTACGAACTACTACATCAAGGTTCGTGCGGGTGACAACAAGTATATGCACCTGAAAGTGTTTAAGAGCCTGGTTGATATCGCAAACCTGTTCGAATACGAAGATTTGGTGCTGACGGGCTACCAGGTTGACAAGAACAAAGATGACGAGCTGACGGGTTTCGCGGCCGCTGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAAGATCTGGCCGCGCATCACCATCACCACCAC 393
En outre, des modifications mineures peuvent également inclure de petit(e)s délétions ou ajouts - au-delà des inserts de boucle 2 et de boucle 4 décrits ci-dessus - aux séquences dérivées de la Stéfine A ou de Stéfine A décrites ici, telles que l'ajout ou la délétion de jusqu'à 10 acides aminés par rapport à la Stéfine A ou la variante de la Stéfine A.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peut se lier au TNFR2 humain en tant que monomère avec une constante de dissociation (KD) d'environ 1 uM ou moins, d'environ 100 nM ou moins, d'environ 40 nM ou moins, d’environ 20 nM ou moins, d’environ 10 nM ou moins, d’environ 1 nM ou moins, ou d’environ 0,1 nM ou moins.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peut se lier au TNFR2 humain en tant que monomère avec une constante de taux de décalage (Koff, de l’anglais « off-rate constant »), telle que mesurée par essai BIACORE™, d'environ 10-3s-1(par ex. unité de 1/seconde) ou plus lent ; d'environ 10-4s-1ou moins ou même d'environ 10-5s-1ou moins.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peut se lier au TNFR2 humain en tant que monomère avec une constante d'association (Kon), telle que mesurée par essai BIACORE™, d'au moins environ 103M-1s-1ou plus rapide ; d’au moins environ 104M-1s-1ou plus rapide ; d’au moins environ 105M-1s-1ou plus rapide ; ou même d’au moins environ 106M-1s-1ou plus rapide.
Dans certains modes de réalisation, variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peut se lier au TNFR2 humain en tant que monomère avec une CI50 dans un essai de liaison en concurrence avec le TNFR2 humain de 1 uM ou moins, d’environ 100 nM ou moins, d’environ 40 nM ou moins, d’environ 20 nM ou moins, d’environ 10 nM ou moins, d’environ 1 nM ou moins, ou d’environ 0,1 nM ou moins.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 a une température de fusion (Tm, par ex. la température à laquelle les états replié et déplié sont également peuplés) de 65°C ou plus, et de préférence d'au moins 70°C, 75°C, 80°C. °C ou même 85°C ou plus. La température de fusion est un indicateur particulièrement utile de la stabilité des protéines. Les proportions relatives de protéines repliées et non repliées peuvent être déterminées par de nombreuses techniques connues de la personne du métier, y compris la calorimétrie différentielle à balayage, la spectroscopie par différence aux UV, la fluorescence, le dichroïsme circulaire (CD de l’anglais « circular dichroism ») et la RMN (Pace et al. (1997) "Measuring the conformational stability of a protein" in Protein structure: A practical approach 2: 299-321).
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peut être exprimée dans la cellule génétiquement modifiée, et peut être sécrétée et/ou ancrée à la membrane et présentée sur la surface cellulaire.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se lie spécifiquement au TNFR2, de préférence ancrée à la membrane de la cellule génétiquement modifiée ou présentée à la surface cellulaire. En particulier, lorsque la variante de la protéine Stéfine A se lie spécifiquement au TNFR2 est présentée sur la membrane ou la surface de la cellule génétiquement modifiée, la cellule génétiquement modifiée peut avoir un effet agoniste sur le TNFR2.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peut être exprimée dans la cellule génétiquement modifiée, et peut être localisée dans un organe ou emplacement spécifique au sein de la cellule.
Dans certains modes de réalisation, lorsque la variante de la protéine Stéfine A est ancrée à une membrane ou exprimée sur une surface cellulaire, la variante de la protéine Stéfine A peut être directement/indirectement liée (ou fusionnée) à un domaine transmembranaire, et peut être exprimée sous la forme d’une protéine de fusion comprenant un domaine transmembranaire. Dans le cas d'une variante de la protéine Stéfine A ancrée à la membrane ou exprimée à la surface cellulaire, la protéine de fusion comprenant la transmembrane sera décrite en détail dans la section sur les protéines de fusion ci-dessous.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 est un monomère.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peut former un multimère.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peut former un dimère, un trimère, un tétramère, un pentamère ou plus multimère.
Dans certains modes de réalisation, le multimère peut être formé par liaison covalente ou non covalente par une interaction entre les résidus d'acides aminés de la variante de la protéine Stéfine A.
Dans certains modes de réalisation, le multimère peut être une protéine de fusion formée par un domaine de fusion fusionné avec une variante de la protéine Stéfine A.
Dans certains modes de réalisation, le multimère peut être formé par fusion en ligne d'une variante de la protéine Stéfine A, et la protéine de fusion en ligne sous la forme d'un tel multimère est décrite en détail dans la section sur les protéines de fusion ci-dessous.
Protéines de Fusion - Général
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut en outre comprendre une insertion, une substitution et/ou une délétion supplémentaire(s) qui module l'activité biologique de la variante de la protéine Stéfine A ou qui offre des fonctions biologiques supplémentaires. Par exemple, les additions, substitutions et/ou délétions peuvent moduler au moins une propriété ou activité des variantes de la protéine Stéfine A modifiée. Par exemple, les additions, substitutions ou délétions peuvent moduler l'affinité pour la variante de la protéine Stéfine A, par ex. pour la liaison au TNFR2 et l'activation de la voie TNFR2, la modulation de la demi-vie circulante, la modulation de la demi-vie thérapeutique, la modulation de la stabilité de la variante de la protéine Stéfine A, la modulation du clivage par les protéases, la modulation de la dose, la modulation de la libération ou de la biodisponibilité, la facilitation de la purification, la réduction de la désamidation, l’amélioration de la durée de péremption, ou l’amélioration ou l’altération d’une voie d'administration particulière. Par exemple, la protéine de fusion peut comprendre des séquences de clivage de protéase, des groupes réactifs, des domaines de liaison d'anticorps (y compris, mais sans s'y limiter, FLAG ou poly-His) ou d'autres séquences basées sur l'affinité (y compris, mais sans s'y limiter, FLAG, poly-His, GST, etc.) ou des molécules liées (y compris, mais sans s'y limiter, la biotine) qui améliorent la détection, la purification ou d'autres caractéristiques du polypeptide, mais ne s'y limite pas.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut être une protéine de fusion dans laquelle une séquence peptidique supplémentaire (un domaine de fusion) est fusionnée à une extrémité et/ou à l'autre extrémité de la variante de la protéine Stéfine A.
Tel qu'utilisé ici, le terme « domaine de fusion » fait référence à un domaine ou groupement supplémentaire qui peut être incorporé directement ou indirectement en étant fusionné à la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut comprendre au moins un domaine de fusion.
Dans certains modes de réalisation, le domaine de fusion, par exemple, peut être fusionné pour conférer des propriétés d'expression telles que la sécrétion à partir de la cellule, ou l'ancrage à la surface cellulaire (par ex. la membrane cellulaire), ou la localisation intracellulaire ; pour servir de substrat ou d'autre séquence de reconnaissance pour les modifications post-traductionnelles ; pour créer des structures multimériques s'agrégeant par des interactions protéine-protéine pour altérer (souvent pour étendre) la demi-vie sérique ; ou pour altérer la localisation de tissus ou l'exclusion de tissus et autres propriétés ADME (de l’anglais « Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion », soit en français « Absorption, Distribution, Métabolisme, and Excrétion ») ;pour ajouter d'autres protéines ou peptides fonctionnels.
Par exemple, certains domaines de fusion sont particulièrement utiles pour l'isolement et/ou la purification des protéines de fusion, tel que par chromatographie d'affinité. Des exemples bien connus de tels domaines de fusion qui facilitent l'expression ou la purification comprennent, à simple titre illustratif, des étiquettes d'affinité telles que la polyhistidine (par ex. une étiquette His6), l'étiquette Strep II, l'étiquette de peptide de liaison à la streptavidine (SBP, de l’anglais « streptavidin-binding peptide »), le peptide de liaison à la calmoduline (CBP, de l’anglais « calmodulin-binding peptide »), la glutathion S-transférase (GST de l’anglais « glutathione S-transferase »), la protéine de liaison au maltose (MBP, de l’anglais « maltose-binding protein »), l’étiquette S, l’étiquette HA, l’étiquette c-Myc, la thiorédoxine, la protéine A et la protéine G.
Pour que la variante de la protéine Stéfine A ou la protéine de fusion soit sécrétée, il contiendra généralement une séquence signal qui dirige le transport de la protéine vers la lumière du réticulum endoplasmique et finalement pour être sécrétée (ou retenue sur la surface cellulaire si un domaine transmembranaire ou autre signal de rétention sur la surface cellulaire). Les séquences signal (également appelées peptides signaux ou séquences leader) sont situées à l'extrémité N-terminale des polypeptides naissants. Elles ciblent le polypeptide vers le réticulum endoplasmique et les protéines sont triées vers leurs destinations, par exemple vers l'espace interne d'un organite, vers une membrane interne, vers la membrane externe de la cellule, ou vers l'extérieur de la cellule par sécrétion. De nombreuses séquences signal sont clivées de la protéine par une peptidase signal après le transport des protéines jusqu’au réticulum endoplasmique. Le clivage de la séquence signal du polypeptide survient habituellement à un site spécifique dans la séquence d'acides aminés et dépend des résidus d'acides aminés dans la séquence signal.
Dans certains modes de réalisation, le peptide signal a une longueur d'environ 5 à environ 40 acides aminés (tel qu’environ 5 à environ 7, environ 7 à environ 10, environ 10 à environ 15, environ 15 à environ 20, environ 20 à environ 25, ou environ 25 à environ 30, environ 30 à environ 35, ou environ 35 à environ 40 acides aminés de longueur).
Dans certains modes de réalisation, le peptide signal est un peptide signal natif d'une protéine humaine. Dans d'autres modes de réalisation, le peptide signal est un peptide signal non natif. Par exemple, dans certains modes de réalisation, le peptide signal non natif est un peptide signal natif mutant provenant de la protéine humaine sécrétée native correspondante, et peut inclure au moins une (tel que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou plus) substitution, insertions et/ou délétions.
Dans certains modes de réalisation, le peptide signal est un peptide signal ou un mutant de celui-ci d'une famille de protéines non IgSF, tel qu'un peptide signal d'une immunoglobuline (telle qu'une IgG chaîne lourde ou une IgG-kappa chaîne légère), une cytokine (telle que l'interleukine-2 (IL-2), ou CD33), une protéine d'albumine sérique (par ex. HSA ou albumine), une séquence signal de préprotéine azurocidine humaine, une luciférase, un trypsinogène (par ex. chymotrypsinogène ou trypsinogène) ou un autre peptide signal capable de sécréter efficacement un protéine d'une cellule. Les exemples de peptides signal incluent, mais sans s'y limiter.
Le Tableau 3 ci-dessous énumère des exemples de peptides signal qui peuvent être utilisés pour la sécrétion de variantes de la protéine Stéfine A ou de protéines de fusion de celles-ci de la présente invention, mais n'est pas limité à ceux-ci.
Tableau 3. Séquences peptidiques signal
Protéine native Séquence signal SEQ ID NO :
Albumine sérique humaine (HSA) MKWVTFISLLFLFSSAYS 483
Ig kappa chaîne légère MDMRAPAGIFGFLLVLFPGYRS 394
Préprotéine azurocidine humaine MTRLTVLALLAGLLASSRA 395
IgG chaîne lourde MELGLSWIFLLAILKGVQC 396
IgG chaîne lourde MELGLRWVFLVAILEGVQC 397
IgG chaîne lourde MKHLWFFLLLVAAPRWVLS 398
IgG chaîne lourde MDWTWRILFLVAAATGAHS 399
IgG chaîne lourde MDWTWRFLFVVAAATGVQS 400
IgG chaîne lourde MEFGLSWLFLVAILKGVQC 401
IgG chaîne lourde MEFGLSWVFLVALFRGVQC 402
IgG chaîne lourde MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS 403
Ig kappa légère MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC 404
Ig kappa légère MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA 405
Gaussia luciférase MGVKVLFALICIAVAEA 406
Chymotrypsinogène humain MAFLWLLSCWALLGTTFG 407
Interleukine-2 shumaine MQLLSCIALILALV 408
Trypsinogène-2 humain MNLLLILTFVAAAVA 409
CD33 humain MPLLLLLPLLWAGALA 410
Prolactine MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLCQGVVS 411
tPA humain MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS 412
Synthétique/Consensus MLLLLLLLLLLALALA 413
Synthétique/Consensus MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA 414
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut en outre comprendre au moins un lieur séparant la variante de la protéine Stéfine A et/ou les domaines de fusion. Dans certains modes de réalisation, le « lieur » peut être inséré entre un premier polypeptide (par ex. la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2) et un second polypeptide (par ex. une autre variante de la protéine Stéfine A ou le domaine de fusion).
Dans certains modes de réalisation, une ou plus variantes de la protéine Stéfine A et un ou plus domaines de fusion peuvent être directement lié(e/s/es) sans lieur.
De nombreux lieurs naturels présentaient des structures α-hélicoïdales. La structure en hélice α était rigide et stable, avec des liaisons hydrogène intrasegment et un squelette étroitement compacté. Par conséquent, les lieurs α-hélicoïdaux raides peuvent agir comme espaceurs rigides entre domaines protéiques. George et al. (2002) “An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding” Protein Eng. 15(11):871-9. En général, les lieurs rigides présentent des structures relativement raides en adoptant des structures α-hélicoïdales ou en contenant de multiples résidus Pro. Dans de nombreuses circonstances, ils séparent les domaines fonctionnels plus efficacement que les lieurs flexibles. La longueur des lieurs peut être facilement ajustée en modifiant le nombre de copies pour obtenir une distance optimale entre les domaines. En conséquence, des lieurs rigides sont choisis lorsque la séparation spatiale des domaines est essentielle pour préserver la stabilité ou la bioactivité des protéines de fusion. A cet égard, des lieurs formant une hélice alpha avec la séquence de (EAAAK)n (SEQ ID NO: 421) ont été appliqués à la construction de nombreuses protéines de fusion recombinantes. Un autre type de lieurs rigides a une séquence riche en Pro, (XP)n, X désignant n'importe quel acide aminé, de préférence Ala, Lys ou Glu.
A des fins purement d’illustration, des exemples de lieurs comprennent GRA, poly(Gly), poly(Ala) et ceux fournis dans le Tableau 4.
Tableau 4. Séquences de lieurs.
Séquence SEQ ID NO :
(GGGGS)n(par ex. n = 1-6) 415
(Gly)8 416
(Gly)6 417
KESGSVSSEQLAQFRSLD 418
EGKSSGSGSESKST 419
GSAGSAAGSGEF 420
(EAAAK)n(par ex. n = 1-6) 421
A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A 422
PAPAP 423
AEAAAKEAAAKA 424
(Ala-Pro)n (10 à 34 aa) 425
GGSG 426
GSGS 427
GGGS 428
S(GGS)n (n=1-7) 429
GGGSGGG 430
ESGGGGVT 431
LESGGGGVT 432
GRAQVT 433
WRAQVT 434
ARGRAQVT 435
SGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT 436
SGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI 437
SAPVLSAVATVGITIGVLARVALI 438
SSPDLSAGTAVSIMIGVLAGMALI 439
TLGGNSASYTFVSLLFSAVTLLLLC 440
SGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI 441
Dans certains modes de réalisation, outre le rôle basique dans la liaison des domaines de fusion entre eux, le lieur peut offrir de nombreux autres avantages pour la production de protéines de fusion, tels que l'amélioration de l'activité biologique, l'augmentation du rendement d'expression, et l'obtention de profils pharmacocinétiques souhaitables.
Dans certains modes de réalisation, les lieurs, de préférence, ne doivent pas affecter négativement l'expression, la sécrétion ou l'activité de chaque domaine. Dans certains modes de réalisation, les lieurs, de préférence, ne doivent pas être antigéniques et ne doivent pas provoquer de réponse immunitaire.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut comprendre un domaine de fusion sélectionné dans le groupe constitué d'une protéine de liaison à antigène (domaine), d'une cytokine, d'un domaine d'extension de demi-vie, d'un facteur de croissance, d'une enzyme, et d'un domaine de pénétration cellulaire, mais ne s'y limite pas. Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut en outre comprendre un peptide ou une protéine thérapeutique.
Dans certains modes de réalisation, le/la « peptide ou protéine thérapeutique » fait référence à tout(e) peptide ou protéine ayant un effet préventif ou thérapeutique sur une maladie spécifique. Dans certains modes de réalisation, le peptide ou la protéine thérapeutique peut être une variante de la protéine Stéfine A (qui peut être la même que, ou différente de, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention). Il ou elle comprend, sans limitation, des peptides et protéines signalé(e)s comme ayant des effets préventifs ou thérapeutiques sur une maladie spécifique dans l'art.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut comprendre un domaine de liaison.
Dans certains modes de réalisation, lorsque la protéine de fusion comprend un domaine de liaison, elle peut avoir une multispécificité capable de se lier à au moins une molécule cible en plus du TNFR2.
Dans certains modes de réalisation, le domaine de liaison peut être sélectionné dans le groupe consistant, par exemple, en une variante de la protéine Stéfine A (qui peut être la même que, ou différente de, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention), un anticorps ou fragment de celui-ci, un matériau de type anticorps, un peptide de liaison à antigène, un site de liaison à ligand, d'un récepteur (par ex. un polypeptide piège de récepteur, de l’anglais « receptor trap polypeptide »), un ligand de liaison à récepteur (par ex. une cytokine ou un facteur de croissance), un récepteur de lymphocyte T d’ingénierie, et une enzyme ou un fragment catalytique de celle-ci, mais ne s'y limite pas.
Dans certains modes de réalisation, des exemples du domaine de liaison peuvent inclure, mais sans s'y limiter, les adnectines/monocorps, les affilines, les affibodies, les affitines, l'anticaline, les atrimères, les avimères, les peptides bicycliques, le peptide C7, la centyrine, le module de liaison aux glucides (CBM, de l’anglais « carbohydrate-binding module »), les nœuds cys*, les darpin**, les el-tandem***, les fynomers****, les knottin*****, les domaines de Kunitz******, les corps O*******, la pronectine********, les scFv (de l’anglais « single chain variable fragment », soit « fragment variable simple chaîne »), la Sac7d, la Sso7d, la Tn3, et similaires (de l’anglais : *cys-knots, **darpin, ***el-tandem, ****fynomers, *****knottin, ******Kunitz domains, *******O bodies, ********pronectin).
Dans certains modes de réalisation, le domaine de fusion fusionné à la variante de la protéine Stéfine A peut être une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 identique ou différente, et/ou une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à une autre cible.
Dans certains modes de réalisation, lorsque le domaine de fusion est une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2, les deux ou plus variantes de la protéine Stéfine A incluses dans la protéine de fusion de la présente invention peuvent se lier au même site ou à des sites différents de TNFR2. Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut se lier à deux sites (biparatopique) ou à deux sites ou plus (multiparatopique) du TNFR2.
Dans certains modes de réalisation, le domaine de fusion peut être une protéine de point de contrôle immunitaire, un récepteur costimulateur immunitaire, un récepteur (ou un agoniste de récepteur), une cytokine, un facteur de croissance ou un antigène associé à une tumeur, mais ne s’y limite pas.
Dans certains modes de réalisation, la cytokine est utilisée comme terme générique pour les protéines sécrétoires qui jouent un rôle important dans la signalisation entre les cellules. Des exemples de cytokines peuvent inclure, mais sans s'y limiter, des chimiokines, interférons, lymphokines, interleukines, facteurs de nécrose tumorale, etc.
Dans certains modes de réalisation, le facteur de croissance fait référence à un matériau d’occurrence naturelle ou à une variante de celui-ci qui peut stimuler la prolifération cellulaire, la cicatrisation et/ou la différenciation cellulaire. Des exemples de facteurs de croissance peuvent inclure, mais sans s'y limiter, GH, EGF, VEGF, FGF, bFGF, HGF, BMPs, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, EPO, GDNF, IGF, KGF, BDNF, NGF, PDGF, TPO, TGF, et similaires.
Dans certains modes de réalisation, l'enzyme est utilisé en tant que terme générique pour les protéines qui catalysent une réaction biologique. Des exemples de l'enzyme peuvent inclure, mais sans s'y limiter, l'α-chymotrypsine, le lysozyme, l'urate oxydase, l'acétylcholinestérase, la lipase de Thermomyces lanuginosus, la glucose oxydase, la superoxyde dismutase, la caspase, la β-glucosidase, la laccase de Trametes versicolor, l'alcool oxydase, la Cas9, la Cas12, la Cas13, la Cas14, la nucléase à doigt de zinc, les TALLEN, le diméthylsulfoxyde, l’uricase, l’agalsidase bêta, l’agalsidase alfa, l’imiglucérase, la taliglucérase alfa, la vélaglucérase alfa, l’alglucérase, la sébélipase alpha, la laronidase, l’idursulfase, l’élosulfase alpha, la galsulfase, l’alglucosidase alpha, et similaires.
Dans certains modes de réalisation, le peptide pénétrant dans la cellule est un court peptide qui favorise la capture et l'absorption cellulaires de diverses molécules. Dans certains modes de réalisation, lorsque la protéine de fusion comprend un peptide pénétrant dans la cellule, la variante de la protéine Stéfine A peut être absorbée dans la cellule. Des exemples du peptide pénétrant dans la cellule peuvent inclure, mais sans s'y limiter, Tat, pénétratine, transporant, Pept1, Pept 2, pVEC, DPV3, DPV6, R8, R9, MPG, MAP, Bip4, C105Y, mélittine, et similaires.
Dans certains modes de réalisation, un acide nucléique codant pour la protéine de fusion est introduit dans une cellule génétiquement modifiée. La cellule génétiquement modifiée peut être peut exprimer une protéine de fusion et sécréter de manière extracellulaire, et/ou de préférence peut être ancrée sur une membrane cellulaire et présentée sur la surface cellulaire.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion est exprimée dans une cellule génétiquement modifiée et peut être localisée dans un organe ou un emplacement spécifique à l'intérieur de la cellule.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion est une protéine de fusion sécrétoire et/ou une protéine de fusion ancrée à la membrane.
Dans certains modes de réalisation, lorsque la protéine de fusion est fixée à une membrane cellulaire ou est exprimée sur une surface cellulaire, la protéine de fusion peut en outre comprendre un domaine transmembranaire. Tel qu'utilisé ici, le terme « domaine transmembranaire » fait référence à un domaine protéique qui s'étend sur la largeur d'une membrane cellulaire. Dans certains modes de réalisation, le domaine transmembranaire a de préférence une structure en hélice alpha, mais ne s’y limite pas.
Dans certains modes de réalisation, le domaine transmembranaire peut être un domaine transmembranaire dérivé de, par exemple, CD3, CD4, CD5, CD8, CD28, CD99, de l’immunoglobuline (par ex. IgG1, IgG4, IgD, etc.), du PDGFR, du PTGFRN, etc. ou d’une variante de ceux-ci, mais ne s’y limite pas.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut en outre comprendre un domaine charnière en plus du domaine transmembranaire. Tel qu'utilisé ici, le terme « domaine charnière » fait référence à une série de séquences d'acides aminés qui existent entre le domaine extracellulaire et le domaine transmembranaire d'une protéine d'ancrage membranaire. Dans certains modes de réalisation, le domaine charnière peut être situé entre la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et le domaine transmembranaire.
Dans certains modes de réalisation, le domaine charnière peut être un domaine charnière dérivé de, par exemple, CD3, CD4, CD5, CD8, CD28, CD99, de l’immunoglobuline (par ex. IgG1, IgG4, IgD, etc.), du PDGFR, du PTGFRN, etc. ou d’une variante de ceux-ci, mais ne s’y limite pas.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut en outre comprendre un domaine superhélice (de l’anglais « coiled coil »). Tel qu'utilisé ici, le terme « domaine superhélice » fait référence à un motif structurel d'une protéine dans laquelle deux à sept hélices alpha sont enroulées comme un brin de corde. De préférence, le domaine superhélice est configuré de sorte que deux ou trois hélices alpha sont enroulées.
Dans certains modes de réalisation, le domaine superhélice peut être un domaine superhélice dérivé d'une glissière à leucine (de l’anglais « leucine zipper »), d'un foldon, d'un phospholambane cardiaque, d'un analogue soluble dans l'eau d'un phospholambane membranaire, d’une COMP (protéine de matrice oligomérique du cartilage, de l’anglais « cartilage oligomeric matrix protein »), de la thrombospondine 3, de la thrombospondine 4, ou de la VASP (phosphoprotéine stimulée par un vasodilatateur, de l’anglais « vasodilator-stimulated phosphoprotein »), ou d’une variante de celles-ci, mais sans s'y limiter.
Dans certains modes de réalisation, le domaine superhélice peut être situé entre la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et le domaine transmembranaire.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut en outre comprendre un peptide ou une protéine dérivé(e) d'un virus. Dans certains modes de réalisation, des exemples du peptide ou de la protéine dérivé(e) d’un virus peuvent inclure, mais sans s'y limiter, la syncytine-1, la syncytine-2, la VSVG (glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculeuse, de l’anglais « vesicular stomatitis virus glycoprotein »), les protéines F et G de virus Nipah, les protéines F et H de virus de la rougeole, les protéines F et H de paramyxovirus Tupaia, les protéines F et G, les protéines F et H, ou les protéines F et HN de paramyxovirus, les protéines F et G de virus Hendra, les protéines F et G de Henipavirus, les protéines F et H de Morbillivirus, les protéines F et HN de respirovirus, les protéines F et HN de virus Sendai, les protéines F et HN de rubulavirus, les protéines F et HN de l'avulavirus, des variantes de celles-ci, et des combinaisons de celles-ci.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut en outre comprendre un domaine immunomodulateur ou un domaine de signalisation intracellulaire.
Dans certains modes de réalisation, le domaine immunomodulateur ou le domaine de signalisation intracellulaire est un domaine situé dans la direction cytoplasmique d'une protéine d'ancrage membranaire, et indique un site qui active ou inhibe une réponse immunitaire lorsqu'un antigène cible est lié au domaine extracellulaire.
Dans certains modes de réalisation, le domaine immunomodulateur ou le domaine de signalisation intracellulaire peut être un domaine immunomodulateur dérivé de CD3, CD28, CD40L, ICOS, OX40, 4-1BB, TNFR2, etc., mais n'est pas limité à ceux-ci.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut être un récepteur d’antigène chimérique (CAR, de l’anglais « chimeric antigen receptor »). Dans certains modes de réalisation, lorsque la protéine de fusion est un récepteur d'antigène chimérique, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peut fonctionner comme un domaine de liaison extracellulaire.
Dans certains modes de réalisation, lorsque la protéine de fusion est un récepteur d'antigène chimérique, elle peut en outre comprendre le domaine transmembranaire, le domaine charnière et le domaine de signalisation intracellulaire décrits ci-dessus, mais la présente invention n'y est pas limitée. La protéine de fusion peut être facilement conçue et préparée en changeant le domaine extracellulaire de liaison à antigène de divers récepteurs d’antigènes chimériques connus dans l'art ou d’analogues de ceux-ci en la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut en outre comprendre un domaine de localisation. Dans certains modes de réalisation, lorsque la protéine de fusion est exprimée de manière intracellulaire, il est préférable d'inclure en outre un domaine de localisation. Tel qu'utilisé ici, le terme « domaine de localisation » fait référence à une séquence peptidique ou protéique qui opère pour localiser une protéine dans un organe spécifique au sein d’une cellule ou à un emplacement spécifique au sein d’une cellule. Dans certains modes de réalisation, le domaine de localisation peut être un domaine de localisation spécifique à un organe ou un domaine de localisation de protéine intracellulaire.
Dans certains modes de réalisation, le domaine de localisation peut être un domaine de localisation spécifique au noyau, dérivé de VACM-1/CUL5, CXCR4, VP1, 53BP1, ING4, IER5, ERK5, Hrp1, UL79, EWS, PTHrP, Pho4, et rpL23a, un domaine de localisation spécifique aux mitochondries, dérivé de l'ATP synthase F1b, du polypeptide VIII de la cytochrome c oxydase, du SOD2, de la citrate synthase, du facteur d'élongation de traduction Tu, etc., ou d'un domaine de localisation des peroxysomes dérivé du PTS1, PTS2, etc., mais sans s'y limiter.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut en outre comprendre un domaine d'extension de demi-vie. Dans certains modes de réalisation, le domaine d'extension de demi-vie est un domaine ou un groupement qui est fusionné pour prolonger la demi-vie de la variante de la protéine Stéfine A de la présente invention, et des exemples du domaine d'extension de demi-vie peuvent inclure, mais ne sont pas limités à, un domaine Fc, une protéine ou un peptide de liaison au Fc, l'albumine (par ex. l’HSA), une protéine ou un peptide de liaison à l'albumine, la transferrine, une protéine ou un peptide de liaison à la transferrine, etc.
D'autres modifications, encore, qui peuvent être apportées à la séquence de la variante de la protéine Stéfine A ou de la protéine de fusion ou à un groupement polypeptidique flanquant fourni en tant que partie d'une protéine de fusion sont au moins une séquence qui est un site de modification post-traductionnelle par une enzyme. Celles-ci peuvent inclure, mais sans s'y limiter, une glycosylation, une acétylation, une acylation, une modification lipidique, une palmitoylation, une addition de palmitate, une phosphorylation, une modification de la liaison glycolipidique, etc.
Protéines de fusion multispécifiques
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion est un polypeptide multispécifique comprenant, par exemple, une première variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et au moins un domaine de liaison supplémentaire. Le domaine de liaison supplémentaire peut être une séquence polypeptidique sélectionnée parmi, pour illustrer, une seconde variante de la protéine Stéfine A (qui peut être identique ou différente de la première variante de la protéine Stéfine A), un anticorps ou un fragment de celui-ci ou un autre polypeptide de liaison à antigène, une partie de liaison à ligand, d'un récepteur (tel qu'un polypeptide piège de récepteur, de l’anglais « receptor trap polypeptide »), un ligand de liaison à récepteur (tel qu'une cytokine, un facteur de croissance ou similaire), un récepteur de lymphocyte T d’ingénierie, une enzyme ou un fragment catalytique de celle-ci.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion comprend au moins une séquence supplémentaire de la variante de la protéine Stéfine A qui est également dirigée vers le TNFR2. Le ou les variantes supplémentaires de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 peuvent être les mêmes que la première variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 ou différentes (ou un mélange de celles-ci) afin de créer une protéine de fusion multispécifique. La protéine de fusion peut se lier aux mêmes sites ou à des sites chevauchants sur TNFR2 ou peuvent se lier à deux sites différents de sorte que la protéine de fusion peut se lier simultanément à deux sites sur la même protéine TNFR2 (biparatopique) ou à plus de deux sites (multiparatopique).
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion inclut au moins un site de liaison à antigène provenant d'un anticorps. La protéine de fusion résultante peut être une chaîne unique comprenant à la fois la variante de la protéine se liant spécifiquement au TNFR2 et le site de liaison à antigène (comme dans le cas d'un scFv) ou peut être un complexe protéique multimérique comme dans un anticorps assemblé avec des chaînes lourdes et/ou légères auxquelles la séquence de l'anticorps TNFR2 a également été fusionnée.
Dans certains modes de réalisation, par rapport à une protéine de fusion multispécifique comprenant une immunoglobuline de pleine longueur, la fusion de la séquence polypeptidique AFFIMER® à l'anticorps préservera la fonction Fc de la région Fc de l'immunoglobuline. Par exemple, la protéine de fusion peut être capable de se lier, via sa partie Fc, au récepteur Fc des cellules positives au récepteur Fc. Dans certains autres modes de réalisation, la protéine de fusion peut activer la cellule positive au récepteur Fc en se liant à la cellule positive au récepteur Fc, initiant ou augmentant ainsi l'expression de cytokines et/ou d'antigènes costimulateurs. De plus, l'agent AFFIMER® peut transférer au moins un second signal d'activation nécessaire à l'activation physiologique de la lymphocyte T à la lymphocyte T via les antigènes costimulateurs et/ou les cytokines.
Dans certains modes de réalisation, résultant de la liaison de sa partie Fc à d'autres cellules qui expriment les récepteurs Fc présents à la surface des cellules effectrices du système immunitaire, telles que les cellules immunitaires, hépatocytes et cellules endothéliales, l'agent AFFIMER® peut posséder une fonction de cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC, de l’anglais « antibody-dependent cellular cytotoxicity »), un mécanisme de défense immunitaire à médiation cellulaire par lequel une cellule effectrice du système immunitaire lyse activement une cellule cible, dont l'antigène de surface membranaire a été lié par un anticorps, et par conséquent, déclenche la mort des cellules tumorales via ADCC. Dans certains autres modes de réalisation, l'agent AFFIMER® est capable de démontrer une fonction ADCC.
Comme décrit ci-dessus, outre la cytotoxicité médiée par Fc, la partie Fc peut contribuer au maintien des niveaux sériques de la protéine de fusion, critiques pour sa stabilité et sa persistance dans l'organisme. Par exemple, lorsque la partie Fc se lie aux récepteurs Fc sur les cellules endothéliales et sur les phagocytes, la protéine de fusion peut être internalisé et recyclé dans la circulation sanguine, amplifiant sa demi-vie dans le corps.
Des exemples de cibles de la variante de la protéine Stéfine A supplémentaire incluent, mais sans s'y limiter, une autre protéine de point de contrôle immunitaire et un récepteur costimulateur immunitaire (en particulier si le(s) variante(s) de la protéine Stéfine A supplémentaire(s) peu(ven)t agoniser le récepteur costimulateur), un récepteur, une cytokine, un facteur de croissance ou un antigène associé à une tumeur, purement à titre illustratif. Dans certains modes de réalisation, la partie d’immunoglobuline peut être un anticorps monoclonal dirigé contre au moins une cible auto-immune. Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 fait partie d'une protéine de fusion qui comprend un ou plus domaine(s) de liaison qui se lie(nt) à une protéine régulée positivement dans des conditions auto-immunes.
Voir William BA et al. J. Clin. Med. 2019; 8(8): 1261 pour passer en revue la variante de la protéine Stéfine A et les formats de protéines de fusion englobés par la présente divulgation.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion multispécifique peut en outre comprendre un groupement d'extension de demi-vie, tel que l'un quelconque de ceux décrits ici. Par exemple, la protéine de fusion peut comprendre au moins une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 lié par un lieur peptidique à un domaine de liaison spécifique d'au moins un domaine de liaison (par ex., la chaîne CD3ε ou CD16) de cellule immunitaire (par ex. lymphocyte T et/ou lymphocyte NK) lié en outre à un groupement d'extension de demi-vie, tel qu'un domaine fragment cristallisable (Fc) (par ex. un Fc de non liaison à FcγR), de l'albumine sérique humaine (HSA) ou une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l'HSA. Dans certains modes de réalisation, le groupement d'extension de demi-vie est un domaine fragment cristallisable (Fc). Dans certains modes de réalisation, le groupement d'extension de demi-vie est une albumine sérique humaine (HSA). Dans certains modes de réalisation, le groupement d'extension de demi-vie est une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l'HSA.
Ingénierie des propriétés PK et ADME
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut ne pas avoir une demi-vie et/ou un profil PK optimal pour la voie d'administration, telle qu'un dosage thérapeutique parentéral. Une "demi-vie" est la quantité de temps qu'il faut pour qu'une substance, telle qu'une protéine de fusion ou une variante de la protéine Stéfine A de la présente invention, perde la moitié de son activité ou de sa concentration pharmacologique ou physiologique. La demi-vie biologique peut être affectée par l'élimination, l'excrétion, la dégradation (par ex. enzymatique) de la substance, ou l'absorption et la concentration dans certains organes ou tissus du corps. Dans certains modes de réalisation, la demi-vie biologique peut être appréciée en déterminant le temps pris pour que la concentration plasmatique de la substance atteigne la moitié de son niveau d’état d'équilibre ("demi-vie plasmatique"). Pour remédier à cette lacune, une variété de stratégies générales pour prolonger la demi-vie a été utilisée dans le cas d'autres protéines thérapeutiques, y compris l'incorporation de groupements d’extension de demi-vie en tant que parties de la protéine de fusion.
Le terme « groupement prolongeant la demi-vie » fait référence à un groupement, un domaine ou une molécule pharmaceutiquement acceptable lié(e) de manière covalente (chimiquement conjugué ou fusionné) à une variante de la protéine Stéfine A pour former une protéine de fusion décrite ici, optionnellement via un amino acide non codé naturellement, directement ou via un lieur, qui empêche ou atténue la dégradation protéolytique in vivo ou autre modification diminuant l'activité de la variante de la protéine Stéfine A, augmente la demi-vie, et/ou améliore ou altère d'autres propriétés pharmacocinétiques ou biophysiques, y compris, mais non limité à, l’augmentation du taux d'absorption, la réduction de la toxicité, l’amélioration de la solubilité, la réduction de l'agrégation des protéines, l’augmentation de l'activité biologique et/ou la sélectivité des cibles de la variante de la protéine Stéfine A modifié, l’augmentation de la fabricabilité et/ou la réduction de l'immunogénicité du polypeptide AFFIMER® modifié, par rapport à un comparateur tel qu'une forme non conjuguée du polypeptide AFFIMER® modifié. Le terme « groupement prolongeant la demi-vie » comprend des groupements prolongeant la demi-vie, non protéiques, telles qu'un polymère soluble dans l'eau tel que le polyéthylène glycol (PEG) ou le PEG discret, l'hydroxyéthylamidon (HEA), un lipide, un groupe acyle ramifié ou non ramifié, un groupe acyle en C8-C30 ramifié ou non ramifié, un groupe alkyle ramifié ou non ramifié, et un groupe alkyle en C8-C30 ramifié ou non ramifié ; et des groupements prolongeant la demi-vie protéiques, telles que l'albumine sérique, la transferrine, les adnectines (par ex. les adnectines se liant à l'albumine ou prolongeant la pharmacocinétique (PKE, de l’anglais « pharmacokinetics extending »), le domaine Fc, et un polypeptide non structuré, tel que les polypeptides XTEN et PAS (par ex. les séquences polypeptidiques conformationnelles désordonnées composées des acides aminés Pro, Ala et/ou Ser), et un fragment de l'un quelconque de tels éléments.
Les groupements d’extension de demi-vie qui peuvent être utilisés dans la production des protéines de fusion de la présente divulgation sont bien connus dans l'art et peuvent être utilisés par une personne du métier pour préparer des protéines de fusion en les utilisant sans limitation.
Dans certains modes de réalisation, le groupement d’extension de demi-vie étend la demi-vie de la protéine de fusion résultante circulant dans le sérum sanguin de mammifère par rapport à la demi-vie de la protéine qui n'est pas conjuguée ainsi au groupement (par ex. par rapport au polypeptide AFFIMER® seul). Dans certains modes de réalisation, la demi-vie est étendue de plus ou de plus d'environ 1,2 fois, 1,5 fois, 2,0 fois, 3,0 fois, 4,0 fois, 5,0 fois ou 6,0 fois. Dans certains modes de réalisation, la demi-vie est étendue de plus de 6 heures, de plus de 12 heures, de plus de 24 heures, de plus de 48 heures, de plus de 72 heures, de plus de 96 heures ou de plus d'1 semaine après administration in vivo par rapport à la protéine sans le groupement d’extension de demi-vie.
Comme moyens à titre d’exemples additionnelles, les groupements prolongeant la demi-vie pouvant être utilisés dans la génération de la protéine de fusion de la divulgation incluent :
• La fusion génétique de la séquence pharmacologique AFFIMER® à une protéine ou un domaine protéique à demi-vie naturellement longue (par ex. fusion Fc, fusion transferrine [Tf] ou fusion albumine. Voir, par exemple, Beck et al. (2011) “Therapeutic Fc-fusion proteins and peptides as successful alternatives to antibodies. MAbs. 3:1–2 ; Czajkowsky et al. (2012) “Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives. EMBO Mol Med. 4:1015–28 ; Huang et al. (2009) “Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and Mimetibody technology” Curr Opin Biotechnol. 2009; 20:692–9; Keefe et al. (2013) “Transferrin fusion protein therapies: acetylcholine receptor-transferrin fusion protein as a model. Dans : Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley ; p. 345–56 ; Weimer et al. (2013) “Recombinant albumin fusion proteins. Dans: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley ; 2013. p. 297–323 ; Walker et al. (2013) “Albumin-binding fusion proteins in the development of novel long-acting therapeutics. Dans: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 325–43.
• La fusion génétique de la séquence pharmacologique AFFIMER® à un polypeptide inerte, par ex. XTEN (également connu sous le nom de PEG recombinant ou ''rPEG''), un polymère d'homoaminoacides (HAP ; HAPylation), un polymère proline-alanine-sérine (PAS ; PASylation), ou un peptide de type élastine (ELP ; ELPylation). Voir, par exemple, Schellenberger et al. (2009) “A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009; 27:1186–90; Schlapschy et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino-acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007; 20:273–84; Schlapschy (2013) PASylation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins. Protein Eng Des Sel. 26:489–501. Floss et al. (2012) “Elastin-like polypeptides revolutionize recombinant protein expression and their biomedical application. Trends Biotechnol. 28:37–45. Floss et al. “ELP-fusion technology for biopharmaceuticals. Dans: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: application and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 372–98.
• L’augmentation du rayon hydrodynamique par conjugaison chimique du peptide ou de la protéine pharmacologiquement actif pour répéter des groupements chimiques, par ex. au PEG (PEGylation) ou à l'acide hyaluronique. Voir, par exemple, Caliceti et al. (2003) “Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates” Adv Drug Delivery Rev. 55:1261–77; Jevsevar et al. (2010) PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnol J 5:113–28; Kontermann (2009) “Strategies to extend plasma half-lives of recombinant antibodies” BioDrugs. 23:93–109; Kang et al. (2009) “Emerging PEGylated drugs” Expert Opin Emerg Drugs. 14:363–80 ; et Mero et al. (2013) “Conjugation of hyaluronan to proteins” Carb Polymers. 92:2163–70.
• L’augmentation significative de la charge négative de fusion du peptide ou de la protéine pharmacologiquement actif par polysialylation ; ou, alternativement, (b) la fusion d'un peptide fortement sialylé chargé négativement (par ex. le peptide carboxy-terminal [CTP ; de la gonadotrophine chorionique (GC) chaîne b]), connu pour prolonger la demi-vie de protéines naturelles telles que la GC humaine, sous-unité b, au candidat-médicament biologique. Voir, par exemple, Gregoriadis et al. (2005) “Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids” Int J Pharm. 2005 ; 300:125–30 ; Duijkers et al. “Single dose pharmacokinetics and effects on follicular growth and serum hormones of a long-acting recombinant FSH preparation (FSHCTP) in healthy pituitary-suppressed females” (2002) Hum Reprod. 17:1987–93 ; et Fares et al. “Design of a longacting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit” (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:4304–8. 35; and Fares “Half-life extension through O-glycosylation.
• La liaison non covalente, via la fixation d'un peptide ou d’un domaine de liaison à protéine à la protéine bioactive, à des protéines normalement à longue demi-vie telles que la HSA, l'IgG humaine, la transferrine ou la fibronectine. Voir, par exemple, Andersen et al. (2011) “Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal albumin binding domain” J Biol Chem. 286:5234–41; O’Connor-Semmes et al. (2014) “GSK2374697, a novel albumin-binding domain antibody (albudAb), extends systemic exposure of extendin-4: first study in humans—PK/PD and safety” Clin Pharmacol Ther. 2014; 96:704–12. Sockolosky et al. (2014) “Fusion of a short peptide that binds immunoglobulin G to a recombinant protein substantially increases its plasma half-life in mice” PLoS One. 2014; 9:e102566.
Les fusions génétiques classiques avec des protéines sériques à longue durée de vie offrent un procédé alternatif d'extension de la demi-vie distinct de la conjugaison chimique au PEG ou aux lipides. Deux protéines majeures ont traditionnellement été utilisées comme partenaires de fusion : les domaines Fc d'anticorps et l'albumine sérique humaine (HSA, de l’anglais « human serum albumin »). Les fusions Fc impliquent la fusion de peptides, de protéines ou d'exodomaines récepteurs à la partie Fc d'un anticorps. Les fusions Fc et albumine atteignent des demi-vies prolongées non seulement en augmentant la taille du médicament peptidique, mais toutes deux tirent également parti du mécanisme de recyclage naturel du corps : le récepteur néonatal Fc, FcRn. La liaison dépendante du pH de ces protéines au FcRn empêche la dégradation de la protéine de fusion dans l'endosome. Les fusions basées sur ces protéines peuvent avoir des demi-vies de l'ordre de 3 à 16 jours, bien plus longues que les peptides PEGylés ou lipidés typiques. La fusion aux domaines Fc d'anticorps peut améliorer la solubilité et la stabilité du médicament peptidique ou protéique. Un exemple de fusion peptidique Fc est le dulaglutide, un agoniste du récepteur GLP-1 actuellement en phase avancée d'essais cliniques. L'albumine sérique humaine, la même protéine exploitée par les peptides gras acylés, est l'autre partenaire de fusion populaire. L'albiglutide est un agoniste des récepteurs GLP-1 basé sur cette plateforme. Une différence majeure entre Fc et albumine est la nature dimère de Fc par rapport à la structure monomère d’HSA conduisant à la présentation d'un peptide fusionné sous forme de dimère ou de monomère selon le choix du partenaire de fusion. La nature dimérique d'une fusion AFFIMER®-Fc peut produire un effet d'avidité si les cibles AFFIMER® sont suffisamment rapprochées ou sont elles-mêmes des dimères. Ceci peut être souhaitable ou non en fonction de la cible.
Fusions Fc
La protéine de fusion peut comprendre un domaine Fc d'immunoglobuline (un domaine Fc) ou un fragment ou une variante de celui-ci, par exemple, une région Fc fonctionnelle. Dans certains modes de réalisation, la région Fc est une région Fc de non liaison à FcγR. Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut comprendre au moins une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 liée de manière covalente par l’intermédiaire d’un squelette peptidique (directement ou indirectement) à une région Fc d'une immunoglobuline. Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut comprendre la région Fc d'un anticorps (qui facilite les fonctions effectrices et la pharmacocinétique) et la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 en tant que partie du même polypeptide. Une région Fc d'immunoglobuline peut également être liée indirectement à au moins une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2. Divers lieurs sont connus dans l'art pour une utilisation dans les protéines de fusion de l'invention. Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion comprenant le domaine Fc peut être utilisée comme dimère, et peut être utilisée comme homodimère ou hétérodimère.
Dans certains modes de réalisation, diverses séquences de domaine Fc qui peuvent être utilisées pour la fusion du domaine Fc et leur fonctionnalité sont bien connues dans l'art, et une personne versée dans l'art peut sélectionner un domaine Fc approprié en fonction de l'objectif et le fusionner à la variante de la protéine Stéfine A de la présente invention.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A peut faire partie d'une protéine de fusion avec un domaine Fc d'immunoglobuline ("domaine Fc"), ou un fragment ou une variante de celui-ci, tel qu'une région Fc fonctionnelle. Dans certains modes de réalisation, la région Fc est une région Fc de non liaison à Fc-gammaR. Dans ce contexte, une fusion Fc ("fusion-Fc"), telle qu'une protéine de fusion, est un polypeptide comprenant au moins une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à une séquence de TNFR2 liée de manière covalente par l’intermédiaire d’un squelette peptidique (directement ou indirectement) à une région Fc d'une immunoglobuline. Un fusion-Fc peut comprendre, par exemple, la région Fc d'un anticorps (qui facilite les fonctions effectrices et la pharmacocinétique) et une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à une séquence de TNFR2 en tant que partie du même polypeptide. Une région Fc d'immunoglobuline peut également être liée indirectement à au moins une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2. Divers lieurs sont connus dans l'art et peuvent optionnellement être utilisés pour lier un Fc à un polypeptide comprenant une séquence de variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 pour générer un Fc-fusion. Dans certains modes de réalisation, les fusions-Fc peuvent être dimérisées pour former des homodimères fusion-Fc, ou en utilisant des domaines Fc non identiques, pour former des hétérodimères fusion-Fc.
Dans certains modes de réalisation, un homodimère fusion-Fc comprend un dimère d'une protéine de fusion qui comprend une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 liée à un domaine Fc lié à une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 (polypeptide TNFR2 AFFIMER®-domaine Fc-polypeptide TNFR2 AFFIMER®).
Il existe plusieurs raisons de choisir la région Fc d'anticorps humains pour une utilisation dans la génération de protéines de fusion. La principale raison est de produire une protéine stable, suffisamment grande pour démontrer un profil pharmacocinétique similaire à ceux des anticorps, et de tirer parti des propriétés conférées par la région Fc ; ceci inclut la voie de récupération du récepteur FcRn néonatal impliquant le recyclage médié par FcRn de la protéine de fusion à la surface cellulaire après l’endocytose, évitant la dégradation lysosomale et résultant en une relibération dans la circulation sanguine, contribuant ainsi à une demi-vie sérique étendue. Un autre avantage évident est la liaison du domaine Fc à la Protéine A, ce qui peut simplifier le traitement en aval pendant la production de la protéine de fusion et permettre la génération d'une préparation hautement pure de la protéine de fusion.
En général, un domaine Fc comprendra la région constante d'un anticorps à l'exclusion du premier domaine d'immunoglobuline à région constante. Ainsi, le domaine Fc fait référence aux deux derniers domaines d'immunoglobuline à région constante de l'IgA, IgD et IgG, et aux trois derniers domaines d'immunoglobuline à région constante de l'IgE et IgM, et à la charnière N-terminale flexible de ces domaines. Pour les IgA et IgM, Fc peut inclure la chaîne J. Pour les IgG, Fc comprend les domaines d'immunoglobuline Cγ2 et Cγ3 et la charnière entre Cγ1 et Cγ2. Bien que les frontières du domaine Fc puissent varier, la région Fc de l'IgG humaine chaîne lourde est généralement définie comme comprenant les résidus C226 ou P230 jusqu'à son extrémité carboxyle, la numérotation étant conforme à l'index EU tel qu'énoncé dans Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, Md. (1991)). Fc peut faire référence à cette région isolément, ou à cette région dans le contexte d'un anticorps entier, d'un fragment d'anticorps ou d'une protéine de fusion de Fc. Des polymorphismes ont été observés à un certain nombre de positions Fc différentes et sont également inclus en tant que domaines Fc tels qu'utilisés ici.
Dans certains modes de réalisation, le Fc Tel qu'utilisé ici, une « région Fc fonctionnelle » fait référence à un domaine Fc ou un fragment de celui-ci qui conserve la capacité de se lier au FcRn. Une région Fc fonctionnelle se lie au FcRn mais ne possède pas de fonction effectrice. La capacité de la région Fc ou d'un fragment de celle-ci à se lier au FcRn peut être déterminée par des essais de liaison standard connus dans l'art. Des exemples de "fonctions effectrices" incluent la liaison de C1q ; la cytotoxicité dépendante du complément (CDC) ; la liaison au récepteur Fc ; la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) ; la phagocytose; la régulation à la baisse des récepteurs de surface cellulaire (par ex. récepteur des lymphocytes B ; BCR, de l’anglais « B cell receptor »), etc. De telles fonctions effectrices peuvent être appréciées en utilisant divers essais connus dans l'art pour évaluer de telles fonctions effectrices d'anticorps.
Dans un exemple de mode de réalisation, le domaine Fc est dérivé d'une sous-classe d'IgG1, cependant, d'autres sous-classes (par ex. IgG2, IgG3 et IgG4) peuvent également être utilisées. Un exemple de séquence d'un domaine Fc d'immunoglobuline IgG1 humaine pouvant être utilisé est : DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO : 442)
Dans certains modes de réalisation, la région Fc utilisée dans la protéine de fusion peut comprendre la région charnière d'une molécule Fc. Un exemple de région charnière comprend les résidus de charnière centrale couvrant les positions 1 à 16 (par ex. DKTHTCPPCPAPELLG ((SEQ ID NO : 536)) de l'exemple de séquence de domaine Fc d'immunoglobuline humaine IgG1 fourni ci-dessus. Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion contenant AFFIMER® peut adopter une structure multimérique (par ex. un dimère) en raison, en partie, des résidus de cystéine aux positions 6 et 9 au sein de la région charnière de l'exemple de séquence de domaine Fc d'immunoglobuline humaine IgG1 proposé ci-dessus. Dans d'autres modes de réalisation, la région charnière telle qu'utilisée ici peut comporter en outre des résidus dérivés des régions CH1 et CH2 qui flanquent la séquence charnière centrale de l'exemple de séquence de domaine Fc d'immunoglobuline IgG1 humaine fournie ci-dessus. Dans encore d'autres modes de réalisation, la séquence charnière peut comprendre ou consister en GSTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO : 443) ou EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO : 444).
Dans certains modes de réalisation, la séquence charnière peut inclure au moins une substitution qui confère des propriétés pharmacocinétiques, biophysiques et/ou biologiques souhaitables. Des exemples de séquences charnières incluent :
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO : 445) ;
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO : 446) ;
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 447) ;
EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 448) ;
DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO : 449) ; et
DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 450).
Dans certains modes de réalisation, le résidu P en position 18 de l'exemple de séquence de domaine Fc d'immunoglobuline IgG1 humaine fourni ci-dessus peut être remplacé par S pour retirer la fonction effectrice de Fc ; ce remplacement est exemplifié dans des charnières ayant les séquences
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 451), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 452), et DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 453).
Dans un autre mode de réalisation, les résidus DK aux positions 1-2 de l'exemple de séquence de domaine Fc d'immunoglobuline humaine IgG1 proposé ci-dessus peuvent être remplacés par GS pour éliminer un site de clip (de l’anglais « clip site ») potentiel ; ce remplacement est exposé à titre d’exemple dans la séquence EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 448). Dans un autre mode de réalisation, le C en position 103 de la région constante de la chaîne lourde de l'IgG1 humaine (par ex. les domaines CH1-CH3) peut être remplacé par S pour empêcher la formation incorrecte d’une liaison cystéine en l'absence d’une chaîne légère ; ce remplacement est illustré à titre d’exemple par EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO : 446), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 451), et EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO : 452).
Dans certains modes de réalisation, le Fc est un Fc de mammifère tel qu'un Fc humain, comprenant des domaines Fc dérivés d'IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. La région Fc peut posséder au moins environ 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % d'identité de séquence avec une région Fc native et/ou avec une région Fc d'un polypeptide parent. Dans certains modes de réalisation, la région Fc peut avoir au moins environ 90 % d'identité de séquence avec une région Fc native et/ou avec une région Fc d'un polypeptide parent.
Dans certains modes de réalisation, le domaine Fc comprend une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 454-467 ou une séquence Fc parmi les exemples fournis par les SEQ ID NO : 454-467. Il doit être compris que la lysine C-terminale d'un domaine Fc est un composant optionnel d'une protéine de fusion comprenant un domaine Fc. Dans certains modes de réalisation, le domaine Fc comprend une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 454-467, à ceci près que la lysine C-terminale de celle-ci est omise. Dans certains modes de réalisation, le domaine Fc comprend la séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 454-467. Dans certains modes de réalisation, le domaine Fc comprend la séquence d'acides aminés sélectionnée parmi les SEQ ID NO : 454-467 à ceci près que la lysine C-terminale de celle-ci est omise.
Tableau 5. Séquences du domaine Fc.
Nom Séquence SEQ ID NO :
hIgG1a_191 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 454
[Sous-type A]
hIgG1a_189 [hIgG1a_191 sans "GK" sur terminaison C ; Sous-type A]
 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 455
hIgG1a_191b
[Sous-type A/F]
 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 456
hIgG1f_1.1_191
[Contient cinq mutations ponctuelles pour altérer la fonction ADCC, sous-type F]		 DKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 457
hIgG1f_1.1_186
[Contient cinq mutations ponctuelles pour altérer la fonction ADCC et C225S (numérotation Edlemen) ; sous-type F]
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK		 458
hIgG1a_(N297G)_191
[Sous-type A]
 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 459
hIgG1a_190
[hIgG1a_190 sans "K" sur terminaison C ; Sous-type A]
 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 460
hIgG1a_(N297Q)_191
[Sous-type A]
 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 461
hIgG1a_(N297S)_191
[Sous-type A]
 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 462
hIgG1a_(N297A)_191
[Sous-type A]
 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 463
hIgG1a_(N297H)_191
[Sous-type A]
 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYHSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 464
hIgG4
 DKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 465
hIgG4_(S241P)
 DKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 466
hIgG1 (contient deux mutations ponctuelles pour altérer la fonction ADCC L20A, L21A) SEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 467
La « cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps » ou « ADCC » (en anglais « Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ») fait référence à une forme de cytotoxicité dans laquelle les Ig sécrétées liées aux récepteurs Fc (FcR) présents sur certaines cellules cytotoxiques (par ex. les lymphocytes NK (de l’anglais « Natural Killer », soit tueuses naturelles), les neutrophiles et les macrophages) permet à ces cellules effectrices cytotoxiques de se lier spécifiquement à une cellule cible porteuse d'antigènes et de tuer ensuite la cellule cible avec des cytotoxines.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion comprend une séquence de domaine Fc pour laquelle la protéine de fusion résultante n'a pas (ou qu’un niveau réduit) d'ADCC et/ou l'activation du complément ou la fonctionnalité effectrice. Par exemple, le domaine Fc peut comprendre une région constante naturellement désactivée d'isotype IgG2 ou IgG4 ou une région constante IgG1 mutée. Des exemples de modifications appropriées sont décrits dans EP0307434. Un exemple comprend les substitutions de résidus d'alanine aux positions 235 et 237 (numérotation selon l'index UE).
Dans d'autres modes de réalisation, la protéine de fusion comprend une séquence de domaine Fc pour laquelle la protéine de fusion résultante conservera une partie ou la totalité de la fonctionnalité Fc, par exemple sera capable d'une ou des deux activités ADCC et CDC, comme par exemple si la protéine de fusion comprend le domaine Fc de l'IgG1 ou IgG3 humaine. Les niveaux de fonction effectrice peuvent varier selon des techniques connues, par exemple par des mutations dans le domaine CH2, par exemple où le domaine IgG1 CH2 a au moins une mutation en des positions sélectionnées parmi 239 et 332 et 330, par exemple les mutations étant sélectionnées parmi S239D et I332E et A330L de telle sorte que l'anticorps ait une fonction effectrice amplifiée, et/ou par exemple en altérant le profil de glycosylation de la protéine de liaison à antigène de la divulgation de sorte qu'il y ait une réduction de la fucosylation de la région Fc.
Fusions d'albumine
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion est une protéine de fusion comprenant, en plus d'au moins une variante de la protéine Stéfine A, une séquence d'albumine ou un fragment d'albumine. Dans d'autres modes de réalisation, l'agent AFFIMER® est conjugué à la séquence d'albumine ou à un fragment d'albumine par l’intermédiaire d’une liaison chimique autre qu'une incorporation dans la séquence polypeptidique incluant la variante de la protéine Stéfine A. Dans certains modes de réalisation, l'albumine, une variante de l'albumine ou un fragment d'albumine est de l’albumine sérique humaine (HSA), une variante de l’albumine sérique humaine ou un fragment d’albumine sérique humaine. Des protéines sériques d'albumine comparables à l'HSA se trouvent, par ex. chez les singes cynomolgus, les vaches, chiens, lapins et rats. Parmi les espèces non humaines, l'albumine sérique bovine (BSA, de l’anglais « bovine serum albumin ») est structurellement la plus similaire à l’HSA. Voir, par ex., Kosa et al., (2007) J Pharm Sci. 96(11):3117-24. La présente divulgation envisage l'utilisation d'albumine provenant d'espèces non humaines, dont, mais sans s'y limiter, une séquence d'albumine dérivée de l’albumine sérique cyno ou de l’albumine sérique bovine.
L’HSA mature, un polypeptide de 585 acides aminés (env. 67 kDa) ayant une demi-vie sérique d'environ 20 jours, est principalement responsable du maintien de la pression artérielle osmotique colloïdale, du pH sanguin, et du transport et de la distribution de nombreux ligands endogènes et exogènes. La protéine a trois domaines structurellement homologues (domaines I, II et III), est presque entièrement de conformation alpha-hélicoïdale et est hautement stabilisée par 17 ponts disulfure. Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut être une protéine de fusion d'albumine comprenant au moins une variante de la protéine Stéfine A et la séquence pour l'albumine sérique humaine mature (SEQ ID NO : 468) ou une variante ou un fragment de celle-ci qui maintient les propriétés PK et/ou de biodistribution de l'albumine mature dans la mesure souhaitée dans la protéine de fusion.
La séquence d'albumine peut être séparée de la séquence de la variante de la protéine Stéfine A ou d'autres séquences flanquantes dans la protéine de fusion par utilisation de séquences de lieurs comme décrit ci-dessus.
Sauf indication contraire, la référence ici à « l'albumine » ou à « l'albumine mature » est prévue pour se référer à l'HSA. Cependant, il est à noter que la HSA pleine longueur a un peptide signal de 18 acides aminés (MKWVTFISLLFLFSSAYS (SEQ ID NO : 483) suivi d'un prodomaine de 6 acides aminés (RGVFRR) (SEQ ID NO : 469) ; ce peptide de 24 résidus d'acides aminés peut être appelé préprodomaine. Les protéines de fusion AFFIMER®-HSA peuvent être exprimées et sécrétées en utilisant le préprodomaine HSA dans la séquence codante des protéines recombinantes. En variante, la protéine de fusion AFFIMER®-HSA peut être exprimée et sécrétée par inclusion d'autres séquences signal de sécrétion, telles que décrites ci-dessus.
Dans des modes de réalisation alternatifs, plutôt que fournis en tant que partie d'une protéine de fusion avec la variante de la protéine Stéfine A, le polypeptide d'albumine sérique peut être couplé de manière covalente au polypeptide contenant la variante de la protéine Stéfine A par l’intermédiaire d’une liaison autre qu'une liaison amide de squelette, tel que réticulé par l’intermédiaire d’une conjugaison chimique entre des chaînes latérales d'acides aminés sur chacun parmi le polypeptide d'albumine et le polypeptide contenant la variante de la protéine Stéfine A.
Dans certains modes de réalisation, un procédé de modification chimique qui peut être appliqué dans la génération de la variante de la protéine Stéfine A ou de la protéine de fusion sujet pour augmenter la demi-vie des protéines est la lipidation, qui implique la liaison covalente d'acides gras aux chaînes latérales peptidiques. Conçue à l'origine et développée en tant que procédé pour étendre la demi-vie de l'insuline, la lipidation partage le même mécanisme de base d’extension de la demi-vie que la PEGylation, à savoir l'augmentation du rayon hydrodynamique pour réduire la filtration rénale. Cependant, le groupement lipidique est lui-même relativement petit et l'effet est médié indirectement par la liaison non covalente du groupement lipidique à de l'albumine circulante. Une conséquence de la lipidation est qu'elle réduit la solubilité dans l'eau du peptide, mais l'ingénierie du lieur entre le peptide et l'acide gras peut moduler cela, par exemple en utilisant du glutamate ou des mini PEG au sein du lieur. L'ingénierie des lieurs et la variation du groupement lipidique peuvent affecter l'auto-agrégation, ce qui peut contribuer à augmenter la demi-vie en ralentissant la biodistribution, indépendamment de l'albumine. Voir, par exemple, Jonassen et al. (2012) Pharm Res. 29(8):2104-14.
D'autres exemples de groupements de liaison à l'albumine à utiliser dans la génération de certains protéines de fusion incluent les adnectines de liaison à l'albumine (PKE2) (voir WO2011140086 "Serum Albumin Binding Molecules", WO2015143199 "Serum albumin-binding Fibronectin Type III Domains" et WO2017053617 "Fast-off rate serum albumin binding fibronectin type iii domains"), le domaine de liaison à l'albumine 3 (ABD3, de l’anglais « albumin binding domain 3 ») de la protéine G de la souche G148 de Streptocoque, et l'anticorps du domaine de liaison à l'albumine GSK2374697 (« AlbudAb ») ou la portion de nanocorps de liaison à l'albumine de l'ATN-103 (Ozoralizumab).
AFFIMER® XT
Dans certains modes de réalisation, la molécule qui se lie à une protéine sérique telle que l’HSA comprend une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l’HSA. Des exemples d'une telle variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l’HSA peuvent être trouvés dans WO2022/023540. La variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l’HSA proposée ici, dans certains modes de réalisation, est liée à une autre molécule et prolonge la demi-vie de cette molécule (par ex. un polypeptide thérapeutique). Il a été démontré que ces variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l’HSA dans Alluda des études pharmacocinétiques (PK, de l’anglais « PharmacoKinetic ») in vivo prolongent, d’une manière contrôlée, la demi-vie sérique de toute autre variante de la protéine Stéfine A thérapeutique à laquelle elle est conjuguée en une seule fusion génétique, par ex. qui peut être faite dans E. Coli. Les polypeptides AFFIMER® XT™ peuvent également être utilisés pour prolonger la demi-vie d'autres agents thérapeutiques peptidiques ou protéiques, tels que la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention.
Dans certains modes de réalisation, une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l’HSA prolonge la demi-vie sérique du polypeptide TNFR2 AFFIMER® in vivo. Par exemple, une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l’HSA peut prolonger la demi-vie du polypeptide TNFR2 AFFIMER® d'au moins 2 fois, par rapport à la demi-vie de la molécule non liée à une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l'HSA. Dans certains modes de réalisation, une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l’HSA prolonge la demi-vie de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 d'au moins 3 fois, au moins 4 fois, au moins 5 fois, au moins 6 fois, au moins 7 fois, au moins 8 fois, au moins 9 fois, au moins 10 fois, au moins 20 fois, ou au moins 30 fois, par rapport à la demi-vie de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 non liée à une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l’HSA. Dans certains modes de réalisation, une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l'HSA prolonge la demi-vie de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de 2 à 5 fois, de 2 à 10 fois, de 3 à 5 fois, de 3 fois à 10 fois, de 15 fois à 5 fois, de 4 fois à 10 fois, ou de 5 fois à 10 fois, par rapport à la demi-vie de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 non liée à une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l’HSA. Dans certains modes de réalisation, une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l’HSA prolonge la demi-vie de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 d'au moins 6 heures, d'au moins 12 heures, d'au moins 24 heures, d'au moins 48 heures, d’au moins 72 heures, d’au moins 96 heures, par exemple, au moins 1 semaine après l’administration in vivo, par rapport à la demi-vie de la molécule non liée à une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l’HSA.
Une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l’HSA comprend un polypeptide AFFIMER® dans lequel au moins une des boucles accessibles à solvant provient de la protéine Stéfine A de type sauvage ayant des séquences d'acides aminés pour permettre à un polypeptide AFFIMER® de se lier à l'HSA, sélectivement, et dans certains modes de réalisation, avec un Kd de 10-6M ou moins.
Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l'HSA est dérivée de la protéine Stéfine A humaine de type sauvage ayant une séquence squelette et dans laquelle l'une ou les deux parmi la boucle 2 (désignée (Xaa)n) et la boucle 4 (désignée (Xaa)m) sont remplacées par des séquences de boucles alternatives (Xaa)n et (Xaa)m, pour avoir la Formule générale (I) :
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I),
où FR1 est une séquence d’acides aminés ayant au moins 70 % (par ex. au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % ou 100 %) d'identité avec MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA (SEQ ID NO : 470) ; FR2 est une séquence d’acides aminés ayant au moins 70 % (par ex. au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % ou 100 %) d'identité avec GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (SEQ ID NO : 2) ; FR3 est une séquence d’acides aminés ayant au moins 70 % (par ex. au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % ou 100 %) d'identité avec EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (SEQ ID NO : 3) ; Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est un acide aminé ; et n est un nombre entier de 3 à 20, et m est un nombre entier de 3 à 20. Des variantes supplémentaires de cette structure générale peuvent être trouvées dans WO2022/023540.
Dans tous les modes de réalisation, chaque acide aminé de (Xaa)n peut être identique ou sélectionné parmi n'importe quel acide aminé. Il en va de même pour (Xaa)m.
Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion comprend en outre une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l'HSA comprenant une séquence d'acides aminés sélectionnée parmi l'une quelconque des SEQ ID NO : 471-477 (Tableau 6). Dans certains modes de réalisation, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 a une demi-vie sérique prolongée et comprend une séquence d'acides aminés qui est d'au moins 70 %, 75 % 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou même 98 % identique à une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NO : 471-477 (Tableau 6). Une variante supplémentaire de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement aux séquences HSA pour une utilisation avec la présente invention peut être trouvée dans WO2022/023540.
Tableau 6. Exemple de variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à des Séquences d’HSA
Séquence SEQ ID NO :
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLADWWQAKWPHSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPYKVHQSSGGADRVLTGYQVDKNKDDELTGF 471
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAGYWAAKWPGSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPFPNTSYDLQADRVLTGYQVDKNKDDELTGF 472
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLANWYQQRWPGSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPWHNYGESSGADRVLTGYQVDKNKDDELTGF 473
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAVWGPEYQHQSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPNAGWPLVPEADRVLTGYQVDKNKDDELTGF 474
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAGHYARYWPGSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPWAQKSKVHQADRVLTGYQVDKNKDDELTGF 475
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAGFWASKWPGSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPFTAVSKKDAADRVLTGYQVDKNKDDELTGF 476
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLANFFQRRWPGSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPWKFRNTDRGADRVLTGYQVDKNKDDELTGF 477
Cellule hôte et cellule génétiquement modifiée
Dans certains modes de réalisation, un acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 décrit ci-dessus et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci est introduit dans une cellule hôte.
Tel qu'utilisé ici, le terme « cellule hôte » fait référence à une cellule avant introduction, pour introduire un acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci, étant entendu que la cellule hôte n’est pas une cellule souche embryonnaire humaine.
Tel qu'utilisé ici, le terme « cellule génétiquement modifiée » fait référence à une cellule exprimant la variante de la protéine Stéfine A et/ou à la protéine de fusion par introduction d’un acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci.
Dans certains modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée peut comprendre une modification génétique supplémentaire en plus de l'introduction d'un acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci.
Dans certains modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée peut être caractérisée en ce qu'un acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci est introduit, afin de produire la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci.
Dans certains modes de réalisation, lorsque la cellule génétiquement modifiée est construite pour la production de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou à la protéine de fusion comprenant celle-ci, tous les types de cellules tels que les cellules eucaryotes, les cellules procaryotes, etc. peuvent être utilisés, et les exemples de cellule hôte peuvent inclure, mais sans s'y limiter, des cellules bactériennes telles qu’Escherichia coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium, etc., des cellules de levure, des cellules fongiques telles que Pichia pastoris, etc., des cellules d'insectes telles que Drosophila, des cellules de Spodoptera Sf9, etc., des cellules animales telles que les CHO, COS, NSO, 293, et des cellules de mélanome en arc (de l’anglais « bow melanoma cells »), et des cellules végétales.
Dans un mode de réalisation de la présente invention, une cellule stromale mésenchymateuse génétiquement modifiée a été produite, laquelle exprime la variante de la protéine Stéfine A ou la protéine de fusion en introduisant un acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention ou la protéine de fusion comprenant celle-ci dans une cellule stromale mésenchymateuse.
Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte peut être sélectionné au sein du groupe constitué par une cellule souche, une cellule immunitaire et une cellule somatique.
Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte est une cellule dérivée de la nature, par exemple, un animal, de préférence un mammifère, plus préférablement un humain, ou une cellule d’ingénierie via ingénierie cellulaire ou ingénierie génétique.
Tel qu'utilisé ici, le terme « cellule souche » fait référence à une cellule capable de se différencier en divers types de cellules constituant un tissu biologique, et fait référence à collectivement des cellules indifférenciées au stade de prédifférenciation qui peuvent être obtenues à partir de chaque tissu d'embryon, de fœtus, et de corps adulte. Les cellules souches sont différenciées en cellules spécifiques par des stimuli de différenciation (environnement), et contrairement aux cellules dans lesquelles la différenciation est terminée et la division cellulaire est arrêtée, les cellules souches sont capables de s'auto-renouveler par division cellulaire pour permettre ainsi la prolifération (expansion), et peuvent être différenciées en d'autres cellules par différents environnements ou différents stimuli de différenciation, ce qui signifie qu'elles ont une plasticité de différenciation.
Dans certains modes de réalisation, des exemples de cellules souches peuvent inclure, mais sans s'y limiter, des cellules souches pluripotentes, des cellules souches multipotentes et des cellules souches unipotentes, en fonction de leur potentiel de différenciation.
Dans certains modes de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont des cellules souches capables de se différencier en trois couches germinales constituant un corps vivant, et des exemples de celles-ci peuvent inclure, mais sans s'y limiter, des cellules souches embryonnaires, des cellules souches pluripotentes induites (iPS, de l’anglais « induced pluripotent stem cells »), et similaires.
Dans certains modes de réalisation, les cellules souches multipotentes sont des cellules ayant le potentiel de différencier des cellules progénitrices en cellules appartenant à une certaine famille. Les exemples de cellules souches multipotentes peuvent inclure, mais sans s'y limiter, des cellules souches hématopoïétiques, des cellules stromales mésenchymateuses, des cellules souches neurales, et similaires.
Dans certains modes de réalisation, les cellules souches peuvent être des cellules stromales mésenchymateuses. Tel qu'utilisé ici, le terme « cellule stromale mésenchymateuse » fait référence à une cellule capable de se différencier en ostéoblastes, adipocytes, chondrocytes, et similaires, qui peuvent être différenciées du mésoderme parmi les trois couches germinales du tissu embryonnaire. Les cellules stromales mésenchymateuses peuvent être extraites de la moelle osseuse, du tissu adipeux, du sang du cordon ombilical, de la membrane synoviale, de l'os trabéculaire, du coussinet adipeux sous-patellaire, etc. Les cellules stromales mésenchymateuses sont connues pour 1) inhiber l'activité et la prolifération des lymphocytes T et des lymphocytes B, 2) inhiber l'activité des lymphocytes tueurs naturels (lymphocytes NK), et 3) permettre l'allotransplantation et la xénotransplantation en vertu de l'activité immunomodulatrice de régulation de la fonctions des cellules dendritiques et des macrophages.
La variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention manifeste un effet agoniste sur TNFR2, et ainsi un effet immunosuppresseur tel que l'inhibition de l'activité des lymphocytes T et/ou des lymphocytes B. Par conséquent, dans un mode de réalisation de la présente invention, en introduisant un acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A dans une cellule stromale mésenchymateuse (MSC, de l’anglais « Mesenchymal Stromal Cells ») en tant que cellule hôte, une nouvelle activité immunomodulatrice a été acquise par l'effet agoniste au TNFR2 par la variante de la protéine Stéfine A tout en maintenant l'effet immunomodulateur de la cellule stromale mésenchymateuse (par ex. effet inhibiteur de l'activation des lymphocytes T), confirmant que l'immunité a été très efficacement inhibée et également qu'un effet thérapeutique largement supérieur sur les maladies liées au système immunitaire telles que la GVHD ou les maladies auto-immunes était manifesté.
Dans certains modes de réalisation, la cellule stromale mésenchymateuse peut être dérivée d'une cellule souche pluripotente. Dans certains modes de réalisation, la cellule stromale mésenchymateuse permet une sous-culture de long terme. Le procédé de production de la cellule stromale mésenchymateuse à partir de la cellule souche pluripotente et le procédé de sous-culture à long terme sont bien connus dans l'art, et par exemple, la publication de demande de brevet coréen n° 10-2021-0072734, le brevet coréen n° 10-1135636, etc. divulguent un procédé de maintien de la puissance d'indifférenciation et des caractéristiques d'expression de marqueurs même après des dizaines de passages.
Dans certains modes de réalisation, la cellule stromale mésenchymateuse peut exprimer au moins l’un sélectionné parmi CD29, CD44, CD73 et CD90. Dans certains modes de réalisation, la cellule stromale mésenchymateuse ne doit pas exprimer au moins un marqueur de surface cellulaire sélectionné parmi c-kit, CD11b, CD19, CD14, CD34, CD45, CD14, CD79, HLA-DR, TRA-1-60 et TRA-1-81.
Dans certains modes de réalisation, la cellule stromale mésenchymateuse peut exprimer au moins un marqueur de surface cellulaire sélectionné parmi CD29, CD44, CD73 et CD105.
Dans certains modes de réalisation, la cellule stromale mésenchymateuse est capable de maintenir au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 % ou au moins 95 % de l'expression du marqueur de surface cellulaire après au moins 10 passages, au moins 11 passages, au moins 12 passages, au moins 13 passages, au moins 14 passages, au moins 15 passages, au moins 16 passages, au moins 17 passages, au moins 18 passages, au moins 19 passages, ou au moins 20 passages.
Dans certains modes de réalisation, le passage peut être basé sur une augmentation du nombre de cellules d'un certain facteur ou plus, et par exemple, une prolifération du nombre de cellules au moins 2 fois, 3 fois ou plus, 4 fois ou plus, 5 fois ou plus, 6 fois ou plus, 7 fois ou plus, ou 8 fois ou plus par rapport au début du passage précédent peut être déterminée comme étant 1 passage, mais la présente invention ne s’y limite pas.
Dans certains modes de réalisation, la cellule stromale mésenchymateuse ne doit pas exprimer au moins un marqueur de surface cellulaire sélectionné parmi CD34, CD45, HLA-DR, TRA-1-60 et TRA-1-81.
Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte peut être une cellule immunitaire.
Tel qu'utilisé ici, le terme « cellule immunitaire » fait référence à tous les types de cellules constituant le système immunitaire. Un agent thérapeutique cellulaire utilisant l'activité immunomodulatrice des cellules immunitaires est utilisé pour le traitement de diverses maladies telles que le cancer et les maladies auto-immunes, mais en raison de leurs effets non spécifiques, les agents thérapeutiques cellulaires immunitaires conçus par ingénierie pour permettre une régulation immunitaire spécifique à la cible, tels que les récepteurs d’antigènes chimériques, présentent un grand intérêt.
La variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention cible le TNFR2 impliqué dans la régulation immunitaire, et en particulier, puisqu'il a une capacité agoniste au TNFR2, lorsqu'un acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci est introduite dans des cellules immunitaires, un effet immunomodulateur largement supérieur peut être manifesté.
Dans certains modes de réalisation, les cellules immunitaires peuvent être sélectionnées dans le groupe constitué des lymphocytes T, des lymphocytes B, des lymphocytes tueurs naturels (NK), des lymphocytes nkT et des cellules dendritiques, mais ne sont pas limitées à celles-ci.
Dans certains modes de réalisation, les cellules immunitaires sont celles isolées du corps humain, du sang ou des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC, de l’anglais « peripheral blood mononuclear cells »), ou celles différenciées des cellules souches (de préférence des cellules souches pluripotentes), mais ne s’y limitent pas.
Dans certains modes de réalisation, lorsqu'un acide nucléique codant pour une protéine de fusion (par ex. un récepteur d'antigène chimérique) comprenant la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 en tant que domaine de liaison extracellulaire est introduit dans les cellules immunitaires, les cellules résultantes peuvent être utilisées en tant que cellule agent thérapeutique, telles que CAR-T ou CAR-NK.
Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte peut être une cellule somatique.
Tel qu'utilisé ici, le terme « cellule somatique » fait référence à tout type de cellules à l'exception des gamètes, constituant le corps d'un animal, de préférence un humain. Des exemples d'agents thérapeutiques cellulaires utilisant des cellules somatiques sont bien connus dans l'art. Par exemple, les cellules épidermiques telles que les kératinocytes, fibroblastes et membranes muqueuses peuvent être utilisées pour le traitement de brûlures cutanées, de cicatrices, à des fins cosmétiques, etc., et les chondrocytes, adipocytes, cellules des îlots et les myoblastes squelettaux peuvent être utilisés pour le traitement de maladies telles que l'arthrite dégénérative, l'éradication de graisse sous-cutanée, etc., mais la présente invention ne s'y limite pas.
Lorsqu'un gène codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci est introduit dans une cellule somatique en tant que cellule hôte de la présente invention, un effet immunomodulateur par inhibition de l'activité du TNFR2 peut être manifesté.
Dans certains modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée permet la sécrétion de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou à la protéine de fusion comprenant celle-ci, l’expression de celle-ci sur la membrane cellulaire, et/ou la localisation de celle-ci dans un site spécifique dans la cellule.
Dans certains modes de réalisation, le plus préférablement, la cellule génétiquement modifiée exprime la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou à la protéine de fusion et la présente sur la surface cellulaire (ou membrane).
In vivo, le ligand du récepteur du TNF, la molécule TNF, agit dans un trimère. Une molécule de TNF trimérique interagit avec trois molécules de soit TNFR1, soit TNFR2. Fait important, le TNF membranaire active les deux récepteurs du TNF, tandis que seul le TNFR1 répond fortement au sTNF (TNF soluble). Le déclenchement des voies de signalisation associées au TNFR2 nécessite un regroupement secondaire de complexes multimériques TNF-TNFR2 initialement formés. Ceci survient spontanément pour les complexes TNF-TNFR2 membranaires induits par TNF mais pas pour les complexes sTNF-TNFR2.
Lorsque la cellule génétiquement modifiée de la présente invention exprime et présente la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 sur la surface cellulaire, le regroupement de complexes ligand-TNFR2 et l'activation de la voie TNFR2 sont imités. En conséquence, la cellule génétiquement modifiée présentant la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 sur la surface cellulaire a un fort effet agoniste sur TNFR2 et peut induire l'activation de la voie TNFR2.
Procédé d'introduction d'acide nucléique dans une cellule hôte
Tel qu'il est utilisé ici, le terme « introduction » fait référence au fait de permettre à la cellule hôte de recevoir un gène étranger (acide nucléique) que la cellule hôte ne possède pas.
Dans certains modes de réalisation, un acide nucléique codant pour une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 ou une protéine de fusion comprenant celle-ci peut être introduit dans une cellule hôte à l'aide d'un vecteur comprenant ceux-ci.
Tel qu'utilisé ici, un « vecteur » est un moyen pour exprimer un gène cible dans une cellule hôte, et des exemples du vecteur peuvent inclure, mais sans s'y limiter, des vecteurs viraux tels qu'un vecteur adénoviral, un vecteur rétroviral, un vecteur viral adéno-associé, et des vecteurs dérivés de virus tels que le virus de la vaccine (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy, 10:649-657 (1999); Ridgeway, 467-492 (1988); Baichwal et Sugden, In: Kucherlapati R., ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986) et Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), le lentivirus (Wang G. et al., J. Clin. Invest., 104(11):R55-62(1999)), le virus herpes simplex (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92:1411-1415 (1995)), le poxvirus (GCE, NJL, Krupa M., Esteban M., Curr. Gene Ther. 8(2):97-120 (2008)), le réovirus, le virus de la rougeole, le virus de la forêt de Semliki et le poliovirus, et les vecteurs non viraux tels que les vecteurs plasmidiques (Sambrook et al., 1989) et les minicercles (Yew et al. 2000 Mol. Ther. 1(3), 255-62).
Le vecteur peut typiquement inclure au moins un composant sélectionné parmi une séquence signal, une origine de réplication, au moins un gène marqueur de résistance aux antibiotiques, un élément amplificateur, un promoteur, et une séquence de terminaison de transcription, mais la présente invention n'est pas limitée à ceux-ci. L'acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A de la présente invention ou la protéine de fusion comprenant celle-ci peut être lié opérationnellement à un promoteur et à une séquence de terminaison de transcription.
Tel qu'il est utilisé ici, le terme « lié opérationnellement » signifie une relation fonctionnelle entre une séquence de contrôle de l'expression de l'acide nucléique (par ex. un promoteur, une séquence signal ou un éventail de sites de liaison régulateurs transcriptionnels) et une séquence d'acide nucléique différente, la séquence de contrôle servant à contrôler la transcription et/ou la traduction de la séquence d'acide nucléique différente.
Lorsqu'une cellule procaryote est utilisée comme hôte, un promoteur fort capable de promouvoir la transcription (par ex. un promoteur tac, un promoteur lac, un promoteur lacUV5, un promoteur lpp, un promoteur pLλ, un promoteur pRλ, un promoteur rac5, un promoteur amp, un promoteur recA, un promoteur SP6, promoteur trp ou promoteur T7), un site de liaison au ribosome pour l'initiation de la traduction et une séquence de terminaison de transcription/traduction sont généralement inclus. De plus, par exemple, lorsqu'une cellule eucaryote est utilisée comme hôte, un promoteur dérivé du génome d'une cellule de mammifère (par ex. un promoteur de métallothionine, un promoteur de β-actine, un promoteur d'hémoglobine humaine ou un promoteur de créatine musculaire humaine) ou un promoteur dérivé d'un virus de mammifère (par ex. un promoteur tardif d'adénovirus, un promoteur 7,5k du virus de la vaccine, un promoteur SV40, un promoteur du cytomégalovirus (CMV), un promoteur tk de l’HSV, un promoteur du virus de la tumeur mammaire de la souris (MMTV, de l’anglais « mouse mammary tumor virus »), un promoteur LTR du VIH, un promoteur du virus Moloney, un promoteur du virus d'Epstein-Barr (EBV, de l’anglais « Epstein-Barr virus »), ou un promoteur du virus du sarcome de Rous (RSV, de l’anglais « Rous sarcoma virus »)) peut être utilisé, et une séquence de polyadénylation est généralement utilisée comme séquence de terminaison de la transcription
Dans certains modes de réalisation, le promoteur peut être un promoteur eucaryote, est de préférence sélectionné parmi un promoteur de cytomégalovirus (CMV), un promoteur PGK, un promoteur EF1α, un promoteur EFS, un promoteur CBh, un promoteur MSCV, un promoteur SFFV, et un promoteur UbC, et est le plus préférablement sélectionné parmi un promoteur CMV, un promoteur EF1α et un promoteur CBh, mais n'est pas limité à ceux-ci.
Dans certains modes de réalisation, le promoteur peut en outre comprendre une séquence amplificatrice, mais n'est pas limité à ceci.
Dans certains cas, le vecteur peut être fusionné avec une autre séquence afin de faciliter la purification de l'anticorps exprimé à partir de celle-ci. Des exemples de séquence fusionnée avec celui-ci incluent la glutathion S-transférase (Pharmacia, USA), la protéine de liaison au maltose (NEB, USA), la séquence FLAG (IBI, USA) et la séquence 6x His (hexa-histidine ; Qiagen, USA)).
Le vecteur peut comprendre, en tant que marqueur sélectif, un gène de résistance aux antibiotiques qui est couramment utilisé dans l'art, par exemple, un gène conférant une résistance à l'ampicilline, la gentamicine, la carbénicilline, le chloramphénicol, la streptomycine, la kanamycine, la puromycine, la blasticidine, l'hygromycine, la généticine, la néomycine et la tétracycline, mais sans s'y limiter.
Dans certains modes de réalisation, un acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 ou la protéine de fusion comprenant celle-ci peut être incorporé(e) et introduit(e) dans le gène de la cellule hôte.
Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 ou la protéine de fusion comprenant celle-ci peut être construit(e) par synthèse chimique à l'aide d'un synthétiseur d'oligonucléotides. Les oligonucléotides peuvent être conçus sur la base de la séquence d'acides aminés du polypeptide souhaité et par sélection de codons qui sont favorisés dans la cellule hôte dans laquelle le polypeptide recombinant d'intérêt sera produit. Une séquence polynucléotidique codant pour le polypeptide d'intérêt isolé peut être synthétisée en utilisant des procédés standards. Par exemple, un gène à traduction inverse peut être construit en utilisant une séquence complète d'acides aminés. De plus, un oligomère d'ADN contenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide isolé particulier peut être synthétisé. Par exemple, plusieurs petits oligonucléotides codant pour des parties d’un polypeptide souhaité peuvent être synthétisés puis ligaturés (en anglais « ligated »). Les oligonucléotides individuels contiennent généralement des extensions 5' ou 3' pour un assemblage complémentaire.
Dans certains modes de réalisation, lorsque la séquence d'acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 ou la protéine de fusion comprenant celle-ci est obtenue, un vecteur comprenant celle-ci peut être produit par la technologie à ADN recombinant en utilisant une technique bien connue dans l'art. Un vecteur d'expression contenant une séquence codant pour la variante de la protéine Stéfine A de la présente invention ou la protéine de fusion comprenant celle-ci et des signaux de contrôle transcriptionnel et traductionnel appropriés peuvent être construits en utilisant des procédés bien connus des personnes du métier. Des exemples de tels procédés peuvent inclure des techniques à ADN recombinant in vitro, des techniques de synthèse et une recombinaison génétique in vivo (par ex. Sambrook et al., 1990, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al. eds., 1998, CURRENT PROTOCOLS IN Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci ou le vecteur d'expression non viral comprenant celle-ci peut être délivré à la cellule hôte en utilisant des techniques typiques (par ex. l’électroporation, la transfection de liposomes, et la précipitation au phosphate de calcium).
Le vecteur peut être introduit dans la cellule hôte par un procédé tel que la transduction ou la transfection. Tel qu'il est utilisé ici, le terme « transduction » fait référence à l'introduction d'ADN dans un hôte de sorte que l'ADN devient réplicable soit en tant que facteur extrachromosomique soit via une intégration chromosomique. Tel qu'utilisé ici, le terme « transfection » signifie qu'un vecteur d'expression est hébergé par la cellule hôte, indépendamment du fait qu'une quelconque séquence codante soit réellement exprimée ou non. Afin d'introduire le vecteur, une variété de techniques couramment utilisées pour introduire des acides nucléiques exogènes (ADN ou ARN) dans des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes, par exemple, l'électrophorèse, la précipitation au phosphate de calcium, la transfection au DEAE-dextrane, ou la lipofection peuvent être utilisées, mais la présente invention ne s’y limite pas.
Il faut comprendre que tous les vecteurs et séquences de contrôle de l'expression ne fonctionnent pas de la même manière dans l'expression de la séquence d'ADN de la présente invention. De même, tous les hôtes ne fonctionnent pas de la même manière pour le même système d'expression. Cependant, les personnes du métier seront capables de faire une sélection appropriée parmi divers vecteurs, séquences de contrôle d'expression et hôtes sans expérimentation excessive et sans s'écarter de la portée de la présente invention. Par exemple, un vecteur peut être sélectionné en tenant compte de l'hôte. En effet, le vecteur doit être capable de se répliquer dans l'hôte. En outre, le nombre de copies d'un vecteur, la capacité à contrôler le nombre de copies, et l'expression d'une autre protéine codée par le vecteur, par exemple un marqueur antibiotique, doivent être pris en considération. Lors de la sélection de la séquence de contrôle de l'expression, divers facteurs doivent être pris en considération. Par exemple, la force relative des séquences, leur contrôlabilité, leur compatibilité avec les séquences d'ADN de la présente invention, etc., doivent être prises en compte, en particulier en ce qui concerne d'éventuelles structures secondaires. L'hôte unicellulaire doit être sélectionné en prenant en considération des facteurs tels que le vecteur sélectionné, la toxicité et les propriétés de sécrétion du produit codé par la séquence d'ADN de l'invention, la capacité à replier correctement la protéine, les exigences de culture et de fermentation, la facilité de purification du produit codé par la séquence d'ADN de la présente invention à partir de l'hôte, et similaires. Dans la portée de ces paramètres, les personnes du métier pourront sélectionner diverses combinaisons vecteur/séquence de contrôle d'expression/hôte capables d'exprimer la séquence d'ADN de la présente invention en fermentation ou en culture animale à grande échelle. Des exemples d'un procédé de criblage de clonage d'ADNc par clonage d'expression peuvent comprendre un procédé de liaison, un procédé d’étalement (de l’anglais « panning »), un procédé d'émulsion de film, etc.
Dans un mode de réalisation de la présente invention, un acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 ou la protéine de fusion comprenant celle-ci a été introduit dans une cellule hôte à l'aide d'un lentivirus.
En particulier, comme dans un mode de réalisation de la présente invention, un amplificateur de transduction peut être utilisé lors de l'introduction d'un gène à l'aide d'un lentivirus.
Dans certains modes de réalisation, l'amplificateur de transduction peut être sélectionné parmi, par exemple, le polybrène, le sulfate de protamine et le LentiBOOST de Sirion, et est le plus préférablement le polybrène, mais n'est pas limité à celui-ci.
Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte qui est attachée ou non attachée peut être infectée à la fois par un amplificateur de transduction et un lentivirus, et une infection avant l'attachement cellulaire est préférable, mais la présente invention n'est pas limitée à cela.
Un autre aspect de la présente invention concernait une cellule génétiquement modifiée exprimant la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion la comprenant.
Procédé de production de cellule génétiquement modifiée et culture de cellule génétiquement modifiée
Un autre aspect, encore, de la présente invention porte sur un procédé de production d'une cellule génétiquement modifiée dans laquelle un acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci est introduit, comprenant :
(a) l’introduction d’un acide nucléique codant pour une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou une protéine de fusion comprenant celle-ci dans une cellule hôte ; et
(b) la sélection et l’obtention de la cellule hôte dans laquelle l’acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci est introduit(e).
Dans certains modes de réalisation, l'étape (a) peut être réalisée par divers moyens connus dans l'art.
Dans certains modes de réalisation, l'étape (a) peut être réalisée en utilisant un lentivirus contenant l'acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci.
Dans certains modes de réalisation, le lentivirus peut être introduit avec un vecteur comprenant l'acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci.
Dans certains modes de réalisation, le vecteur peut en outre inclure au moins un élément sélectionné parmi une séquence signal, une origine de réplication, au moins un gène marqueur de résistance aux antibiotiques, un élément amplificateur, un promoteur, et une séquence de terminaison de transcription.
Dans certains modes de réalisation, le promoteur peut être un promoteur eucaryote, est de préférence sélectionné parmi un promoteur CMV, un promoteur PGK, un promoteur EF1α, un promoteur EFS, un promoteur CBh, un promoteur MSCV, un promoteur SFFV, et un promoteur Siriono UbC, et est le plus préférablement sélectionné parmi un promoteur CMV, un promoteur EF1α et un promoteur CBh, mais n'est pas limité à ceux-ci.
Dans certains modes de réalisation, le promoteur peut en outre comprendre une séquence amplificatrice, mais n'est pas limité à ceci.
Dans certains modes de réalisation, l'amplificateur est une courte région d'ADN d'environ 50 à 1500 pb de longueur qui peut se lier à une protéine régulatrice de la transcription. L'amplificateur peut être situé dans le site d'initiation de transcription ou en amont ou en aval du promoteur. Les amplificateurs pour divers promoteurs sont bien connus dans l'art, et peuvent être sélectionnés et appliqués sans limitation par les personnes du métier.
Dans certains modes de réalisation, l'étape (a) peut comprendre la transduction de la cellule hôte par infection de la cellule hôte avec le lentivirus.
Dans certains modes de réalisation, la transduction de la cellule hôte par infection de la cellule hôte avec le lentivirus peut être effectuée en ajoutant un amplificateur de transduction.
Dans certains modes de réalisation, l'amplificateur de transduction est de préférence un polymère cationique, ce qui facilite l'incorporation d'un gène ou d'un acide nucléique chargé négativement dans la cellule hôte.
Dans certains modes de réalisation, l'amplificateur de transduction peut être un polymère cationique. Par exemple, l'amplificateur de transduction peut être sélectionné parmi le polybrène, le sulfate de protamine et le LentiBOOST de Sirion, et est le plus préférablement le polybrène, mais n'est pas limité à celui-ci.
Dans certains modes de réalisation, la transduction de la cellule hôte par infection de la cellule hôte avec le lentivirus peut être effectuée en traitant la cellule hôte avec le lentivirus après attache à la cellule hôte, ou par traitement et infection de la cellule hôte avec le lentivirus avant attache à la cellule hôte.
Dans certains modes de réalisation, un procédé d'infection de la cellule hôte avec le lentivirus pendant le processus d’attache à la cellule hôte par traitement de la cellule hôte avec le lentivirus avant attache à la cellule hôte est également connu sous le nom de transduction inverse.
Dans certains modes de réalisation, dans la transduction de la cellule hôte par infection de la cellule hôte avec le lentivirus, il est préférable d'infecter la cellule hôte par traitement avec le lentivirus avant attache à la cellule hôte, mais la présente invention ne s’y limite pas.
Dans certains modes de réalisation, l'étape (b) peut être caractérisée en ce que la cellule hôte dans laquelle l'acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci est introduit(e) est sélectionnée en utilisant un antibiotique et un gène de résistance à celui-ci.
Le procédé de sélection de la cellule transduite dans laquelle le gène est introduit en utilisant un vecteur comprenant un antibiotique et un gène de résistance à celui-ci est bien connu dans l'art.
Dans certains modes de réalisation, l'étape (b) peut être caractérisée en ce que la cellule génétiquement modifiée dans laquelle l'acide nucléique est introduit est sélectionnée au moyen d’un traitement avec un antibiotique à base d'aminoglycoside.
Dans certains modes de réalisation, des exemples de l'antibiotique peuvent inclure, mais sans s'y limiter, l'ampicilline, la gentamycine, la carbénicilline, le chloramphénicol, la streptomycine, la kanamycine, la puromycine, la blasticidine, l'hygromycine, la généticine, la néomycine, la tétracycline, et similaires.
Dans certains modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée peut en outre comprendre un gène de résistance à la néomycine introduit dans celle-ci, en plus de l'acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci.
Dans certains modes de réalisation, un traitement avec l'antibiotique pendant 3 à 7 jours à une concentration de 250 à 500 μg/mL, pendant 5 jours à une concentration d'environ 125 μg/mL ou pendant 7 jours à une concentration d'environ 62,5 μg/mL est possible, mais la présente invention ne s'y limite pas.
Encore un autre aspect de la présente invention a trait à un fluide de culture de la cellule génétiquement modifiée. Dans certains modes de réalisation, le milieu de culture cellulaire conditionné peut être préparé en cultivant la cellule génétiquement modifiée en utilisant des conditions et des milieux appropriés selon le type de cellule hôte.
Dans certains modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée est capable d'exprimer et de sécréter la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci. Ainsi, le milieu de culture cellulaire conditionné de la cellule génétiquement modifiée peut comprendre non seulement la cellule génétiquement modifiée, mais également la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et/ou la protéine de fusion comprenant celle-ci, qui sont ainsi sécrétées.
Dans certains modes de réalisation, lorsque la cellule hôte est une cellule stromale mésenchymateuse, un procédé de sous-culture à long terme de celle-ci est bien connu dans l'art, et, par exemple, la publication de demande de brevet coréen n° 10-2021-0072734, le brevet coréen n° 10-1135636, et similaires divulguent un procédé de maintien de la puissance d'indifférenciation et des caractéristiques d'expression de marqueurs même après des dizaines de passages.
UTILISATION
La présente invention exclut l'utilisation uniquement pour la fabrication d'une variante de la protéine Stéfine A qui se lie spécifiquement au TNFR2 des cellules modifiées par ingénierie génétique et/ou d'une protéine de fusion contenant celle-ci.
Les utilisations des cellules modifiées par ingénierie génétique de la présente invention comprennent, sans limitation, toutes les utilisations à l'exception de la fabrication de variantes de la protéine Stéfine A et/ou de protéines de fusion les contenant. Des exemples préférés comprennent, mais sans s'y limiter, les utilisations médicales, pharmaceutiques et cliniques.
Utilisation – Agent thérapeutique cellulaire ou composition pharmaceutique
Dans un exemple de la présente invention, l'acide nucléique codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 a été introduit dans des cellules stromales mésenchymateuses dérivées de PSC (cellules souches pluripotentes, de l’anglais « Pluripotent Stem Cell ») pour préparer des cellules génétiquement modifiées. Afin que la variante de la protéine Stéfine A soit présentée sur la surface cellulaire, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 a été fusionnée avec le domaine transmembranaire humain PDGFR (récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes, ou, en anglais, « platelet-derived growth factor receptor »). Les cellules génétiquement modifiées préparées ont montré un niveau élevé de présentation de surface de la variante de la protéine Stéfine A tout en conservant les caractéristiques des MSC.
Dans un autre exemple de la présente invention, les cellules génétiquement modifiées ont été cocultivées avec des cellules HEK-Blue TNF-alpha pour évaluer la fonction agoniste au TNFR2. En conséquence, il a été confirmé que la variante de la protéine Stéfine A présentée à la surface de la cellule génétiquement modifiée de la présente invention se lie au TNFR2 des cellules HEK-Blue TNF-alpha et présente un excellent effet agoniste.
Diverses études antérieures dans ce domaine rapportent que l'activation de la voie TNFR2 est très importante pour la prolifération et l'activation des Treg. Les souris déficientes en TNFR2 ont montré des nombres réduits de Tregs thymiques et périphériques (2013_Chen X, et al. PMID: 23277487), et les Tregs TNFR2 -/- n'ont pas été capables de contrôler la réponse inflammatoire in vivo (2008_Van Mierlo GJ, et al. PMID: 18292492). Chez l'humain, il a été démontré que les Treg expriment un niveau plus élevé de TNFR2 que les lymphocytes effecteurs T (2013_Okubo Y, et al. PMID: 24193319 & 2002_ Annunziato F, et al. PMID: 12163566) et les Tregs TNFR2+ ont manifesté la suppression la plus puissante de la prolifération et de la production de cytokines des lymphocytes répondeurs T cocultivées (en anglais « co-cultured T-responder cells ») (2010_Chen X, et al. PMID: 20127680).
Par conséquent, on peut évidemment prédire que les cellules génétiquement modifiées de la présente invention seront capables de manifester une prolifération et une activation des Treg, réduisant davantage la réponse immunitaire ou supprimant le système immunitaire à partir de l'effet agoniste sur TNFR2 des cellules génétiquement modifiées de la présente invention.
En conclusion, les cellules génétiquement modifiées de la présente invention peuvent être utilisées pour prévenir et/ou traiter diverses maladies immunitaires causées par une homéostasie anormale de l'immunité, de préférence une réponse excessive ou anormale du système immunitaire. Plus spécifiquement, elle peut être utilisée pour la prévention et/ou le traitement de diverses maladies qui ont été signalées comme pouvant être traitées en utilisant la prolifération et l'activation des Treg comme mécanisme.
Dans un autre aspect, la présente invention porte sur un agent thérapeutique cellulaire comprenant la cellule génétiquement modifiée et/ou le milieu de culture cellulaire conditionné de celui-ci.
Dans un autre aspect, la présente invention porte sur une utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou de son milieu de culture cellulaire conditionné pour la fabrication d'un agent thérapeutique cellulaire.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique pour prévenir ou traiter une maladie immunitaire ou un cancer incluant la cellule génétiquement modifiée et/ou le milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci.
Dans un autre aspect, la présente invention porte sur une utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou de son milieu de culture cellulaire conditionné pour la prévention ou le traitement d'une maladie immunitaire ou d'un cancer.
Dans un autre aspect, la présente invention porte sur une utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou de son milieu de culture cellulaire conditionné pour la fabrication d'une composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement d'une maladie immunitaire ou d'un cancer.
Dans un autre aspect, la présente invention porte sur un procédé de prévention ou de traitement de maladies immunitaires ou d’un cancer incluant l’administration de la cellule génétiquement modifiée et/ou le milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci à un sujet.
Les maladies immunitaires pour lesquelles des effets préventifs et/ou thérapeutiques peuvent être attendus en utilisant les cellules génétiquement modifiées de la présente invention incluent, par exemple, les maladies inflammatoires, les maladies auto-immunes ou le cancer, mais sans s'y limiter.
Tel qu'utilisé ici, le terme « maladie immunitaire » fait référence à une maladie qui peut être directement causée par une anomalie dans le système immunitaire, et peut être sélectionnée dans le groupe comprenant la dermatite, les allergies, la rhinite, la goutte, la spondylarthrite ankylosante, le rhumatisme articulaire aigu, le lupus, la fibromyalgie, la tendinite, le diabète de type 1, la sclérodermie, les maladies neurodégénératives, le diabète de type 2, la silicose, l'athérosclérose, le vitiligo, la conjonctivite et les maladies auto-immunes, mais sans s'y limiter.
Tel qu'utilisé ici, le terme "maladie auto-immune" fait référence à une maladie qui survient lorsque les cellules immunitaires dans un organisme reconnaissent les propres tissus ou cellules de l'organisme, plutôt qu'un antigène envahissant externe, en tant qu’antigène et les attaquent. La maladie auto-immune peut être sélectionnée dans le groupe comprenant la polyarthrite rhumatoïde, la sclérodermie systémique, la dermatite atopique, le psoriasis, l'asthme, le syndrome de Guillain-Barré, la myasthénie grave, la dermatomyosite, la polymyosite, la sclérose en plaques, l'encéphalomyélite auto-immune, la polyartérite noueuse, l'artérite temporale, le diabète infantile, la pelade, les ampoules (de l’anglais « blisters »), la stomatite aphteuse, la maladie de Crohn et la maladie de Behcet, mais sans s'y limiter.
Tel qu'il est utilisé ici, le terme « maladie inflammatoire » est un terme générique pour une maladie accompagnée d'une inflammation en tant que lésion principale, en particulier une maladie sélectionnée dans le groupe constitué par l'œdème, les allergies, l'asthme, la conjonctivite, la parodontite, la rhinite, l'otite (de l’anglais « otitis media »), le mal de gorge, l’amygdalite, la pneumonie, l’ulcère gastrique, la gastrite, la maladie de Crohn, la colite, les hémorroïdes, la goutte, la spondylarthrite ankylosante, le rhumatisme articulaire aigu, le lupus, la fibromyalgie, le rhumatisme psoriasique, l’arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, la périarthrite de l'épaule, la tendinite, la ténosynovite, la myosite, l’hépatite, la cystite, la néphrite, le syndrome de Sjogren, la myasthénie sévère (de l’anglais « severe myasthenia gravis ») et la sclérose en plaques, mais sans s'y limiter.
Un autre exemple, la maladie inclut, le lupus érythermatose disséminé (LES), la néphrite lupique (par ex. la néphrite lupique d’origine médicamenteuse), la thrombocytopénie immunitaire (ITP), la polyarthrite rhumatoïde (PR), la sclérose en plaques (SEP), les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) (par ex. la maladie de Crohn et la colite/colite ulcéreuse), la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) (liée aux transplantations de cellules souches) également appelée rejet d'allogreffe, la transplantation/Transplantation d'Organe Solide (SOT), la cholangite biliaire primitive (CBP), le psoriasis, l’arthrite psoriasique, l’arthrite induite par le collagène, l’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE), l’ovarite, la rhinite allergique, l’asthme, le syndrome de Sjogren, l’eczéma atopique, la myasthénie, la maladie de Basedow, la glomérulosclérose et/ou le cancer, mais ne se limite pas à ceux-ci.
Tel qu'utilisé ici, le terme "prévention" fait référence à toute action qui inhibe ou retarde l'apparition d'une maladie immunitaire ou d'un cancer en administrant la composition pharmaceutique proposée dans la présente invention à un sujet duquel il est attendu qu’il développe une maladie immunitaire ou un cancer.
Tel qu'utilisé ici, le terme « traitement » fait référence à toute action qui intervient cliniquement pour altérer le processus naturel d'un sujet ou d'une cellule à traiter, et peut être réalisée au cours d’une pathologie clinique ou pour la prévenir. L'effet thérapeutique souhaité inclut la prévention de l’apparition ou de la récurrence de maladies, le soulagement de symptômes, l'inhibition de toutes les conséquences pathologiques directes ou indirectes de maladies, la prévention de métastases, la réduction de la vitesse de progression de maladies, le soulagement ou le soulagement temporaire d'un état de maladies, et l'amélioration d’un pronostic. Aux fins de la présente invention, le traitement peut être interprété comme incluant toutes les actions d'amélioration des symptômes d'une maladie auto-immune par administration de la composition pharmaceutique de la présente invention à un patient souffrant d'une maladie auto-immune incluant le psoriasis, mais la présente invention ne se limite pas à cela en particulier.
Lupus Erythermatose Disséminé
Le lupus érythémateux disséminé (LES), communément appelé simplement lupus, est une maladie auto-immune chronique qui peut provoquer un gonflement (inflammation) et des douleurs dans tout le corps. Il existe plusieurs types différents de lupus. Le lupus érythémateux disséminé est le plus fréquent. D’autres types de lupus incluent :
Lupus érythémateux cutané : Ce type de lupus affecte la peau - cutané est un terme qui signifie peau. Les personnes atteintes de lupus érythémateux cutané peuvent connaître des problèmes de peau comme une sensibilité au soleil et des éruptions. La perte de cheveux peut également être un symptôme de cette affection.
Lupus d'origine médicamenteuse : Ces cas de lupus sont causés par certains médicaments. Les personnes atteintes de lupus d'origine médicamenteuse peuvent présenter bon nombre des mêmes symptômes que ceux du lupus érythémateux disséminé, mais il est généralement temporaire.
Lupus néonatal : Un type rare de lupus, le lupus néonatal est une affection que l'on retrouve chez les nourrissons à la naissance. Les enfants nés avec un lupus néonatal ont des anticorps qui leur ont été transmis depuis leur mère – qui avait soit le lupus au moment de la grossesse, soit peut présenter l’affection plus tard dans la vie. Tous les bébés nés d'une mère atteinte de lupus ne présenteront pas la maladie.
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec la cellule génétiquement modifiée proposée ici incluent, par exemple : les stéroïdes (corticostéroïdes, y compris la prednisone) ; l’Hydroxychloroquine (Plaquenil®) ; l’Azathioprine (Imuran®); le Méthotrexate (Rheumatrex®) ; le Cyclophosphamide (Cytoxan®) et le Mycophénolate Mofétil (CellCept®) ; le Belimumab (Benlysta®) ; et/ou le Rituximab (Rituxan®).
Néphrite lupique
La néphrite lupique est une complication fréquente chez les personnes atteintes de lupus érythémateux disséminé, plus connu sous le nom de lupus. La néphrite lupique survient lorsque les autoanticorps lupiques affectent les structures des reins qui filtrent les déchets. Ceci provoque une inflammation des reins et peut entraîner l’apparition de sang dans les urines, de protéines dans les urines, d’une pression artérielle élevée, d’une altération de la fonction rénale ou même d’une insuffisance rénale. Jusqu'à la moitié des adultes atteints de lupus systémique développent une néphrite lupique. Le lupus systémique entraîne des lésions des reins par les protéines du système immunitaire, ce qui nuit à leur capacité à filtrer les déchets.
Polyarthrite rhumatoïde
La polyarthrite rhumatoïde est un type d'arthrite chronique (permanente) qui touche les articulations des deux côtés du corps, comme les mains, les poignets et les genoux. Les objectifs à court terme des médicaments contre la polyarthrite rhumatoïde sont de réduire la douleur et le gonflement des articulations et/ou d'améliorer la fonction articulaire. L'objectif à long terme est de ralentir ou d'arrêter le processus de la maladie, en particulier les lésions articulaires.
L'arthrite est un terme général qui décrit une inflammation des articulations. La polyarthrite rhumatoïde est un type d'arthrite chronique (permanente) (entraînant des douleurs et un gonflement) qui survient généralement dans les articulations de manière symétrique (des deux côtés du corps, comme les mains, les poignets et les genoux). Cette atteinte de plusieurs articulations aide à distinguer la polyarthrite rhumatoïde d’autres types d'arthrite.
En plus d'affecter les articulations, la polyarthrite rhumatoïde peut occasionnellement affecter la peau, les yeux, les poumons, le cœur, le sang, les nerfs ou les reins.
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec la cellule génétiquement modifiée proposée ici pour traiter la polyarthrite rhumatoïde peuvent inclure, par exemple :
Les médicaments qui diminuent la douleur et l'inflammation. Ces produits incluent les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), tels que l'ibuprofène (MOTRIN®), le naproxène (ALEVE®) et autres produits similaires. Un autre type de médicament - l'inhibiteur de la COX-2 - entre également dans cette catégorie de médicaments, offrant un soulagement aux signes et symptômes de la polyarthrite rhumatoïde. Le célécoxib (CELEBREX®), un inhibiteur de la COX-2, est disponible et utilisé aux États-Unis. Les inhibiteurs de la COX-2 ont été conçus pour présenter moins d'effets secondaires de saignement sur l'estomac.
Antirhumatismaux modificateurs de maladie (ARMM). Contrairement aux autres AINS, les ARMM peuvent en réalité ralentir le processus de la maladie en modifiant le système immunitaire. Les ARMM plus anciens incluent le méthotrexate (TREXALL®), les sels d'or, la pénicillamine (CUPRIMINE®), l'hydroxychloroquine (PLAQUENIL®), la sulfasalazine (AZULFIDINE®), la cyclosporine (SANDIMMUNE®), le cyclophosphamide (CYTOXAN®) et le léflunomide (ARAVA®). Actuellement, le méthotrexate, le léflunomide, l'hydroxychloroquine et la sulfasalazine sont les plus couramment utilisés. (La cyclosporine, le cyclophosphamide, les sels d'or et la pénicillamine ne sont généralement plus utilisés.)
Produits biologiques. Au-delà de ces ARMM plus "traditionnels", de nouveaux médicaments ont été approuvés. Actuellement, il existe sept classes différentes de médicaments et, dans certains cas, différentes sortes existent dans chaque classe. (Certains d'entre eux, comme les anti-TNF de classe, sont utilisés depuis 2000.) Collectivement, ces ARMM sont connus sous un autre nom – agents biologiques (ou agents de réponse biologique). Par rapport aux ARMM traditionnels, ces produits ciblent les molécules qui causent l'inflammation dans la polyarthrite rhumatoïde. Les cellules inflammatoires des articulations sont impliquées dans le développement de la polyarthrite rhumatoïde elle-même. Les agents biologiques réduisent le processus inflammatoire qui cause in fine les lésions articulaires observées dans la polyarthrite rhumatoïde. Les ARMM plus anciens fonctionnent un peu plus loin que les produits biologiques ; ils agissent en modifiant la propre réponse immunitaire du corps à l'inflammation. En attaquant les cellules à un niveau plus spécifique de l'inflammation elle-même, les produits biologiques sont considérés comme plus efficaces et plus spécifiquement ciblés. Les agents biologiques incluent l'étanercept (ENBREL®), l'infliximab (REMICADE®), l'adalimumab (HUMIRA®), l'anakinra (KINARET®), l'abatacept (ORENCIA®), le rituximab (RITUXAN®), le certolizumab pegol (CIMZIA®), le golimumab (SYMPONI ®), le tocilizumab (ACTEMRA®) et le tofacitinib (XELJANJ®). Certains des produits biologiques sont utilisés en association avec les ARMM traditionnels, en particulier avec du méthotrexate.
Sclérose En Plaques
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune. Avec ces affections, le système immunitaire attaque à tort les cellules saines. Chez les personnes atteintes de SEP, le système immunitaire attaque les cellules dans la myéline, la gaine protectrice qui entoure les nerfs dans le cerveau et la moelle épinière. Les lésions à la gaine de myéline interrompent les signaux nerveux allant du cerveau vers d'autres parties du corps. Les lésions peuvent entraîner des symptômes affectant le cerveau, la moelle épinière et les yeux.
Il existe quatre types de sclérose en plaques :
Syndrome cliniquement isolé (SCI) : Lorsqu'une personne présente un premier épisode de symptômes de SEP, les fournisseurs de soins de santé le classent souvent en tant que SCI. Toutes les personnes atteintes de SCI ne développent pas de sclérose en plaques.
SEP récurrente-rémittente (SEP-RR) : Il s'agit de la forme la plus courante de sclérose en plaques. Les personnes atteintes de SEP-RR ont des poussées - également appelées rechutes ou exacerbations - de symptômes nouveaux ou qui s'aggravent. Des périodes de rémission suivent (lorsque les symptômes se stabilisent ou disparaissent).
SEP primaire progressive (SEP-PP, de l’anglais « Primary progressive Multiple Sclerosis ») : Les personnes diagnostiquées d’une SEP-PP ont des symptômes qui s'aggravent lentement et progressivement sans aucune période de rechute ou de rémission.
SEP secondaire progressive (SEP-SP, de l’anglais SPMS, ou « Secondary progressive Multiple Sclerosis ») : Dans de nombreux cas, les personnes initialement diagnostiquées avec une SEP-RR évoluent finalement vers une SEP-SP. Avec une sclérose en plaques secondaire progressive, on continue d'accumuler des lésions nerveuses. Les symptômes s'aggravent progressivement. Bien que l'on puisse encore éprouver des rechutes ou des poussées (lorsque les symptômes augmentent), on n'a plus de périodes de rémission par la suite (lorsque les symptômes se stabilisent ou disparaissent).
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec la cellule génétiquement modifiée proposée ici incluent, par exemple :
Des thérapies modificatrices de la maladie (DMT, de l’anglais « Disease-modifying therapies ») : Plusieurs médicaments disposent d’un agrément de la FDA pour le traitement à long terme de la SEP. Ces médicaments aident à réduire les rechutes (également appelées poussées ou attaques). Ils ralentissent la progression de la maladie. Et ils peuvent empêcher que de nouvelles lésions ne se forment sur le cerveau et la moelle épinière.
Des médicaments de gestion de rechutes : En cas d’attaque grave, un neurologue peut recommander une forte dose de corticostéroïdes. Le médicament peut réduire rapidement l'inflammation. Ils ralentissent les lésions à la gaine de myéline entourant les cellules nerveuses.
Une rééducation physique : La sclérose en plaques peut affecter les fonctions physiques. Rester en bonne forme physique et fort aide à maintenir la mobilité.
Le conseil en santé mentale : Faire face à une affection chronique peut être difficile sur le plan émotionnel. La SEP peut parfois affecter l'humeur et la mémoire. Travailler avec un neuropsychologue ou disposer d’un autre soutien émotionnel est un élément essentiel de la gestion de la maladie.
Une maladie inflammatoire chronique de l'intestin
Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) sont un groupe de troubles qui provoquent une inflammation chronique (douleur et gonflement) dans les intestins.
La maladie de Crohn et la colite ulcéreuse sont les principaux types de MICI. Les types incluent :
La maladie de Crohn provoque des douleurs et un gonflement dans le tractus digestif. Elle peut affecter n'importe quelle partie depuis la bouche jusqu’à l'anus. Elle affecte le plus souvent l'intestin grêle et la partie supérieure du gros intestin.
La colite ulcéreuse provoque un gonflement et des plaies (ulcères) dans le gros intestin (côlon et rectum).
La colite microscopique provoque une inflammation intestinale qui n'est détectable qu'au microscope.
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec la cellule génétiquement modifiée proposée ici incluent, par exemple : les aminosalicylates (un médicament anti-inflammatoire comme la sulfasalazine, la mésalamine ou le balsalazide) minimisent l'irritation des intestins ; les antibiotiques traitent les infections et les abcès ; les produits biologiques interrompent les signaux provenant du système immunitaire qui provoquent une inflammation ; les corticostéroïdes, tels que la prednisone, maintiennent le système immunitaire sous contrôle et gèrent les poussées ; les immunomodulateurs calment un système immunitaire hyperactif ; les médicaments antidiarrhéiques ; les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ; les vitamines et suppléments tels que les probiotiques.
Maladie du greffon contre l'hôte
La maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) est une affection qui peut survenir après une greffe allogénique. Dans la GvHD, la moelle osseuse donnée ou les cellules souches du sang périphérique perçoivent le corps du receveur comme étranger, et les cellules/la moelle osseuse données attaquent le corps.
Il existe deux formes de GvHD : Maladie aiguë du greffon contre l'hôte (aGvHD, de l’anglais « Acute graft versus host disease ») ; et Maladie chronique du greffon contre l'hôte (cGvHD, de l’anglais « Chronic graft versus host disease »).
Psoriasis
Le psoriasis est une affection cutanée chronique, c'est-à-dire une affection cutanée qui ne disparaît pas. Les personnes atteintes de psoriasis ont des plaques de peau épaisses, roses ou rouges couvertes d'écailles blanches ou argentées. Les aplats épais et squameux sont appelés plaques. Le psoriasis commence généralement au début de l'âge adulte, bien qu'il puisse commencer plus tard dans la vie. En plus des plaques rouges et squameuses, les symptômes du psoriasis incluent : des démangeaisons, une peau craquelée et sèche, un cuir chevelu squameux, des douleurs cutanées, des ongles piqués, fissurés ou friables, et des douleurs articulaires.
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec la cellule génétiquement modifiée proposée ici incluent, par exemple : Des crèmes à base de stéroïdes, des crèmes hydratantes pour peaux sèches, l’anthraline (un médicament ralentissant la production de cellules cutanées), des lotions médicamenteuses, des shampoings et solutions pour le bain pour améliorer le psoriasis du cuir chevelu, des pommades à la vitamine D3, des crèmes à la vitamine A ou aux rétinoïdes, la luminothérapie, le PUVA (un traitement associant un médicament appelé psoralène avec exposition à une forme spéciale de lumière UV), le méthotrexate, les rétinoïdes, la cyclosporine et/ou les thérapies immunitaires.
Syndrome de Sjogren
Le syndrome de Sjögren est une maladie auto-immune permanente qui réduit la quantité d'humidité produite par les glandes des yeux et de la bouche. Il porte le nom d'Henrik Sjögren, un oculiste suédois qui a décrit l’affection pour la première fois. Bien qu’une bouche sèche et des yeux secs soient les principaux symptômes, la plupart des personnes qui ont ces problèmes n'ont pas le syndrome de Sjögren. La bouche sèche est aussi appelée xérostomie.
Il existe deux formes du syndrome de Sjögren : le syndrome de Sjögren primaire, qui se développe de lui-même, non à cause d'un autre problème de santé, et le syndrome de Sjögren secondaire, qui se développe en plus d'autres maladies auto-immunes telles que la polyarthrite rhumatoïde, le lupus et le rhumatisme psoriasique.
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec la cellule génétiquement modifiée proposée ici incluent, par ex. des traitements pour les yeux secs (par ex. des larmes artificielles, gouttes ophtalmiques sur ordonnance, bouchons lacrymaux, la chirurgie, des gouttes de sérum autologue), des traitements pour la sécheresse buccale (par ex. des producteurs de salive), des traitements des problèmes articulaires ou organiques (par ex. analgésiques, antirhumatismaux, immunosuppresseurs, stéroïdes, antifongiques et traitements de la sécheresse vaginale.
Myasthénie auto-immune
La myasthénie auto-immune (MG, de l’anglais « myasthenia gravis ») est une maladie auto-immune, ce qui signifie que le système immunitaire du corps attaque par erreur ses propres parties. La MG affecte la communication entre les nerfs et les muscles (la jonction neuromusculaire).
Les personnes atteintes de MG perdent la capacité de contrôler volontairement leurs muscles. Ils éprouvent une faiblesse musculaire et une fatigue de gravités variables. Ils peuvent ne pas être capables de bouger les muscles des yeux, visage, cou et membres. La MG est une maladie neuromusculaire permanente.
La MG affecte environ 20 personnes sur 100.000. Les experts estiment que 36.000 à 60.000 Américains sont atteints de cette maladie neuromusculaire. Le nombre réel de personnes touchées peut être plus élevé, car certaines personnes atteintes de cas bénins peuvent ne pas savoir qu'elles sont atteintes de la maladie. La MG affecte majoritairement les femmes âgées de 20 à 40 ans et les hommes âgés de 50 à 80 ans. Environ un cas de MG sur 10 survient chez des adolescents (MG juvénile). La maladie peut toucher des personnes de tous âges mais est rare chez les enfants.
La MG auto-immune est la forme la plus courante de cette maladie neuromusculaire. La MG auto-immune peut être :
Oculaire : Les muscles qui déplacent les yeux et les paupières faiblissent. Les paupières peuvent s’affaisser ou il peut ne pas être possible de garder les yeux ouverts. Certaines personnes présentent une vision double. La faiblesse des yeux est souvent le premier signe de la MG. Près de la moitié des personnes atteintes de MG oculaire évoluent vers la forme généralisée dans les deux ans suivant le premier symptôme.
Généralisée : La faiblesse musculaire affecte les yeux et d'autres parties du corps telles que les visage, cou, bras, jambes et gorge. Il peut être difficile de parler ou d'avaler, de lever les bras au-dessus de la tête, de se lever depuis une position assise, de marcher de longues distances et de monter les escaliers.
Les thérapies qui peuvent être utilisées en combinaison avec la cellule génétiquement modifiée proposée ici incluent, par exemple, les médicaments, les anticorps monoclonaux, l'immunoglobuline IV (IVIG), l'échange de plasma (plasmaphérèse) et/ou la chirurgie.
Cancer
Il a été démontré que la liaison du TNF au TNFR2 favorise l'activation des cellules tumorales et des types de cellules associées aux tumeurs, tout en affectant la réponse immunitaire, comme les lymphocytes infiltrant la tumeur, pour créer un environnement dans lequel la tumeur peut progresser. En effet, l'expression de TNFR2 dans les tumeurs est associée à la progression de la maladie et à de mauvais résultats cliniques (Sheng Y, et al.). Par conséquent, la cellule génétiquement modifiée de la présente invention peut être utile dans le traitement du cancer, soit en monothérapie soit en conjonction avec d'autres traitements du cancer tels que les immunothérapies, par ex. les thérapies CAR-T, les inhibiteurs de points de contrôle et les traitements anticancéreux conventionnels.
Le cancer inclut, par exemple, les tumeurs bénignes, prémalignes et malignes, ou une maladie proliférative, un état précancéreux, mais se s’y limite pas.
Dans certains modes de réalisation, le cancer est un cancer hématologique, tel que la leucémie lymphoïde chronique (CLL, de l’anglais « chronic lymphocytic leukemia »), les leucémies aiguës, la leucémie lymphoïde aiguë (ALL, de l’anglais « acute lymphoid leukemia »), la leucémie lymphoïde aiguë à lymphocytes B (B-ALL, de l’anglais « B-cell acute lymphoid leukemia »), la leucémie lymphoïde aiguë à lymphocytes T (T-ALL, de l’anglais « T-cell acute lymphoid leukemia »), la leucémie myéloïde chronique (LMC), la leucémie prolymphocytaire à lymphocytes B, le néoplasme à cellules plasmacytoïdes dendritiques blastiques, le lymphome de Burkitt, le lymphome diffus à grands lymphocytes B, le lymphome folliculaire, la leucémie à tricholeucocytes, le lymphome folliculaire à petites ou à grandes cellules, les affections malignes lymphoprolifératives, le lymphome MALT (de l’anglais « mucosa-associated lymphoid tissue », soit « du tissu lymphoïde associé aux muqueuses »), le lymphome à cellules du manteau, le lymphome de la zone marginale, le myélome multiple, la myélodysplasie et le syndrome myélodysplasique, le lymphome non hodgkinien, le lymphome de Hodgkin, le lymphome plasmablastique, le néoplasme à cellules dendritiques plasmacytoïdes, la macroglobulinémie de Waldenstrom, ou la préleucémie, mais sans s'y limiter.
Dans certains modes de réalisation, le cancer est sélectionné dans le groupe constitué par le cancer du côlon, le cancer rectal, le carcinome à cellules rénales, le cancer du foie, le carcinome du poumon à cellules non petites, le cancer de l'intestin grêle, le cancer de l'œsophage, le mélanome, le cancer des os, le cancer du pancréas, le cancer de la peau, le cancer de la tête ou du cou, le mélanome malin cutané ou intraoculaire, le cancer de l'utérus, le cancer de l'ovaire, le cancer du rectum, le cancer de la région anale, le cancer de l'estomac, le cancer des testicules, le cancer utérin, le carcinome des trompes de Fallope, le carcinome de l'endomètre, le carcinome du col de l'utérus, le carcinome du vagin, le carcinome de la vulve, la maladie de Hodgkin, le lymphome non hodgkinien, le cancer du système endocrinien, le cancer de la glande thyroïde, le cancer de la glande parathyroïde, le cancer de la glande surrénale, le sarcome des tissus mous, le cancer de l'urètre, le cancer du pénis, les tumeurs solides de l'enfance, le cancer de la vessie, le cancer du rein ou de l'uretère, le carcinome du bassinet du rein, le néoplasme du système nerveux central (SNC), le lymphome primitif du SNC, l’angiogenèse tumorale, la tumeur de l'axe rachidien, le gliome du tronc cérébral, l’adénome hypophysaire, le sarcome de Kaposi, le cancer épidermoïde, le cancer des cellules squameuses, le lymphome des lymphocytes T, les cancers induits par l'environnement, les combinaisons desdits cancers, et les lésions métastatiques desdits cancers.
Préparations pharmaceutiques Les formulations sont préparées pour le stockage et l'utilisation par combinaison d’une cellule génétiquement modifiée de la présente divulgation avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable (par ex. un support ou excipient). Les personnes du métier considèrent généralement que les supports, excipients et/ou stabilisants pharmaceutiquement acceptables sont des ingrédients inactifs d'une formulation ou composition pharmaceutique.
Dans certains modes de réalisation, un agent AFFIMER® décrit ici est lyophilisé et/ou stocké sous une forme lyophilisée. Dans certains modes de réalisation, une formulation comprenant la cellule génétiquement modifiée décrite ici est lyophilisée.
Les véhicules pharmaceutiquement acceptables appropriés incluent, mais sans s'y limiter, des tampons non toxiques tels que le phosphate, le citrate et d'autres acides organiques ; des sels tels que le chlorure de sodium ; des antioxydants dont l'acide ascorbique et la méthionine ; les conservateurs tels que le chlorure d'octadécyldiméthylbenzylammonium, le chlorure d'hexaméthonium, le chlorure de benzalkonium, le chlorure de benzéthonium, le phénol, l'alcool butylique ou benzylique, les alkylparabènes tels que le méthyl- ou propylparabène, le catéchol, le résorcinol, le cyclohexanol, le 3-pentanol, le m-crésol ; des polypeptides de faible poids moléculaire (par ex. moins d'environ 10 résidus d'acides aminés) ; des protéines telles que l'albumine sérique, la gélatine ou les immunoglobulines ; les polymères hydrophiles tels que la polyvinylpyrrolidone ; des acides aminés tels que la glycine, la glutamine, l'asparagine, l'histidine, l'arginine ou la lysine ; les glucides tels que les monosaccharides, les disaccharides, le glucose, le mannose ou les dextrines ; des agents chélatants tels que l'EDTA ; les sucres tels que le saccharose, le mannitol, le tréhalose ou le sorbitol ; des contre-ions salifiants tels que le sodium ; les complexes métalliques tels que les complexes Zn-protéine ; et des tensioactifs non ioniques tels que le TWEEN ou le polyéthylène glycol (PEG). (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.).
Les compositions pharmaceutiques de la présente divulgation peuvent être administrées de n'importe quel nombre de manières pour un traitement soit local, soit systémique. L'administration peut être topique par patchs épidermiques ou transdermiques, pommades, lotions, crèmes, gels, gouttes, suppositoires, pulvérisateurs, liquides et poudres ; pulmonaire par inhalation ou insufflation de poudres ou d'aérosols, notamment par nébulisation, intratrachéale et intranasale ; orale ; ou parentérale y compris intraveineuse, intra-artérielle, intratumorale, sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire (par ex. injection ou perfusion) ou intracrânienne (par ex. intrathécale ou intraventriculaire).
La formulation thérapeutique peut être sous forme posologique unitaire. De telles formulations incluent les comprimés, pilules, gélules, poudres, granulés, solutions ou suspensions dans de l'eau ou des milieux non aqueux, ou les suppositoires. Dans les compositions solides telles que les comprimés, le principal ingrédient actif est mélangé avec un support pharmaceutique. Les ingrédients de fabrication de comprimés classiques incluent l'amidon de maïs, le lactose, le saccharose, le sorbitol, le talc, l'acide stéarique, le stéarate de magnésium, le phosphate ou les gommes dicalciques, et les diluants (par ex. de l'eau). Ceux-ci peuvent être utilisés pour former une composition de préformulation solide contenant un mélange homogène d'un composé de la présente divulgation, ou un sel pharmaceutiquement acceptable non toxique de celui-ci. La composition de préformulation solide est ensuite subdivisée en formes posologiques unitaires d'un type décrit ci-dessus. Les comprimés, pilules, etc. de la formulation ou composition peuvent être enrobés ou mélangés d'une autre manière pour offrir une forme posologique offrant l'avantage d'une action prolongée. Par exemple, le comprimé ou la pilule peut comprendre une composition interne recouverte d'un composant externe. De plus, les deux composants peuvent être séparés par une couche entérique qui sert à résister à la désintégration et permet au composant interne de traverser intact l'estomac ou d'être retardé dans sa libération. Une variété de matériaux peut être utilisée pour ces couches ou revêtements entériques, de tels matériaux incluant un certain nombre d'acides polymériques et de mélanges d'acides polymériques avec des matériaux tels que la gomme laque, l'alcool cétylique et l'acétate de cellulose.
La cellule génétiquement modifiée décrite ici peut également être piégée dans des microcapsules. De telles microcapsules sont préparées, par exemple, par des techniques de coacervation ou par polymérisation interfaciale, par exemple, des microcapsules d'hydroxyméthylcellulose ou de gélatine et des microcapsules de poly-(méthacrylate de méthyle), respectivement, dans des systèmes colloïdaux de délivrance de médicament (par exemple, des liposomes, des microsphères d'albumine, des microémulsions, nanoparticules et nanocapsules) ou dans des macroémulsions tel que décrit dans Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.
Dans certains modes de réalisation, les formulations pharmaceutiques comprennent la cellule génétiquement modifiée de la présente divulgation complexée avec des liposomes. Les procédés de production des liposomes sont connus des personnes du métier. Par exemple, certains liposomes peuvent être générés par évaporation en phase inverse avec une composition lipidique comprenant de la phosphatidylcholine, du cholestérol et de la phosphatidyléthanolamine dérivée de PEG (PEG-PE). Les liposomes peuvent être extrudés à travers des filtres de taille de pores définie pour produire des liposomes du diamètre souhaité.
Dans certains modes de réalisation, des préparations à libération prolongée comprenant la cellule génétiquement modifiée décrite ici peuvent être produites. Des exemples appropriés de préparations à libération prolongée incluent des matrices semi-perméables de polymères hydrophobes solides contenant un agent AFFIMER®, où les matrices sont sous la forme d'articles façonnés (par ex. des films ou microcapsules). Des exemples de matrices à libération prolongée incluent les polyesters, les hydrogels tels que le poly(2-hydroxyéthyl-méthacrylate) ou le poly(alcool vinylique), les polylactides, les copolymères d'acide L-glutamique et de 7 éthyl-L-glutamate, l'éthylène-acétate de vinyle non dégradable, les copolymères dégradables d'acide lactique et d'acide glycolique tels que le LUPRON DEPOT™. (microsphères injectables composées de copolymère d'acide lactique-acide glycolique et d'acétate de leuprolide), d'isobutyrate d'acétate de saccharose et d'acide poly-D-(-)-3-hydroxybutyrique.
Dans certains modes de réalisation, en plus de l'administration de la cellule génétiquement modifiée décrite ici, le procédé ou le traitement comprend en outre l'administration d'au moins un agent thérapeutique supplémentaire. Un agent thérapeutique supplémentaire peut être administré avant, concurremment à et/ou après l'administration de la cellule génétiquement modifiée. Des compositions pharmaceutiques comprenant la cellule génétiquement modifiée et le ou les agents thérapeutiques supplémentaires sont également proposées. Dans certains modes de réalisation, l’au moins un agent thérapeutique supplémentaire comprend 1, 2, 3 ou plus agents thérapeutiques supplémentaires.
La thérapie combinée avec deux ou plus agents thérapeutiques utilise souvent des agents qui agissent selon différents mécanismes d'action, bien que cela ne soit pas requis. La thérapie combinée utilisant des agents ayant des mécanismes d'action différents peut entraîner des effets additifs ou synergiques. La thérapie combinée peut autoriser une dose plus faible de chaque agent que celle utilisée en monothérapie, réduisant ainsi les effets secondaires toxiques et/ou augmentant l'indice thérapeutique de la cellule génétiquement modifiée.
Dans certains modes de réalisation des procédés décrits ici, la combinaison de la cellule génétiquement modifiée décrite ici et d'au moins un agent thérapeutique supplémentaire aboutit à des résultats additifs ou synergiques. Dans certains modes de réalisation, la thérapie combinée aboutit à une augmentation de l'indice thérapeutique de la cellule génétiquement modifiée. Dans certains modes de réalisation, la thérapie combinée aboutit à une augmentation de l'indice thérapeutique de(s) agent(s) thérapeutique(s). Dans certains modes de réalisation, la thérapie combinée entraîne une diminution de la toxicité et/ou des effets secondaires de la cellule génétiquement modifiée. Dans certains modes de réalisation, la thérapie combinée entraîne une diminution de la toxicité et/ou des effets secondaires de(s) agent(s) thérapeutique(s).
L'administration combinée peut inclure une coadministration, soit dans une seule formulation pharmaceutique soit en utilisant des formulations séparées, ou une administration consécutive dans l'un ou l'autre ordre mais généralement dans un laps de temps tel que tous les agents actifs puissent exercer leurs activités biologiques simultanément.
On comprendra que la combinaison de la cellule génétiquement modifiée décrite ici et d'au moins un agent thérapeutique supplémentaire peut être administrée dans n'importe quel ordre ou concurremment. Dans certains modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée sera administrée à des patients ayant préalablement subi un traitement avec un second agent thérapeutique. Dans certains autres modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée et un second agent thérapeutique seront administrés sensiblement simultanément ou concurremment. Par exemple, un sujet peut recevoir la cellule génétiquement modifiée tout en subissant une trajectoire de traitement avec un second agent thérapeutique (par ex. une chimiothérapie). Dans certains modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée sera administrée sous 1 année du traitement avec un second agent thérapeutique. Dans certains modes de réalisation alternatifs, la cellule génétiquement modifiée sera administrée dans les 10, 8, 6, 4 ou 2 mois de tout traitement avec un second agent thérapeutique. Dans certains autres modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée sera administrée dans les ou la 4, 3, 2 ou 1 semaine(s) de tout traitement avec un second agent thérapeutique. Dans certains modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée sera administrée sous 5, 4, 3, 2 ou 1 jour(s) de tout traitement avec un second agent thérapeutique. On notera en outre que les deux agents ou traitements (ou plus) peuvent être administrés au sujet en l'espace de quelques heures ou minutes (par ex. sensiblement simultanément).
Utilisation - une composition ou un procédé pour l’immunomodulation
Comme décrit ci-dessus, il est bien connu que l'activation de la voie TNFR2 peut conduire à une suppression du système immunitaire. La variante de la protéine Stéfine A et/ou la protéine de fusion de la cellule génétiquement modifiée se lie à et active la voie TNFR2 manifestant ainsi l'effet de prolifération et d'activation des lymphocytes Treg, et par conséquent, la régulation de l'immunité, c'est-à-dire l'effet de suppression du système immunitaire ou de la réponse immunitaire.
Ainsi, dans un autre aspect, la présente invention porte sur une composition pour l’immunomodulation comprenant la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci.
Dans un autre aspect, la présente invention porte sur une utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci pour immunomodulation.
Dans un autre aspect, la présente invention porte sur une utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci pour immunomodulation.
Dans un autre aspect, la présente invention porte sur un procédé pour l’immunomodulation comprenant l’administration de la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci à un sujet.
Tel qu'il est utilisé ici, le terme « immunomodulation » signifie soulager le déséquilibre immunitaire dans le sang et maintenir l'homéostasie immunitaire. Le maintien de l'homéostasie immunitaire fait référence à un état dans lequel la tolérance immunitaire, qui est un mécanisme d'inhibition de l'immunité, et l'immunité qui favorise la réponse immunitaire, sont équilibrées, et le maintien d'un tel état est un facteur essentiel dans le traitement des maladies immunitaires, en particulier les maladies auto-immunes.
Le terme « immunosuppression » ou « suppression du système immunitaire » tel qu'utilisé ici fait référence à diverses substances utilisées pour réduire ou bloquer la capacité d'un hôte à produire des anticorps (réponse immunitaire humorale) ou la capacité à déclencher une réponse immunitaire cellulaire à l'action d’un antigène.
Dans certains modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée et/ou le milieu de culture cellulaire conditionné peuvent manifester un effet hyper-immunosuppresseur. L'effet hyper-immunosuppresseur est un effet de suppression de l'hyper-immunité en inhibant la surexpression des lymphocytes provoquée par un stimulateur non spécifique dans les splénocytes.
Les compositions selon la présente invention peuvent être administrées en combinaison avec des protéines liées à l'immunité, en particulier des protéines liées à l’auto-immunité ou aux allergies. Des exemples spécifiques des protéines incluent les auto-antigènes impliqués dans des maladies auto-immunes. Par exemple, les protéines peuvent inclure des auto-antigènes impliqués dans la polyarthrite rhumatoïde, tels que des protéines de choc thermique (HSP, de l’anglais « heat-shock proteins »), la filaggrine citrullinée, la glucose-6-phosphate isomérase, la p205, le collagène, et similaires ; les auto-antigènes impliqués dans le diabète de type I, tels que l'insuline, la protéine transporteur de zinc 8 (ZnT8), l'homéoboîte 1 pancréatique et duodénale (PDX1, de l’anglais « Pancreatic and duodenal homeobox 1 »), la chromogranine A (CHGA) et l’amyline (IAPP, de l’anglais « Islet amyloid polypeptide ») ; et les auto-antigènes impliqués dans la myasthénie, tels qu'un récepteur de l'acétylcholine. En plus de tous les types d'auto-antigènes connus dans les maladies auto-immunes, les protéines peuvent inclure divers allergènes connus pour provoquer des allergies alimentaires, tels que les arachides, le lait, les œufs, les noix, les haricots, les crustacés tels que les crevettes et similaires, les substances dérivées du poisson, et similaires.
Utilisation - une composition ou un procédé de culture de lymphocytes T régulateurs
Comme décrit ci-dessus, l'importance du rôle du TNFR2 dans la prolifération et la fonction des Treg a été démontrée dans diverses études. Les souris déficientes en TNFR2 ont montré des nombres réduits de Tregs thymiques et périphériques (2013_Chen X, et al. PMID: 23277487), et les Tregs TNFR2 -/- n'ont pas été capables de contrôler la réponse inflammatoire in vivo (2008_Van Mierlo GJ, et al. PMID: 18292492). Chez l'humain, il a été démontré que les Treg expriment un niveau plus élevé de TNFR2 que les lymphocytes effecteurs T (2013_Okubo Y, et al. PMID: 24193319 & 2002_ Annunziato F, et al. PMID: 12163566) et les Tregs TNFR2+ ont manifesté la suppression la plus puissante de la prolifération et de la production de cytokines des lymphocytes répondeurs T cocultivés (en anglais « co-cultured T-responder cells ») (2010_Chen X, et al. PMID: 20127680).
Ainsi, dans un autre aspect, la présente invention porte sur une composition ou milieu pour la culture d’une lymphocyte T régulateur comprenant la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci.
Dans un autre aspect, la présente invention porte sur un procédé pour la culture d’un lymphocyte T régulateur comprenant la culture d’un lymphocyte T régulateur en présence de la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci.
Dans un autre aspect, la présente invention porte sur une utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci une la culture d’un lymphocyte T régulateur.
Dans un autre aspect, de la présente invention porte sur une utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci pour fabriquer une composition ou un milieu pour une culture de lymphocytes T régulateurs.
Dans certains modes de réalisation, la composition ou le milieu de culture des lymphocytes T comprend en outre l'un quelconque sélectionné dans le groupe constitué d'une source d'énergie, d'acides aminés, de sucres, de sels inorganiques et de vitamines. du sérum bovin fœtal (FBS, de l’anglais « fetal bovine serum »), de l’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique (HEPES, de l’anglais « hydroxyethyl piperazine ethane sulfonic acid »), des protéines, des glucides, du mercaptoéthanol, et des facteurs de croissance.
Dans certains modes de réalisation, la composition ou le milieu peut en outre comprendre - des composants nécessaires aux cellules pour la croissance et la survie des cellules in vitro, ou comprendre des composants qui aident la croissance et la survie des cellules. Plus précisément, les composants peuvent être des vitamines, des acides aminés essentiels ou non essentiels, et des oligo-éléments.
Tel qu'utilisé ici, le terme « lymphocyte T régulateur (Treg ou lymphocyte Treg) » comprend les lymphocytes T régulateurs naturels (nTreg, de l’anglais « natural regulatory T cells ») ou les lymphocytes T régulateurs induits (iTreg, de l’anglais « induced regulatory T cells »). Les lymphocytes T régulateurs maintiennent l'homéostasie immunitaire et bloquent une réponse auto-immune, et similaire en inhibant une réponse immunitaire. Dans certains modes de réalisation, les lymphocytes T régulateurs peuvent être des lymphocytes T régulateurs modifiées par ingénierie génétique. Des exemples de lymphocytes T régulateurs modifiées par ingénierie génétique incluent, mais sans s'y limiter, les CAR-Treg et TCR-Treg.
Dans certains modes de réalisation, les lymphocytes T régulateurs sont de préférence des lymphocytes T régulateurs CD4+Foxp3+, mais ne se limitent pas à ceux-ci.
Dans certains modes de réalisation, les lymphocytes T régulateurs expriment le TNFR2, de préférence le TNFR2 est présenté sur la surface (ou la membrane) des lymphocytes T régulateurs. Dans certains modes de réalisation, les lymphocytes T régulateurs sont des lymphocytes T régulateurs isolés.
Dans certains modes de réalisation, les lymphocytes T régulateurs sont cultivés en présence de la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci.
Dans certains modes de réalisation, la culture des lymphocytes T régulateurs en présence de la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci peut être effectuée in vitro ou ex vivo. Dans certains modes de réalisation, la culture des lymphocytes T régulateurs peut être réalisée en cocultivant les lymphocytes T régulateurs et les cellules génétiquement modifiées. Dans le contexte de la présente invention, la cellule génétiquement modifiée et/ou son milieu de culture cellulaire conditionné se lie au TNFR2 présenté sur la surface des lymphocytes Treg et active une voie TNFR2.
Dans certains modes de réalisation, les lymphocytes T régulateurs induits (iTregs) peuvent être obtenus par coculture avec des cellules présentatrices d'antigène tolérogènes avec des lymphocytes T CD4+, mais ne s’y limitent pas.
Dans certains modes de réalisation, l'utilisation, la composition, le milieu ou le procédé de culture de lymphocytes Treg de la présente invention peut induire la prolifération et/ou l'activation des lymphocytes T régulateurs.
Utilisation - Composition pour la délivrance de médicament
Encore un autre aspect de la présente invention porte sur une composition pour délivrance de médicament, comprenant la cellule génétiquement modifiée décrite ci-dessus.
Dans certains modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée peut comprendre au moins un médicament qui est supporté par celle-ci ou attaché à sa surface.
Dans certains modes de réalisation, le médicament peut être additionnellement chargé avec au moins un élément sélectionné dans le groupe constitué d'un gène, d'un virus et d'un composé à petite molécule.
Dans certains modes de réalisation, le médicament peut avoir une activité immunomodulatrice, de préférence un effet immunosuppresseur, mais n'est pas limité à cela.
La cellule génétiquement modifiée de la présente invention est capable d'exprimer la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2, activant ainsi la fixation ciblée sur le TNFR2 et l'activité des cellules immunitaires.
De plus, dans certains modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée peut être une cellule stromale mésenchymateuse. Lorsque la cellule hôte de la présente invention est une cellule stromale mésenchymateuse, la cellule stromale mésenchymateuse a une fonction de ralliement pour rechercher biologiquement un site endommagé ou infecté dans le corps, et a ainsi une capacité de ciblage très élevée, permettant de délivrer efficacement et précisément le médicament à un site souhaité du corps.
Dans certains modes de réalisation, le médicament peut être supporté à l'intérieur de la cellule stromale mésenchymateuse, attaché à la surface de celle-ci, ou supporté à l'intérieur de la cellule et attaché à la surface cellulaire, mais la présente invention peut ne pas s'y limiter. Le médicament peut être directement supporté à l'intérieur des cellules stromales mésenchymateuses et/ou attaché à la surface de celles-ci, mais la présente invention ne s’y limite pas. Le médicament peut être chargé sur une nanostructure, supporté à l'intérieur de la cellule stromale mésenchymateuse dans un état attaché à une molécule spécifique, et/ou attaché à la surface cellulaire, mais la présente invention ne s’y limite pas. Dans certains modes de réalisation, la nanostructure peut comprendre des nanoparticules inorganiques, des nanoparticules polymères, des protéines ou des liposomes. Les exemples de nanoparticules inorganiques peuvent inclure, mais sans s'y limiter, des nanoparticules d'oxyde de fer, des nanoparticules de points quantiques, des nanoparticules d'oxyde métallique, et similaires. La nanostructure peut comprendre, mais sans s'y limiter, une nanostructure poreuse. Par exemple, le médicament peut être supporté par les pores dans la nanostructure poreuse ou chargé sur la cellule stromale mésenchymateuse sous une forme fixée à la surface de la nanostructure, mais la présente invention n’y est pas limitée. Les nanoparticules de polymère sont des nanoparticules fréquemment utilisées pour la délivrance de médicament et sont principalement constituées de polymères et de graisses.
Dans certains modes de réalisation, la cellule génétiquement modifiée peut être caractérisée en ce que le médicament est libéré au niveau d'un site cible. Dans certains modes de réalisation, le médicament porté dans la cellule génétiquement modifiée peut être libéré. Dans certains modes de réalisation, le médicament fixé à la surface de la cellule génétiquement modifiée peut être détaché et libéré de la surface en fonction de l'environnement cible. Dans certains modes de réalisation, lorsque le médicament est supporté par la nanostructure, le médicament peut être libéré par un changement structurel spécifique à la température ou spécifique au pH de la nanostructure.
EXEMPLES
Ci-après, la présente invention sera décrite plus en détail en référence aux exemples suivants. Cependant, il sera évident pour les personnes du métier que les exemples suivants sont fournis uniquement à titre d'illustration de la présente invention et ne doivent pas être interprétés comme limitant la portée de la présente invention.
Exemple 1. Sélection de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 à partir d’une bibliothèque d’exposition sur phages
Identification de clones candidats
La variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention a été identifiée par sélection à partir d'une bibliothèque de variantes de la protéine Stéfine A avec deux séquences de boucles aléatoires, chaque boucle ayant une longueur d'environ 9 acides aminés affichés dans un squelette de structure constant de la variante de la protéine Stéfine A sur la base de la séquence d'acides aminés de la Stéfine A. De telles procédures de sélection ont été décrites (voir, par ex. Tiede et al. Protein Eng Des Sel. 2014. 27(5): 145–155 et Hughes et al. Sci Signal. 2018. 10(505): eaaj2005). Selon de telles procédures, des suspensions de phages exprimant une variante de la protéine Stéfine A ont été incubées avec du TNFR2 humain (ou de souris dans des expériences ultérieures) selon les besoins, les séquences desquelles étant présentées dans le Tableau 7.
Tableau 7. Séquences de protéines TNFR utilisées lors de la sélection (de Sino Biologicals).
Protéine Séquence cible Numéro du plasmide au catalogue SEQ ID NO :
TNFR2 humain MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDFALPVGLIVGVTALGLLIIGVVNCVIMTQVKKKPLCLQREAKVPHLPADKARGTQGPEQQHLLITAPSSSSSSLESSASALDRRAPTRNQPQAPGVEASGAGEARASTGSSDSSPGGHGTQVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASSTMGDTDSSPSESPKDEQVPFSKEECAFRSQLETPETLLGSTEEKPLPLGVPDAGMKPS Cat: HG10417-CY 478
TNFR1 humain MGLSTVPDLLLPLVLLELLVGIYPSGVIGLVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSCSNCKKSLECTKLCLPQIENVKGTEDSGTTVLLPLVIFFGLCLLSLLFIGLMYRYQRWKSKLYSIVCGKSTPEKEGELEGTTTKPLAPNPSFSPTPGFTPTLGFSPVPSSTFTSSSTYTPGDCPNFAAPRREVAPPYQGADPILATALASDPIPNPLQKWEDSAHKPQSLDTDDPATLYAVVENVPPLRWKEFVRRLGLSDHEIDRLELQNGRCLREAQYSMLATWRRRTPRREATLELLGRVLRDMDLLGCLEDIEEALCGPAALPPAPSLLR HG10872-CY 479
TNFR2 de cynomolgus MAPAAVWAALAVGLELWAAGHALPAQVAFTPYAPEPGGTCRLREYYDQTAQMCCSKCPPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAQLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICHVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPAPSTAPGTSFLLPVGPSPPAEGSTGDIVLPVGLIVGVTALGLLIIGVVNCVIMTQVKKKPLCLQRETKVPHLPADKARGAQGPEQQHLLTTVPSSSSSSLESSASALDRRAPTRNQPQAPGAEKASGAGEARASTGSSDSSPGGHGTQVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASSTTGDTDASPSGSPKDEQVPFSKEECAFRSQLETPETLLGSTGEKPLPLGVPDAGMKPS CG90102-ACR 480
TNFR2 de souris MAPAALWVALVFELQLWATGHTVPAQVVLTPYKPEPGYECQISQEYYDRKAQMCCAKCPPGQYVKHFCNKTSDTVCADCEASMYTQVWNQFRTCLSCSSSCTTDQVEIRACTKQQNRVCACEAGRYCALKTHSGSCRQCMRLSKCGPGFGVASSRAPNGNVLCKACAPGTFSDTTSSTDVCRPHRICSILAIPGNASTDAVCAPESPTLSAIPRTLYVSQPEPTRSQPLDQEPGPSQTPSILTSLGSTPIIEQSTKGGISLPIGLIVGVTSLGLLMLGLVNCIILVQRKKKPSCLQRDAKVPHVPDEKSQDAVGLEQQHLLTTAPSSSSSSLESSASAGDRRAPPGGHPQARVMAEAQGFQEARASSRISDSSHGSHGTHVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASATVGDPDAKPSASPKDEQVPFSQEECPSQSPCETTETLQSHEKPLPLGVPDMGMKPSQAGWFDQIAVKVA
 MG50128-CY 481
TNFR1 de souris MGLPTVPGLLLSLVLLALLMGIHPSGVTGLVPSLGDREKRDSLCPQGKYVHSKNNSICCTKCHKGTYLVSDCPSPGRDTVCRECEKGTFTASQNYLRQCLSCKTCRKEMSQVEISPCQADKDTVCGCKENQFQRYLSETHFQCVDCSPCFNGTVTIPCKETQNTVCNCHAGFFLRESECVPCSHCKKNEECMKLCLPPPLANVTNPQDSGTAVLLPLVILLGLCLLSFIFISLMCRYPRWRPEVYSIICRDPVPVKEEKAGKPLTPAPSPAFSPTSGFNPTLGFSTPGFSSPVSSTPISPIFGPSNWHFMPPVSEVVPTQGADPLLYESLCSVPAPTSVQKWEDSAHPQRPDNADLAILYAVVDGVPPARWKEFMRFMGLSEHEIERLEMQNGRCLREAQYSMLEAWRRRTPRHEDTLEVVGLVLSKMNLAGCLENILEALRNPAPSSTTRLPR
 MG50496-CY 482
Tableau 8. Antigènes commerciaux utilisés lors de la sélection. Les antigènes TNFR2 ayant les séquences présentées dans le Tableau 7 ainsi que d'autres protéines présentées ci-dessous ont été testés dans différents formats pour biotinylation et utilisation dans la sélection TNFR2 AFFIMER® et d'autres essais.
Antigène Fournisseur Numéro au catalogue Etiquette Source PM prévu (kDa)
hTNFR2-hFc-his-Avi (conjugué à la biotine) BPS 100205 IgG1 humaine, 6x His, Avi, Biotine HEK293 75
hTNFR2-hFc-his-Avi BPS 79363 IgG1 humaine, 6x His, Avi HEK293 75
hTNFR2-his Acro Biosystems AMS.TN2-H5227 Etiquette 6X His HEK293 26
hTNFR2-his-avi (conjugué à la biotine) Acro Biosystems AMS.TN2-H82E3 Etiquette 6X His et Avi, Biotine HEK293 26
hTNFR2-his Sino Biologicals 10417-H08H 6x His HEK293 45
hTNFR2 Peprotech 310-12 N/A E. coli 20
mTNFR2-mFc R&D Biosystems 9707-R2-050 IgG2a de souris NS0 52
mTNFR2-his Sino Biologicals 50128-M08H 6x His HEK293 27
mTNFR2-hFc Sino Biologicals 50128-M02H IgG1 Fc humaine HEK293 52
hTNFa Peprotech 300-01-A N/A E. coli 17,4
mTNFa Peprotech 315-01A N/A E. coli 17,3
hFc (IgG1) AcroBiosystems FCC- H5214 N/A HEK293 26
hFc-Avi (IgG1) (conjugué à la biotine) AcroBiosystems IG1-H8213 Etiquette Avi, biotine HEK293 28,4
mFc (IgG2a) AcroBiosystems IGA-M5207 N/A HEK293 26,4
mFc (IgG2a) biotinylé AcroBiosytems IGA-M8210 N/A HEK293 28,2
hTNFR1-hFc AcroBiosytems TN1-H5251 IgG1 Fc humaine HEK293 47,9
mTNFR1-hFc-His R&D Systems 430-RI/CF IgG1 Fc humaine NS0 48,6
Dans certains cas, le TNFR2 a été biotinylé et capturé sur des billes de streptavidine et de neutravidine en alternance, alternativement le TNFR2 a été passivement absorbé par une surface. Les particules de phage non liées ont ensuite été enlevées par lavage et, en suite du lavage, les phages liés ont été élués. L'élution du phage lié a été accomplie par i exposition à la trypsine. Les particules de phage élués ont ensuite été utilisées pour infecter Escherichia coli (E. coli) et les bactéries infectées ont été incubées dans des conditions adaptées à la réplication du bactériophage. Après libération de particules de bactériophage par ces bactéries infectées, le cycle consistant à permettre aux particules de phage de se lier à l'antigène cible, à éluer les particules de phage liées, à propager les particules de phage éluées dans les bactéries, et à isoler les particules de phage libérées des bactéries infectées a été répété pour enrichir la population de bactériophages pour les particules de phage présentant des protéines qui se lient à l'antigène cible. Des conditions spécifiques ont été modifiées dans ces cycles, telles que l'augmentation du nombre d'étapes de lavage, la réduction de la quantité d'antigène disponible ou l'ajout d'un réactif de blocage, pour sélectionner des particules de phage exhibant des protéines qui se lient plus étroitement ou spécifiquement à l'antigène cible.
Après de multiples tours de sélection et d'amplification de la bibliothèque d'exposition sur phages (de l’anglais « phage display library », les protéines exprimées par les phages ont été exprimées et criblées par dosage immuno-enzymatique (ELISA, de l’anglais « enzyme-linked immunosorbent assay »). En bref, la variante de la protéine Stéfine A ont été surexprimées à partir de vecteurs phagémides, les cellules bactériennes ont été lysées, et les lysats ont été utilisés comme substrats dans les ELISA. Dans ces ELISA, du TNFR2 humain, murin et de cynomolgus a été immobilisé sur une plaque, des lysats ont été ajoutés, et la quantité de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 dans chaque plaque a été mesurée à l'aide d'un anticorps détecteur spécifique de l'étiquette Myc exprimée sur la variante de la protéine Stéfine A candidate. Les vecteurs phagémides codant pour la variante de la protéine Stéfine A avec la meilleure activité de liaison au TNFR2 humain ont été séquencés pour identifier les séquences d'ADN des clones candidats pour un développement ultérieur. Des polypeptides TNFR1 ont également été utilisés pour distinguer la spécificité. Les séquences d'acides aminés de la boucle 2 et de la boucle 4 de chacun de ces clones candidats sont présentées dans le tableau 1.
EXEMPLE 2 : Production d’une variante de la protéine Stéfine A dans des cellules de mammifères sous forme de protéine soluble et criblage
Clonage dans un vecteur d'intérêt
Pour apprécier la capacité de la variante de la protéine Stéfine A sélectionnée à se lier au TNFR2 lorsqu'elle est exprimée à la surface d'une cellule de mammifère, des groupes de cellules transfectées de manière transitoire ont été générés pour 30 clones « accélérés » (en anglais « fast-tracked ») sur la base des séquences les plus répétées lors de la sélection passive. Ces clones ont été utilisés pour la caractérisation initiale et l'optimisation de l’essai. Les séquences de variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et les cibles TNFR2 ont été clonées à partir du phagémide de l'Exemple 1 dans le vecteur d'expression de mammifère pD609kanR (vecteur personnalisé ATUM) pour expression dans des cellules Expi293F™ (ThermoFisher). La concentration moyenne obtenue à partir de l'expression a été de 2,8 mg/mL, avec 19 clones sélectionnés en fonction de leur pureté et jaugés par ELISA quant à la dégradation.
Ces 19 clones ont été criblés sur des cellules Expi293F™ exprimant hTNFR2 par cytométrie en flux à 1 µM et 0,1 µM tout en étant comparés aux témoins négatifs SQT-GLY et 3T0-GLY qui contiennent des glycines uniquement dans la Boucles 2 et la Boucles 4 et ne sont donc pas des liants spécifiques. Le signal détecté sur les cellules transfectées a été soustrait du signal obtenu sur les cellules Expi293F™ non transfectées. Parmi ceux-ci, 16 clones démontrent une liaison aux cellules hTNFR2-Expi293F™ à 1 µM > 10 % qu’une liaison à la lignée cellulaire parentale ait été soustraite. Les clones 15, 22 et 23 n'ont pas démontré de telle liaison ( ).
Les variantes de la protéine Stéfine A purifiées de mammifère à hTNFR2 ont été criblées dans l’essai rapporteur HEK Blue™ TNFα SEAP (Invivogen) selon les instructions du fabricant pour déterminer si elles pouvaient déclencher la voie NFkB et la production de SEAP via une liaison au TNFR2 lorsqu'elles sont regroupées (de l’anglais « clustered ») par un anticorps anti-his enduit sur la plaque. Dans cette expérience, 5 des clones accélérés (01, 09, 12, 21 et 26) ont démontré une capacité à déclencher la libération de SEAP, le clone 12 montrant l'agonisme le plus constant.
90 autres variantes de la protéine Stéfine A ont été clonées à partir du phagémide et caractérisées de manière similaire. 55 clones ont été repris et la liaison confirmée par analyse Mirrorball. Une caractérisation plus poussée a été effectuée par ELSA en concurrence pour tester leur capacité à bloquer l'interaction entre hTNFR2-hFc-his-avi et le TNF-alpha recombinant. Une série d'expériences a été réalisée pour déterminer l'EC80 de hTNFR2-hFc-his-Avi lors de la liaison au hTNF alpha enrobé (593 pM). La variante de la protéine Stéfine A ont été testées à trois concentrations différentes (10, 1 et 0,1 µM) lorsque possible, en présence de l'antigène hTNFR2 à sa CE80 déterminée. La détection de hTNFR2-hFc-his-Avi lié a été effectuée par l’anticorps anti-hFc-HRP. Parmi les 75 clones testés, 32 clones, qui ont montré un % d'inhibition supérieur à 65 % à 10 µM, ont été sélectionnés pour être caractérisés davantage afin de déterminer leur CI50 ( ). Les clones 06, 21, 26, 27, 44, 108 et 115 ont montré une inhibition totale de l'interaction entre TNFα et hTNFR2 aux concentrations testées.
A ce stade, ces 55 clones ainsi que les 14 clones du groupe accéléré (13 agonistes, un négatif, clone 06) ont été clonés dans le vecteur pDisplay (Thermo Fisher). Ce vecteur contient un domaine transmembranaire de protéine PDGFR en C-term pour permettre l'expression d'Affiner à la surface des cellules d'expression et en tant que protéines solubles. Des étiquettes supplémentaires telles que HA en N-term sont également codées par ce vecteur permettant une vérification facile de l'expression d’Affimer. Une fois clonées, ces Affimer ont été transfectées de manière transitoire dans des cellules Expi293F™ pour une analyse SEAP comme décrit précédemment. En prenant toutes les données ensemble, 43 clones ont été sélectionnés pour une caractérisation supplémentaire.
EXEMPLE 3 : Caractérisation de 43 clones sélectionnés
Essai Biacore
Les 43 clones sélectionnés ont été testés dans une analyse cinétique Biacore en tant que protéines solubles. En bref, des cinétiques multicycles ont été réalisées à l'aide d'une puce CM5 sur laquelle l'antigène dimérique hTNFR2-hFc-his-avi a été immobilisé à 500. Une variante de la protéine Stéfine A ont été titrées à la baisse (de l’anglais « downtitrated ») dans un tampon HBS-EP+ à partir de 1 µM dans une série de dilutions à 1:2. Le temps d'association et la dissociation utilisés étaient respectivement de 200 s et 400 s à un débit de 20 µl/min avec une régénération avec 10 mM de glycine à pH 1,5 pendant 30 s à 30 µl/min. Douze clones ont montré une réponse très faible et aucune valeur KD n'a pu être estimée pour ceux-ci. Le clone 09 a été ajusté à l'aide du modèle de liaison à 1:1, cependant, la valeur KD rapportée était trop élevée (>E-05) pour être fiable avec la plage de concentration utilisée. Pour 16 clones, le signal atteint était adéquat et ils ont pu être ajustés avec succès en utilisant le modèle de liaison à 1:1, la courbe et leur ajustement sont compilés. Deux clones (21 et 69) qui sont des dimères ont été ajustés en utilisant à la fois le modèle de liaison à 1:1 et un état d'équilibre afin d'estimer leur KD, tandis que dans 12 clones, un faible Rmax a rendu difficile leur ajustement en utilisant le modèle de liaison à 1:1 et le modèle d'état d’équilibre (en anglais « Steady State ») a été utilisé à la place. Dans ce cas, la valeur KD obtenue n'a pas été rapportée ; à la place, un ordre de grandeur l'a été. Les résultats sont présentés en .
Réactivité croisée ELISA (« Enzyme Linked Immunosorbent Assay », soit : « technique d'immunoadsorption par enzyme liée ») de liaison
La spécificité des clones de variantes de la protéine Stéfine A pour TNFR2 a été appréciée par ELISA lorsque les clones se liant au TNFR1 ont été comparés à leur liaison au TNFR1. Aucun des clones n'a montré de liaison au TNFR1 en tant qu'antigène recombinant. L’hTNFR1 a également été exprimé dans des cellules Expi293F™, et aucune liaison n'a été observée à ce hTNFR1 exprimé de manière cellulaire, confirmant l'absence de réactivité croisée entre les variantes de la protéine Stéfine A se liant aux liants hTNFR2 avec l’hTNFR1.
En plus de leur liaison au TNFR2 humain, la liaison des clones au TNFR2 de souris a également été testée pour vérifier si l'un d'entre eux présentait une réaction croisée. Il y avait très peu de chances que cela se produise car l'homologie entre les deux protéines est d'environ 68 % pour le domaine extracellulaire, ce qui a été confirmé car aucun clone n'a démontré de liaison aux cellules Expi293F™ exprimant mTNFR2.
HEK293 – Caractérisation par essai HEK Blue
Les 43 clones principaux ont été transfectés temporairement dans des cellules HEK 293, avec 4 témoins, SQT-Gly (SEQ ID NO : 484), 3t0-Gly (SEQ ID NO: 485), vecteur vide et clone 06 qui s'est révélé être négatif. Environ 29h après la transfection, la viabilité des cellules a été déterminée en utilisant un compteur de cellules, et l'expression de la variante de la protéine Stéfine A a été déterminée par cytométrie en flux en utilisant un anticorps anti-HA. 48 heures après la transfection, les cellules HEK293 exprimant la variante de la protéine Stéfine A ont été cocultivées avec des cellules rapporteuses HEK Blue à 4 densités cellulaires différentes, 40000, 20000, 10000 et 5000 avec un nombre fixe de cellules HEK Blue de 50000 cellules/puits. En parallèle, le contrôle positif MR2-1 a également été incubé avec des cellules HEK Blue pendant 24h sur une plage de concentrations. Après 24h, la libération de SEAP dans le surnageant a été quantifiée en utilisant Quanti-Blue et une mesure d'absorbance 640 nm. La coloration des AFFIMER® avec un anticorps monoclonal anti-HA a montré des niveaux d'expression > 90 % dans chacune des deux expériences. Dans l’essai rapporteur de coculture, l'effet de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 exhibée sur HEK293 sur les cellules HEK-Blue était visible, ainsi que l'effet du clone MR2-1, permettant la sélection de 16 clones qui ont été classés de manière cohérente parmi les 20 meilleurs clones dans chacune des deux expériences. Ces résultats sont compilés en , avec les clones suivants identifiés : 001, 007, 009, 012, 013, 026, 027, 037, 044, 059, 069, 079, 100, 103, 112 et 115.
Liaison cellulaire au TNFR2 humain et de cynomolgus
Les 16 meilleurs agonistes ont été caractérisés en format soluble pour leur liaison au TNFR2 humain surexprimant Expi293F™ et au TNFR2 de cynomolgus surexprimant Expi293F. L'expérience a été répétée 3 fois et 2 lots différents de cellules transfectées de manière transitoire ont été utilisés. Tous les clones ont montré une liaison spécifique constante aux cellules hTNFR2-Expi293F™. Les clones 26 et 69 ont montré les meilleures CE50 sur à la fois les cellules exprimant TNFR2 humaines et de cynomolgus. 13 des 16 clones testés montrent une réactivité croisée avec le TNFR2 de cynomolgus. Les 3 clones sans réactivité croisée étaient les clones 001, 007 et 009. Sans nécessairement être les meilleurs liants, les clones DAW02-013, DAW02-044 et DAW02-112 sont les clones avec le moins de différence entre la liaison aux cellules surexprimant le TNFR2 humain et le TNFR2 de cynomolgus lorsque les 3 expériences sont compilées ( ).
EXEMPLE 4. Constructions d'homodimères de fusion en ligne
Les clones 001, 009 et 012 ont été choisis pour être formatés en tant qu'homodimères de fusion en ligne (ILF, de l’anglais « in-line fusion »), afin de déterminer si ce format serait un avantage pour déclencher un agonisme par rapport à la forme monomérique des clones, en tant que protéine soluble et lorsqu'il est affiché sur les cellules. Deux constructions ont été utilisées pour la génération des homodimères ILF avec un lieur flexible, un codon optimisé pour une expression de mammifère et un codon non optimisé. Les deux constructions ont été clonées dans un vecteur de sécrétion de mammifère (pD609-KanR) pour purifier la protéine recombinante et apprécier leurs niveaux d'expression, la qualité de la protéine, la cinétique de liaison à hTNFR2-hFc-his-avi par Biacore et l'activité agoniste dans un essai à rapporteur (en anglais, « reporter assay ») avec des cellules rapporteuses HEK. De plus, les deux constructions ont été clonées dans le vecteur pDisplay pour leur expression sur la surface cellulaire Expi293F™ et l'appréciation de leurs niveaux d'expression, de la liaison à hTNFR2-hFc-his-avi et de l'activité agoniste dans un essai à rapporteur de coculture avec des cellules rapporteuses HEK. L'optimisation des codons n'a pas amélioré les rendements ou la pureté des homodimères ILF solubles, ce qui a été confirmé par HPLC.
Lorsqu'ils ont été analysés par Biacore, les clones 001 et 009 ont montré une affinité accrue dans leur format ILF soluble par rapport au format monomère soluble. Le Clone 12 n'a montré aucune réponse. Aucune différence n'a été observée entre les constructions d'optimisation des codons. Dans les essais SEAP, seul le clone 12 a montré un profil amélioré en tant que format ILF soluble, mais lorsqu'il est exhibé sur des cellules, dans les essais SEAP ainsi que dans les essais de présentation par cytométrie en flux, aucune différence n'a pu être déterminée entre les formats ILF et monomère.
Résumé de la sélection de la variante de la protéine Stéfine A se liant au hTNFR2 et caractérisation.
Plus de 2500 phages monoclonaux ont été criblés par ELISA sur phages avec un taux de succès supérieur à 60% avec une bonne diversité (20-40%). Lors du criblage dans l’ELISA sous forme d'extrait brut de cellules, plus de 400 clones ont montré une liaison à l'antigène hTNFR2. A ce stade, il a été décidé d'introduire une autre étape dans la campagne de criblage de sélection pour réduire le nombre de clones à cloner dans le vecteur d'expression de mammifère. En parallèle, il a également été décidé d'accélérer 30 clones de la sélection passive directement à l'expression en tant que protéines AFFIMER® solubles pour faciliter le développement d’essais et la construction de la cascade de criblage pour le reste des clones. 20 de ces clones ont passé les critères de qualité de production de protéines de plus de 80% de pureté par SEC-HPLC (de l’anglais « size exclusion chromatography - high performance liquid chromatography », soit « chromatographie d'exclusion stérique - chromatographie liquide à haute performance ») et ont été utilisés pour mettre en place différents essais ainsi que pour être caractérisés. 5 clones sur 20 ont démontré une activité agoniste dans un essai agoniste préliminaire où la variante de la protéine Stéfine A soluble monomère a été regroupée avec un anticorps anti-his via leur étiquette histidine et incubée avec la lignée cellulaire rapporteuse HEK.
Parallèlement au développement d’essais avec des clones accélérés, la campagne de criblage de phages a été finalisée et un total de 364 variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 humain a été purifié à partir du phagémide et leur liaison à une lignée cellulaire surexprimant le TNFR2 a été testée. A la suite de cet essai, 90 variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 humain ont été reformatées dans le vecteur d'expression mammifère. 55 de ces clones ont passé les critères de qualité de production de protéines de plus de 80% de pureté par SEC-HPLC et ont été repris pour le reste des essais.
Le nombre total de clones (accélérés et non accélérés) a été restreint de 75 à 43 à la suite d'une série d'expériences s’intéressant à la liaison des protéines solubles variantes de la protéine Stéfine A aux cellules surexprimant hTNFR2, l’essai agoniste avec des cellules rapporteuses HEK et les données préliminaires de l’essai agoniste utilisant des cellules rapporteuses HEK en coculture avec des protéines variantes de la protéine Stéfine A exprimées à la surface des cellules Expi293F™. Ces 43 meilleurs clones ont été caractérisés en tant que protéines solubles pour leur liaison au TNFR2 humain par Biacore où 16 sur 43 ont vu leur KD calculé avec succès en utilisant un modèle de liaison à 1:1. Aucun des clones n'a démontré de liaison au TNFR1 humain par ELISA ou au TNFR2 de souris par liaison cellulaire. En tant que variante de la protéine Stéfine A exhibée à la surface de HEK293, la capacité de ces 43 clones à déclencher un agonisme au TNFR2 dans une lignée cellulaire rapporteuse HEK lorsqu'ils sont en coculture a été testée. Une grande majorité des clones testés ont démontré un effet dépendant de la dose sur les cellules rapporteuses HEK (80%). 16 variantes de la protéine Stéfine A ont été sélectionnées comme meilleures agonistes et soumises à une caractérisation supplémentaire pour apprécier la liaison du TNFR2 de cynomolgus et la liaison du TNFR1 humain sur les cellules. Les 16 variantes de la protéine Stéfine A sélectionnées se liant spécifiquement aux polypeptides hTNFR2 sont les clones 001, 007, 009, 012, 013, 026, 027, 037, 044, 059, 069, 079, 100, 103, 112 et 115.
L'utilisation d'homodimères de fusion en ligne en tant que protéines solubles vs. monomères a montré des avantages pour la liaison au TNFR2 recombinant par Biacore et un avantage possible dans l’essai d'agonisme de regroupement anti-his avec des cellules rapporteuses HEK. Cependant, aucun avantage n'a été démontré par rapport aux monomères lorsque les variantes de la protéine Stéfine A de fusion en ligne ont été exhibées sur des cellules pour déclencher la voie d'agonisme de la lignée cellulaire rapporteuse via TNFR2. La raison pour laquelle les homodimères de fusion en ligne n'ont pas obtenu de meilleurs résultats que les monomères dans ce dernier essai pourrait être que le format de fusion en ligne n'était pas bien exhibé sur la surface de la cellule et qu'une seule des deux variantes de la protéine Stéfine A était disponible pour la liaison ou que la limite de l’essai rapporteur avait été atteinte et qu'il n'était pas possible de discriminer entre les deux formats.
EXEMPLE 5. Variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de souris
Campagne de sélection et de criblage de phages
L’aptitude d’antigènes TNFR2 murins, ayant la séquence telle que montrée dans le Tableau 7 mais dans différents formats, à être utilisés dans des essais pour sélectionner des polypeptides mTNFR2 AFFIMER® a été testée. Parmi les trois formats (mFc, hFc et étiqueté His), le mTNFR2-mFc a été choisi pour la biotinylation et l'utilisation dans les sélections de variantes de la protéine Stéfine A en raison de ses meilleures performances dans les essais.
Sélections
Des sélections passives et en solution ont été effectuées sur les deux bibliothèques de phages à variante de la protéine Stéfine A comme décrit pour la sélection de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au hTNFR2. L'enrichissement a été observé lorsque la concentration en mTNFR2 a été maintenue à 10 nM au tour 3. Plus de 2000 variantes de la protéine Stéfine A présentées sur phage ont été criblées par ELISA de phages monoclonaux à partir des résultats du tour 2 et du tour 3. Parmi ces clones, plus de 900 ont démontré une liaison au mTNFR2, sans liaison non spécifique au Fc de souris détectable, au plastique, à la streptavidine ou à la neutravidine. Ceux-ci ont été définis comme des « succès » sur la base des critères d'absorbance 450nm-630nm au-dessus de 0,5 sur des plaques revêtues de mTNFR2 et en dessous de 0,05 sur des plaques revêtues d'antigènes de contrôle (c'est-à-dire Fc de souris, plastique, neutravidine). Le séquençage des succès ELISA sur phage a identifié 281 séquences de clones uniques, 109 desquels ayant démontré une liaison au mTNFR2 après ELISA sur des extraits bruts de cellules. Une analyse plus approfondie de la liaison à l'aide de cellules mTNFR2-Expi293F™ a réduit ce champ à 58 clones, identifiés comme clones 122-179 dans le Tableau 2.
Caractérisation des protéines solubles
Comme décrit ci-dessus pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au hTNFR2, la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au mTNFR2 identifiée a été clonée à partir du phagémide jusque dans des vecteurs de mammifères pour l’expression dans des cellules Expi293F™. La pureté des protéines exprimées a ensuite été évaluée par SDS-PAGE et HPLC, et l'affinité par Biacore, ainsi que la liaison sur base cellulaire de mTNFR2 dans les cellules mTNFR2-Expi293F™. La spécificité pour mTNFR2 a été testée à l'aide d'ELISA et d’essais cellulaires utilisant mTNFR1 et mTNFR2 en tant que cibles, confirmant la spécificité des clones identifiés. Pour compléter la caractérisation des protéines solubles, la capacité des variantes de la protéine Stéfine A à bloquer la liaison du mTNFR2-mFC à mTNFα dans un ELISA a été testée, avec quatre clones (157, 160, 171 et 172) montrant une capacité concurrentielle claire dans la gamme testée.
Essais de stimulation des lymphocytes T
L’essai de stimulation des lymphocytes T a été utilisé comme outil de dépistage puisque les lymphocytes T activées expriment des niveaux élevés de TNFR2, lorsqu'elles sont stimulées avec HM102 (agoniste du TNFR2), l'expression de CD25 augmente.
La variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au mTNFR2 a d'abord été exprimée sur la surface cellulaire des HEK293. Ensuite, ces cellules ont été cocultivées pendant 48 heures avec des splénocytes BALB/c et enfin l'augmentation de l'expression de CD25 a été évaluée sur des lymphocytes T CD4 et CD8 positifs. L'expression de la variante de la protéine Stéfine A sur la surface cellulaire HEK293 a été appréciée par coloration par cytométrie en flux de l'étiquette HA présente au début du cadre de lecture ouvert avant la variante de la protéine Stéfine A et la protéine d'ancrage cellulaire. Afin d'apprécier l'effet de la variante de la protéine Stéfine A-HEK sur les cellules CD4+ et CD8+, après 48h d'incubation, les cellules ont été colorées avec le panel de marqueurs suivant, coloration Live/Dead, CD90.2, CD4, CD8 et CD25.
Une dose-réponse a été observée dans l'expression de CD25 dans les lymphocytes T CD4+ et CD8+ en réponse aux cellules HEK293 exprimant les protéines mTNFR2 AFFIMER®, similaire à la réponse observée pour l'agoniste HM102 du TNFR2. La réponse obtenue dans les lymphocytes T CD8+ est plus forte que dans les lymphocytes T CD4+. Cependant, en se concentrant sur les deux nombres de cellules les plus élevés utilisés, un classement similaire des clones a été obtenu entre les sous-ensembles de lymphocytes T CD8+ et CD4+.
Dans deux cycles de cette expérience d’essai, les six variantes de la protéine Stéfine A les mieux classées étaient cohérentes 174, 160, 175, 125, 157 et 179.
Résumé de la sélection de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au mTNFR2 et caractérisation.
Plus de 2000 phages monoclonaux ont été criblés par ELISA sur phages avec un taux de succès modéré de 35-60%, avec une bonne diversité (25-35%). Lors du criblage dans l’ELISA sous forme d'extrait brut de cellules, 109 clones ont montré une liaison à l'antigène mTNFR2. En utilisant la même cascade de criblage que pour le programme humain, il a été décidé de purifier les liants identifiés à partir du phagémide et de tester leur liaison à une lignée cellulaire surexprimant le TNFR2. A la suite de cet essai, 60 variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de souris ont été reformatées dans le vecteur d'expression de mammifère, produites et testées pour leurs propriétés biophysiques en tant que protéines solubles. 22 variantes de la protéine Stéfine A ont passé les critères de qualité de production de protéines de pureté par SEC-HPLC supérieure à 80%. Les 22 clones ont été caractérisés dans différents essais en tant que protéines solubles, puis ont été exprimés à la surface de HEK293 pour un essai de coculture avec des splénocytes.
Bien que seulement 10 des 22 variante de la protéine Stéfine A aient montré des affinités de liaison nanomolaires à trois chiffres (KD) lorsque testées sur Biacore, il a été considéré que même une variante de la protéine Stéfine A avec une valeur KD plus élevée pourrait être un bon agoniste une fois exhibée sur la surface cellulaire. Additionnellement, la performance des clones en tant que protéines solubles dépendait également de s'il s'agissait d'un dimère ou d'un trimère naturel. Pour ces raisons, les données Biacore ont été considérées dans le contexte de l'activité agoniste de mTNFR2 et n'ont pas été utilisées pour discriminer les clones. Lorsqu'ils ont été testés sur des cellules exprimant le TNFR2 de souris, 20 des 22 clones ont démontré une liaison spécifique avec une large gamme de valeurs CE50. Pour ce qui est des données Biacore, les résultats de liaison cellulaire n'ont été pris en compte que dans le contexte de l'activité agoniste du TNFR2 de souris et n'ont pas été utilisés pour discriminer les clones. Aucun des clones ne s'est lié au TNFR1 sous forme de protéines recombinantes ou exprimé à la surface d'une cellule. 5 des 22 clones ont démontré une inhibition complète de l'interaction entre le TNF-alpha et le TNFR2 dans un ELISA en concurrence.
Les 22 clones de souris ont également été exprimés à la surface des cellules HEK293 pour un essai de coculture avec des splénocytes. La principale lecture de l’essai était l'augmentation de l'expression de CD25 sur les lymphocytes T CD4+ et les lymphocytes T CD8+. Une grande majorité des clones testés a démontré un effet dépendant du dosage sur les lymphocytes T CD4+ et les lymphocytes T CD8+ (plus de 70%). Les clones ont été classés eu égard à l'expression de CD25 sur les lymphocytes T CD4+ et CD8+. Sur la base des résultats de cet essai clé, six variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au mTNFR2 ont été identifiées : 174, 160, 175, 125, 157 et 179.
Les exemples 1 à 5 ont été réalisés par Avacta Life Sciences Limited.
EXEMPLE 6 : Caractéristiques de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 exprimée à la surface cellulaire
Modification génétique stable de MSC dérivées de PSC (Cellules stromales mésenchymateuses dérivées de cellules souches pluripotentes) au moyen de vecteurs lentiviraux
Parmi les clones de variantes de la protéine Stéfine A sélectionnés se liant spécifiquement au TNFR2 humain, les 7 principaux gènes de clone à activité élevée ont été clonés jusque dans un vecteur plasmidique afin qu'ils puissent être exprimés par le promoteur de CBh, et des vecteurs lentiviraux ont été produits respectivement. Des vecteurs lentiviraux ont été construits en utilisant un vecteur comprenant un acides nucléiques codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au domaine transmembranaire fusionné TNFR2 (dérivé de PDGFR, SEQ ID NO : 486, Biotechnology and Bioengineering, 73(4), 313-323) et un gène de résistance à la néomycine (Gene Volume 85, Issue 2, 28 December 1989, Pages 421-426). La MSC congelée dérivée de PSC Naïves a été décongelée, mélangée avec 1 MOI de vecteurs lentiviraux et 2-8 µg/mL de polybrène, puis inoculée dans un flacon de culture cellulaire. Après culture à 37°C et 5% de CO2 pendant 16 à 20 heures, le milieu de culture contenant le lentivirus a été soigneusement retiré puis remplacé par un milieu de culture frais, suivi d'une culture à 37°C et 5% de CO2 pendant 48 heures. Ensuite, les cellules ont été récoltées et inoculées à nouveau à une densité cellulaire de 0,4 à 1,0 x 104 cellules/cm2, suivies d'une culture à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 18 à 24 heures. Le milieu de culture a été remplacé par un milieu de culture contenant 100~250 μg/mL de G418, suivi par une culture pendant 5 jours, et le milieu de culture a été remplacé par un milieu de culture contenant du G418 tous les 2 jours. Lorsque la confluence cellulaire a atteint 90 % ou plus, les cellules ont été récoltées puis congelées.
Les MSC dérivées de PSC conservent leur caractère souche après transduction lentivirale avec les acides nucléiques codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2
L'analyse par cytométrie en flux des eMSC, 5 passages après leur transduction avec le lentivirus codant pour la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2, indique leur caractère souche, qui était comparable aux MSC dérivées de PSC Naïves. Les cellules congelées à chaque passage ont été décongelées et leur pureté et leurs marqueurs immunitaires analysés par cytométrie en flux. L’expression des marqueurs de surface CD29, CD44, CD73 et CD105 des cellules stromales mésenchymateuses, et l’expression des marqueurs de surface cellulaire pour le marqueur CD45 spécifique aux cellules souches hématopoïétiques, les marqueurs spécifiques aux cellules souches embryonnaires SSEA-3, TRA-1-60 et TRA-1-81, et le marqueur immunitaire HLA-DR ont été analysées de manière comparative avec des MSC naïves. Comme le montrent les et 7, il a été confirmé que l'expression des marqueurs de surface CD29, CD44, CD73 et CD105 des cellules stromales mésenchymateuses était maintenue à 95 %, indifféremment de l'introduction de gènes. En outre, l'expression de CD45, SSEA-3, TRA-1-60, TRA-1-81 et HLA-DR a été maintenue à moins de 1 %, indiquant que les caractéristiques des cellules stromales mésenchymateuses ont été bien maintenues.
Appréciation d’une variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement à l'expression de TNFR2
Le domaine transmembranaire de la PDGFR humaine (récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes, ou, en anglais, « platelet-derived growth factor receptor ») a été fusionné au C-terminus de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 en tant que protéine de membrane extracellulaire faisant face au plasma. Des analyses par transfert Western (de l’anglais : « Western blot ») et de cytométrie en flux ont été effectuées pour confirmer l'expression fonctionnelle des protéines de fusion recombinantes PDGFR et variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 dans les MSC dérivées de PSC.
Les eMSC transduites avec des vecteurs lentiviraux ont été récoltées et des lysats de protéines préparés après cinq passages. Dans l'analyse de Western, toutes les cellules transduites avec la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 fusionnée au domaine transmembranaire PDGFR ont démontré des niveaux élevés d'expression de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 ( ).
Le pourcentage de cellules qui exprime la variante de la protéine Stéfine A est déterminé par cytométrie en flux à l'aide d'anticorps anti-AFFIMER® marqués à la phycoérythrine (PE), et le nombre absolu moyen de protéines AFFIMER® ancrées à la membrane par cellule en utilisant des billes d'étalonnage de PE QuantiBRITE PE (BD Biosciences, San José, Californie, États-Unis). Pour estimer le nombre absolu de protéines d'AFFIMER® ancrées à la membrane, nous avons utilisé des billes de PE QuantiBRITE. Les tubes de billes de PE QuantiBRITE contiennent un comprimé lyophilisé de billes qui ont été conjuguées avec quatre concentrations de PE. Chaque type de billes a un nombre connu de molécules de PE par bille. A l'aide de ce kit, nous avons tracé une courbe d'étalonnage et établi une formule permettant de convertir les valeurs MFI en nombre de molécules AFFIMER® sur la surface cellulaire. Lorsque les MSC dérivées de PSC naïves (MSC non génétiquement modifiées) ont été comparées, les niveaux les plus élevés de protéines AFFIMER® ont été trouvés dans les eMSC transduites avec les protéines TNFR2 AFFIMER® fusionnées au hPDGFR, respectivement (Tableau 9 et ).
Tableau 9. Résultat des Anticorps Liés par Cellule
ID de lignée de cellulaire Numéro de Clone AFFIMER® Moyenne géométrique de PE Moyenne géométrique Log de PE (y) Anticorps liés/cellule (ABC)
AFX-MSC-MCB001 - 577 2,761 2,312 205
AFX002-C010 3t0 85.833 4,934 4,548 34.524
AFX002-C011 SQT 59.756 4,776 4,377 23.823
AFX002-C012 001 71.955 4,857 4,460 28.817
AFX002-C013 009 16.053 4,206 3,792 6.197
AFX002-C014 100 7.739 3,889 3,468 2.935
AFX002-C015 026 29.299 4,467 4,060 11.478
AFX002-C016 012 39.587 4,598 4,194 15.624
AFX002-C017 044 49.784 4,697 4,296 19.759
AFX002-C018 007 38.518 4,586 4,182 15.192
Coculture de cellules eMSC - HEK-Blue TNF α pour l'appréciation de la fonction agoniste du TNFR2
Les 7 clones principaux ont été transduits de manière stable dans des MSC dérivées de PSC, ainsi que 2 témoins, SQT-Gly et 3t0-Gly, qui se sont révélés négatifs. Les cellules eMSC exprimant la variante de la protéine Stéfine A ont été cocultivées avec des cellules rapporteuses HEK Blue à 10 densités cellulaires différentes allant de 40.960 à 80 avec un nombre fixe de cellules HEK Blue de 20.000 cellules/puits. Après 24h, la libération de SEAP dans le surnageant a été quantifiée en utilisant Quanti-Blue et une mesure d'absorbance 640 nm. Parmi les sept types d'eMSC transduites par AFFIMER®, les cellules AFX002-C013, AFX002-C016 et AFX002-C017 n'ont pas montré d'activité agoniste du TNFR2, et les cellules AFX002-C010 et AFX002-C011 utilisées comme témoins négatifs n'ont pas non plus montré d'activité agoniste. L'activation des cellules HEK-Blue TNF-α a été détectée dans quatre lignées cellulaires candidates : AFX002-C012, AFX002-C014, AFX002-C015 et AFX002-C018 (Fig. 10e. Les variantes de la protéine Stéfine A sous forme soluble (AFFIMER®) se liant spécifiquement au TNFR2 humain ont échoué à induire une activation des cellules HEK-Blue TNFα. Cependant, les gènes des variantes de la protéine Stéfine A transduits par les MSC dérivées de PSC induisent l'activation du TNFR2. Il semblerait que le déclenchement des voies de signalisation associées au TNFR2 nécessite un regroupement secondaire de complexes trimériques TNF-TNFR2 initialement formés (Front. Immunol. 10:2040, 2019). Nos résultats viennent à l’appui du fait que l'expression d'AFFIMER® sur la membrane cellulaire induit un regroupement entre AFFIMER® et TNFR2, qui peut transduire des signaux.
Bien que des modes de réalisation spécifiques de la présente invention aient été décrits de manière illustrative, les personnes du métier apprécieront que la présente invention puisse être réalisée sous d'autres formes spécifiques sans changer l'esprit technique ou les caractéristiques essentielles de celle-ci. Ainsi, les modes de réalisation décrits ci-dessus doivent être compris comme étant non limitatifs et illustratifs en tous points.

Claims (28)

  1. Cellule génétiquement modifiée dans laquelle un acide nucléique codant pour une variante de la protéine stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 ou une protéine de fusion comprenant la variante de la protéine stéfine A a été introduit(e) dans une cellule hôte, étant entendu que ladite cellule hôte n’est pas une cellule souche embryonnaire humaine, et ladite variante de la protéine stéfine A comprenant une séquence d’acides aminés ayant au moins 80 %, au moins 90 %, au moins 95 ou au moins 98 % d'identité avec une séquence d’acides aminés de
    MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQV-Xaa2-(Xaa)n-Xaa3-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa4-Xaa5-Xaa6-(Xaa)m-Xaa7-D-Xaa8-VLTGYQVDKNKDDELTGF (SEQ ID NO : 4),
    où Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est un ou deux résidus d’acides aminés ; et n et m sont chacun, indépendamment, un nombre entier de 3 à 20.
  2. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1, dans laquelle la variante de la protéine stéfine A comprend une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 %, au moins 90 %, au moins 95, ou au moins 98 % d'identité avec une séquence d'acides aminés de
    MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVD-(Xaa)n-GTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSL-(Xaa)m-EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF (SEQ ID NO : 5),
    dans laquelle Xaa, individuellement pour chaque occurrence, est un résidu d'acide aminé ; et n et m sont chacun, indépendamment, un entier de 3 à 20.
  3. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle (Xaa)n comprend une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 6 à 102.
  4. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle (Xaa)m comprend une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 103 à 199.
  5. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la variante de la protéine stéfine A comprend une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 200 à 296.
  6. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 5, dans laquelle l'acide aminé sélectionné dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 200 à 296 exclut un ou plus des vingt-et-un résidus carboxy terminaux.
  7. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1, dans laquelle la protéine de fusion comprend en outre au moins un élément sélectionné dans le groupe constitué d’un(e) peptide signal, domaine Fc, domaine de liaison, cytokine, domaine d'extension de demi-vie, facteur de croissance, enzyme et domaine pénétrant dans les cellules.
  8. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1, dans laquelle la protéine de fusion comprend en outre au moins l’un au sein du groupe constitué d'un domaine transmembranaire, d'un domaine charnière, d'un domaine superhélice, d'un domaine dérivé de virus, d'un domaine de signalisation intracellulaire, et d'un domaine de localisation.
  9. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1, dans laquelle la protéine de fusion comprend en outre un peptide ou une protéine thérapeutique.
  10. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 8, dans laquelle la variante de la protéine stéfine A ou la protéine de fusion comprenant la variante de la protéine stéfine A comprend en outre un domaine transmembranaire.
  11. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 10, dans laquelle le domaine transmembranaire est dérivé du groupe constitué de CD3, CD4, CD5, CD8, CD28, CD99, de l’immunoglobuline (par ex. IgG1, IgG4, IgD, etc.), de PDGFR et de PTGFRN.
  12. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1, dans laquelle la cellule hôte est sélectionnée dans le groupe constitué d'une cellule souche, d'une cellule immunitaire et d'une cellule somatique.
  13. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 12, dans laquelle la cellule souche est sélectionnée dans le groupe constitué d’une cellule souche pluripotente, d’une cellule souche multipotente et d’une cellule souche unipotente.
  14. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1, dans laquelle la cellule hôte est une cellule stromale mésenchymateuse.
  15. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 14, dans laquelle la cellule stromale mésenchymateuse est différenciée d'une cellule souche pluripotente humaine.
  16. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 14, dans laquelle la cellule stromale mésenchymateuse exprime au moins un marqueur de surface cellulaire sélectionné parmi CD29, CD44, CD73 et CD105.
  17. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 14, dans laquelle la cellule stromale mésenchymateuse n’exprime pas au moins un marqueur de surface cellulaire sélectionné parmi CD34, CD45, HLA-DR, TRA-1-60, et TRA-1-81.
  18. Cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1, dans laquelle la variante de la protéine stéfine A ou la protéine de fusion comprenant la variante de la protéine stéfine A est exprimée sur une surface cellulaire.
  19. Milieu de culture cellulaire conditionné de la cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1.
  20. Agent thérapeutique cellulaire pour son utilisation dans la prévention ou le traitement d’une maladie immunitaire ou un cancer comprenant la cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1.
  21. Composition pharmaceutique pour son utilisation dans la prévention ou le traitement d’une maladie immunitaire ou un cancer comprenant la cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1.
  22. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 21, dans laquelle les maladies immunitaires sont sélectionnées dans le groupe constitué du lupus (LES), de la néphrite lupique (par ex. la néphrite lupique d’origine médicamenteuse), la thrombocytopénie immunitaire (ITP), la polyarthrite rhumatoïde (PR), la sclérose en plaques (SEP), la maladie chronique inflammatoire de l'intestin (MICI) (par ex. la maladie de Crohn et la colite/colite ulcéreuse), la maladie du greffon contre l'hôte (GVHD) ou le rejet d'allogreffe, la transplantation/transplantation d'organe solide (SOT), la cholangite biliaire primitive (CBP), le psoriasis, l’arthrite psoriasique, l’arthrite induite par le collagène, l’ovarite, la rhinite allergique, l’asthme, le syndrome de Sjögren, l’eczéma atopique, la myasthénie, la maladie de Basedow et la glomérulosclérose.
  23. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 21, dans laquelle le cancer est sélectionné dans le groupe constitué par le cancer hématologique, le cancer du côlon, le cancer rectal, le carcinome à cellules rénales, le cancer du foie, le carcinome du poumon à cellules non petites, le cancer de l'intestin grêle, le cancer de l'œsophage, le mélanome, le cancer des os, le cancer du pancréas, le cancer de la peau, le cancer de la tête ou du cou, le mélanome malin cutané ou intraoculaire, le cancer de l'utérus, le cancer de l'ovaire, le cancer du rectum, le cancer de la région anale, le cancer de l'estomac, le cancer des testicules, le cancer utérin, le carcinome des trompes de Fallope, le carcinome de l'endomètre, le carcinome du col de l'utérus, le carcinome du vagin, le carcinome de la vulve, la maladie de Hodgkin, le lymphome non hodgkinien, le cancer du système endocrinien, le cancer de la glande thyroïde, le cancer de la glande parathyroïde, le cancer de la glande surrénale, le sarcome des tissus mous, le cancer de l'urètre, le cancer du pénis, les tumeurs solides de l'enfance, le cancer de la vessie, le cancer du rein ou de l'uretère, le carcinome du bassinet du rein, le néoplasme du système nerveux central (SNC), le lymphome primitif du SNC, l’angiogenèse tumorale, la tumeur de l'axe rachidien, le gliome du tronc cérébral, l’adénome hypophysaire, le sarcome de Kaposi, le cancer épidermoïde, le cancer des cellules squameuses, le lymphome des lymphocytes T, les cancers induits par l'environnement, les combinaisons desdits cancers, et les lésions métastatiques desdits cancers.
  24. Composition pour l'immunomodulation comprenant la cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1 ou le milieu de culture cellulaire conditionné selon la revendication 19.
  25. Composition selon la revendication 24, dans lequel l'immunomodulation est une immunosuppression.
  26. Composition ou milieu pour la culture de lymphocytes T régulateurs comprenant la cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1 ou le milieu de culture cellulaire conditionné selon la revendication 19.
  27. Procédé de culture d'un lymphocyte T régulateur comprenant, la culture d'un lymphocyte T régulateur en présence de la cellule génétiquement modifiée selon la revendication 1.
  28. Procédé selon la revendication 27, dans lequel le lymphocyte T régulateur présente le TNFR2 sur la surface cellulaire.
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