FR3034992A1 - Milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et procede d'obtention - Google Patents
Milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et procede d'obtention Download PDFInfo
- Publication number
- FR3034992A1 FR3034992A1 FR1553344A FR1553344A FR3034992A1 FR 3034992 A1 FR3034992 A1 FR 3034992A1 FR 1553344 A FR1553344 A FR 1553344A FR 1553344 A FR1553344 A FR 1553344A FR 3034992 A1 FR3034992 A1 FR 3034992A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- plasmin
- medium
- rich
- autologous
- plasma
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 8
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 claims abstract description 127
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 claims abstract description 127
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 22
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 160
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 46
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 18
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 16
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 claims description 15
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 claims description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- 230000002358 autolytic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 6
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 12
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 12
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 11
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 4
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 4
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 3
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 108010073682 nattokinase Proteins 0.000 description 2
- 229940086319 nattokinase Drugs 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000002367 Retinal Perforations Diseases 0.000 description 1
- 101100386054 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CYS3 gene Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- -1 for example Chemical class 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 229940113601 irrigation solution Drugs 0.000 description 1
- 208000029233 macular holes Diseases 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005111 ocular hyperemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 101150035983 str1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 208000029257 vision disease Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/484—Plasmin (3.4.21.7)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Surgery (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
L'invention concerne un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, caractérisé en ce que : - il présente une activité enzymatique, dite activité plasmine, telle que mesurée par un test de libération de para-nitro-aniline supérieure à 0,1 µmole de para-nitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, - il comprend une proportion de protéine hétérologue inférieure à 600 µg par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, ledit test de libération consistant à : ○ mélanger dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine maintenu à la température de 37°C un substrat chromogène S-2251 à une concentration initiale dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine de l'ordre de 1 mM, puis ; ○ évaluer la vitesse initiale de libération de para-nitro-aniline par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine suite au mélange.
Description
1 MILIEU PLASMATIQUE EX VIVO AUTOLOGUE RICHE EN PLASMINE ET PROCÉDÉ D'OBTENTION L'invention concerne un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, un tel milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine pour son utilisation à titre de médicament et un tel milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine pour son utilisation à titre de médicament pour le traitement de traction vitréo-maculaire en ophtalmologie. L'invention concerne aussi un procédé d'obtention d'un tel milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine.
Le traitement de trous maculaires en ophtalmologie résultant de contraintes par tractions tangentielles différentielles survenant entre le corps vitré et la rétine, nécessitent de libérer la rétine de ces contraintes. Des traitements connus sont principalement de nature chirurgicale et visent à séparer mécaniquement la rétine et le corps vitré.
On connaît en particulier (WO 2004/052228) une composition comprenant une forme tronquée d'une plasmine comprenant un domaine catalytique de la plasmine et l'utilisation d'une telle plasmine tronquée dans une méthode de traitement ou de prévention d'un trouble visuel. Une telle plasmine tronquée est une plasmine recombinante et ne peut pas être une protéine autologue.
En outre, une telle plasmine recombinante est complexe dans sa fabrication. Son coût est élevé, de sorte que des solutions alternatives à l'utilisation d'une plasmine recombinante dans une méthode de traitement thérapeutique sont recherchées, avec lesquelles par ailleurs, les risques inflammatoires seraient minimisés.
On connait aussi de WO 2010/125148 une composition de traitement ophtalmique obtenue par addition d'urokinase à un milieu plasmatique aux fins de conversion de plasminogène d'un plasma sanguin en plasmine. Un traitement ophtalmique mettant en oeuvre une telle composition provoque une réaction immunitaire chez le patient et décrit l'utilisation de dexaméthasone à titre de composé anti-inflammatoire. Une alternative à l'utilisation d'une telle composition est proposée par l'invention.
3034992 2 L'invention vise donc à pallier à l'ensemble de ces problèmes. Pour ce faire, l'invention concerne un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine caractérisé : - en ce qu'il comprend une proportion de protéine -notamment de 5 plasminogénase- hétérologue inférieure à 600 iug par millilitre (mL) de milieu plasmatique, - en ce qu'il présente une activité enzymatique, dite activité plasmine, telle que mesurée par un test de libération de para-nitro-aniline, supérieure à 0,1 iumole de para-nitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de 10 milieu plasmatique, ledit test de libération consistant à : o mélanger dans le milieu plasmatique maintenu à la température de 37°C un substrat chromogène S-2251 de formule (I) ci-après : NO2 15 à une concentration initiale de l'ordre de 1 mM dans le milieu plasmatique, o évaluer suite au mélange une vitesse initiale de libération de paranitro-aniline (en iumole de de para-nitro-aniline) par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Dans tout le texte, on adopte la terminologie suivante : 20 - l'expression « milieu plasmatique sanguin » désigne tout milieu liquide sensiblement exempt de cellules sanguines résultant directement d'une centrifugation de sang -notamment de sang humain- liquide non coagulé, dans des conditions adaptées pour permettre une séparation des cellules sanguines (hématies, leucocytes, plaquettes) et du milieu plasmatique sanguin ; 25 - le terme « plasminogénase » désigne toute enzyme présentant une activité enzymatique de conversion de plasminogène en plasmine par clivage d'une liaison peptidique du plasminogène ; 3034992 3 - l'expression « au moins sensiblement » indique, de façon habituelle, qu'une caractéristique structurelle -telle qu'une valeur- ou fonctionnelle, ne doit pas être prise comme marquant une discontinuité abrupte, qui n'aurait pas de sens physique, mais couvre non seulement cette structure ou cette fonction, mais 5 également des variations légères de cette structure ou de cette fonction qui produisent, dans le contexte technique considéré, un effet de même nature, sinon de même degré ; - le terme « hétérologue » qualifie une substance biologique provenant d'un tiers organisme vivant et susceptible d'être reconnue par le système 10 immunitaire d'un patient comme étant un corps étranger de nature à déclencher une réaction immunitaire. Cette définition s'étend à un milieu plasmatique « hétérologue », c'est-à-dire un milieu plasmatique comprenant au moins un composé susceptible d'être reconnu par le système immunitaire d'un patient comme étant un corps étranger de nature à déclencher une réaction immunitaire chez ledit 15 patient ; - le terme « autologue » qualifie un composé et s'étend à une composition, notamment à un milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine, obtenu à partir d'un milieu plasmatique sanguin prélevé chez un patient unique, sensiblement exempt(e) de matière biologique issue d'un tiers organisme et 20 susceptible d'être administré(e) à ce même patient -notamment par voie intraveineuse- sans induire de réaction immunitaire et/ou inflammatoire significative chez ce patient. Un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est obtenu à partir du sang d'un patient unique et est propre et destiné au traitement exclusif de ce patient unique.
25 L'invention concerne un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, c'est-à-dire un milieu plasmatique extrait du corps humain ou animal, qui est autologue, c'est-à-dire qui est obtenu à partir d'un milieu plasmatique sanguin d'un individu unique et administré au même individu sans apport irréversible de composé hétérologue dans le milieu plasmatique sanguin ex 30 vivo autologue riche en plasmine. Le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est sensiblement exempt de substance -notamment de substance 3034992 4 biologique- hétérologue. Le milieu plasmatique ex vivo autologue est riche en plasmine, c'est-à-dire dont l'activité plasmine est supérieure à un niveau basal d'activité plasmine du milieu plasmatique sanguin à partir duquel a été obtenu le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine.
5 Le substrat chromogène S-2251 est un tri-peptide de formule H-D-Val-Leu-Lys-pNA-2HCf et distribué par Chromogenix, Werfen France, Le Pré Saint Gervais, FRANCE. Avantageusement et selon l'invention, l'activité plasmine est comprise entre 0,1 et 0,5 iumole de para-nitro-aniline libérée par minute et par 10 millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Avantageusement et selon l'invention, l'activité plasmine est de l'ordre de 0,2 iumole de para-nitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Avantageusement et selon l'invention, le milieu plasmatique 15 ex vivo autologue riche en plasmine est sensiblement -notamment totalement-exempt de cellules sanguines. Avantageusement et selon une variante de l'invention, le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est sensiblement exempt de tout composé anti-inflammatoire tel que, par exemple, la dexaméthasone.
20 Le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention se distingue : - du sang au moins par le fait qu'il est exempt de cellules sanguines, en particulier de cellules sanguines fonctionnelles ; - d'un plasma sanguin in vivo par le fait qu'il est exempt de cellules 25 sanguines, en particulier de cellules sanguines fonctionnelles ; - d'un plasma sanguin ex vivo au moins par le fait qu'il est riche en plasmine, et ; - du plasma sanguin riche en plasmine de WO 2010/125148 au moins par le fait qu'il est sensiblement exempte de plasminogénase hétérologue.
30 Selon l'invention, on détermine l'activité plasmine du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine par mesure de la vitesse initiale 3034992 5 d'hydrolyse à 37°C du substrat chromogène S-2251 et d'apparition de la para-nitroaniline dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine par une méthode dans laquelle : - dans une cuvette de mesure d'un spectrophotomètre, on mélange à 5 37°C un volume -notamment 0,4 mL- de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine préalablement dilué 10 fois dans un tampon salin aqueux et un même volume d'une solution de substrat chromogène S-2251 dans l'eau ultra-pure à une concentration de 2 mM de façon à former un milieu de mesure dans lequel la concentration initiale en substrat chromogène S-2251 est de 1 mM, puis ; 10 - à compter du mélange, on mesure et on enregistre (par exemple en continu) l'absorbance (ou densité optique, DO) à 405 nm du milieu de mesure maintenu à la température de 37°C, et ; - à partir de cet enregistrement, on évalue la vitesse initiale Vi de la réaction exprimée en A -abs / min, et on calcule l'activité plasmine -exprimée en 15 U/mL de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine- selon la formule (II) ci-après : Vi * Vm *no Activité plasmine = s*L*Vp ' dans laquelle : - Vi est la vitesse initiale -ou la dérivée première à l'origine, ou la pente 20 à l'origine- exprimée en Aabs / Mill ; - Vm est le volume (en mL) total du milieu de mesure ; - c est le coefficient d'extinction moléculaire de la para-nitro-aniline à 405 nm (10 000 M-1.cm-1) ; - L est la longueur (en cm) du trajet optique de la cuve de mesure 25 spectrophotométrique, et ; - Vp est le volume (en mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine introduit dans la cuve de mesure spectrophotométrique. Le cas échéant, on mesure à titre de contrôle l'activité plasmine basale d'un milieu plasmatique sanguin non enrichi en plasmine en 30 remplaçant dans le protocole ci-dessus le milieu plasmatique ex vivo autologue riche (II) 3034992 6 en plasmine par le même volume de milieu plasmatique sanguin duquel est issu le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. On déduit de la valeur d'activité plasmine du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine la valeur d'activité plasmine basale ainsi calculée.
5 Avantageusement et selon l'invention, la proportion de protéine -notamment de plasminogénase- hétérologue est inférieure à 400 iLt.g -notamment inférieure à 200 iug, de préférence inférieure à 100 iug, en particulier inférieure à 50 iug, plus préférentiellement inférieure à 25 iug- par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Avantageusement et selon 10 l'invention, la proportion de protéine -notamment de plasminogénase- hétérologue est inférieure à 10 µg/mL -en particulier inférieure à 5 µg/mL, de préférence inférieure à 2 µg/mL- de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Cette proportion de protéine hétérologue dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est adaptée pour limiter au maximum -voire ne pas 15 induire- de réaction immunitaire et/ou inflammatoire chez le patient donneur du milieu plasmatique sanguin et receveur du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Avantageusement et selon l'invention, le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est au moins sensiblement exempt de tout 20 germe microbien, en particulier de tout germe microbien pathogène. Avantageusement et selon l'invention, le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est stérile. On détermine le caractère stérile du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine par tout moyen approprié de diagnostic microbiolo gigue.
25 Avantageusement et selon l'invention, le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est sensiblement apyrogène. On valide les conditions d'obtention d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine apyrogène par la mesure de la température corporelle d'un lapin ayant reçu une injection de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine obtenu à partir 30 d'une quantité de milieu plasmatique sanguin dudit lapin. L'absence d'augmentation de la température corporelle du lapin suite à l'injection traduit le 3034992 7 caractère apyrogène du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et valide les conditions de son obtention. L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention, pour son utilisation à titre de 5 médicament. L'invention vise donc toute indication thérapeutique d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention à titre de médicament. L'invention vise la première indication thérapeutique d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention. L'invention vise aussi toute deuxième indication 10 thérapeutique d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention comme médicament dans un traitement thérapeutique d'une pathologie cardiovasculaire ou lors d'une intervention chirurgicale. L'invention vise aussi toute deuxième indication thérapeutique d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention comme médicament lors d'une intervention 15 chirurgicale intra-vitréenne d'un traitement en ophtalmologie. L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention, pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement thérapeutique d'une pathologie cardiovasculaire ou lors d'une intervention chirurgicale.
20 L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention, pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement thérapeutique de traction vitréo-maculaire (TVM) en ophtalmologie. L'invention s'étend aussi à une composition thérapeutique 25 comprenant un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention et au moins un excipient en une quantité physiologiquement acceptable. L'invention s'étend aussi à une telle composition thérapeutique : - pour son utilisation comme médicament, 30 - pour son utilisation comme médicament dans un traitement thérapeutique d'une pathologie cardiovasculaire ou lors d'une intervention chirurgicale, 3034992 8 - pour son utilisation comme médicament dans un traitement ophtalmologique, - pour son utilisation comme médicament dans un traitement d'une traction vitréo-maculaire (TVM), - pour son utilisation comme médicament dans un traitement ophtalmologique 5 en application oculaire intra-vitréenne par injection ou lors d'une intervention chirurgicale à l' oeil. L'invention s'étend aussi à un procédé de préparation d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention. L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'un 10 milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, dans lequel : - on prépare un milieu plasmatique sanguin comprenant du plasminogène à partir de sang d'un individu unique ; - on choisit une composition enzymatique comprenant au moins une enzyme, dite plasminogénase, de conversion en plasmine de plasminogène du 15 milieu plasmatique sanguin comprenant du plasminogène, ladite plasminogénase étant liée à un support solide, insoluble en solution aqueuse ; - on met en contact la composition enzymatique et le milieu plasmatique sanguin pendant une durée et dans des conditions choisies pour permettre une conversion en plasmine de plasminogène du milieu plasmatique 20 sanguin et la formation d'un milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine, puis ; - on réalise une séparation par filtration de la composition enzymatique et du milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine, ladite séparation étant une séparation par filtration sur filtre présentant un seuil de coupure sensiblement égal à 0,22 ium et adaptée pour former le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en 25 plasmine exempt de composition enzymatique. Avantageusement et selon l'invention, pour préparer le milieu plasmatique sanguin, on procède à un prélèvement de sang du patient unique, puis à une séparation -notamment par centrifugation ou par fractionnement dans un procédé de micro-fluidique- du milieu plasmatique sanguin et des cellules sanguines 30 (plaquettes, hématies et leucocytes) dans des conditions aptes à empêcher la coagulation du sang. On réalise un tel prélèvement sanguin, par exemple en utilisant 3034992 9 un tube de prélèvement de type Vacutainer® (BD Diagnostics, Le Pont de Claix, France) comprenant un anticoagulant du type EDTA ou citrate de sodium. On procède ensuite à la séparation On réalise une étape de séparation du milieu plasmatique sanguin et des cellules sanguines (plaquettes, hématies et leucocytes) 5 par centrifugation à 4000 rpm pendant 15 min. On prélève le milieu plasmatique sanguin surnageant, par exemple par aspiration. Avantageusement et selon l'invention, au moins une plasminogénase -notamment chaque plasminogénase- est choisie dans le groupe formé des endopeptidases à sérine -notamment des endopeptidases à activité 10 antithrombotiques- de la classe EC 3.4.21 de la classification des enzymes. Avantageusement et selon l'invention, au moins une plasminogénase -notamment chaque plasminogénase- est choisie dans le groupe formé d'une urokinase, d'une streptokinase, d'une nattokinase et d'un activateur tissulaire du plasminogène (t-PA). Avantageusement et selon l'invention, au moins une plasminogénase est 15 l'urokinase U0633 (Sigma-Aldrich, Lyon, France). Avantageusement et selon l'invention, ladite au moins une plasminogénase est liée par au moins une liaison stable au support solide lorsque la composition enzymatique est immergée dans le milieu plasmatique sanguin. Avantageusement et selon l'invention, au moins une liaison 20 stable est choisie pour résister à une mise en contact avec une solution saline aqueuse de haute force ionique, notamment avec une solution aqueuse de NaCI 0,5 M. Avantageusement et selon l'invention, la composition enzymatique est formée d'une plasminogénase immobilisée sur un support solide 25 par une liaison stable choisie dans le groupe formé d'une liaison covalente, d'une liaison ionique, d'une liaison covalente de coordination (ou liaison dative) et d'une interaction hydrophobe de type van der Waals. Une telle liaison est qualifiée de liaison stable lorsqu'elle ne permet pas sensiblement de libération de plasminogénase dans le milieu plasmatique sanguin dans lequel la composition 30 enzymatique est immergée à 37°C pendant la conversion en plasmine de plasminogène du milieu plasmatique sanguin.
3034992 10 Avantageusement et selon l'invention, ladite au moins une plasminogénase est liée au support solide par au moins une liaison covalente. Avantageusement et selon l'invention, le support solide de la composition enzymatique est choisi pour pouvoir être immergé dans le milieu 5 plasmatique sanguin et présente des dimensions adaptées pour permettre une séparation de la composition enzymatique et d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine obtenu par action de la composition enzymatique sur le milieu plasmatique sanguin. Avantageusement et selon l'invention, le support solide de la 10 composition enzymatique présente des dimensions adaptées pour permettre une séparation de la composition enzymatique et du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine sur un filtre présentant un seuil de coupure sensiblement égal à 0,22 ium. Avantageusement et selon l'invention, le support solide de la 15 composition enzymatique est à l'état divisé et formé de particules présentant trois dimensions s'étendant selon trois directions orthogonales entre elles, au moins deux des trois dimensions étant supérieures à 0,22 !am. Avantageusement et selon l'invention, le support solide est formé d'un matériau poreux présentant un diamètre moyen de pores compris entre 5 20 nm et 50 nm, de préférence compris entre 10 nm et 20 nm. Avantageusement et selon l'invention, le support solide -notamment le support solide à l'état divisé- est formé d'un matériau choisi dans le groupe formé des poly-glucosides et des polymères méthacrylates. Avantageusement, le support solide peut être formé des supports SEPABEADS® 25 EC-HFA/S et GE Healthcare Epoxy-activated SepharoseTM. Avantageusement, le support solide à l'état divisé est formé de particules sphériques de diamètre moyen compris entre 100 ium et 300 ium. Avantageusement et selon l'invention, on réalise la séparation du milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine et de la composition enzymatique 30 par filtration au moyen d'un filtre apte à retenir la composition enzymatique et à former le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et sensiblement 3034992 11 exempt de plasminogénase hétérologue. Avantageusement, la séparation du milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine et de la composition enzymatique est une séparation stérilisante et d'obtention du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et stérile.
5 Avantageusement et selon l'invention, le support solide est formé de particules présentant trois dimensions s'étendant selon trois directions orthogonales entre elles, au moins deux des trois dimensions étant supérieures à 0,22 ium. Avantageusement et selon l'invention, la durée de contact est 10 supérieure à 5 min, notamment comprise entre 5 min et 60 min. Avantageusement et selon l'invention, on met et on maintient en contact la composition enzymatique et le milieu plasmatique sanguin sous agitation et à la température de 37°C. Avantageusement et selon l'invention, on réalise au moins une 15 étape du procédé sous une hotte à flux laminaire. Avantageusement et selon l'invention, on réalise toutes les étapes sous une hotte à flux laminaire. Avantageusement et selon l'invention, on utilise une composition enzymatique stérile et on met le milieu plasmatique sanguin comprenant du plasminogène en contact avec la composition enzymatique stérile 20 dans un récipient hermétiquement clos. On obtient un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine qui est stérile, sensiblement non immunogène et qui est notamment adapté pour pouvoir être utilisé en injection autologue dans le cadre de tout traitement préventif ou curatif d'une pathologie dans lequel une transformation de 25 plasminogénase en plasmine autologue est requise, par exemple dans le cadre du traitement d'une pathologie cardiovasculaire ou dans le cadre d'une intervention chirurgicale, en particulier lors d'une intervention intra-vitréale d'un traitement -notamment lors d'une intervention chirurgicale- de troubles vitréo-maculaires en ophtalmologie.
30 L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine susceptible d'être obtenu par un procédé selon 3034992 12 l'invention. L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine obtenu directement par un procédé selon l'invention. L'invention concerne également un milieu plasmatique ex-vivo autologue riche en plasmine, un tel milieu plasmatique ex-vivo autologue riche en 5 plasmine pour son utilisation à titre de médicament, un tel milieu plasmatique ex-vivo autologue riche en plasmine pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement de troubles vitréo-maculaires et un procédé de préparation d'un tel milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après.
10 D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et aux exemples illustratifs de l'invention donnés à titre indicatif et non limitatif. Plasminogénase immobilisée sur un support solide On prépare une composition enzymatique formée d'une 15 plasminogénase -notamment une urokinase- immobilisée sur un support solide par un procédé dans lequel on choisit un matériau solide à l'état divisé dans le groupe formé des matériaux hydrophiles poreux, notamment dans le groupe formé des matériaux hydrophiles poreux présentant des groupements surfaciques réactifs de greffage et de nature époxydique. On choisit par exemple le matériau solide dans le 20 groupe formé du matériau Epoxy-GE Healthcare (GE Healthcare Epoxy-activated SepharoseTM) et du matériau SEPABEADS® EC-EP/S (Resindion, Binasca, Italie). À titre d'exemple, le matériau solide est le SEPABEADS® EC-HFA/S (Resindion, Binasca, Italie) formé de particules de diamètre moyen compris entre 100 ium et 300 ium. Les particules du SEPABEADS® EC-HFA/S sont 25 formées de polyméthacrylate et fonctionnalisées en surface par des groupements amino-époxyde de formule (III) ci-après : OH H /1\10(i)< Support 0 (III) ; à raison d'au moins 75 iumoles de groupement amino-époxyde par gramme de support à l'état sec. La porosité moyenne du matériau solide est comprise entre 30 10 nm et 20 nm.
3034992 13 Dans un procédé de fabrication d'une telle composition enzymatique, on hydrate une quantité de matériau solide sec à l'état divisé dans une composition aqueuse d'hydratation. La composition aqueuse d'hydratation peut être par exemple de l'eau osmosée, de l'eau « pour préparation injectable » (dite PPI) ou 5 du sérum physiologique stérile. Par exemple, on place 0,2 g de matériau solide déshydraté -par exemple 0,2 g de SEPABEADS® EC-HFA/S à l'état sec- dans 40 mL d'eau PPI pendant 1 heure à température ambiante, puis on réalise ensuite trois rinçages successifs du support hydraté avec 0,7 mL de sérum physiologique stérile à pH 6,8.
10 On met ensuite le matériau solide rincé en contact avec 0,7 mL d'une solution aqueuse -par exemple, du sérum physiologique stérile apyrogène ou une solution stérile d'irrigation intraoculaire BSS (Bioaqua®, « Balanced Salt Solution »)- de plasminogénase -par exemple d'urokinase ou de streptokinase, ou de nattokinase, ou d'activateur tissulaire du plasminogène (t-PA)- 15 comprenant de l'ordre de 2 unités (2 U/mL) d'activité plasminogénase par mL de solution aqueuse. On maintient le contact entre le matériau solide et la plasminogénase pendant plusieurs heures de façon à former la composition enzymatique. On prélève le surnageant liquide de réaction, puis on rince 3 fois la 20 composition enzymatique ainsi obtenue avec 0,7 mL d'une solution de NaCI 1M dans de l'eau PPI, ou de préférence du sérum physiologique stérile. Préparation d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine On prélève stérilement une quantité de sang d'un patient à 25 soigner dans un tube de prélèvement (BD Vacutainer®, BD Diagnostics, Le Pont de Claix, France) comprenant un anticoagulant du type EDTA ou citrate de sodium. On réalise une étape de séparation des cellules sanguines et du milieu plasmatique sanguin par centrifugation à 4000 rpm pendant 15 min. On place stérilement 0,7 mL de ce milieu plasmatique sanguin 30 sous agitation, à 37°C et au contact d'une fraction aliquote de l'ordre de 0,2 g de composition enzymatique obtenue par un procédé décrit ci-dessus et pendant une 3034992 14 durée comprise entre 5 min et 60 min de façon à convertir du plasminogène du milieu plasmatique sanguin en plasmine et former le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. On sépare par filtration sur un filtre Millex PVDF (Millipore) de seuil de coupure de 0,22 ium, la composition enzymatique (rétentat) 5 et le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine (filtrat) et sensiblement exempt d'urokinase. On procède ensuite à une injection intraoculaire d'un volume, par exemple compris entre 50 it.11_, et 200 ILEL, de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et stérile de façon à libérer les contraintes existant entre 10 le corps vitré et la rétine. Détermination de l'activité plasmine d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine On détermine l'activité enzymatique à 37°C de la plasmine (dite activité plasmine) du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine 15 obtenu ci-dessus par un suivi par spectrophotométrique de la libération de paranitro-aniline à partir du substrat S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-pNA-2HCf, Chromogenix, Werfen France, Le Pré Saint Gervais, FRANCE) sous l'action de la plasmine du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Pour ce faire, on prépare dans une cuvette de mesure 20 spectrophotométrique un milieu de mesure à 37°C par mélange de 0,4 mL de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine dilué 10 fois dans un tampon salin (« Balanced salt solution ») et 0,4mL d'une solution comprenant du S-2251 (H-DVal-Leu-Lys-pNA-2HCf, Chromogenix, Werfen France, Le Pré Saint Gervais, FRANCE) à la concentration de 2 mM, de sorte que la concentration initiale de S- 25 2251 dans le milieu de mesure soit de l'ordre de 1 mM. À compter du mélange, on mesure l'évolution de l'absorbance (densité optique, D0405.) à 405 nm du milieu de mesure à 37°C pendant 5 minutes. On évalue la pente à l'origine de la courbe d'évolution de l'absorbance à 405 nm, c'est-à-dire la vitesse initiale Vi de la réaction exprimée en A -abs / min. L'activité plasmine du milieu plasmatique ex vivo 30 autologue riche en plasmine (exprimée en U/mL de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine) est donnée par la formule (II) : 3034992 15 io3vm. Activité plasmine = vi. (II) E.L.Vp dans laquelle : - Vi est la vitesse initiale de la réaction exprimée en Aabs Min ; - Vm est le volume (en mL) du milieu de mesure ; 5 - c est le coefficient d'extinction moléculaire (en M-1 cm-1) de la para- nitro-aniline à 405 nm ; - L est la longueur (en cm) du trajet optique de la cuve de mesure spectrophotométrique, et ; - Vp est le volume (en mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue 10 riche en plasmine introduit dans la cuve de mesure spectrophotométrique. L'activité plasmine (U/mL de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine) à 37°C du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine obtenu après 15 min ou 60 min de contact entre la composition enzymatique et le milieu plasmatique sanguin mesurée en présence de substrat S- 15 2251 est comprise entre 0,116 et 0,148 U/mL pour un temps de contact de 15 min et comprise entre 0,200 et 0,218 U/mL pour un temps de contact de 60 min. Détermination de la quantité de plasminogénase -notamment d'urokinase- d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine On détermine la quantité de plasminogénase d'un milieu 20 plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine par dosage selon la technique immuno-enzymatique « ELISA » en utilisant un anticorps primaire spécifique de la plasminogénase (notamment un anticorps dirigé contre l'urokinase humaine -par exemple, l'anticorps de lapin ABcam ab24121-) et un anticorps secondaire quantifiable (par exemple, un anticorps de chèvre dirigé contre les IgG de lapin et 25 conjugué à la HRP (« Horse Raddish Peroxydase ») en présence d'Amplex®UltraRed. On réalise une courbe d'étalonnage à partir de quantités connues de plasminogénase dans du milieu plasmatique sanguin. La masse d'urokinase présente dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine obtenu par mise en contact de la composition 30 enzymatique et d'un milieu plasmatique sanguin pendant 60 minutes à la 3034992 16 température de 37°C, mesurée par la méthode immuno-enzymatique « ELISA », est inférieure à 30 ag par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. EXEMPLE 1 - Préparation d'urokinase immobilisée 5 On hydrate 0,2 g de SEPABEADS® EC-HFA/S dans de l'eau PPI, puis on réalise ensuite trois rinçages successifs du matériau hydraté avec 0,7 mL de sérum physiologique stérile à pH 6,8. On met en contact le support ainsi rincé avec 0,7 mL d'une solution de plasminogénase (Urokinase humaine, U0633, Sigma-Aldrich, Lyon, France) dans du sérum physiologique, ladite solution 10 présentant une activité enzymatique de 2 U/mL On maintient le contact entre le support et l'enzyme pendant plusieurs heures. On élimine le surnageant liquide de réaction, puis on réalise trois rinçages successifs. On obtient une composition enzymatique formée d'urokinase immobilisée sur un support solide à l'état divisé. L'activité enzymatique de la composition enzymatique est de l'ordre de 0,172 à 15 0,196 U/mL La composition enzymatique permet de convertir du plasminogène d'un milieu plasmatique sanguin en plasmine sans apporter dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, une quantité importante de protéase immunogène.
20 Dosage d'urokinase libre dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine Le dosage par la méthode immuno-enzymatique « ELISA » de la quantité d'urokinase libre présente dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine montre une proportion d'urokinase hétérologue libre inférieure à 25 20 µg/mL et en moyenne de l'ordre de 10,0 µg/mL
Claims (5)
- REVENDICATIONS1/ - Milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine caractérisé : - en ce qu'il comprend une proportion de protéine hétérologue inférieure à 600 iug par millilitre (mL) de milieu plasmatique, - en ce qu'il présente une activité enzymatique, dite activité plasmine, telle que mesurée par un test de libération de para-nitro-aniline, supérieure à 0,1 iumole de para-nitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique, ledit test de libération consistant à : o mélanger dans le milieu plasmatique maintenu à la température de 37°C un substrat chromogène S-2251 de formule (I) ci-après : NO2 à une concentration initiale de l'ordre de 1 mM dans le milieu plasmatique, o évaluer suite au mélange une vitesse initiale de libération de para- nitro-aniline par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique.
- 2/ - Milieu plasmatique selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activité plasmine est comprise entre 0,1 et 0,5 iumole de para-nitroaniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique.
- 3/ - Milieu plasmatique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'activité plasmine est de l'ordre de 0,2 iumole de paranitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique.
- 4/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend une proportion de protéine hétérologue inférieure à 400 iLt.g par 25 millilitre (mL) de milieu plasmatique. 3034992 18 5/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la proportion de protéine hétérologue est inférieure à 10 iug par millilitre (mL) de milieu plasmatique. 6/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé 5 en ce qu'il est stérile. 7/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est apyrogène. 8/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 7, pour son utilisation à titre de médicament. 10 9/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 8, pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement thérapeutique d'une pathologie cardiovasculaire ou lors d'une intervention chirurgicale. 10/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 9, pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement thérapeutique de traction vitréo15 maculaire (TVM) en ophtalmologie. 11/ - Composition comprenant un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'une des revendications 1 à 10 et au moins un excipient en une quantité physiologiquement acceptable. 12/ - Procédé de préparation d'un milieu plasmatique ex vivo 20 autologue riche en plasmine selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel : - on prépare un milieu plasmatique sanguin comprenant du plasminogène à partir de sang d'un individu unique ; - on choisit une composition enzymatique comprenant au moins une enzyme, dite plasminogénase, de conversion en plasmine du plasminogène dudit milieu plasmatique sanguin, ladite plasminogénase étant liée à un support solide insoluble en solution aqueuse et formé d'un matériau poreux ; - on met en contact la composition enzymatique et ledit milieu plasmatique sanguin pendant une durée de contact et dans des conditions choisies pour permettre une conversion en plasmine du plasminogène dudit milieu plasmatique sanguin et la formation d'un milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine, puis ; 3034992 19 - on réalise une filtration dudit milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine sur filtre présentant un seuil de coupure inférieur ou égal à 0,22 Lam de façon à obtenir un filtrat constituant un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine stérile et exempt de composition enzymatique.
- 5 13/ - Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la durée de contact est supérieure à 5 min. 14/ - Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce qu'on met en contact la composition enzymatique et ledit milieu plasmatique sanguin sous agitation et à température de 37°C.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1553344A FR3034992A1 (fr) | 2015-04-15 | 2015-04-15 | Milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et procede d'obtention |
| PCT/FR2016/050870 WO2016166485A1 (fr) | 2015-04-15 | 2016-04-14 | Milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et procédé d'obtention |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1553344A FR3034992A1 (fr) | 2015-04-15 | 2015-04-15 | Milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et procede d'obtention |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR3034992A1 true FR3034992A1 (fr) | 2016-10-21 |
Family
ID=53794323
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR1553344A Pending FR3034992A1 (fr) | 2015-04-15 | 2015-04-15 | Milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et procede d'obtention |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR3034992A1 (fr) |
| WO (1) | WO2016166485A1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20230210895A1 (en) * | 2020-08-03 | 2023-07-06 | Sereye Gmbh | Composition for treating damaged epithelial surfaces and method of producing same |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009073457A1 (fr) * | 2007-11-30 | 2009-06-11 | Bausch & Lomb Incorporated | Procédés et compositions pour le sauvetage d'une bulle filtrante |
| WO2009149199A2 (fr) * | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Composition, méthode et nécessaire pour la préparation de plasmine |
| WO2010125148A2 (fr) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Catherine Blondel | Méthodes de traitement de pathologies oculaires |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0228409D0 (en) | 2002-12-06 | 2003-01-08 | Thromb X Nv | Pharmacological vitreolysis |
-
2015
- 2015-04-15 FR FR1553344A patent/FR3034992A1/fr active Pending
-
2016
- 2016-04-14 WO PCT/FR2016/050870 patent/WO2016166485A1/fr not_active Ceased
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009073457A1 (fr) * | 2007-11-30 | 2009-06-11 | Bausch & Lomb Incorporated | Procédés et compositions pour le sauvetage d'une bulle filtrante |
| WO2009149199A2 (fr) * | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Composition, méthode et nécessaire pour la préparation de plasmine |
| WO2010125148A2 (fr) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Catherine Blondel | Méthodes de traitement de pathologies oculaires |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ANDREI Z. BUDZYNSKI: "Chromogenic Substrates in Coagulation and Fibrinolytic Assays", LABORATORY MEDICIN, NR. 7, VOL. 32, 1 July 2001 (2001-07-01), pages 365 - 368, XP055096857, Retrieved from the Internet <URL:http://labmed.ascpjournals.org/content/32/7/365.full.pdf> [retrieved on 20140116] * |
| DÍAZ-LLOPIS M ET AL: "[Enzymatic vitrectomy by intravitreal autologous plasmin injection as initial treatment for macular epiretinal membranes and vitreomacular traction syndrome]", SOCIEDAD ESPAGNOLA DE OFTALMOLOGIA. ARCHIVOS, SOCIEDAD ESPAGNOLA DE OFTALMOLOGIA, MADRID, ES, vol. 84, no. 2, 1 February 2009 (2009-02-01), pages 91 - 100, XP002610178, ISSN: 0365-6691 * |
| DÍAZ-LLOPIS M ET AL: "[Intravitreal autologous plasmin without associated-vitrectomy. Pharmacological vitreolysis, a perfeccionated method using urokinase]", SOCIEDAD ESPAGNOLA DE OFTALMOLOGIA. ARCHIVOS, SOCIEDAD ESPAGNOLA DE OFTALMOLOGIA, MADRID, ES, vol. 83, no. 5, 1 May 2008 (2008-05-01), pages 291 - 292, XP002610179, ISSN: 0365-6691 * |
| MIZUTANI M ET AL: "A NEW THROMBOLYTIC THERAPY USING AUTOLOGOUS PLASMIN RICH PLASMA", JAPANESE CIRCULATION JOURNAL, KYOTO, JP, vol. 51, no. 7, 31 March 1987 (1987-03-31), pages 822, XP009187527, ISSN: 0047-1828 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20230210895A1 (en) * | 2020-08-03 | 2023-07-06 | Sereye Gmbh | Composition for treating damaged epithelial surfaces and method of producing same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2016166485A1 (fr) | 2016-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2733985C (fr) | Compositions de cellules souches mesenchymateuses purifiees, et procedes de purification de compositions de cellules souches mesenchymateuses | |
| TWI225404B (en) | Pharmaceutical composition for treating hypercoagulable states or acquired protein C deficiency | |
| US9155785B2 (en) | Crystallized oxalate decarboxylase and methods of use | |
| CA2623170C (fr) | Kit pour preparer une composition comprenant des cellules adipocytaires | |
| JPH07507550A (ja) | 非繊維形成誘導性アルギン酸被覆移植体，その製造方法およびその使用方法 | |
| WO1998029144A1 (fr) | Procede de preparation d'une colle biologique | |
| FR2831170A1 (fr) | Proteines c modifiees activables directement par la thrombine | |
| US8476054B2 (en) | Thrombin-like enzyme of Agkistrodon acutus | |
| FR2600895A1 (fr) | Utilisation de l'activateur tissulaire du plasminogene, son association avec une superoxyde-dismutase et formulation pharmaceutique contenant cette association | |
| FR2599625A1 (fr) | Procede de production d'activateur du plasminogene biologiquement actif | |
| EP1962885A2 (fr) | Procede de preparation d'un concentre de facteur h et utilisation de ce concentre de facteur h au titre de medicament | |
| JP6018299B2 (ja) | 単一ドナーのトロンビン血清を調製する方法および機器 | |
| FR3034992A1 (fr) | Milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et procede d'obtention | |
| KR20180133865A (ko) | 혈전성 혈소판감소성 자반 치료 약물 제조에 사용하는 항혈소판 트롬볼리신의 응용 | |
| RU2315621C2 (ru) | Применение ингибитора или антагониста тканевого фактора | |
| FR3035120A1 (fr) | Composition de plasminogenase immobilisee, procede de preparation, utilisation et dispositif comprenant une telle composition | |
| JPH0393799A (ja) | プロティンｃの活性化法 | |
| FR2504921A1 (fr) | Medicament nouveau constitue par un complexe aprotinine-plasmine et procede de preparation de ce nouveau complexe | |
| JP5761661B2 (ja) | 海洋性腐植土の水溶性抽出液およびフルボ酸とその用途 | |
| FR2495634A1 (fr) | Enzyme nouvelle et utilisable en therapeutique | |
| Méndez et al. | Altered pancreatic arginase activity and [alpha]-amylase levels in patients with type 2 diabetes and alcoholic pancreatitis | |
| AU2015268673B2 (en) | Purified mesenchymal stem cell compositions and methods of purifying mesenchymal stem cell compositions | |
| Atanasov et al. | Some physicochemical characteristics of anti-platelet fraction isolated from Galega officinalis L. | |
| CN109925323A (zh) | 有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞制剂 | |
| Lourbakos | Activation of human protease-activated receptors by proteases from a periodontal pathogen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 2 |
|
| PLSC | Publication of the preliminary search report |
Effective date: 20161021 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 3 |