FR3027533A1 - Preparation de polyplexes monoplasmidiques - Google Patents

Abstract

L'invention est relative à un procédé de préparation de complexes de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, en particulier de polyplexes comprenant un polymère cationique et une seule molécule d'acide nucléique, notamment un plasmide. La présente invention concerne également les complexes obtenus par le procédé et leur utilisation pour la transfection in vitro, ex vivo et in vivo de molécules d'intérêt chargées, en particulier des molécules thérapeutique, telles que notamment des acides nucléiques.

Description

PREPARATION DE POLYPLEXES MONOPLASIVIIDIQUES La présente invention a pour objet un procédé de préparation de complexes de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, en particulier de polyplexes comprenant un polymère cationique et une seule molécule d'acide nucléique, notamment un plasmide, tels que des polyplexes monoplasmidiques. La présente invention a également pour objet les complexes obtenus par le procédé. Particulièrement, la présente invention a pour objet des polyplexes comprenant un polymère cationique et une seule molécule d'acide nucléique et leur utilisation pour la transfection in vitro, ex vivo et in vivo de molécules d'intérêt chargées, en particulier de molécules thérapeutique, telles que notamment des acides nucléiques. Les stratégies utilisées en thérapie génique pour introduire un gène médicament dans les cellules font appel à des virus modifiés encore appelés vecteurs viraux. Ces vecteurs posent un certain nombre de problèmes pour leur application en toute sécurité chez l'homme. Il existe également des méthodes physiques telles que l'électroperméation et l'utilisation des ultrasons ou sonoporation. Les vecteurs chimiques (lipides cationiques et polymères cationiques) pourraient à priori remplacer les vecteurs viraux car moins immunogènes et de plus faible coût de fabrication. Il a été montré depuis près de vingt ans qu'il est possible d'utiliser un polymère cationique, telle que la polylysine, la polyéthylènimine ou le chitosan pour condenser un acide nucléique (polynucléotide tel que notamment un ADN plasmidique ou un ARN) et former une particule qui pourra ensuite être utilisée pour véhiculer le polynucléotide vers l'intérieur de la cellule. Par exemple, la Demande WO 2009/112402 et Bertrand et al., Chem. Commmun., 2011, 14, 12547- 12549 décrivent des polymères linéaires de polyéthylènimine, modifiés par des résidus d'histidine, qui ont une bonne efficacité de transfection et une toxicité cellulaire faible. L'utilisation de polymères cationiques pour la transfection de cellules repose sur la formation de complexes électrostatiques entre un polymère 30 cationique et un acide nucléique, dénommés polyplexes. La méthodologie classiquement utilisée pour préparer des polyplexes consiste à ajouter une solution de polymère cationique dans une solution contenant le plasmide ADN, et les particules se forment spontanément. L'optimisation de polyplexes est assurée par la variation du rapport N/P, exprimant le nombre de charges positives (N pour azote) par molécule de polymère rapporté au nombre de charges négatives (P pour phosphate) par molécule d'ADN. Les particules sont caractérisées par leur diamètre hydrodynamique moyen et leur charge de surface ou potentiel zéta. Les particules ont un diamètre moyen généralement supérieur à 100 nm et sont constituées de plusieurs (3 à 4) molécules de plasmides (Clamme el al., Biophysical Journal, 2003, 84, 1960-1968; Midoux el al., Somatic Cell and Molecular Genetics, 2002, 27, 27-47). Lors de la préparation de ces particules par cette méthode, le rapport de charge N/P entre le polycation et le polyanion évolue puisque le polycation est versé dans la solution de polyanion. N/P est initialement inférieur à 1, puis augmente jusqu'à la neutralisation (N/P autour de 1) pour atteindre une valeur finale de N/P voisine de 3 ou 6 selon les formulations. Ainsi, le procédé de formulation « remonte » le diagramme de phase proposé par Mengarelli, V (Complexes de polyélectrolytes de charge opposée : des polymères synthétiques à la thérapie génique ; Thèse de doctorat en Physique, Université de Paris-sud XI, Orsay, 2009), et passe systématiquement par le point N/P ( ou X) = 0, zone de précipitation, observée à partir d'une concentration, généralement de l'ordre du ug/ut. Ainsi les polyplexes sont généralement formés à une concentration en ADN bien inférieure à celle nécessaire pour des études in vivo et ce quelques soient les modes d'administration. Les polyplexes ainsi générés ont donc des diamètres généralement supérieurs à 100 nm permettant d'envisager leur utilisation in vitro, mais rendant leur utilisation in vivo impossible du fait des risques de toxicité sévères. De plus les polyplexes ainsi formés sont instables en présence de solution saline telle que le sérum physiologique : ils forment rapidement des agrégats pouvant atteindre la taille de 1 um. Pour éviter les problèmes de précipitation observés aux concentrations élevées d'ADN, il a été proposé de préparer des polyplexes selon le procédé standard, avec des concentrations d'ADN inférieures à celles induisant la formation d'agrégats (solution très peu saline) puis de concentrer les polyplexes. Toutefois, cette méthode conduit le plus souvent à la formation d'agrégats. En vue d'applications de transfert de gènes in vivo, il est donc indispensable de disposer de nouveaux procédés de formulation des polyplexes permettant de préparer des nanoparticules de faible diamètre (<100 nm), stables en milieu salin, pour des concentrations élevées d'ADN et de polymère. La réduction de la taille des particules doit faciliter tant la biodistribution dans l'organisme que la pénétration dans la cellule et le trafic intracellulaire vers la délivrance nucléaire. En effet, il a été démontré que le processus d'internalisation de particules dans une cellule peut être directement corrélé aux tailles de ces particules : des particules de diamètre faible sont plus facilement intemalisées que des particules de diamètre élevé. L'entrée des polyplexes dans le cytoplasme qui se fait généralement par endocytose clathrine ou cavéoline dépendante, implique que le diamètre des polyplexes soit inférieur à la taille de l'endosome (environ 100 nm). La taille élevée des polyplexes tient en partie au fait que ces complexes sont formés avec plusieurs molécules d'ADN plasmidique. Une façon de diminuer celle-ci est de contrôler le processus de fonnation de particules de façon à ce qu'elles contiennent une seule molécule d'ADN plasmidique. Des polyplexes monoplasmidiques n'ont jamais été obtenus en milieu concentré avec des polymères cationiques. De tels polyplexes n'ont été obtenus qu'a deux reprises, et uniquement en utilisant une formulation à base de lipides (Chittimalla et al., JACS, 2005, 127, 11436-11441 ; Rudorf, J. O. Radier, JACS, 2012, 134, 11852-11858). La formation de polyplexes monoplasmidiques utilisables en thérapie reste donc un challenge. Les inventeurs ont mis au point un procédé original de préparation de polyplexes qui permet avantageusement de produire des polyplexes monoADN à base d'ADN et de polymère cationique tout en s'affranchissant des problèmes de précipitation rencontrés avec le procédé standard de préparation de polyplexes de l'art antérieur. De façon générale, ce procédé est utilisable pour produire des polyplexes à base de polymère(s) chargé(s) positivement (polymère(s) cationique(s)) ou négativement (polymère(s) anionique(s)) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée (polyélectrolyte négatif ou positif), notamment un seul acide nucléique. En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'au moins un complexe de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes: - la distribution d'une solution de molécules d'intérêt chargées dans un premier compartiment séparé d'un deuxième compartiment par une surface 5 poreuse, et ledit deuxième compartiment comprenant une solution de polymère(s) de charge opposée, et - l'extrusion des molécules d'intérêt chargées, une à une, au travers de ladite surface poreuse vers la solution de polymère de charge opposée pour former des complexes entre le(s) polymère(s) chargé(s) et une seule molécule d'intérêt de 10 charge opposée. Le principe du procédé est illustré dans les figures 1 et 2. Le procédé de préparation de polyplexes comprenant une seule molécule d'intérêt selon l'invention présente les avantages suivants par rapport au procédé classique de préparation de polyplexes : 15 - Il permet d'obtenir des nanoparticules de taille comprise entre 50 nm et 100 nm, préférentiellement 50 nm. - Il permet de s'affranchir des questions relatives au diagramme de phase du mélange polyélectrolyte positif/polyélectrolyte négatif, notamment, ADN/polymère cationique, et donc du passage de la zone de précipitation pour 20 laquelle il est observé une floculation des complexes, généralement autour de N/P=1, qui les rend impropres à une utilisation biologique. - Chaque molécule d'intérêt chargée, par exemple un plasmide, est condensée de façon unique et indépendante, rendant les questions de concentration de formulation caduques : il est alors possible d'envisager la formation de polyplexes 25 comprenant une seule molécule d'intérêt quelle que soit la taille de la molécule d'intérêt, notamment du plasmide et la concentration à laquelle elle est foiinulée. Cette observation est particulièrement importante pour envisager des applications thérapeutiques pour lesquelles les molécules à délivrer dans les cellules, notamment les plasmides, sont de taille élevée, voire voisine de 20 kbp. 30 - Ce mode de folinulation peut s'appliquer à n'importe quel type de polymère chargé (anionique ou cationique).

La quantité de polymère(s) chargé(s)nécessaire à la réalisation d'un polyplexe selon l'invention est fortement diminuée, ce qui a pour effet de diminuer la quantité de polyélectrolyte chargé, notamment de polyélectrolyte positif, souvent toxique, injectée lors de transfection in vivo.

Les polyplexes obtenus par le procédé selon l'invention ont des applications très variées dans tous les domaines mettant en oeuvre le transfert de molécules dans les cellules, notamment de gènes, à l'aide de vecteurs synthétiques, tels que de façon non-limitative le domaine de l'imagerie cellulaire, du diagnostic, de la thérapie, notamment la thérapie génique et la médecine régénérative, et de la bioproduction. Dans le cadre de la thérapie génique, les pathologies concernées sont extrêmement nombreuses, elles concernent aussi bien les maladies génétiques (Mucoviscidose, Dystrophie musculaire de Duchenne...) ou acquises (cancer, infections par des microorganismes pathogènes notamment des virus). Dans le cadre de la bioproduction, la méthode de formulation selon l'invention, en permettant d'éviter la formation d'agrégats en milieu concentré, constitue un débouché très important pour les polymères chargés, en particulier les polymères cationiques. La question de reproductibilité des formulations est peu discutée dans la littérature scientifique mais ce procédé présente l'avantage d'une standardisation des formulations, conduisant à une meilleure reproductibilité des résultats.

La membrane poreuse utilisée dans le procédé selon l'invention est constituée d'un matériau adapté à l'extrusion. De préférence, il s'agit d'une membrane de polycarbonate. Ladite membrane comprend avantageusement des pores d'une taille de 5 à 200 nm, de préférence de 10 à 50 nm (10, 20, 30, 40 ou 50 nm), de manière encore plus préférée de 50 nm, Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon l'invention, l'extrusion est réalisée à une pression de 10 mbar à 3 bars, de préférence de 100 mbar à 2 bars, notamment 100 mbar, 500 mBar ou 2 bars, de manière encore plus préférée de 1 à 2 bars. La vitesse du flux au travers de la membrane est imposée par la taille des pores et la pression. Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre avec des concentrations variables de molécule d'intérêt chargée, notamment d'acide nucléique (premier compartiment), aussi bien faibles qu'élevées, comme le démontre les exemples de la présente Demande qui ont été réalisées avec des concentrations d'acide nucléique variant d'un facteur 1 à 200 (10 tg/ml à 2000 ug/m1). Les proportions respectives du polymère et de la molécule d'intérêt, notamment du polymère cationique et de l'acide nucléique sont de préférence déterminées de sorte que le rapport massique (pg/ug) entre le polymère et la molécule d'intérêt, notamment l'acide nucléique, soit de 2 à 6 ug/ug. La présente invention a également pour objet un complexe de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, obtenu ou susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un complexe de polymère(s) chargé(s) positivement (polymère(s) cationique(s)) et d'une seule molécule d'acide nucléique. Le complexe selon l'invention, dénommé également polyplexe, est formé par des associations, notamment électrostatiques, entre la molécule d'intérêt chargée et le(s) polymère(s) de charge opposée, notamment le(s) polymère(s) cationique(s) comprenant des charges positives et la molécule d'acide nucléique comprenant des charges négatives. Un polyplexe contenant de l'ADN est dénommé polyplexe monoADN ; lorsque l'ADN est un plasmide, il s'agit alors d'un polyplexe 20 monoplasmidique. Le polymère chargé englobe tous les polymères cationiques ou anioniques et les co-polymères possédant un bloc cationique ou anionique, utilisables pour transfecter des cellules in vitro, ex vivo ou in vivo. Il s'agit notamment de polymères cationiques ou de co-polymères possédant un bloc cationique. tels que par 25 exemple, la polylysine, la polyéthylénimine, le chitosan et leurs dérivés. Le polymère chargé est avantageusement un polymère cationique, de préférence une polyéthylèneimine linéaire, de manière préférée une polyéthylèneimine linéaire partiellement histidinylée (IPEI-His), de manière encore plus préférée dans laquelle 5% à 25 %, plus préférentiellement 16%, des monomères totaux sont 30 histidinylés ; de tels copolymères sont décrits dans la Demande WO 2009/112402. La molécule d'intérêt chargée est capable de former une particule avec le ou les polymère(s) de charge opposée.

Il s'agit d'un polyélectrolyte positif ou négatif, notamment une molécule utilisée pour le diagnostic, la thérapie ou l'imagerie cellulaire/tissulaire. La molécule d'intérêt chargée est en particulier un acide nucléique, notamment une molécule d'ADN, d'ARN ou mixte ADN/ARN, simple-brin, double- brin (en totalité ou partiellement), linéaire ou circulaire, naturelle, recombinante, synthétique ou semi-synthétique, incluant les acides nucléiques modifiés au niveau de la partie sucre et/ou ou base de leurs nucléotides, et/ou de leurs liaisons internucléotidiques, par exemple du type morpholino ou PNA. L'acide nucléique est avantageusement un ADN ou un ARNm 10 comprenant une séquence codant pour un polypeptide ou une protéine d'intérêt, notamment thérapeutique; un ADN ou ARN antisens, un ARN interférant ou un ribozyme comprenant une séquence complémentaire d'un gène d'intérêt, notamment thérapeutique; un ADN codant les ARN précédents. De préférence, ledit acide nucléique comprend les éléments permettant son expression dans la cellule ou 15 l'organisme hôte, à savoir des éléments régulateurs de la transcription et/ou de la traduction (promoteur, polyA). Il peut être également incorporé dans un vecteur tel qu'un vecteur plasmidique. Parmi les acides nucléiques d'intérêt thérapeutique, on peut citer la forme non-mutée et par conséquent fonctionnelle des gènes impliqués dans les 20 maladies héréditaires, notamment les maladies héréditaires monogéniques, ainsi que les acides nucléiques codant pour des antigènes de microorganismes ou des antigènes tumoraux. Selon un mode de réalisation avantageux, l'acide nucléique est un ADN, de préférence un plasmide. 25 Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit acide nucléique est un acide nucléique d'intérêt thérapeutique. Selon un autre mode de réalisation avantageux, le complexe selon l'invention est une particule de taille inférieure à 100 nm, de préférence inférieure à 70 nm. Il s'agit notamment d'une particule de 10 à 70 nm, de préférence de 30 à 30 70 nm, de manière préférée d'environ 50 nm. De préférence, ladite particule est un polyplexe d'acide nucléique, de manière préférée un polyplexe monoplasmidique.

L'invention englobe les particules chargées négativement ou positivement, telles que notamment des particules inorganiques ou magnétiques. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un complexe selon l'invention et éventuellement un excipient pharmaceutiquement acceptable. Les excipients pharmaceutiquement acceptables sont les excipients classiques bien connus de l'Homme du métier. La composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un autre composé, notamment un principe actif d'un médicament ou un adjuvant capable de s'associer au complexe polymère/acide nucléique selon l'invention et d'améliorer le pouvoir transfectant dudit complexe. Selon un mode de réalisation avantageux, le complexe ou la composition de l'invention comprennent un élément ou agent de ciblage permettant d'orienter le transfert de la molécule d'intérêt chargée, notamment l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être un élément de ciblage extracellulaire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains types cellulaires ou certains tissus souhaités, par exemple des cellules tumorales, hépatiques, immunitaires ou hématopoïétiques. Il peut s'agir également d'un élément de ciblage intracellulaire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains compartiments cellulaires privilégiés, par exemple le noyau, les microtubules ou les mitochondries. Parmi les éléments de ciblage utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer les sucres, les peptides oligonucléotides, les lipides ou les protéines. Avantageusement, il s'agit de sucres, de peptides ou de protéines, tels que de façon non-limitative : des anticorps ou fragments d'anticorps, des ligands de récepteurs cellulaires ou des fragments de ceux-ci, des récepteurs ou des fragments de récepteurs. En particulier, il peut s'agir de ligands de récepteurs de facteurs de croissance, de cytokines, de lectines cellulaires ou de protéines d'adhésion. On peut également citer le récepteur de la transferrine. des IIDL et des LDL. L'élément de ciblage peut également être la partie sucre permettant de cibler le récepteur du fragment Fc des immunoglobulines.

L'élément de ciblage est avantageusement lié au complexe selon l'invention, de façon directe ou indirecte, par l'intermédiaire de liaisons covalentes et/ou non-covalentes, selon les techniques standards connues de l'homme du métier. De préférence, l'agent de ciblage est fixé sur le polymère cationique ou anionique de façon à être exposé à la surface du polyplexe selon l'invention, en particulier un polyplexe MonoADN, pour obtenir une efficacité de ciblage maximale du complexe selon l'invention. Les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie orale, parentérale, notamment intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée, sublinguale ; locale, notamment topique, transdermique, rectale, vaginale, intraoculaire, intranasale ; intratumorale, ou par inhalation. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, pour une administration par inhalation (aérosol), ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir de solutions stériles isotoniques ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettant la constitution de solutés injectables.

Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. Les complexes et compositions selon l'invention peuvent être utilisés pour le transfert de molécules d'intérêt chargées, notamment d'acides nucléiques dans les cellules in vivo, in vitro ou ex vivo. En particulier, du fait de leur toxicité réduite et de leur efficacité de transfection, les complexes selon l'invention peuvent être utilisés pour transférer de manière efficace des acides nucléiques dans de nombreux types cellulaires habituellement difficiles à transfecter, notamment des lignées cellulaires primaires et des cellules fragiles, particulièrement sensibles à la toxicité des agents de transfection.

Ainsi, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un complexe selon la présente invention pour transfecter des cellules, in vitro ou ex vivo. La présente invention a également pour objet un procédé pour transférer in vitro ou ex vivo une molécule d'intérêt chargée, notamment un acide nucléique, en particulier un plasmide, dans des cellules, ledit procédé comprenant la mise en contact desdites cellules avec au moins un complexe selon la présente invention ou une composition pharmaceutique selon l'invention. Les cellules peuvent être d'origine procaryote ou eucaryote, en particulier animale, végétale ou humaine.

Avantageusement, les cellules sont des cellules de mammifères, de façon avantageuse choisies parmi : des cellules souches hématopoïétiques, des cellules du système immunitaire, telles que des cellules dendritiques, des macrophages et des lymphocytes ; des cellules du foie ; des cellules des muscles squelettiques ; des cellules de la peau telles que des fibroblastes, des kératinocytes, des cellules dendritiques et des mélanocytes ; des cellules des vaisseaux et microvaisseaux sanguins, telles que des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses ; des cellules épithéliales des voies aériennes ; des cellules du système nerveux central ; des cellules cancéreuses ; des cellules du tissu conjonctif, telles que des ténocytes. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la méthode de transfection ou l'utilisation du complexe ou de la composition pharmaceutique selon l'invention pour la transfection in vitro ou ex vivo se caractérisent en ce que l'on met en présence le complexe ou la composition dans un milieu contenant des cellules à transfecter, dans des conditions telles que le complexe passe au travers de la membrane plasmique des cellules et libère la molécule d'intérêt chargée, notamment l'acide nucléique, en particulier le plasmide, dans le cytoplasme et/ou le noyau des cellules. L'acide nucléique ainsi libéré dans les cellules est transcrit et la protéine correspondante exprimée dans la cellule. La présente invention a en outre pour objet un complexe selon l'invention pour son utilisation comme médicament.

L'invention englobe également un complexe selon l'invention pour son utilisation dans le traitement d'une maladie génétique héréditaire ou acquise. La maladie génétique héréditaire est de préférence une maladie monogénique telle que de façon non-limitative les syndromes de déficit immunitaire combiné sévère (SCID), la mucoviscidose, l'hémophilie, la drépanocytose, la béta-thalassémie et la dystrophie musculaire de Duchenne. La maladie génétique acquise inclut les cancers et les infections par des microorganismes pathogènes tels que notamment des bactéries, virus ou parasites pathogènes. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure I illustre le principe de la formation de polyplexes selon le procédé de l'invention, en utilisant comme exemple les polyplexes monoplasmidiques (MonoADN). - la figure 2 illustre le procédé de formulation des polyplexes par extrusion de plasmide. la figure 3 représente l'analyse par diffusion dynamique de la lumière (DLS) du diamètre des polyplexes d'ADN du phage lambda et de polyéthyléneimine linéaire, non modifiée (1-PEI) ou modifiée par des groupements histidyles (1-PEI-Histidine 16 %), préparés selon le procédé d'extrusion de l'invention : -figure 3a. Diamètre des polyplexes en fonction du diamètre des pores de la membrane d'extrusion (15 nm à 1000 nm), à une pression de 120 mbars. -figure 3b. Diamètre des polyplexes en fonction du diamètre des pores de la membrane d'extrusion (15 nm à 1000 nm), à une pression de 2 bars. -figure 3c. Diamètre des polyplexes en fonction du rapport massique (pg/pg) entre le polymère et l'ADN, N/P (1 à 6), à une pression de 2 bars, en utilisant une membrane d'extrusion avec des pores de 50 nm. - la figure 4 représente des images de microscopie électronique en transmission (TEM) de polyplexes monoADN formés par extrusion d'une solution de plasmide d'environ 9500 paires de bases dans une solution de polycations de IPEI 30 greffée histidine (16% de greffage) avec un rapport de charge ADN : Polymère de 1 : 1. Les pores utilisés ont un diamètre de 50 nm et la pression d'extrusion est de 2 bars. A. images de TEM en coloration négative des polyplexes formulés en milieu dilué (0,1 pg/pL d'ADN). La barre d'échelle sur l'image de gauche représente 50 nm. La barre d'échelle sur l'image de droite représente 150 nm. L'image du polyplexe montre en clair les parties anioniques et en foncé les parties cationiques. B. image de CryoTEM des polyplexes formulés en milieu concentré (2 pg4tL d'ADN). La barre d'échelle représente 100 nnt. - la figure 5 représente la mesure par diffusion dynamique de la lumière du diamètre des polyplexes monoADN à base de plasmide et de polymère cationique (1-PEI-Histidine 16 %) préparés selon le procédé d'extrusion de l'invention, en utilisant des concentrations croissantes (0,1 à 2 mg/mi) de deux plasmides (ADNp 1 : 9,6 kb et ADNp 2 : 5,9 kb). - la figure 6 représente la mesure de l'activité luciférase (RLU) après transfection de cellules Hela avec des polyplexes MonoADN préparés selon le procédé d'extrusion de l'invention, en utilisant un plasmide de 9500 paires de base (2,5 ug) codant pour la luciférase (pCMVLuc) et différents polymères cationiques : polyéthylénimine linéaire comprenant 0, 6 ou 14 % de momomères histidylés (1PEI, 6 % ou 14 %), avec un rapport N/P (rapport massique (ug/pg) entre le polymère et l'ADN) variable, compris entre 1 et 6, par comparaison avec des polyplexes obtenus par le procédé de formulation standard (N/P=6). - la figure 7 représente la mesure de la toxicité induite par la transfection de cellules HeLa avec des polyplexes issus de la complexation de l'ADN (2,5pg ou 5pg) par plusieurs types de polymères cationiques : polyéthylénimine linéaire non-modifiée (1PEI) et polyéthylénimine linéaire comprenant 6 ou 14 % de momomères histidylés (1PEI-Histidine 6 % et 1PEI-Histidine 14 %), selon la formulation standard (rapport massique (tg/tg) entre le polymère et l'ADN, N/P =6 et la formulation par extrusion (rapport massique (pg/ug) entre le polymère et l'ADN, N/P=3) EXEMPLE 1: 1VIATERIELS ET METHODES 1) Matériels - Polymères cationiques Deux polymères cationiques standards ont été testé: - polyéthylénimine linéaire, 11PEI (jetPEIO, POLYPLUS TRANSFECTION) et - polyéthylénimine linéaire histidylée (1PEI-His) telle que décrite dans la Demande WO 2009/112402 et commercialisée par POLYTHERA.GENE : 1PEI-His comprenant 6, 14, 16 ou 30% de momomères histidylés, également dénommée PTG16, PTG114 PTG116, PTG130 ou 1PEI-Histidine 6 %, 1PEI-Histidine 14 %, 1PEI-Histidine 16 % et 1PEI-Histidine 30 %, respectivement. - Acides nucléiques ADN linéaire de phage lambda (48 kb) ; plasmide de 9,6 kb ; plasmide de 5,9 kb ; plasmide pCMV-lue codant pour le gène de la luciferase (Luc) de lampyre (Photinus pyralis) sous le contrôle du promoteur du cytomegalovirus humain (CMV ; pTG11033, 9514 bp, Transgène S.A., Strasbourg, France) : - Cellules Les cellules HeLa (CCL2, ATCC, Rockville MD, USA) sont maintenues en culture par passage régulier dans du milieu MEM (Gibco, Invitrogen SARL, CergyPontoise, France) contenant 10% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur, 2 mM 1-glutamine et 100 U/mL de penicilline et 50 U/mL de streptomycine (Gibco). 2) Méthodes - Extrusion du plasmide dans la solution de polymère cationique L'extrudeuse est de type pneumatique (LiposoFastTm ; AVESTIN).

Les seringues et pré-filtres support du système d'extrusion sont nettoyés par sinisation dans l'éthanol puis rincés à l'eau doublement dé-ionisée. La membrane poreuse en polycarbonate (Nucleporen4 ; WHATMANe) est préalablement trempée dans l'éthanol quelques secondes puis dans l'eau afin d'assurer le remplissage des pores. Les seringues (d'une contenance de lmL) sont remplies au maximum jusqu'à moitié.

Ainsi après extrusion le volume ne dépassera pas la contenance de la seringue trans. Les solutions d'ADN et de polyélectrolytes positifs sont placées dans chaque seringue. Les pré-filtres support de l'extrudeuse sont insérés dans l'embouchure de chaque seringue. La membrane poreuse est placée sans la sécher sur l'un des pré-filtres et les deux seringues sont montées sur l'extrudeuse pneumatique. L'activation de l'extrudeuse, injecte une solution dans l'autre au travers de la membrane poreuse. Puis les seringues sont démontées de l'extrudeuse et les polyplexes formés sont récupérés dans la seringue remplie. - Mesure de la taille des particules par Diffitsion dynamique de la lumière (DLS pour Dynamic Light Scattering) Les solutions de polyplexes sont diluées de façon à obtenir 1 mL de solution puis analysées par un Zetasizer Nano (MALVERN, Malvem Instrument, France, Laser rouge : 633 nm, angle 173°) utilisant la diffusion de la lumière dynamique, d'après la diffusion des particules. - Analyse des particules par microscopie électronique en transmission (TEM pour Transmission Electron Microscopy) CryoTEM Une grille de carbone Quantifoil (Jena, Allemagne) est ionisée par décharge électrique et 5 !JI de polyplexes y sont déposés. La grille est rapidement imergée dans de l'éthane liquide par un cryoplongeur puis stockée dans l'azote liquide avant analyse. L'échantillon congelé est alors introduit dans un microscope électronique à transmission de précision JEOL 2011 par un porte échantillon cryogénique. Les polyplexes sont imagés à 200 kV en utilisant une dose d'exposition minimale pour garder le film intact et permettre un grossissement de 50,000X. Les photographies sont digitalisées à 4000 points par pouce par un scanner Nikon CoolScan. - Visualisation des molécules d'ADN franchissant les pores La méthode utilisée est celle précédemment décrite (Auger et al., Physical Review Letters ; 9 juillet 2014, 113, 028302.1-5). - Test de cytotoxicité (MIT) Après incubation des cellules avec les polyplexes pendant 48h, 100 jti d'une solution de 3 (4,5-diméthylthiazol-2-y1) -2,5-diphényltétrazolium (MTT) à 5 mg/ml dans du PBS sont ajoutés par puits de culture, et les cellules sont incubées pendant 4 h à 37 °C. Le MTT qui a été converti en formazan est solubilisé par la suite avec de l'isopropanol acide. La cytotoxicité a été déterminée en mesurant l'absorbance à 570 mn avec un spectrophotomètre Victor I (PerkinElmer, Courtaboeuf, France) et exprimée en pourcentage de l'absorbance des cellules incubées avec les polyplexes par rapport à l'absorbance des cellules incubées sans polyplexes. - Test de mesure de l'activité luciférase L'efficacité de transfection est quantifiée après 48 h de culture en mesurant l'activité de la luciférase dans les lysats cellulaires comme suit. Le milieu de culture est éliminé et les cellules sont lysées à la température ambiante pendant 10 min dans du tampon de lyse (1% de Triton X-100, 25 mM de Tris-phosphate, 1 mM de DTT, 1 mM EDTA, 15% glycérol, 1 mM MgC12, pH 7,8). Le substrat de la luciférase (Beetle luciférine, Promega, Madison, USA) est ajouté au surnageant de lysat en présence de 1 mM d'ATP. L'activité luciférase est mesurée en utilisant un luminomètre (Lumat LB 9507, Berthold, Thoiry, France) et exprimée en RLU par mg de protéine après normalisation des protéines en utilisant le test colorimétrique BCA et la sérum-albumine bovine. EXEMPLE 2: PREPARATION DE POLYPLEXES MONO-ADN Des polyplexes monoplasmidiques ont été préparés selon la méthode décrite à l'exemple 1 dont le principe et les conditions de mise en oeuvre sont schématisés sur les figures 1 et 2. Typiquement, deux compartiments séparés par une surface poreuse sont respectivement remplis d'une solution d'ADN et de polymère cationique. L'ADN est extrudé vers la solution de polymère cationique, provoquant ainsi la condensation des macromolécules d'ADN, une à une (Figure 1). Les concentrations d'ADN plasmidique et de polymère utilisées dans ce travail sont répertoriées sur la figure 2. Il a été montré qu'une pression d'extrusion de 2 bars est suffisante pour permettre la translocation d'ADN linéaire du phage lambda (48 kb) au rayon de giration de l'ordre de 650 nm ou de plasmide de taille élevée, au travers de pores de 50 mn de diamètre. Les expériences réalisées avec l'ADN de ce virus ont montré que cet ADN était capable de passer à travers un pore d'environ 50 nm (figure 3a et 3b) ; ceci implique qu'une contrainte est exercée sur la molécule lors du franchissement. Cependant, 90% de l'ADN passe effectivement le pore. Le diamètre du pore a été varié entre 15 nm et 1000 nm, et il semble que le meilleur diamètre de pore soit autour des 50 nm, pour les plasmides. Il est probable que le diamètre des pores doive être adapté à la taille du plasmide à transloquer. La nature de la membrane importe peu.

Par microscopie, des molécules de plasmide franchissant les pores ont été visualisées ; en conclusion de cette étude, on peut affirmer qu'une unique molécule de plasmide passe le pore à la fois. La caractérisation en imagerie par microscopie électronique en transmission (TEM) en coloration négative a démontré que ces polyplexes sont formés d'un coeur riche en ADN (en clair les parties anioniques) et une couronne riche en polycations (en foncé les parties cationiques) (Figure 4). En outre, la taille mesurée du polyplexes est inférieure à celle théorique de deux molécules de plasmide condensées, indiquant que les polyplexes comprennent une seule molécule de plasmide par nanoparti cule. En variant les rapports N / P (rapports en masse de polymère / ADN, il a été observé que les polyplexes conservaient une taille constante, attestant de l'avantage de la méthode d'extrusion (figure 3c). De même, en faisant varier la concentration en ADN plasmidique, on obtient des polyplexes de taille comparable (figures 4 et 5). Les polyplexes formés avec du PEI-His sont plus petits, plus sphériques, et contiennent de l'ADN sous forme amorphe ; au contraire, ceux formés avec du PET seront plus gros, non-sphériques (apparition de renflements), et contiennent de l'ADN sous forme compactée (peut s'agréger dans le cytosol après la transfection). Les polyplexes conservent leur forme, même 3 jours après leur formation; ceci indique une grande stabilité des polyplexes préparés selon le procédé d'extrusion de l'invention. Par comparaison, les polyplexes produits par le procédé standard sont peu stables (quelques heures seulement) et doivent donc être utilisés rapidement après leur préparation. EXEMPLE 3: TRANSFECTION IN VITRO AVEC LES POLYPLEXES MONO-ADN Les nanoparticules préparées selon le procédé d'extrusion décrit à l'exemple 1 ont été utilisées pour effectuer des tests de transfection sur des cellules Hela selon un protocole d'incubation de 4 heures, suivi de 48h de culture (conditions de formulation : pores : 50 nm ; P : 2 bars). Les résultats de transfection sont reportés sur la figure 6. Les polyplexes utilisés dans cette étude avaient différents rapports rapport massique (ug/ug) entre le polymère et l'ADN, N/P = 1, 2, 3 et 6). Les transfections sont évaluées par rapport au mode de foimulation standard avec un rapport 1/6. On observe que les diamètres moyens des nanoparticules mesurés 5 par Diffusion dynamique de la lumière (DLS pour Dynamic Light Scattering) sont inférieurs à 60 nm pour N/P = 6, quel que soit le polymère cationique utilisé. Ce diamètre est maintenu lorsque l'on diminue le rapport N/P jusqu'à 3 sauf pour la IPEI, et tend vers des valeurs proches de 150 nm pour N/P =1. De façon très surprenante, aucune précipitation n'est observée lorsque N/P=1, ce qui confiime les observations 10 faites par TEM, à savoir des particules non-homogènes probablement de type coeur-couronne. Les niveaux de transfection des polyplexes monoplasmidiques sont de l'ordre de ceux obtenus dans le cas d'une formulation standard, ce qui est tout à fait performant sauf pour la 1PEI avec laquelle les transfections sont moins efficaces. L'évaluation de la toxicité des formulations menée avec des 15 polyplexes obtenus par formulation classique et des polyplexes obtenus par formulation par extrusion a été conduite par le test MTT (Figure 7). Les résultats obtenus sur différents polymères, à différentes concentration en ADN montrent que les polyplexes monoplasmidiques sont moins toxiques que les nanoparticules issues de formulations standard. 20 D'un point de vue général, la toxicité induite par les polyplexes monoplasmidiques est significativement inférieure à celle des polyplexes standards, ouvrant de nouvelles perspectives pour le transfert de gènes in vivo. EXEMPLE 4: TRANSFECTION IN VIVO AVEC LES POLYPLEXES MONO-ADN 25 Des études in vivo ont également été menées pour évaluer l'efficacité de transfection des polyplexes produits par la méthode de l'invention. Des polyplexes contenant 40gg de plasmide codant pour la Luciférase ont été préparés selon le procédé décrit à l'exemple 1, puis injectés dans la veine caudale de souris. L'injection de Luciférine permet alors de détecter les cellules qui ont été transfectées 30 et expriment le gène luciférase. Les résultats de ces expériences montrent que les particules vont en majorité dans les poumons (capillaires fins), mais également dans la rate ou la vessie (prise en charge par le système de détoxification).

Conclusions La méthode de formulation d'ADN proposée dans cette étude permet d'obtenir des polyplexes monoplasmidiques ayant des niveaux de transfection in vitro équivalents à ceux obtenus dans le cas de formulation standard. Les nanoparticules obtenues semblent être de type coeur-couronne, ce qui est important pour une question de ciblage et de furtivité dans les applications in vivo. La toxicité déterminée est plus faible que dans le cas d'une formulation classique, et on peut s'attendre à ce que ce type de formulation limite les questions d'embolie pulmonaire lors d'injection IV dans les souris, et donc une diminution significative de la toxicité in vivo.

Claims (15)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation de complexes de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes: - la distribution d'une solution de molécules d'intérêt chargées dans un premier compartiment séparé d'un deuxième compartiment par une surface poreuse, et ledit deuxième compartiment comprenant une solution de polymère(s) de charge opposée, et - l'extrusion des molécules d'intérêt chargées, une à une, au travers de ladite surface poreuse vers la solution de polymère(s) de charge opposée pour former des complexes entre le(s) polymère(s) chargé(s) et une seule molécule d'intérêt de charge opposée.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la dite surface est une membrane comprenant des pores d'une taille de 5 à 200 mn.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'extrusion est réalisée à une pression comprise entre 10 mbar et 3 bars.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit polymère est un polymère cationique.
5. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit polymère cationique est une polyéthylèneimine linéaire.
6. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite polyéthylèneimine est partiellement histidylée.
7. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite molécule d'intérêt est un acide nucléique.
8. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit acide nucléique est un plasmide.
9. 9. Complexe de polymère(s) cationique(s) et d'une seule molécule d'acide nucléique.
10. 10. Complexe de polymère(s) chargé(s) et d'une seule molécule d'intérêt de charge opposée, obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
11. 11. Complexe selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un complexe de polymère(s) cationique(s) tel(s) que défini(s) à l'une quelconque des revendications 4 à 6 et d'un acide nucléique tel que défini à l'une quelconque des revendications 7 à 8.
12. 12. Complexe selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une particule de taille inférieure à 70 nm.
13. 13. Utilisation d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 pour transfecter des cellules, in vitro ou ex vivo.
14. 14. Complexe selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 pour 10 son utilisation comme médicament.
15. 15. Complexe selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 pour son utilisation dans le traitement d'une maladie génétique ou acquise.