FR3024363A1

FR3024363A1 - Composition thermogelifiable

Info

Publication number: FR3024363A1
Application number: FR1457547A
Authority: FR
Inventors: Mickael Chausson; Renaud Lecler
Original assignee: Synolyne Pharma SA
Current assignee: SYNOLYNE PHARMA, BE
Priority date: 2014-08-01
Filing date: 2014-08-01
Publication date: 2016-02-05
Anticipated expiration: 2034-08-01
Also published as: CN106714780A; US9901543B2; CA2956789A1; FR3024363B1; EP3016662A1; WO2016016463A1; US20170135952A1

Abstract

L'invention concerne une composition thermogélifiable comprenant un chitosane présentant des unités N-acétyl--glucosamine, des unités glucosamine, et des unités glucosamine substituées autres que les unités N-acétyl- glucosamine, ledit chitosane substitué présentant de préférence un degré de substitution des unités glucosamine allant de 10 à 50%, exprimé en nombre de mole du substituant par rapport au nombre de mole d'unités totales, sa préparation et ses applications.

Description

Composition thermogélifiable La présente invention concerne une composition thermogélifiable. Cette composition est notamment adaptée à son injection, par exemple chez un être humain ou un animal, et plus particulièrement chez un être humain. La présente invention concerne également une méthode de prévention ou de traitement thérapeutique et une méthode de soin esthétique, notamment comprenant l'injection d'une composition thermogélifiable de l'invention. Il est tout à fait connu d'injecter des compositions à base de biopolymères, par exemple l'acide hyaluronique, du fait de ses propriétés viscoélastiques, par exemple pour un traitement thérapeutique. Ce type de composition est notamment utile dans le traitement des douleurs articulaires, en particulier de l'arthrose. Ces compositions sont également connues pour réaliser le comblement de tissu, tel que le derme. Ce comblement peut intervenir dans un but esthétique ou dans le cadre d'un traitement de chirurgie réparatrice. Il est également connu d'utiliser des compositions à base de chitosane comme biopolymère pour la réparation tissulaire, en particulier la réparation de défauts du cartilage en mélange avec le sang. Il est également connu de préparer et d'utiliser des solutions à base de chitosane associé à des agents qui entraînent une transition sol-gel de la solution à température physiologique, pour l'injection dans des tissus et des articulations. De telles compositions peuvent être utilisées par exemple en injection intra- tissulaire (par exemple sous-cutanée, intra-dermique), intra-articulaire, ou intra-oculaire. Il peut s'agir par exemple de protéger ou de réparer une articulation qui présente des signes d'arthrose et de lésion du cartilage par injection d'un fluide visqueux. Il peut encore s'agit de combler un tissu ou un organe pour favoriser sa réparation ou en augmenter le volume. Pour la fourniture de telles compositions, il se présente généralement le problème technique de pouvoir fournir une composition dont les propriétés physico-chimiques sont proches de celles des tissus ou fluides de la zone d'injection. Cependant il se pose notamment le problème de l'injection de tel fluide visqueux car lorsqu'il présente des propriétés physico-chimiques, proches de celles désirées, par exemple en terme de viscosité, ces compositions sont très difficilement injectables, voire il est impossible de les injecter.

Parmi les solutions recherchées, on peut notamment citer le brevet américain US 6 344 488 qui enseigne la préparation d'une composition thermogélifiable comprenant du chitosane. Cette composition est également très sensible au pH, et peut, selon la valeur du pH, présenter ou non une réversibilité de la transition sol-gel. La réversibilité de la transition sol-gel est importante car elle permet une stérilisation par montée en température. La composition comprend également du glycérol phosphate en concentration plutôt élevée. On note toutefois d'après le tableau 2 de ce brevet que le chitosane à une concentration inférieure à 1,5 % (masse/volume) n'est pas gélifié à 37°C. Or il s'agit de la température corporelle moyenne d'un être humain non fiévreux. Les compositions utilisées présentent une concentration de 2% (m/v). Il est intéressant de fournir une composition comprenant du chitosane en concentration qui puisse être inférieure. Les compositions décrites dans ce brevet présentent un pH d'au maximum 7,05. Il est donc intéressant de fournir une composition comprenant du chitosane présentant un pH plus proche du pH physiologique pour les applications visées. Par ailleurs, le thermogel décrit dans ce brevet ne semble pas pouvoir être stérilisé par la vapeur. Il s'agit donc d'un inconvénient majeur.

Il existe donc le besoin de fournir une composition thermogélifiable à température physiologique d'un être humain présentant de bonnes propriétés viscoélastiques pour des applications thérapeutiques ou esthétiques. L'invention a donc pour but de résoudre ces problèmes techniques. L'invention a notamment pour but de fournir une composition thermogélifiable qui puisse être facilement injectée tout en étant gélifiée à température physiologique d'un être humain. Une telle composition doit présenter de bonnes propriétés physico-chimiques pour des applications thérapeutiques ou esthétiques, en particulier à la température physiologique du corps humain ou animal, par exemple de 37°C pour des usages après implantation. Plus particulièrement, une telle composition devrait pouvoir présenter des propriétés physico-chimiques modulables selon l'application visée pour se rapprocher le plus précisément possible des propriétés nécessaires pour le but thérapeutique ou esthétique visé. L'invention a pour but également de fournir une composition thermogélifiable dont le pH soit acceptable pour les applications thérapeutiques ou esthétiques visées. Plus particulièrement, de telles compositions devraient pouvoir présenter un pH modulable selon l'application visée, notamment pour être le plus proche possible du pH physiologique. La présente invention a également pour but de fournir une composition thermogélifiable dont l'osmolarité est contrôlée et par exemple proche de celle physiologique pour l'application thérapeutique ou esthétique visée, en particulier une osmolarité allant de 200 à 500 mosm/kg.

La présente invention a pour but également de fournir une composition dont la transition sol-gel soit réversible, notamment afin que les conditions de stockage et/ou de transport ne nécessitent pas un contrôle drastique de la température, et/ou subir une stérilisation par montée en température.

L'invention a également pour but, selon une variante, de fournir une composition dont la teneur en biopolymère, et plus précisément en chitosane, est faible. Une telle teneur devrait être inférieure à 5%, de préférence inférieure à 2%, en masse de chitosane par rapport à la masse totale de la composition. Il a été découvert de manière surprenante qu'une telle composition thermogélifiable pouvait être préparée lorsque cette composition comprend un chitosane présentant des unités N-acétyl- glucosamine, des unités glucosamine, et des unités glucosamine substituées autres que les unités N-acétyl- glucosamine, ledit chitosane substitué présentant de préférence un degré de substitution des unités glucosamine allant de 10 à 50%, exprimé en nombre de mole du substituant par rapport au nombre de mole d'unités totales. Selon un mode de réalisation particulier, les unités glucosamine sont des unités D- glucosamine (unités D-glucosamine, unités D-glucosamine substituées, unités N-acétyl-Dglucosamine et éventuellement des unités N-acétyl-D-glucosamine substituées). Selon une variante, le chitosane présente des unités N-acétyl-D-glucosamine, des unités D-glucosamine, et des unités D-glucosamine substituées autres que les unités N- acétyl-D-glucosamine, et éventuellement des unités N-acétyl-D-glucosamine substituées. Par « D-glucosamine substituées autres que les unités N-acétyl-D-glucosamine », on entend que les unités D-glucosamine substituées ne forment pas des unités N-acétylD-glucosamine après substitution.

Selon une variante, un chitosane substitué présente une substitution des unités D- glucosamine uniquement. Selon une autre variante, un chitosane substitué présente une substitution des unités D-glucosamine et N-acétyl-D-glucosamine simultanément, et dans lequel le groupe de substitution est lié de manière covalente, selon une variante aux groupes amine du chitosane uniquement, ou selon une autre variante aux groupes amine et hydroxyle du chitosane simultanément. Selon un mode de réalisation, le degré de substitution des unités D-glucosamine exprimé en nombre de moles d'unités D-glucosamine par rapport au nombre de moles d'unités totales (unités D-glucosamine et N-acétyl-D-glucosamine, substituées ou non) du chitosane substitué, va de 0.1 à 0.5%.

Il a été découvert selon une variante spécifique, qu'un degré de substitution des unités glucosamine, exprimé en nombre de moles d'unités glucosamine sur lesquelles le groupe substituant est attaché par une liaison covalente, par rapport au nombre de moles totales d'unités glucosamine et N-acétyl-glucosamine du chitosane substitué, de 0.1 à 0.5 permettait avantageusement de solubiliser le chitosane substitué, éventuellement en présence d'un agent gélifiant, par exemple un sel de polyol ou de sucre, et plus particulièrement un sel de glycérol phosphate, à un pH et à une température dans une gamme particulièrement adaptée aux applications visées. Il peut être plus simple d'exprimer le degré de substitution par le ratio molaire ou par le ratio massique des réactifs de départ par rapport au chitosane, comme expliqué plus loin. Selon une variante, le chitosane substitué est soluble de par son degré de substitution dans une solution d'eau tamponnée à pH=7, par exemple avec un tampon phosphate salin (PBS), la solution comprenant une concentration de chitosane substitué de 1% en masse par rapport à la masse de la solution totale, le pH étant mesuré à 8°C.

Selon une variante, notamment lorsque le chitosane substitué présente un caractère zwitterionique, il existe une plage de pH étroite dans laquelle le chitosane substitué est insoluble. Cette particularité est contournée par l'ajout d'un agent gélifiant, par exemple sel de polyol ou de sucre, et plus particulièrement sel de glycérol phosphate, pour que le chitosane substitué soit solubilisé au pH considéré d'intérêt pour l'invention.

En substituant le chitosane, il a été possible de préparer une solution d'un chitosane substitué soluble dans une solution aqueuse dont le pH varie dans une large gamme, alors que le chitosane non substitué n'est soluble qu'à pH en dessous de 5,5 à 6,5. La solution aqueuse de chitosane substitué peut présenter en général un pH allant de 6,5 à 8,5. Cette solution selon l'invention peut être gélifiée. La gélification ou transition sol- gel peut donc être réalisée à pH neutre ou à pH physiologique, comme par exemple à un pH compris entre 7 et 8,5, alors que le chitosane n'est pas soluble à pH=7, le pKa des groupes amine étant d'environ 5.5 (et donc non chargé à pH 7 auquel les groupes amine ne sont pas protonés). Le chitosane substitué présente ainsi une capacité à être solubilisé à différents pH grâce à la présence de groupes substituants qui modifient son profil de solubilisation. De manière surprenante il a été possible de préparer des compositions thermogélifiables avec un chitosane substitué, et en particulier à faible concentration de chitosane, en particulier avec un chitosane de très faible, faible, ou moyenne masse moléculaire, tout en présentant une transition sol-gel réversible. Une telle composition comprenant un chitosane substitué présente une transition sol-gel lorsque la température augmente. Ainsi, de manière très avantageuse la transition sol-gel, c'est-à-dire le passage de la solution à l'état fluide à l'état de gel, peut être modulée en fonction du degré de substitution pour que cette transition sol-gel se produise notamment dans des conditions de pH, osmolarité, et température désirées. L'invention permet donc avantageusement, selon une variante, de préparer une composition thermogélifiable fluide à une température inférieure à celle d'utilisation, typiquement à une température inférieure à la température physiologique, par exemple de 37°C, mais qui soit sous forme de gel à la température d'utilisation, typiquement à la température physiologique, par exemple de 37°C, à pH neutre (pH=7) ou à pH physiologique, et par exemple de 7à 8,5, avec une osmolarité convenable pour l'utilisation envisagée. Il s'agit par exemple d'une osmolarité physiologique.

On entend par « composition thermogélifiable » ou « thermo-gel » un fluide, et notamment une solution qui présente la propriété de subir une transition sol-gel par modification de la température, de préférence par augmentation de la température, et de préférence encore par augmentation de la température jusqu'à la température physiologique du corps humain ou animal, et ainsi se présenter sous la forme d'un gel à température physiologique après injection ou implantation. La composition thermogélifiable de l'invention peut se présenter sous forme d'hydrogel, c'est-à-dire de gel aqueux. Selon la présente invention, on entend par gel une composition ne s'écoulant pas sous son propre poids, et plus spécifiquement ne présentant aucun écoulement en l'absence de stimuli extérieur par retournement d'un récipient contenant la composition par exemple pendant 30 secondes, et caractérisée par un module élastique G' supérieur au module de perte G", les modules étant mesurés par rhéologie à l'aide d'un rhéomètre de géométrie « Couette ». La différence entre les modules G' et G" du gel sont caractéristiques de la cohésion du gel.

Selon la présente invention, on entend par « fluide » une composition dont s'écoulant sous son propre poids par retournement d'un récipient contenant la composition par exemple pendant 30 secondes et caractérisée par un module élastique G' inférieur au module de perte G", les modules étant mesurés par rhéologie à l'aide d'un rhéomètre à rotation avec cisaillement de Couette (cisaillement du fluide entre deux cylindres coaxiaux). Avantageusement, il a été découvert que le degré de substitution des unités Dglucosamine permet de moduler la transition sol-gel. Ainsi l'invention permet avantageusement de fournir une composition thermogélifiable dans laquelle le degré minimal de substitution du chitosane est choisi de manière à ce que le chitosane substitué soit soluble dans la composition thermogélifiable. On peut aussi vérifier la solubilité dans différents tampons. Par « soluble dans l'eau », on entend que le chitosane substitué ne présente pas de trouble visible à l'oeil nu. Plus spécifiquement, on peut confirmer l'absence de trouble par une densité optique inférieure à 0,5, et de préférence inférieure à 0,2, mesurée par spectrométrie UV-visible à la longueur d'onde de 600nm d'un échantillon comprenant de l'eau éventuellement tamponnée par un tampon au pH concerné, par exemple comme l'acétate de sodium à 0,5M, en référence à une cuve de référence ne comprenant que le solvant aqueux utilisé pour l'échantillon mesuré, mais en l'absence du chitosane substitué. Lorsque le chitosane n'est pas suffisamment substitué, la composition n'est pas soluble dans une gamme de pH satisfaisante, par exemple allant de pH=7 et pH=8,5, à température ambiante, et par conséquent n'est pas non plus thermogélifiable lorsqu'on augmente la température. L'invention permet de fournir une composition thermogélifiable dans laquelle le degré maximal de substitution du chitosane est choisi pour qu'une transition sol-gel s'effectue à une température inférieure à la température d'utilisation, de préférence inférieure à la température physiologique, par exemple à la température de 37°C. La transition sol-gel peut se constater par le croisement des modules G' et G" selon la méthode définie dans l'invention. Avantageusement, le degré de substitution est déterminé par spectrométrie de résonance magnétique (RMN) du proton en solution en milieu aqueux, à l'aide d'un spectromètre de résonance magnétique, par exemple un spectromètre Bruker de fréquence 400 MHz. Les échantillons sont préparés de la manière suivante : 5 à 6mg de chitosane substitué sont dissout dans 1 ml d'eau deutérée. 21.11_ de d'acide chlorhydrique deutéré de concentration 12M sont ajoutés à la solution du chitosane substitué afin d'atteindre une zone de pH appropriée pour l'analyse. La zone de pH appropriée dépend de la nature du substituant. Le spectre est enregistré à une température de 70°C, avec un nombre de scans allant de 64 à 256 et un temps de relaxation allant de 1 à 8 secondes. Le spectre obtenu est traité par déconvolution afin de déterminer la valeur de l'intégrale des aires des signaux d'intérêt pour pouvoir calculer le degré de substitution du chitosane substitué. La méthode de préparation de l'échantillon, les conditions d'enregistrement du spectre RMN, et la formule utilisée pour calculer le degré de substitution doivent être adaptés à chaque type de chitosane substitué, car ils dépendent de la nature et de la position du substituant. Un exemple de calcul du degré de substitution (DS) est donné ci-dessous pour le cas du chitosane substitué par un groupe succinyle lié au groupe amine des unités D- glucosamine (chitosane succinamide, Formule 1). Les abréviations sont les suivantes : 4/2 est égal à l'intégrale de l'aire du signal du proton des unités D-glucosamine en position 2 ; /cH2 succi est égal à l'intégrale de l'aire du signal des protons des deux groupes -CH2 des substituant succinyle liés aux unités D-glucosamine (sur les atomes de carbone en position alpha et beta de la fonction amide) ; ICH3 acétyle est égal à l'intégrale de l'aire du signal des protons des groupes acétyle des unités N-acétyl-D-glucosamine.

Un exemple de spectre RMN du chitosane succinamide et la formule développée du chitosane succinamide sont illustrés sur la Figure 1. Formule 1- Calcul du degré de substitution du chitosane substitué par un groupe succinyle par RMN du proton Si une autre méthode RMN et plus avantageuse pour estimer le degré de substitution de manière fiable, il convient d'utiliser une telle méthode. La formule ci-dessus doit être adaptée par l'homme du métier en ce qui concerne la préparation de l'échantillon et les signaux à intégrer, notamment en fonction de la résolution, de la robustesse et de la position des protons des signaux à utiliser pour le calcul du degré de substitution. Avantageusement, la composition présente une transition sol-gel thermoréversible.

Avantageusement, la présente invention permet de fournir une composition à faible concentration de chitosane substitué. Avantageusement, la concentration de chitosane est inférieure à 4%, par exemple inférieure à 3%, ou encore par exemple inférieure à 2% en masse par rapport à la masse totale de la composition (m/m).

Selon une variante spécifique, la concentration de chitosane substitué est inférieure à 1,9% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse de la composition finale. Avantageusement, la concentration de chitosane substitué est comprise entre 0,5 et 1,5% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse de la composition finale. Selon une variante particulière, la concentration de chitosane substitué est environ de 1,2% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse de la composition finale. Selon une variante particulière, la concentration de chitosane substitué est environ de 1,1% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse de la composition finale. Selon une variante particulière, la concentration de chitosane substitué est environ de 1,0% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse de la composition finale.

Selon une variante particulière, la concentration de chitosane substitué est environ de 0,9% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse de la composition finale. Par ailleurs, le degré de substitution des unités D-glucosamine permet avantageusement de ne pas utiliser une solution à pH acide (typiquement 5,0 à 5,5) pour solubiliser le chitosane puis de devoir nécessairement ajouter un sel de sucre ou de polyol, comme le glycérol phosphate, pour augmenter le pH jusqu'à environ 7. Au contraire, la présente invention permet avantageusement de préparer directement une solution à pH neutre ou à pH physiologique, comme par exemple de 6,2 à 8,5, dans laquelle le chitosane substitué est soluble et présente donc l'avantage également par exemple de n'avoir pas nécessairement besoin d'ajouter une solution acide pour solubiliser le chitosane. Ceci présente l'avantage d'assurer une liberté bien plus importante sur la gamme de pH utilisable pour la composition thermogélifiable, et ainsi préparer des compositions thermogélifiable à pH neutre ou physiologique Selon une variante, la composition comprend un agent gélifiant, de préférence un agent gélifiant induisant une transition sol-gel de la composition, par exemple un sel de glycérol phosphate par exemple sous la forme sodium ou calcium, par exemple sous sa forme pentahydrate, ledit agent gélifiant étant de préférence présent dans la composition à une concentration comprise entre 1 et 20%, de préférence 3 et 9%, en masse par rapport à la masse totale de la composition finale (m/m).

L'agent gélifiant est avantageusement au moins un sel de polyol ou de sucre, y compris l'un quelconque de leurs mélanges. Parmi les sels de polyol ou de sucre on peut citer notamment les sels de phosphate, et plus particulièrement les sels dibasiques de mono-phosphate de polyol ou de sucre. On peut également citer les sels de sulfate comme par exemple les sels de mono-sulfate de polyol ou de sucre. Parmi les sels de phosphate on peut notamment citer les mono-phosphates dibasiques de glycérol, incluant le glycérol-2-phosphate, le snglycérol-3-phosphate et le 1-glycérol-3-phosphate. Selon une variante, il s'agit du betaglycérol phosphate. Parmi les polyol et sucres pour de tels sels, on peut citer les polyols et sucres suivants: histidinol, acetol, diethylstilbestrol, indoleglycerol, sorbitol, ribitol, xylitol, arabinitol, erythritol, inositol, mannitol, glucitol, palmitoyl-glycerol, linoleoyl-glycerol, oleoyl-glycerol, arachidonoyl-glycerol, fructose, galactose, ribose, glucose, xylose, rhamnulose, sorbose, erythrulose, deoxy-ribose, ketose, mannose, arabinose, fuculose, fructopyranose, ketoglucose, sedoheptulose, trehalose, tagatose, sucrose, allose, threose, xylulose, hexose, methylthio-ribose or methylthio-deoxy-ribulose, ou l'un quelconque de leurs mélanges.

Selon une variante spécifique la concentration de sel de polyol ou de sucre, et de préférence de glycérol, est comprise entre 1 et 10%. Avantageusement, la concentration de sel de polyol ou de sucre, et de préférence de glycérol, est comprise entre 1 et 7%. Avantageusement, la concentration de sel de polyol ou de sucre est de 2% à 5%. Les valeurs sont exprimées en masse par rapport en masse totale de la composition. Selon une variante, le sel de glycérol est un glycérol phosphate, et plus précisément un sel de sodium, comme par exemple le disodium glycérol phosphate. Le sel de polyol ou de sucre, et de préférence le glycérol phosphate, est utilisé pour amener le pH à un pH basique, puis le pH de la composition est ajusté par l'ajout d'un acide, ce qui présente l'avantage de fournir une composition thermogélifiable dont le pH est modulable très facilement et précisément. Ainsi, la composition selon l'invention présente un pH supérieur ou égal à 7, par exemple supérieur ou égal à 7,1, et par exemple un pH de 7,2 à 8,5. Le pH est mesuré sur la composition thermogélifiable finale de sous forme de solution, c'est-à-dire avant la transition sol-gel. Le pH est déterminé en suivant la méthode décrite dans la pharmacopée européenne (EP 2.2.3). Le pH-mètre utilisé est un pH-mètre de la gamme Sartorius muni d'une électrode combiné en verre (PY-P11). Les mesures de pH sont réalisées entre 20 et 25 °C. Avantageusement, le pH est ajustable dans la gamme large allant de 6,5 à 8,0.

Selon une variante, le pH est supérieur à 7,40. Selon une variante spécifique, le pH est de 7,50 +/- 0,05. Selon une autre variante spécifique, le pH est de 7,20 +/- 0,05. Selon une autre variante spécifique, le pH est de 7,00 +/- 0,05. Selon une variante préférée, la composition de l'invention présente une transition sol-gel une température supérieure à 30°C, de préférence à une température comprise entre 30 et 50°C, et de préférence entre 32 et 45°C, et encore de préférence entre 35 et 40 °C. Avantageusement, la composition thermogélifiable de l'invention est sous forme fluide à température ambiante, c'est-à-dire entre 20 et 25°C.

Selon une variante préférée, la composition de l'invention est fluide à une température inférieure à 37°C, de préférence à une température inférieure à 35°C, et encore de préférence à une température comprise entre 2°C et 20°C. Selon une variante, la composition de l'invention est fluide à la température de conservation, par exemple de 2 à 8°C, ou à température ambiante étendue, par exemple entre 15 et 30°C.

Selon un mode de réalisation, la composition présente une osmolarité de 100 à 700mosm/kg, de préférence de 200 à 500mosm/kg.

Selon une variante, la composition thermogélifiable selon l'invention est isoosmolaire. Selon une variante, lorsque la composition de l'invention est destinée à être injectée dans le plasma d'un être humain, il est préférable que l'osmolarité soit comprise entre 250 et 400, et plus spécifiquement entre 280 et 350mosm/kg. Selon une autre variante, lorsque la composition de l'invention est destinée à être injectée dans le liquide synovial d'un être humain, il est préférable que l'osmolarité soit comprise entre 300 et 490, et de préférence entre 360 et 470mosm/kg. La détermination de l'osmolarité des solutions est effectuée avec un micro- osmomètre automatique (Osmometer Type 15M de la marque Leiser Messtechnik). L'équipement est préalablement calibré avec une solution de 300mosm/kg. L'échantillon est placé dans un récipient prévu à cet effet, et est mis à la température standard de la mesure. Avantageusement, la composition thermogélifiable de l'invention composition présente à l'état fluide une viscosité apparente dynamique comprise entre 20 et 800mPa.s, par exemple de 40 à 500mPa.s. La viscosité apparente dynamique est mesurée à l'aide d'un viscosimètre à mobile tournant, par exemple un viscosimètre à mobile tournant de la marque Brookfield, par exemple muni d'une aiguille (« spindle ») de type S18 à une vitesse de 5 tour/min et à une température de 8°C. Selon une variante, la composition de l'invention présente une viscosité apparente permettant une injection facile dans un dispositif d'injection comme par exemple une seringue, lors de son remplissage. Selon une variante, la composition de l'invention présente une viscosité apparente permettant une injection facile au travers d'une aiguille fine, par exemple une seringue de 22 Gauge, à température ambiante. Par injection « facile », on entend de préférence que la force à exercer sur une telle seringue est inférieure à 50 Newton pour faire écouler la composition thermogélifiable au travers d'une aiguille de 22 Gauge, de préférence une force inférieure à 20 Newton. La composition thermogélifiable selon l'invention peut être diluée, par exemple dans de l'eau, éventuellement tamponnée. On peut par exemple diluer la composition de l'invention dans un tampon permettant d'ajuster le pH à un pH physiologique. Plus particulièrement on peut par exemple diluer la composition de l'invention dans un tampon acétate (par exemple un tampon acétate de sodium trihydrate 10mM) pour ajuster le pH à environ 7,5.

Pour un gel, le module G' est supérieur à G". Pour une solution, le module G' est inférieur à G". La transition sol-gel est caractérisée par le croisement des modules G' et G". Lorsque la solution présente un caractère « thermogélifiable », le module G' devient supérieur au module G" au-delà d'une certaine température, et en particulier à une température inférieure à la température physiologique (c'est-à-dire la température à laquelle le produit est injecté ou implanté) ou après un certain temps après implantation ou injection dans le corps à température physiologique. Le module G' et le module G" se croisent lorsque la température augmente.

Les modules G' et G" sont mesurés par exemple à l'aide d'un rhéomètre à rotation avec cisaillement de Couette qui applique un cisaillement du fluide entre deux cylindres coaxiaux par exemple un rhéomètre ARES de la marque Rheometrics, par exemple avec une fréquence de 1 Hz et une déformation de 5%. On peut faire la mesure des modules G' et G" à une certaine température. La mesure des modules donnée ici est réalisée en partant du produit à une certaine température, par exemple la température de stockage du produit de 4°C. On laisse le produit atteindre une certaine température naturellement, par exemple la température physiologique, par exemple 37°C, sans contrôler la vitesse à laquelle la température augmente. Avantageusement, le module de conservation G' est compris entre 0,001 et 1000, le module de perte G" est compris entre 0,001 et 1000, G' est inférieur à G" à température de stockage et/ou à température ambiante, et G' est supérieur à G" à la température physiologique, par exemple 37°C, après gélification. Avantageusement, les modules de conservation G' et de perte G" se croisent lorsque le produit passe d'une température de conservation dans un réfrigérateur, par exemple 4°C ou d'une température ambiante, par exemple 18°C à 25°C, à une température physiologique, par exemple 37°C, traduisant la transition sol-gel et le caractère thermogélifiable du système, avec une durée de transition sol-gel adaptée à l'application visée. La gélification peut se réaliser par maintient à une température suffisante et pendant une durée suffisante pour gélifier la solution de chitosane. Cette gélification est effectuée par exemple dans une étuve par exemple maintenue à 40°C. Selon la présente invention la gélification peut intervenir in situ, c'est-à-dire par exemple après injection dans le corps humain ou animal (à sang chaud). La gélification permet notamment de positionner le gel de manière localisée.

Plus particulièrement, la durée nécessaire à la transition sol-gel est généralement comprise entre 1 seconde et 48 heures après passage de la température de 4°C (température de stockage) à 37°C (température physiologique), c'est à dire par exemple in situ après injection de la solution dans un corps humain ou animal. Selon une variante, la transition sol-gel est complète après une durée qui varie entre 5 secondes et 24 heures, de préférence moins de 4 heures, de préférence encore moins de 2 heures après le passage de la température de 4°C à 37°C. Selon une autre variante, la gélification intervient instantanément (gélification intervenue dès l'augmentation de température (et avant la mesure). Il ne faut pas que la composition gélifie dans la seringue d'injection mais gélifie in situ à l'emplacement désiré. Il est possible d'effectuer plusieurs cycles de transition sol- gel puisque la composition selon l'invention présente avantageusement une transition sol- gel réversible. Ceci permet avantageusement de stériliser la composition selon l'invention par montée en température, c'est-à-dire typiquement par autoclave. Ceci permet avantageusement de fournir une composition thermogélifiable dont la possibilité d'obtenir la gélification n'est pas affectée par les variations de température, notamment lors du stockage, du transport, ou de la stérilisation. La composition selon la présente invention étant destinée notamment à être injectée, les propriétés de gélification sont adaptées à son injection via une seringue munie d'une aiguille de taille variable en fonction de l'application visée, par exemple de 19 à 25 Gauge, par exemple de 22 Gauge. Habituellement, la personne réalisant l'injection doit appuyer manuellement sur le piston de la seringue. Il faut donc que la résistance à la compression du fluide non gélifié permette une injection la plus facile possible. Une fois injectée la composition doit gélifier pour présenter les propriétés viscoélastiques requises. Selon une variante, la force nécessaire à l'écoulement de la composition fluide dans l'orifice d'une aiguille de 22 Gauge est comprise entre 1 et 20 Newton. De préférence la force du gel est comprise entre 2 et 15 Newton. Selon une variante, la force du gel est comprise entre 2 et 8 Newton. L'injectabilité est mesurée à l'aide d'un banc d'essai pour la mesure de propriétés mécaniques, par exemple de la marque Instron Bluehill, muni d'une cellule de force de 500N. Le système d'injection est conçu spécifiquement pour la mesure de la force nécessaire à réaliser l'injection de la solution en poussant le piston de la seringue, munie de l'aiguille avec le diamètre désiré. Le système présente un cylindre métallique d'une hauteur de 15cm pourvu d'une fente verticale de 4cm de large. Le cylindre est surmonté d'une plaque métallique carrée de 10cm de côté. Cette plaque est pourvue d'un trou en son milieu, de 0,5 cm de rayon. La seringue, munie d'une aiguille de diamètre 22 Gauge est mise à la température de 4°C. On applique une vitesse de descente du piston de la seringue constante de 1 mm par seconde.

Selon une variante, la composition comprend un tampon, par exemple un tampon acétate. Des agents tampon sont connus de l'homme du métier. De préférence, la composition comprend un sucre réducteur, par exemple le mannitol. Selon une variante, la présente invention concerne une composition thermogélifiable comprenant 0.1 à 5% en masse de chitosane substitué, et de préférence de 1 à 7% de sel de polyol ou de sucre, par exemple de glycérol phosphate, et éventuellement de 0,1 à 10% de sucre réducteur. Avantageusement, la composition de la présente invention comprend de 0,1 à 1,9 % en masse de chitosane substitué et de 2 et 6 (3/0 en masse de glycérol, de préférence de glycérol phosphate, et éventuellement de 0,1 à 2,5% en masse de sucre réducteur, par rapport à la masse totale de la composition. Il est avantageux d'utiliser au moins un polyol dans la composition de l'invention (en plus du sel de polyol comme le glycérol phosphate).

De tels polyols peuvent être par exemple choisis parmi le groupe consistant en : isopropanol, sorbitol, mannitol, alkylène glycol comme le propylène glycol, poly(alkyl glycol), par exemple un poly(éthylène glycol), fructose, galactose, ribose, glucose, xylose, rhamnulose, sorbose, erythrulose, deoxy-ribose, ketose, mannose, arabinose, fuculose, fructopyranose, ketoglucose, sedoheptulose, trehalose, tagatose, sucrose, allose, threose, xylulose, hexose, methylthio-ribose, methylthio-deoxy-ribulose, et l'un quelconque de leurs mélanges. Selon une variante spécifique, le réactif qui permet la substitution est l'anhydride succinique. Selon cette variante spécifique, le chitosane substitué est un chitosane succinamide, c'est-à-dire un chitosane avec des groupes « succinyle » liés de manière covalente à l'atome d'azote des groupes amine des unités D-glucosamine. Le chitosane est modifié par substitution selon une réaction impliquant un chitosane et un agent de substitution dans lequel le chitosane et l'agent de substitution sont mis à y réagir pour obtenir le chitosane substitué sur les groupements Dglucosamine.

L'invention concerne également un procédé de préparation de chitosane substitué. Ce procédé comprend notamment : - une étape de dissolution du chitosane dans une solution aqueuse, de préférence de l'eau, de préférence en ajustant le pH à un pH acide auquel le chitosane est soluble; -une étape de réaction de substitution du chitosane avec un agent de substitution ; -une étape d'arrêt de la réaction de substitution de préférence à un degré de substitution du chitosane allant de 10 à 50%, exprimé en nombre de mole du substituant par rapport au nombre de mole d'unités totales, par exemple par modification du pH du milieu réactionnel, ou par précipitation du chitosane dans un « non-solvant » dans lequel le chitosane substitué n'est pas soluble ; -la purification du chitosane substitué.

On entend par « non-solvant » un solvant dans lequel le chitosane situé n'est pas soluble, c'est-à-dire qu'un trouble est observable à l'oeil nu. De tels solvants sont par exemple des solvants polaires comme par exemple l'éthanol, méthanol, l'acétone, etc. L'étape de dissolution du chitosane dans une solution aqueuse peut être effectuée dans l'eau en ajoutant un acide approprié.

Lors de l'étape de réaction, la quantité d'agent de substitution peut-être adaptée en fonction du degré de substitution souhaité pour le chitosane substitué. Lors de l'étape de réaction, la durée de réaction peut-être adaptée en fonction du degré de substitution souhaité pour le chitosane substitué. Avantageusement, la réaction est arrêtée pour mettre fin à la réaction de substitution du chitosane selon degré de substitution souhaité pour le chitosane substitué. Différentes réactions sont connues pour substituer un chitosane. On peut se référer par exemple à la demande WO 2010/142507 notamment relative à la préparation de dérivés de chitosane. Le chitosane substitute peut comprendre des unités D-glucosamine et N-acétyl- glucosamine, dans lesquelles au moins certaines des unités sont greffées (ou couplées) par un ou plusieurs groupes fonctionnels qui peuvent être identiques ou différents. Selon une variante, le chitosane substitué comprend des unités glucosamine et N- acétyl-glucosamine, lesdites unités comprenant un ou plusieurs groupes fonctionnels. Des modifications chimiques sont par exemple réalisées par couplage d'une ou plusieurs fonctions des unités N-acétyl-glucosamine, c'est-à-dire les fonctions hydroxy et/ou des fonctions amine, et/ou des unités glucosamine, c'est-à-dire des fonctions hydroxy et/ou des fonctions amine. Selon un mode de réalisation particulier, les groupes fonctionnels présents sur le chitosane substitué sont choisis parmi le groupe comprenant, sans y être limité les groupes fonctionnels hydrophobes, les groupes fonctionnels hydrophiles, les groupes fonctionnels ioniques, et l'une quelconque de leurs combinaisons. Selon une variante particulière, les groupes fonctionnels hydrophobes sont choisis parmi le groupe consistant en les groupes alkyles, alcényles, araalkyles, alkaryles, et l'une quelconque de leurs combinaisons. Ces groupes comprennent en général entre 1 et 100 atomes de carbone, et plus généralement 1 entre 50 atomes de carbone, par exemple entre 1 et 25, ou encore 1 et 10 atomes de carbone, un ou plusieurs des atomes de carbone pouvant être remplacés par exemple par un hétéroatome et/ou un atome choisis parmi le bore, l'azote, l'oxygène, le soufre, le silicium, le germanium, une fonction ester, amide, urée, uréthane, et l'une quelconque de leurs combinaisons, et dans lesquels un ou plusieurs atomes d'hydrogène peuvent être remplacés par exemple par un hétéroatome et/ou un atome choisi parmi le groupe consistant en les atomes d'halogène, les groupes alcoxy, amide, et l'une quelconque de leurs combinaisons. Selon un autre mode de réalisation, les groupes fonctionnels hydrophobes sont choisis parmi le groupe consistant en les acides carboxyliques, les acides organosulfoniques, les polyéthers, les polyether d'amines, les polyesters, les stérols, les porphyrines et l'une de leurs combinaisons. Selon une autre variante, les groupes fonctionnels hydrophiles sont choisis parmi le groupe consistant en les diamines, polyamines, diols, polyols, diacides, polyacides, éthers couronnes, les glymes, les polyalcényléthers, les polyalcénylamines, polyalcénylétheramines, les acides polyacrylique, les polyvinylacools, et l'une quelconque de leurs combinaisons. Selon une autre variante particulière, les groupes fonctionnels ioniques sont choisis parmi le groupe consistant en les sels métalliques, les sels d'ammonium, les sels de phosphonium, les sels de sulfate, les sels d'acides carboxyliques, les sels de phosphate, les diacides carboxyliques, les polyacides carboxyliques, une fonction acide carboxyliques étant utilisée pour former une liaison covalente avec le chitosane, les diamines, les polyamines, une fonction amine étant utilisée pour former une liaison covalente avec le chitosane, et l'une quelconque de leurs combinaisons. Selon une variante particulière, le groupe fonctionnel substituant le chitosane, est un groupe aminoalkyle. Par exemple le groupe fonctionnel substituant le chitosane est un groupe aminoéthyle. Selon une variante, le chitosane substitué est : - un chitosane amino-alkyl, tels que par exemple un chitosane amino-éthyle, etc. et leurs équivalents ; - un chitosane N-alkyl ou 0-alkyl hydrophobisé, tel que par exemple un chitosane éthanoyl, propanoyol, butanoyl, pentanoyl, hexanoyl, heptanoyl, octanoyl, nonaoyl, decanoyl, ou dodecanoyl et leurs équivalents ; - un chitosane chargés positivement, tels que par exemple un chitosane trialkyl ammonium (par ex. un triméthyl-chitosane ou TMC) et leurs équivalents ; - un chitosane N-(2-hydroxy)propyl-3-triméthylammonium et son contre-ion comme un chlorure et leurs équivalents ; - un chitosane chargé négativement, tel qu'un chitosane succinamide (succinyl chitosan), un chitosane N,O-carboxyalkyl, un chitosane N,O-sulfoalkyl, et leurs équivalents ; - un chitosane neutre tels que par exemple le chitosane N,O-acétyl, un chitosane N,0-alkyl, éthanoyl, propanoyl, butanoyl, pentanoyl, hexanoyl, heptanoyl, octanoyl, nonaoyl, decanoyl, dodecanoyl, et leurs équivalents ; - un chitosane zwitterionique, tel que par exemple un chitosane comprenant des polymères hydrophobes, tel que par exemple un polyester aliphatique, tels que les homopolymères et copolymères d'acide lactique, d'acide glycolique, d'epsilon- caprolactone, de p-dioxanone de polyesters aliphatiques et/ou aromatiques; de polyamides aliphatiques; polymères éthyléniques et leurs copolymères; les polymères et copolymères de propylène; les polycarbonates; les polyacrylates, et leurs équivalents. Selon un mode de réalisation particulier, d'autres dérivés peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention et comprennent les chitosanes 0-substitués dont la substitution est réalisée sur les groupes hydroxyles des unités glucosamines et/ou N- acétyl-g lucosam ine. Selon une variante, le chitosane présente comme substituant des polymères hydrophobes, choisi de préférence parmi le groupe consistant les polyesters aliphatiques, et polyamides aliphatiques, les homopolymères ou les copolymères d'alcène, tels que par exemple les polymères d'éthylène ou de propylène, les polycarbonates, les polyacrylates, et l'une quelconque de leurs combinaisons. Selon une variante, le chitosane présente comme substituant un polyester aliphatique, et en particulier un polylactide. Comme méthode de substitution du chitosane on peut également citer la réaction décrite dans le brevet américain US 7 838 643, et les chitosanes en résultant. On peut également citer le brevet US 3 953 608. Selon une variante, on peut utiliser comme agent de substitution par exemple un agent N-alkylant, ou un anhydride d'alkyle, comprenant éventuellement une ou plusieurs insaturations, comprenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes et/ou fonctions (comme par exemple éther, thiéther, carboxy, ester, amide, etc) comprenant éventuellement un ou plusieurs substituants (comme alkyl, amine, hydroxyl, carboxyl, acide carboxylique, etc). Selon une variante, on peut citer à titre d'exemples l'anhydride succinique, l'anhydride glutamique, l'anhydride acétoxy succinique, l'anhydride méthylsuccinique, l'anhydride diacétyl tartrique, l'anhydride diglycolique, l'anhydride maléique, l'anhydride itaconique, l'anhydride citraconique, et l'un quelconque de leurs mélanges.

En théorie, tout agent de substitution permettant de fournir un chitosane soluble dans la composition finale, à pH neutre ou physiologique conviendrait. Lorsque l'étape d'arrêt de la réaction est réalisée par précipitation, la purification peut consister en la séparation du chitosane substitué insoluble et du non-solvant.

Après purification, le procédé de l'invention peut comprendre une étape de séchage du chitosane substitué, puis éventuellement de broyage de celui-ci pour obtenir une poudre. Selon une variante spécifique, l'agent de substitution est l'anhydride succinique. Le chitosane substitué est un chitosane succinamide.

Le chitosane succinamide peut être obtenu de la manière suivante : Dissolution du chitosane dans une solution aqueuse à pH inférieur à 6,5 ; La solution est maintenue à une température comprise entre 0°C et 100°C de préférence entre 20°C et 50°C et encore de préférence entre 25°C et 35°C. Après dissolution du chitosane, ajout de l'anhydride succinique, par exemple sous forme poudre, à la solution de chitosane. La quantité d'anhydride succinique et le nombre d'ajout d'anhydride succinique son adaptés en fonction du degré de substitution du chitosane substitué désiré. Après un temps suffisant pour qu'un degré de substitution minimal soit atteint, par exemple après une durée minimale de 15 min, la réaction est stoppée. La réaction peut être stoppée par exemple par modification du pH du milieu réactionnel ou par une étape de précipitation dans un non-solvant tel que l'éthanol, le méthanol, l'acétone,... Le chitosane substitué est ensuite avantageusement purifié, par exemple par une technique de dialyse, ou par des cycles de précipitation/solubilisation dans un non- solvant, ou par une technique de filtration tangentielle. Le produit purifié est ensuite de préférence séché. On peut sécher le produit par exemple par spray-drying (atomisation), ou dans une étuve (sous vide ou à pression atmosphérique), ou encore par lyophilisation.. Le pH de la solution aqueuse de chitosane peut être ajusté par exemple avec une solution d'acide faible, tel que l'acide acétique, l'acide lactique, etc., pour dissoudre le chitosane. Le degré de substitution du chitosane succinamide est corrélé au ratio massique des réactifs par rapport au chitosane au départ de la réaction. Selon une variante, on préfère utiliser un ratio massique des réactifs supérieur à 0,13 dans le cas d'un chitosane succinamide. Selon une variante, on préfère utiliser un ratio massique des réactifs inférieur à 0,2 dans le cas d'un chitosane succinamide.

Selon une variante spécifique, l'agent de substitution est un agent alkylant des groupes amines des unités D-glucosamine. Le chitosane substitué est avantageusement un chitosane alkylé sur les unités D-glucosamine. Comme agents alkylants, on peut citer les halogénoalkyles comme les halogénométhyles, comme l'iodure de méthyle, le bromure de méthyle, les chlorure d'acyles, comme par exemple ceux portant un ou ou plusieurs groupe carboxyméthyle, aminoéthyle et/ou triméthyle, etc. Selon cette variante, le chitosane substitué est un chitosane N-alkylé. Selon une variante spécifique, le chitosane substitué est le chitosane portant un groupe de substitution tri-méthyle (N,N,N-trimethyl chitosan, en abrégé « TMC »).

Selon une variante, le chitosane alkylé, de préférence le TMC, est obtenu avec un ratio molaire des réactifs allant de 0,1 à 0,35, et de préférence de 0,15 à 0,30, exprimé nombre de moles d'agent alkylant par rapport au nombre de moles de groupes amine initialement présents dans le chitosane. Le chitosane est par exemple référencé sous le numéro CAS 9012-76-4.

Le chitosane utilisé pour l'invention est avantageusement d'origine fongique, et de préférence issu du mycélium d'un champignon du type Ascomycète, et en particulier d'Aspergillus piger, et/ou d'un champignon Basidiomycète, et en particulier Lentinula edodes (shiitake) et/ou Agaricus bisporus (champignon de Paris). De préférence, le chitosane est issu d'Agaricus bisporus. Le chitosane est de préférence très pur, c'est-à- dire contenant peu d'impuretés issues de son origine fongique, et d'une qualité microbiologique compatible avec son utilisation comme implant ou composition pharmaceutique. Une méthode de préparation du chitosane est celle décrite dans les brevets WO 03/068824 (EP 1483299 ; US 7 556 946). Le chitosane préparé peut-être de différentes masses moléculaires, et généralement allant de 10 000 à 300 000. Selon une variante, la masse moléculaire moyenne est comprise entre 20 000 et 60 000. Selon une autre variante, la masse moléculaire moyenne est comprise entre 60 000 et 100 000.

Selon une autre variante, la masse moléculaire moyenne comprise entre 120 000 et 150 000. Selon une autre variante, la masse moléculaire moyenne est comprise entre 150 000 et 220 000. Il est possible d'hydrolyser le chitosane afin de diminuer sa masse moléculaire.

De préférence ici, la masse moléculaire moyenne est la masse moléculaire moyenne en viscosité (Mv), calculée à partir de la viscosité intrinsèque selon l'équation de Mark-Houwink. La viscosité intrinsèque est mesurée par viscosimètrie capillaire, avec un viscosimètre capillaire de type Ubbelohde, selon la méthode de la monographie de la Pharmacopée Européenne EP2.2.9. On mesure le temps d'écoulement de la solution à travers un tube capillaire adapté (Lauda, par exemple le tube capilaire Ubbelohde 510 01 de diamètre 0.53mm) à l'aide d'un viscosimètre automatique Lauda Visc, d'abord à la concentration initiale en chitosane, puis pour plusieurs dilutions, par exemple selon les recommandations de la méthode EP2.2.9. On en déduit la viscosité intrinsèque réduite pour chacune des concentrations. On porte la viscosité réduite en fonction de la température, et on extrapole la valeur à la concentration 0 pour en déduire la viscosité intrinsèque. Il faut par exemple porter la viscosité réduite (llréd en ml/g) des i dilutions en fonction de la concentration C des i dilutions (g/ml) selon la formule 5. Formule 2. [11récl] = (t1 - t0) - (1 - C). POur calculer la masse viscosimétrique moyenne, on applique l'équation de MarkHouwink avec les constantes k et alpha recommandées par Rinaudo et al. (Int. J. Biol.

Macromol, 1993, 15, 281-285), selon le DA du chitosane, selon l'une des trois formules suivantes. Formule 3. Mv = (VO/0,082)(110'76), pour un DA de 2% ; Formule 4. Mv = (W0,076)(110'76), pour un DA de 10% (par exemple 11.5%) ; Formule 5. Mv = (W0,074)(110'76), pour un DA de 20% (par exemple 21%).

Pour les valeurs de DA intermédiaires, on réalise une interpolation linéraire pour calculer la masse viscosimétrique moyenne (Mv). De préférence, le chitosane utilisé est d'une masse moléculaire moyenne comprise entre 120 000 et 150 000 ou encore comprise entre 150 000 et 220 000.

Selon une variante spécifique, le chitosane substituée présente, de préférence une masse moléculaire moyenne de 150 000 à 220 000 et un degré de substitution allant de 10 à 50 %, la masse moléculaire étant de préférence exprimée avant substitution. Selon une autre variante spécifique, le chitosane substituée présente, une masse moléculaire moyenne de 120 000 à 150 000 et un degré de substitution allant de 12 à 40%, de préférence de 12 à 30%, voire de 20 à 30% la masse moléculaire étant de préférence exprimée avant substitution. Avantageusement, le chitosane présente un degré d'acétylation compris entre 5 et 50%. Le degré d'acétylation est exprimé en nombre d'unités N-acétyl-D-glucosamine par rapport au nombre d'unités totales N-acétyl-D-glucosamine et D-glucosamine présentes.

Selon une variante, le degré d'acétylation est compris entre 20 et 45%. Selon une variante, le degré d'acétylation est compris entre 5 et 20%.

Selon une variante, le degré d'acétylation est compris entre 15 et 25%. Selon une variante, le degré d'acétylation est compris entre 20 et 30%. Selon une variante, le degré d'acétylation est compris entre 25 et 40%. Le degré d'acétylation est déterminé par potentiométrie. Le chitosane est dissout dans une solution d'acide chlorhydrique. L'excès d'acide chlorhydrique n'ayant pas réagi avec les fonctions amines du chitosane est dosé par une solution titrée d'hydroxyde de sodium. On en déduit ainsi le nombre de mole d'unité D-glusamine présentes dans le chitosane et donc par soustraction le degré d'acétylation. Le chitosane présente avantageusement un degré d'acétylation contrôlé. Par les termes « chitosane ayant un degré d'acétylation contrôlé » on entend un produit dont le degré d'acétylation, c'est-à-dire la proportion des unités N-acétyl-glucosamine, peut être ajustée de manière contrôlée. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une composition thermogélifiable selon l'invention.

Ce procédé comprend typiquement : - la dissolution d'un chitosane substitué dans une solution aqueuse, de préférence de l'eau, éventuellement tamponnée, de préférence à pH compris entre 6,2 et 8,5 et de préférence entre 6,5 et 7,5 ; - l'ajustement éventuel du pH à un pH physiologique ; - le mélange avec une solution de sel de sucre ou de polyol, comme par exemple une solution de sel de glycérol phosphate ; - l'ajustement éventuel du pH à un pH physiologique, par exemple par ajout d'un agent tamponnant ; - l'ajustement éventuel de l'osmolarité de la composition ; - l'ajustement éventuel de la viscosité de la composition. Selon une variante la dissolution du chitosane s'effectue dans de l'eau comprenant un sucre réducteur, comme par exemple le mannitol. Selon une variante, l'agent tamponnant est un tampon acétate. Avantageusement, le procédé comprend également une étape ultérieure de remplissage d'un dispositif d'injection, comme par exemple une seringue, avec la composition selon l'invention. Avantageusement, le dispositif d'injection, comme par exemple une seringue peut ensuite subir une stérilisation à la vapeur. Ce dispositif, par exemple une seringue, peut ensuite être emballée, de préférence de manière stérile. Il est avantageux d'utiliser un chitosane présentant un degré de pureté suffisant pour l'application envisagée.

La présente invention concerne plus particulièrement une composition injectable comprenant ou consistant en une composition thermogélifiable selon l'invention. Selon une variante, la composition selon l'invention est utilisée comme composition pharmaceutique injectable ou dispositif médical injectable ou implantable.

La présente invention concerne plus particulièrement une composition selon l'invention pour une utilisation pour un traitement thérapeutique, par exemple comprenant l'injection par voie sous-cutanée, intradermique, intraoculaire, ou intra-articulaire, de ladite composition, par exemple pour la réparation ou le comblement d'au moins un tissu corporel nécessitant une réparation ou un comblement.

Selon une variante, le tissu corporel est choisi parmi les tissus appartenant aux cordes vocales, muscles, ligaments, tendons, cartilages, organes sexuels, os, articulations, yeux, derme, ou l'une quelconque de leurs combinaisons, et plus particulièrement aux joints articulaires. La présente invention concerne plus particulièrement une composition selon l'invention pour le traitement d'une arthrose, ou la réparation d'un défaut de cartilage, par exemple par injection dans le fluide synovial ou après mélange avec le sang et implantation dans le cartilage. La présente invention concerne plus particulièrement un dispositif médical, par exemple implant médical, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une composition selon l'invention. La présente invention peut également comprendre un ou plusieurs additifs ou excipients permettant de moduler ses propriétés. Selon une variante spécifique la composition de l'invention comprend une suspension de particules, par exemple des particules solides ou de gel.

La présente invention concerne également une composition selon l'invention pour une utilisation dans une méthode de traitement ou de soin esthétique par comblement du derme (« dermal filling »). Il s'agit notamment par exemple d'injecter une composition selon l'invention en sous-cutané ou en intra-dermique. La présente invention concerne également une composition selon l'invention pour une utilisation dans une méthode de traitement ou de soin esthétique dans laquelle la composition est un agent viscosupplément. Il s'agit ici par exemple d'injecter au niveau intra-articulaire la composition de l'invention notamment pour limiter les frottements de la membrane synoviale située de part et d'autre de l'articulation. La présente invention concerne également une composition selon l'invention pour une utilisation comme vecteur cellulaire, d'un ou plusieurs type cellulaire, et/ou un ou plusieurs d'agents actifs. Il peut s'agir d'agents actifs d'un point de vue pharmaceutique ou biologique. La composition de l'invention peut en effet être compatible avec la présence de cellules, de préférence de cellules vivantes. Parmi les cellules vivantes d'intérêt, on peut citer par exemple : chondrocytes (cartilage articulaire), fibrochondrocytes (ménisque), fibroblastes de ligament (ligament), fibroblastes de peau (peau), ténocytes (tendons), myofibroblastes (muscle), les cellules souches mésenchymales, les globules rouges (sang) et kératinocytes (peau). La composition de l'invention peut également être visée comme vecteur thérapeutique pour la délivrance ciblée et/ou à libération contrôlée d'au moins un agent thérapeutique. Selon une variante, on ajoute du sang, ou du plasma, ou un lysat plaquettaire, ou du plasma riche en plaquettes, ou tout fluide biologique avec la composition de l'invention permettant par exemple d'augmenter les performances du produit. Selon une variante, la composition selon l'invention est formulée sous une forme solide (par exemple un film ou une mousse poreuse), qui se solubilise une fois implanté. Selon une variante, la composition est formulée sous une forme d'une composition nébulisable (spray). La présente invention concerne également une composition selon l'invention pour une utilisation dans une méthode de traitement ou de soin esthétique d'un ou plusieurs tissus ou organes affectés par une température excessive, comme dans le cas d'une brûlure.

La présente invention concerne également une composition à titre de fluide synovial artificiel comprenant ou consistant en la composition thermogélifiable selon l'invention. La composition selon la présente invention permet de mimer le fluide synovial en cherchant à mimer ses propriétés d'absorption des chocs (identifiable par le module d'élasticité G'), tout en étant facilement injectable pour remplir une seringue par exemple ou être injectée dans le corps humain ou animal. Pour indication, le module élastique G' du liquide synovial sain est compris entre 40 et 100Pa, et son module de perte G" est compris entre 1 et 10Pa. En général les gammes de valeurs d'osmolarité et pH recherchées dans les applications biomédicales sont proches des valeurs suivantes : -Osmolarité : Iso-osmolaire au plasma : 285-295mosm/kg ; Iso-osmolaire au liquide synovial : 404 +/- 57 mosml/kg, d'après « Clin Orthop Relat Res, 1988, 235, 289-95 » et « Biochem Biophys Res Comm, 2012, 422, 455-461 » ; _pH Un pH physiologique est en général au-dessus de 6,8, en particulier au-dessus de 7,0, et en particulier de 7,4 (comme pour le plasma ou un liquide synovial). Le pH du plasma est en général de 7,4. Le pH du liquide synovial est en général de 7,768 +/- 0,044 selon « J Bone Joint Surg Br, 1959, 41-B(2), 388-400 » ; ou de 7,3 selon « Acta Orthop Scand, 1969, 40, 634-641 », ou encore d'après « Clin Rheumatol 2006, 25, 886-888 ». Le pH synovial dans les cas d'ostéoarthrite est considéré comme étant en général plus faible que celui du fluide synolvial sain. Avantageusement, la composition selon la présente invention est stérile. Très avantageusement, la composition selon la présente invention est stérilisée par montée en température, de préférence sous autoclave. Selon une variante, les compositions de l'invention sont transparentes ou translucides. Par « translucide » on entend que l'on peut distinguer un objet lorsqu'on place sa composition entre l'oeil de l'observateur et l'objet. Par « transparente » on entend que l'on peut distinguer des caractères alphanumériques lorsqu'on place la composition entre l'oeil de l'observateur et les caractères observés. En général on réalise cette évaluation avec une épaisseur composition d'environ 1cm. Selon une variante, la composition de l'invention est incolore, c'est-à-dire en particulier qu'un observateur à l'oeil nu n'attribue pas de couleur spécifique à la composition. L'invention concerne en particulier des articles ou packaging, de préférence stériles, comprenant un ou plusieurs dispositifs d'injection pré-remplis d'une composition thermogélifiable selon l'invention. Il s'agit typiquement de seringues pré-remplies.

La composition de l'invention peut avantageusement être stérilisée. Selon une variante, la composition de l'invention est stérilisée à la vapeur, par exemple par une élévation de la température à une température supérieure à 100°C, et de préférence supérieure à 120°C, par exemple entre 121 et 138°C, sous autoclave, pendant une durée suffisante à la stérilisation, par exemple en général de 15 à 20 minutes.

L'invention couvre encore une composition de l'invention sous une forme sèche, notamment sous une forme lyophilisée. On peut notamment (re)disperser cette composition lyophilisée avant usage. La présente invention couvre également une méthode de traitement thérapeutique comprenant l'injection d'une composition selon l'invention.

La présente invention couvre également une méthode de soin esthétique, en d'autres termes non-thérapeutique, comprenant l'injection d'une composition selon l'invention. Il s'agit par exemple du comblement de rides ou du comblement d'une ou plusieurs zones de tissu visible endommagées, par exemple suite à un accident ou une intervention chirurgicale, dans un but esthétique. Un tissu est un ensemble de cellules semblables et de même origine, regroupées en ensemble fonctionnel, c'est-à-dire concourant à une même fonction. Parmi les tissus on peut citer : le tissu épithélial, le tissu conjonctif, le tissu musculaire, et le tissu nerveux. On entend par « composition selon l'invention » ou des termes équivalents, une composition définie telle que dans la présente invention, y compris selon l'une quelconques des variantes, modes de réalisation particuliers ou spécifiques, indépendamment ou selon l'une quelconque de leurs combinaisons, y compris selon les caractéristiques préférées. Sur les figures : La figure 1 représente un spectre de résonance magnétique nucléaire du proton d'un chitosane succinamide de l'invention.

D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention. Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité. Ainsi, chaque exemple a une portée générale. D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en masse, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire.

Exemples Les chitosanes précurseurs des chitosanes substitués selon l'invention présentent des masses moléculaires moyennes en viscosité (Mv, déterminées par viscosimétrie capillaire) et les degrés d'acétylation (DA, proportion d'unité N-acétyl-glucosamine, déterminée par titrage potentiométrique) compris dans les gammes du Tableau 1. Tableau 1. Caractéristiques des chitosanes précurseurs des chitosanes substitués Gamme de Gamme de Mv Gamme de DA masse moléculaire du chitosane (mol%) ultra low 20 000 - 60 000 5 - 20% low 60 000 - 120 000 15 - 25% medium 120 000 - 150 000 20 - 30% high 150 000 - 220 000 25 - 40% Exemple 1 - Préparation d'un chitosane substitué (chitosane succinamide, CSS) Pour obtenir le chitosane succinamide de référence CSS5 du Tableau 2, on dissout 10g de chitosane de masse moléculaire et de DA connus dans 266m1 d'une solution aqueuse d'acide acétique à 1% (v/v). La solution est maintenue à une température de 30°C. 6,75g d'anhydride succinique (AS) sont ajoutés, ce qui correspond à un ratio massique d'anhydride succinique sur le chitosane (AS/chitosane) de 0 ;675, et à un ratio molaire d'anhydride succinique sur les groupes NH2 du chitosane (AS/NH2) de 1 ;7. Après 15 minutes, le pH du milieu réactionnel est ajusté à 7,5 par ajout de soude 30%. La solution est ensuite précipitée dans 2,5 litres d'éthanol. Le précipité est récupéré, et de nouveau solubilisé dans l'eau. Le chitosane substitué subit ces étapes de précipitation dans l'éthanol puis solubilisation dans l'eau 3 fois. A la dernière précipitation, le précipité est récupéré, pressé et séché dans une étuve à 60°C à pression atmosphérique. Une fois le chitosane succinamide sec, il est broyé pour obtenir une poudre. Le degré de substitution du chitosane est déterminé par RMN du proton selon la méthode décrite précédemment. Un spectre de RMN est illustré par la Figure 1.

Les lots de chitosane succinamide utilisés dans les exemples ont été préparés de la même manière, avec les paramètres du Tableau 2.

Tableau 2. Paramètres et caractéristiques des lots de chitosane succinamide N° CSS Gamme Ratio Ratio DS Plage de pH de Mv massique molaire (%mol) pour AS/chitosane AS/NH2 insolubilité dans l'eau CSS1 medium 0,119 0,3 12 5,4 - 6,7 CSS2 medium 0,159 0,4 18 6,3 - 7,3 CSS3 medium 0,199 0,5 6,1 - 7,0 CSS4 medium 0,262 0,6 42 CSS5 medium 0,675 1,7 52 < 5,5 CSS6 medium 0,178 0,45 5,8 - 6,9 CSS7 high 0,19 0,5 48 CSS8 high 0,258 0,6 4,2 - 7,0 CSS9 high 0,68 1,7 < 5,2 CSS10 medium 0,133 0,3 6,4 - 6,9 CCS11 medium 0,133 0,3 5,9 - 7,1 CSS12 medium 0,133 0,3 6,6 - 7,1 CSS13 medium 0,133 0,3 6,5 - 7,2 CSS14 medium 0,133 0,23 6,1 - 7,6 CSS15 medium 0,133 0,23 4,8 - 6,3 CSS16 medium 0,178 0,4 15 5,8 - 6,9 CSS17 medium 0,222 0,5 CSS18 medium 0,172 0,4 5,5 - 7 CSS19 high 0,2 0,5 5,2 - 6,3 Note : L'ajout de beta-glycérol phosphate de sodium (65%, Salfic-Alcan, en abrégé GP) permet de rendre le CSS soluble au-delà de la limite de solubilité dans l'eau. Le CSS présente un caractère zwiterionique. Cela ne présente de problème car on peut ajouter une faible concentration de GP pour retrouver le caractère soluble du CSS.

Exemple 2 - Préparation d'un chitosane substitué (chitosane triméthylé, TMC) On prépare une suspension de 50g de chitosane dans un volume de 800m1 d'eau. La suspension est chauffée à 95°C. Un volume de 26,27m1 du réactif 3-chloro-2- hydroxypropyl trimethyl ammonium chloride (abréviation CHTAC) est ajouté goutte à goutte au milieu, soit un ratio massique et molaire CHTAC/chitosane de 0,31 et 0,5, respectivement. Après 4 heures de réaction, le milieu réactionnel est dilué avec 400m1 d'eau, puis précipité dans 8,4 litres d'éthanol. Le précipité est récupéré et de nouveau solubilisé dans l'eau. Le chitosane substitué subit 3 fois cette étape de solubilisation/précipitation dans l'éthanol. A la dernière précipitation, le précipité est récupéré, pressé et séché dans une étuve à 60°C à pression atmosphérique. Une fois le chitosan triméthylé sec, il est broyé pour obtenir une poudre. Les lots de chitosane triméthylé utilisés dans les exemples ont été préparés de la même manière, avec les paramètres du Tableau 3. Tableau 3. Paramètres et caractéristiques des lots de chitosane triméthylé N° TMC Gamme de Mv Ratio Ratio DS du chitosane massique molaire (%mol) CHTAC/chitosane CHTAC/NH2 TMC1 medium 0,37 0,5 16 TMC2 medium 0,79 1,05 17 TMC3 medium 0,37 0,5 22 TMC4 medium 0,37 0,5 26 TMC5 medium 0,37 0,5 28 TMC6 medium 0,61 0,8 36 TMC7 medium 1,21 1,5 75 Note : Tous ces chitosanes triméthylés sont parfaitement solubles dans l'eau dans la gamme de DS de 16 à 75%.25 Exemple 3 - Exemple de préparation d'une composition thermogélifiable Un chitosane succinamide (CSS2) obtenu selon l'exemple 1 est solubilisé dans l'eau dans les proportions suivantes : 0,195g de chitosane succinamide CSS2 dans 14,809g d'eau contenant 0,5% (m/m) de mannitol. Une solution de beta-glycérol phosphate de sodium (65%, Salfic-Alcan, en abrégé GP) à 39,7% (m/m) est préparée. Sous agitation magnétique ou mécanique, 1,49m1 de la solution de GP sont ajoutés à la solution de chitosane succinamide. 0,325m1 de tampon acétate 0,5M (pH 3) est ajouté à la solution de chitosane succinamide/GP jusqu'à d'obtenir un pH donné, par exemple 7,5 dans le cas de la solution N°2 du Tableau 4. L'osmolarité de la solution finale est mesurée. Exemple 4 - Capacité à gélifier des solutions de chitosane succinamide à une concentration finale de 1,14% (m/m) Les solutions du Tableau 4 sont préparées selon la méthode décrite dans l'exemple 3. La capacité à gélifier de la solution thermogélifiable est dépendante en particulier du degré de substitution. Le degré de substitution est directement lié au rapport molaire entre les fonctions amine présentes sur le chitosane et la quantité d'anhydride succinique utilisée durant la réaction de substitution. Si le degré de substitution est trop élevé, la Tableau 4. Solutions à base de CSS de Mv « medium » et « high » à une concentration de 1,14% (m/m), de GP à une concentration de 4,11% (m/m) et de mannitol à une concentration de 0,5% (m/m) ; le pH est ajusté à 7,5 Gamme de Mv N° N° Ratio Ratio DS Facilité Transition solution CSS massique molaire (%mol) d'injection sol-gel à AS/chitosane AS/NH2 37°C medium CSS1 0,12 0,3 12 Oui Non 2 CSS2 0,16 0,4 18 Oui Oui 3 CSS3 0,20 0,5 Oui Oui 4 CSS4 0,26 0,6 42 Oui Non 5 CSS5 0,68 1,7 52 Oui Non high 6 CSS6 0,18 0,4 Oui Oui 7 CSS7 0,19 0,5 Oui Oui 8 CSS8 0,26 0.6 Oui Non 9 CSS9 0,68 1,7 Oui Non gélification n'a pas lieu (cas de la solution N°5). La gélification n'a pas lieu si le degré de substitution est trop faible (cas de la solution N°1). Le Tableau 4 montre que pour le chitosane succinamide, le ratio massique AS/chitosane optimal conduisant au caractère thermogélifiable se trouve entre 0,12 et 0,26, ce qui se traduit par une gamme de DS de 10 à 45%. Par ailleurs, les solutions thermogélifiables du Tableau 5 sont préparées au départ de lots différents de chitosane succinamide, pour démontrer la reproductibilité de la préparation des hydrogels avec un ratio massique de 0,13, qui permet de cibler un DS entre 14 et 18mol°/0. On voit que l'osmolarité de la solution finale se trouve entre 363 et 447mosm/kg, et que toutes les solutions sont faciles à injecter et thermogélifiables. La présence de mannitol (qui est optionnelle pour l'effet thermo-gélifiant) augmente l'osmolarité.

Exemple 5 - Capacité du chitosane subsitué TMC à gélifier à une concentration finale de 0.9% (m/m) Dans le cas du chitosane triméthylé de masse moléculaire « medium », le degré de substitution optimal pour la formulation de gel thermogélifiant, par exemple à une concentration faible de 0,9% (m/m), se trouve entre 10 et 36% (Tableau 6). Tableau 5. Solutions à base de chitosane succinamide de Mv « medium » à une concentration de 1,14%, de GP à une concentration de 4,11% et mannitol à une concentration de 0,5% Gamme de Mv N` N° Osmolarité Facilité Gel solution CSS (mosm/kg) d'injection à 37°C medium 10 CSS10 363 Oui OK 11 CSS11 382 Oui OK 12 CSS12 447 Oui OK 13 CSS13 405 Oui OK 14 CSS14 Oui OK 15 CSS15 Oui OK Tableau 6. Solutions à base de TMC à une concentration 0,9% (m/m) et de GP à une concentration de 3,0% (m/m) (pas de mannitol) ; le pH est ajusté à 7,5 N° N° DA DS Gel solution TMC (mol%) (mol%) à 37°C TMC 1 TMC1 16 16 Oui 2 TMC2 16 17 Oui 3 TMC3 15 22 Oui 4 TMC4 18 26 Oui TMC5 18 28 Oui 6 TMC6 17 36 Non 7 TMC7 19 75 Non 5 Exemple 6 - Capacité des solutions de chitosane succinamide à gélifier à faible concentration, à des valeurs d'osmolarité et pH physiologiques On compare la solubilité, le caractère injectable et thermo-gélifiable des solutions à base de chitosane chitosane non substitué (CS) avec ceux des solutions à base de chitosane substitué (chitosane succinamide CSS), préparées selon la méthode de l'exemple 2 (Tableau 7).

Tableau 7. Solutions à base de chitosane (CS) ou de chitosane succinamide (CSS) CS Gamme CS ou GP pH final Facilité Gel ou CSS de Mv CSS (%, m/m) (ajusté) d'injection à (% m/m) 37°C CS high 1,5% 6% 6,8-7,0 Oui Non CS high 1,5% 6% 6,7-7,0 Oui Non CS high 2% 6% 6,7-7,0 Oui Oui CS high 2% 4,1% 6,7-7,0 Oui Non CS medium 2% 4,1% 7,4 Non Non (précipite) CS low 2% 4,1% 7,4 Non Non (précipite) CS medium 1,5% 4,1% 7,4 Non Non (précipite) CS low 1,5% 4,1% 7,4 Non Non (précipite) CSS medium 1,5% 4,1% 7,4 Oui Oui Avec le chitosane non substitué de l'art antérieur, on ne parvient pas à respecter le cahier des charges osmolarité, pH, solubilité dans l'eau, injectabilité et gélification à 37°C simultanément.

Avec le chitosane substitué par un groupe succinyle, on peut obtenir la solubilité, l'injectabilité et le caractère sol-gel même à plus faible concentration en GP (à concentration en polymère égale), grâce au fait que le polymère de départ est un chitosane substitué soluble dans l'eau, la concentration en GP étant modulable pour obtenir le caractère gélifiable, l'osmolarité et le pH désirés.

Exemple 7 - Capacité des solutions de chitosane succinamide de concentration finale 0,88% à gélifier sur une plage de pH large Dans cet exemple, le pH des solutions a été ajusté par ajout d'acide acétique concentré (96% m/v) afin de minimiser la dilution de l'hydrogel. Toutes les solutions sont solubles et facilement injectables.

Pour une masse moléculaire et un degré de substitution donnés, il est possible d'obtenir le caractère gélifiant sur une plage de pH large, par exemple de 7,2 à 8,0, par exemple au départ d'un CSS de masse moléculaire « medium » et d'un ratio massique de 0,133. Exemple 8 - Capacité à diminuer la concentration en chitosane substitué (CSS) tout en conservant la capacité à gélifier de la solution Tableau 9. Solutions à base de CSS de faible concentration Gamme Mv N° CSS pH Gamme de Gamme Gel CSS (% m/m) cc icentration d'osmolarité à en GP 37°C (% m/m) 7,0 3,5 - 4,1 310 - 376 Non 0,75% high CSS7 7,5 3,4 - 4,2 300 - 375 Oui 7,0 3,4 - 4,4 300 - 373 Non 0,88% 7,5 3,4 - 4,4 300 - 380 Oui 1,34% 7,0 3 - 3,7 300 - 380 Oui 7,0 3,4 - 3,8 300 - 375 Non 0,88% medium CSS17 7,5 3,4 - 4,5 300 - 400 Non 7,0 2,4 - 2,7 300 - 360 Non 1,35% 7,5 2,4 - 2,7 300 - 340 Oui Tableau 8. Solution à base de CSS à une concentration de 0,88% (m/m) et de GP à une concentration de 4,16% Gamme N° pH Gel de Mv CSS à 37°C 6,8 Non medium CSS10 7,0 Non 7,2 Oui 7,5 Oui 7,6 Oui 8,0 Oui Il est parfois avantageux de former les solutions de faibles concentrations finale en chitosane substitué dans certaines applications, par exemple en dessous de 1%, par exemple 0,85%, tout en conservant la capacité à produire un gel à température physiologique, par exemple 7,5. Exemple 9 - Injectabilité des produits commerciaux et des solutions de chitosane substitué et GP à température ambiante Cet exemple vise à vérifier que le produit peut être facilement injecté à travers une seringue équipée d'une aiguille de faible diamètre, telle qu'utilisée pour les injections par exemple en intra-dermique ou en intra-articulaire. En particulier, il est important de pouvoir injecter facilement dans des petites articulations comme celles de la main.

On évalue la force nécessaire à injecter les solutions à température ambiante au cours de l'injection de la solution via une aiguille de 22 Gauge, selon le protocole décrit dans le texte. On mesure la force nécessaire à l'injection après un déplacement du piston de la seringue d'environ 15mm, ce qui permet aisément de comparer les différents produits entre eux. Trois solutions d'acide hyaluronique destinées à l'injection intra- articulaire disponibles commercialement ont été testées, et comparées avec des solutions de chitosane succinamide de masse moléculaire « medium » et de concentration variable. Tableau 10. Force nécessaire pour l'injection après un déplacement du piston d'environ 15mm pour une aiguille 22 Gauge Produit Force (N) Eau pure 0,5 Solution commerciale « A » (acide hyaluronique) 2N Solution commerciale « C » (acide hyaluronique ) 6 - 8 N Solution à base de CSS18 3N à une concentration de 1,0 % à pH 7,5 Solution à base de CSS19 3N à une concentration de 1,5% à pH 7,5 On voit que les solutions de chitosane succinamide sont aussi facilement injectable à travers une aiguille de 22 Gauge qu'une solution commerciale d'acide hyaluronique (A), et plus facilement injectables qu'une solution commerciale d'acide hyaluronique (C). Exemple 10 - Propriétés rhéologiques des produits commerciaux à base d'acide hyaluronique et des solutions thermogélifiables à base de chitosane succinamide On mesure les modules G' et G" de produits commerciaux à base d'acide hyaluronique à une température allant de de 4°C à 37°C, en fonction du temps, à l'aide d'un rhéomètre ARES, selon la méthode décrite précédemment. Puis on détermine la valeur des modules G' et G" à 60 minutes (Tableau 11). Tableau 11. Modules G' et G" à 60 minutes Produit Sol ou gel G' G" Sol ou gel à 4°C à 37°C à 37°C à 37°C (Pa) (Pa) (G' versus G") Solution commerciale (acide hyaluronique) « A » Sol 0.1 1 Sol (G' < G") Solution commerciale (acide hyaluronique) « g » Gel 40 38 Gel (G' > G") Solution commerciale (acide hyaluronique) « D » Gel 640 120 Gel (G' > G") Solution à base de CSS16 à une concentration de 1,2% à pH 7,5 (solution de l'exemple 12) Sol 16 1 Gel (G' > G") Pour les compositions de l'invention, par exemple pour la composition à base de chitosane succinamide et de GP à pH=7,5, le module G' croise le module G" au bout de quelques secondes, et G' est supérieur à G" au- delà du temps auquel le croisement s'est produit, caractérisant une transition sol-gel rapide lorsque le produit passe de 4°C à 37°C. Les compositions commerciales à base d'acide hyaluronique testées ne sont pas thermogélifiables.

Exemple 11 - Effet de l'injection intra-articulaire d'une solution de chitosane succinamide chez le lapin après transection du ligament antérieur La solution de cet exemple est une solution stérilisée comprenant 1,2% (m/m) de chitosane succinamide de degré de substitution 15% et de masse moléculaire « medium » (N° CSS16 du Tableau 2), 3,5% (m/m) de GP, 0,4% (m/m) de D-mannitol et 11mmo1/1 de sodium acétate trihydrate. La solution est stérilisée à la vapeur par autoclave, la concentration est ajustée par dilution d'un facteur de 1,33, puis la solution est conditionnée dans une seringue. Après stérilisation et dilution, le pH est égal à 7,5, l'osmolarité est égale à 380mosm/kg, et la viscosité dynamique apparente est égale à 126mPa.s à 9°C. Une transection du ligament antérieur, appelée « anterior cruciate ligament transection (ACLT)», chez le lapin entraîne de manière consistante et bien documentée des modifications symptômatiques de l'ostéoarthrose (OA), à savoir des fissures du cartilage, des lésions et une inflammation de la membrane synoviale importantes sans perte de cartilage sur toute la hauteur de l'articulation. Ce modèle est utilisé en particulier pour étudier les effets de nouvelles thérapies comme les viscosuppléments injectés intraarticulairement sur la structure du cartilage, les lésions de départ pouvant être d'origine et de nature très variables (in Laverty et al. Osteoarthr Cartil, 2010 ; Edouard et al. Phys Ther Sport, 2013 ; Mainil-Varlet et al. Cartilage, 2013; Oprenyeszk et al. Osteoarthr Cartil, 2013). Dans ce modèle, une érosion du cartilage apparaît dès 4 semaines après l'intervention chrirugicale qui consiste à effectuer une transection du ligament antérieur du genou droit. Il est recommandé de mener l'étude jusqu'à 8 semaines après l'intervention, ce qui permet d'obtenir une érosion du cartilage dans au moins 40% des condyles fémoraux.

L'injection intra-articulaire du produit à tester se fait avant l'apparition des premiers signes d'ostéroarthrose, c'est à dire 1 semaine après la chirurgie sur le genou ayant subi la transection. Le genou droit des 10 animaux du groupe test a reçu une injection de 6001.11 de la solution thermogélifiable à tester. Le genou droit des 9 animaux du groupe « contrôle » a reçu une injection de 6001.11 de solution saline à 0.9%. Les produits sont injectés dans l'articulation du genou des lapins via une seringue munie d'une aiguille de de 22 Gauge. On caractérise la capacité du produit à ralentir ou stopper la progression de l'arthrose induite par la chirurgie par l'examen de plusieurs indicateurs macroscopiques, histologiques and radiologiques, caractérisés selon les scores recommandés par l'OARSI (in Laverty et al. Osteoarthr Cartil 2010). Les résultats de la radiologie des articulations sont évalués selon l'échelle de Kellgren & Lawrence, sur base de la présence d'ostéophytes et de l'espace inter-articulaire. L'étude se fait en double aveugle, c'est-à-dire que ni le chirurgien qui procède à l'opération et à l'injection des produits à tester, ni les personnes qui réalisent les observations macroscopiques au cours de la vie des animaux et au moment de leur euthanasie, ni les personnes qui analysent les résultats macroscopiques ou histologiques et établissent les calculs statistiques ne connaissent la correspondance entre les numéros des animaux et les groupes par produit testé. On ne communique cette correspondance qu'une fois les calculs terminés et rédigés par une personne indépendante. Les résultats sont rapportés dans les tableaux 11 à 13. Par rapport à l'injection d'une solution saline, l'injection de la solution thermogélifiable HG permet de diminuer de manière statistiquement significative tous les indicateurs de ostéoarthrose à 8 semaines, comme démontré par une diminution de l'espace inter-articulaire et de la présence d'ostéophytes visibles à l'examen radiologique (Tableau 12, selon l'échelle de Kellgren & Lawrence), la diminution de la sévérité et la taille des lésions du cartilage qui apparaîssent sur le côté latéral des articulations (Tableau 13), et la diminution des infiltrats inflammatoires de la membrane synoviale (Tableau 14). Aucun effet secondaire indésirable de la solution thermogélifiable n'est détecté par rapport au groupe contrôle, traduisant la bonne tolérance du produit dans les conditions de l'étude. Tableau 12. Score radiologique selon l'échelle de Kellgren & Lawrence (de 0 à 4) évaluant l'espace inter-articulaire et la présence d'ostéophytes (valeur-p calculée par la méthode non-paramétrique du test U de Mann-Whitney) Score radiologique Solution saline Solution selon K&L (0-4) thermogélifiable Nombre d'animaux 9 10 N observation 9 10 Score moyen 2,0 0,0 Score médian 1,8 0,4 Score min 0,0 0,0 Score max 3,0 3,0 Ecart-moyen 0,7 0,6 Différence entre les 2 groupes et valeur-p (probabilité) - Statistiquement significative Valeur-p = 0,0079 Tableau 13. Score macroscopique global évaluant la taille et la sévérité des lésions des compartiments latéraux du cartilage des plateaux tibiaux et condyles fémoraux (valeur-p calculée par la méthode non-paramétrique du test U de Mann-Whitney) Score macroscopique global Solution saline Solution (taille et sévérité des lésions) thermogélifiable Nombre d'animaux 9 10 N observation 18 20 Score moyen 32,0 17,5 Score médian 32,8 21,4 Score min 3,0 3,0 Score max 68,0 44,0 Ecart-moyen 13,4 10,2 Différence entre les 2 groupes et valeur-p (probabilité) Statistiquement significative Valeur-p < 0,0041 Tableau 14- Score de l'infiltrat inflammatoire de la membrane synoviale évalué par histologie (valeur-p calculée par la méthode non-paramétrique du test U de Mann-Whitney) Score de l'infiltrat Solution saline Solution inflammatoire (0-5) thermogélifiable Nombre d'animaux 9 10 N observation 27 28 Score moyen 2,0 1,4 Score médian 2,6 1,8 Score min 1 0,5 Score max 5 5,0 Ecart-moyen 1,0 1,0 Différence entre les 2 groupes et valeur-p (probabilité) Statistiquement significative Valeur p = 0,0011

Claims

REVENDICATIONS1.- Composition thermogélifiable comprenant un chitosane présentant des unités N-acétyl-glucosamine, des unités glucosamine, et des unités glucosamine substituées autres que les unités N-acétyl-glucosamine, ledit chitosane substitué présentant de préférence un degré de substitution des unités glucosamine allant de 10 à 50%, exprimé en nombre de mole du substituant par rapport au nombre de mole d'unités totales.
2.-Composition thermogélifiable, selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition présente une transition sol-gel thermoréversible.
3.- Composition thermogélifiable, selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la concentration de chitosane est inférieure à 4%, par exemple inférieure à 3%, ou encore par exemple inférieure à 2% en masse par rapport à la masse totale de la composition (m/m).
4.- Composition thermogélifiable, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite composition comprend un agent gélifiant, de préférence un agent gélifiant induisant une transition sol-gel de !a composition, par exemple un sel de glycérol phosphate par exemple sous la forme sodium ou calcium, par exemple sous sa forme pentahydrate, ledit agent gélifiant étant de préférence présent dans la composition à une concentration comprise entre 1 et 20%, de préférence 3 et 9%, en masse par rapport à la masse totale de la composition finale (m/m).
5.- Composition thermogélifiable, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle présente un pH supérieur ou égal à 7, par exemple supérieur ou égal à 7,1, et par exemple un pH de 7,2 à 8,5.
6.- Composition thermogélifiable, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite composition présente une osmolarité de 100 à 700mosm/kg, de préférence de 200 à 500mosm/kg.
7.- Composition thermogélifiable, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite composition présente à l'état fluide une viscosité comprise entre 20 et 800mPa.s, par exemple de 40 à 500mPa.s.
8.- Composition thermogélifiable, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ladite composition comprend un tampon, par exemple un tampon acétate.
9.- Composition thermogélifiable, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite composition comprend un sucre réducteur, par exemple le D-mannitol.
10.- Composition injectable caractérisée en ce qu'elle comprend ou consiste en une composition thermogélifiable selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
11.- Composition injectable, selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle est utilisée comme composition pharmaceutique injectable ou dispositif médical injectable ou implantable.
12.-Composition selon la revendication 11, pour une utilisation pour un traitement thérapeutique, par exemple comprenant l'injection par voie sous-cutanée, intradermique, intraoculaire, ou intra-articulaire, de ladite composition, par exemple pour la réparation ou le comblement d'au moins un tissu corporel nécessitant une réparation ou un comblement.
13.- Composition, selon la revendication 12, caractérisée en ce que le tissu corporel est choisi parmi les tissus appartenant aux cordes vocales, muscles, ligaments, tendons, cartilages, organes sexuels, os, articulations, yeux, derme, ou l'une quelconque de leurs combinaisons, et plus particulièrement aux joints articulaires.
14.-Composition selon la revendication 12 ou 13, pour le traitement d'une arthrose, ou la réparation d'un défaut de cartilage, par exemple par injection dans le fluide synovial ou après mélange avec le sang et implantation dans le cartilage.
15.- Dispositif médical, par exemple implant médical, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une- composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 14.
16- Procédé de préparation d'une composition thermogélifiable comprenant un chitosane substitué présentant des unités N-acétyl-glucosamine, des unités glucosamine,et des unités glucosamine substituées autres que les unités N-acétyl-glucosamine ; ledit procédé comprenant : - la dissolution dans une solution aqueuse, de préférence de l'eau, éventuellement tamponnée, de préférence à pH compris entre 6,2 et 8,5, et de préférence entre 6,5 et 7,5 d'un chitosane substitué présentant de préférence un degré de substitution des unités glucosamine allant de 10 à 50%, exprimé en nombre de mole du substituant par rapport au nombre de mole d'unités totales; - l'ajustement éventuel du pH à un pH physiologique ; - le mélange avec une solution de sel de sucre ou de polyol, comme par exemple une solution de sel de glycérol phosphate ; - l'ajustement éventuel du pH à un pH physiologique, par exemple par ajout d'un agent tamponnant ; - l'ajustement éventuel de l'osmolarité de la composition ; - l'ajustement éventuel de la viscosité de la composition.15