FR3099770A1 - METHOD OF ANALYSIS OF THE LOSS OF BACTERIAL DIVERSITY OF THE HUMAN INTESTINAL MICROBIOME - Google Patents
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Abstract
La présente invention décrit une méthode permettant de diagnostiquer la perte de diversité bactérienne du microbiote intestinal humain, in vitro, à partir d’un échantillon de selle. Cette méthode implique un ensemble d’étapes calibrées permettant une reproductibilité parfaite des résultats, et une fiabilité accrue du diagnostic. Les inventeurs ont ainsi identifié une valeur de référence permettant de séparer les individus en deux groupes en fonction de leur niveau de diversité bactérienne. Les personnes diagnostiquées pour avoir une faible diversité sont statistiquement plus fréquemment en mauvaise santé que les autres. Des méthodes de traitement appropriées peuvent donc être développées spécifiquement pour ces individus.The present invention describes a method for diagnosing the loss of bacterial diversity of the human gut microbiota, in vitro, from a stool sample. This method involves a set of calibrated steps allowing perfect reproducibility of the results, and increased diagnostic reliability. The inventors have thus identified a reference value making it possible to separate individuals into two groups according to their level of bacterial diversity. People diagnosed with low diversity are statistically more frequently in poor health than others. Appropriate treatment methods can therefore be developed specifically for these individuals.
Description
La présente invention décrit une méthode permettant de diagnostiquer la perte de diversité bactérienne du microbiote intestinal humain,in vitro, à partir d’un échantillon de selle. Cette méthode implique un ensemble d’étapes calibrées permettant une reproductibilité parfaite des résultats, et une fiabilité accrue du diagnostic. Les inventeurs ont ainsi identifié une valeur de référence permettant de séparer les individus en deux groupes en fonction de leur niveau de diversité bactérienne. Les personnes diagnostiquées pour avoir une faible diversité sont statistiquement plus fréquemment en mauvaise santé que les autres. Des méthodes de traitement appropriées peuvent donc être développées spécifiquement pour ces individus.The present invention describes a method for diagnosing the loss of bacterial diversity of the human intestinal microbiota, in vitro , from a stool sample. This method involves a set of calibrated steps allowing perfect reproducibility of results and increased diagnostic reliability. The inventors have thus identified a reference value making it possible to separate the individuals into two groups according to their level of bacterial diversity. People diagnosed with low diversity are statistically more frequently in poor health than others. Appropriate treatment methods can therefore be developed specifically for these individuals.
Description de l’Art Antérieur :Description of Prior Art:
La recherche scientifique et médicale a récemment révélé l’importance du microbiote intestinal dans la santé humaine. En particulier, une perte de diversité du microbiote intestinal a été associée avec de nombreuses pathologies, dont notamment les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et l’obésité.Scientific and medical research has recently revealed the importance of the gut microbiota in human health. In particular, a loss of diversity of the intestinal microbiota has been associated with numerous pathologies, including in particular inflammatory bowel diseases and obesity.
Deux études pionnières publiées dans Nature en 2013, réalisées par les équipes de MetaGenoPolis de l’INRA, ont montré qu’il existait dans environ 24% de la population européenne une perte de richesse bactérienne associée avec un mauvais profil métabolique (augmentation de l’adiposité, de l’insulino résistance et dyslipidémie ainsi qu’un profil plus inflammatoire, cf.1 ; 2). Ces deux études sont basées sur une technologie similaire à la présente invention, à savoir le séquençage métagénomique. Elles illustrent bien la perte de richesse bactérienne chez ces patients.Two pioneering studies published in Nature in 2013, carried out by INRA's MetaGenoPolis teams, showed that approximately 24% of the European population had a loss of bacterial richness associated with a poor metabolic profile (increase in adiposity, insulin resistance and dyslipidemia as well as a more inflammatory profile, see 1; 2 ). These two studies are based on a technology similar to the present invention, namely metagenomic sequencing. They clearly illustrate the loss of bacterial richness in these patients.
En outre, une perte de diversité bactérienne au niveau de la flore intestinale a été reportée dans de nombreuses pathologies, et en particulier dans l’obésité, le diabète de type I et II et la maladie de Crohn (3).In addition, a loss of bacterial diversity at the level of the intestinal flora has been reported in many pathologies, and in particular in obesity, type I and II diabetes and Crohn's disease ( 3 ).
En 2009, Turnbaugh et al. ont également montré sur 154 personnes que l’obésité était associée à une perte de la diversité bactérienne et une altération des voies métaboliques (4). Chez les personnes en surpoids, une diversité basse est indicative d’un profil plus inflammatoire et par conséquent d’un risque accru de complications métaboliques (5). Une autre équipe a de plus montré qu’une intervention alimentaire (régime sur 6 semaines) permettait d’augmenter la diversité chez les personnes en perte de diversité (2).In 2009, Turnbaugh et al. also showed in 154 people that obesity was associated with a loss of bacterial diversity and impaired metabolic pathways ( 4 ). In overweight people, low diversity is indicative of a more inflammatory profile and therefore an increased risk of metabolic complications ( 5 ). Another team also showed that a dietary intervention (a 6-week diet) increased diversity in people with loss of diversity ( 2 ).
Plus récemment, une étude longitudinale anglaise (6) portant sur plus de 1600 personnes a également confirmé ces résultats en montrant que les individus sains avec une perte de diversité prennent plus de poids au cours de leur vie.More recently, an English longitudinal study ( 6 ) involving more than 1600 people also confirmed these results by showing that healthy individuals with loss of diversity gain more weight over their lifetime.
Il est également connu que la prise d’antibiotiques est responsable d’une perte temporaire de diversité, qui varie en durée d’un individu à l’autre. Cette perte de diversité diminue le potentiel protecteur du microbiote intestinal, c’est-à-dire sa capacité à combattre les bactéries pathogènes extérieures et ouvre une opportunité pour l’émergence de bactéries commensales qui deviennent nocives suite à des perturbations de leur environnement (7).It is also known that taking antibiotics is responsible for a temporary loss of diversity, which varies in duration from one individual to another. This loss of diversity decreases the protective potential of the intestinal microbiota, i.e. its ability to fight external pathogenic bacteria and opens an opportunity for the emergence of commensal bacteria that become harmful following disturbances in their environment ( 7 ).
Dans ce contexte, il est indispensable de disposer d’un test rapide et fiable pour détecter très facilement l’état de diversité bactérienne intestinale d’un individu (sans avoir à prélever d’échantillon par biopsie ou par colonoscopie, ce qui est douloureux et dangereux pour le patient). La présente invention remplit ce besoin, en proposant une méthode très fiable et reproductible, à réaliser sur des échantillons de selles et donc entièrement in vitro.In this context, it is essential to have a rapid and reliable test to very easily detect the state of intestinal bacterial diversity of an individual (without having to take a sample by biopsy or colonoscopy, which is painful and dangerous for the patient). The present invention fulfills this need, by proposing a very reliable and reproducible method, to be carried out on stool samples and therefore entirely in vitro.
L’inventeur a identifié une valeur précise qui témoigne de l’état de perte de diversité d’un individu et révèle son état de santé global, comme décrit ci-dessous.The inventor has identified a precise value that testifies to the state of loss of diversity of an individual and reveals his overall state of health, as described below.
Description de l’invention :Description of the invention:
En se basant sur les techniques innovantes de séquençage génétique d'un gène spécifique des bactéries, le gène ARN16s, la méthode de l’invention permet de connaitre la diversité bactérienne du microbiote intestinal à partir d'un échantillon de selles et d'établir ainsi un diagnostic sûr et rapide de perte de diversité bactérienne. L’inventeur a mis au point une méthode extrêmement performante, dont la répétabilité est de 0.10, et la justesse de la mesure est de 0.05.Based on the innovative techniques of genetic sequencing of a specific gene of bacteria, the RNA16s gene, the method of the invention makes it possible to know the bacterial diversity of the intestinal microbiota from a stool sample and thus to establish a sure and rapid diagnosis of loss of bacterial diversity. The inventor has developed an extremely efficient method, the repeatability of which is 0.10, and the accuracy of the measurement is 0.05.
Cette méthode permetin fined’établir objectivement un diagnostic de perte de diversité bactérienne et, dans ce cas, de travailler avec des médecins, nutritionnistes, diététiciens ou naturopathes à augmenter la diversité chez ces patients, de sorte à améliorer la santé générale du patient.This method ultimately makes it possible to objectively establish a diagnosis of loss of bacterial diversity and, in this case, to work with doctors, nutritionists, dieticians or naturopaths to increase diversity in these patients, so as to improve the general health of the patient. .
Les différents choix technologiques tels que la méthode de prélèvement, la technique d’extraction et les méthodes de séquençage influencent les valeurs quantitatives obtenues. L’inventeur a identifié une valeur de référence qui, pour la combinaison des bactéries utilisées dans la méthode de l’invention, permet de classer les patients dans deux catégories, en fonction de leur état de santé. Cette valeur de référence (ou « seuil ») ne se base pas sur la littérature, mais sur une étude exhaustive de deux populations de patients, cumulant plus de 120 échantillons.The different technological choices such as the sampling method, the extraction technique and the sequencing methods influence the quantitative values obtained. The inventor has identified a reference value which, for the combination of bacteria used in the method of the invention, makes it possible to classify patients into two categories, depending on their state of health. This reference value (or "threshold") is not based on the literature, but on an exhaustive study of two patient populations, combining more than 120 samples.
La méthode de l’invention permet de renseigner l’individu sur son état de santé global. Plus précisément, il permet à l’individu de savoir s’il est plus à risque de tomber malade dans les mois à venir, s’il est plus « fragile » que d’autres individus ou dans le cas d’une pathologie établie, s’il est plus à même de se rétablir. Dans ce cas, des compléments diététiques ou un régime alimentaire ou un traitement adapté pourraient rétablir un équilibre du microbiote et permettre audit individu de rétablir une flore diversifiée, plus saine.The method of the invention makes it possible to inform the individual about his overall state of health. More precisely, it allows the individual to know if he is more at risk of falling ill in the months to come, if he is more "fragile" than other individuals or in the case of an established pathology, if he is more likely to recover. In this case, dietary supplements or an adapted diet or treatment could restore a balance of the microbiota and allow said individual to restore a diversified, healthier flora.
De manière plus générale, la méthode de l’invention permet de diagnostiquer une faible diversité bactérienne intestinale chez un individu humain.More generally, the method of the invention makes it possible to diagnose low intestinal bacterial diversity in a human individual.
Par « faible diversité bactérienne », on entend, au sens de la présente invention, une diversité alpha calculée selon la formule de Shannon sur la base de 10000 reads qui est inférieure au seuil de 5.57.By “low bacterial diversity” is meant, within the meaning of the present invention, an alpha diversity calculated according to the Shannon formula on the basis of 10000 reads which is lower than the threshold of 5.57.
Dans le cadre de l’invention, la « diversité α » ou « alpha diversité » ou « diversité alpha » est la mesure du nombre total d'espèces bactériennes présentes dans un échantillon de selles de taille fixe pondéré par la fréquence à un temps donné. Cette diversité se mesure par exemple en utilisant la formule de Shannon (ou « entropie »), bien connue depuis 1948 (9) et couramment appliquée en métagénomique (10).In the context of the invention, the "α diversity" or "alpha diversity" or "alpha diversity" is the measurement of the total number of bacterial species present in a stool sample of fixed size weighted by the frequency at a given time. . This diversity is measured, for example, using the Shannon formula (or “entropy”), well known since 1948 (9) and commonly applied in metagenomics (10).
La méthode de l’invention nécessite de mesurer la diversité alpha des bactéries contenues dans l’échantillon de selles de l’individu testé (voir ci-dessous).The method of the invention requires measuring the alpha diversity of the bacteria contained in the stool sample of the tested individual (see below).
Le calcul de l’alpha diversité peut s’obtenir automatiquement à partir de logiciels d’analyses existants comme Mothur, Qiime ou d’autres, connus de l’homme de l’art.The calculation of alpha diversity can be obtained automatically from existing analysis software such as Mothur, Qiime or others known to those skilled in the art.
Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de l’invention comprenant les étapesin vitrosuivantes:In a particular embodiment, the method of the invention comprising the following in vitro steps:
a) Mesurer la diversité alpha des bactéries présentes dans un échantillon de selles dudit individu,a) Measure the alpha diversity of the bacteria present in a stool sample of said individual,
b) Comparer la valeur obtenue à l’étape a) avec la valeur seuil de 5.57.b) Compare the value obtained in step a) with the threshold value of 5.57.
De préférence, si la diversité alpha calculée à l’étape b) est inférieure strictement à 5.57, alors ledit individu présente une flore bactérienne intestinale de faible diversité.Preferably, if the alpha diversity calculated in step b) is strictly less than 5.57, then said individual has an intestinal bacterial flora of low diversity.
A l’inverse, si la diversité alpha calculée à l’étape b) est supérieure à 5.57, alors ledit individu présente une flore bactérienne intestinale ayant une diversité normale, voire élevée, ce qui permet de déduire que l’état de santé dudit individu est bon.Conversely, if the alpha diversity calculated in step b) is greater than 5.57, then said individual has an intestinal bacterial flora with a normal or even high diversity, which makes it possible to deduce that the state of health of said individual is good.
La méthode de l’invention utilise un ensemble d’éléments spécialement conçus pour permettre la collecte des échantillons de selle au domicile des patients, dans des conditions d’hygiène acceptables et reproductibles. Plus précisément, la méthode de l’invention nécessite d’utiliser un kit contenant au moins :The method of the invention uses a set of elements specially designed to allow the collection of stool samples at patients' homes, under acceptable and reproducible hygienic conditions. More specifically, the method of the invention requires the use of a kit containing at least:
- Un réceptacle protège toilette propre,A receptacle protects clean toilet,
- Une cuillère stérile,A sterile spoon,
- Tube récipient,container tube,
- Un tampon de conservation des ADNs,A DNA preservation buffer,
- Une notice d’utilisation expliquant au patient comment utiliser les différents éléments en vue de permettre à la méthode de l’invention d’être fiable et reproductible,A user guide explaining to the patient how to use the different elements in order to allow the method of the invention to be reliable and reproducible,
- Eventuellement, une enveloppe et/ou une boite pour envoyer l’échantillon au laboratoire de séquençage.Optionally, an envelope and/or a box to send the sample to the sequencing laboratory.
Collecte des sellesStool collection
Par « échantillon de selle », on entend directement les selles d’un patient, recueillies dans des conditions d’hygiène acceptables.By “stool sample”, we mean directly the stool of a patient, collected under acceptable hygienic conditions.
Il est essentiel pour une interprétation correcte des résultats que la selle soit prélevée directement après émission et sans être entrée en contact avec autre chose que le protège siège. En particulier, il est très important que la selle n’ait pas été en contact direct avec l’eau des toilettes ni les toilettes directement. Il est également important de s’assurer qu’il n’y ait eu aucun contact avec d’autres substances du corps humain, telles que les urines ou le sang.It is essential for a correct interpretation of the results that the saddle be taken directly after emission and without having come into contact with anything other than the seat protector. In particular, it is very important that the saddle has not been in direct contact with the toilet water or the toilet directly. It is also important to ensure that there has been no contact with other substances in the human body, such as urine or blood.
Le kit de l’invention contient donc un réceptacle protège-toilette qui permet de collecter les selles en toute sécurité et hygiène. Ce protège toilette est par exemple le réceptacle à selles « EasySampler de GP Medical Devices ApS ».The kit of the invention therefore contains a toilet-protecting receptacle which makes it possible to collect stools in complete safety and hygiene. This toilet protector is for example the “EasySampler” stool receptacle from GP Medical Devices ApS.
Dilution de l’échantillon de sellesDilution of the stool sample
Un petit échantillon de selles est ensuite placé à l’aide d’une cuillère propre (voire stérile) dans un diluant liquide, notamment un tampon de dilution, ce qui permet d'extraire des selles, les microorganismes susceptibles d'être présents, les cibles à détecter et autres composants permettant ensuite de caractériser la présence ou non des bactéries cibles dans l'échantillon liquide obtenu.A small stool sample is then placed using a clean (or even sterile) spoon in a liquid diluent, in particular a dilution buffer, which makes it possible to extract from the stool, the microorganisms likely to be present, the targets to be detected and other components then making it possible to characterize the presence or not of the target bacteria in the liquid sample obtained.
Le tampon de dilution présent dans l'échantillon liquide contient, en général, une base tampon, une protéine de charge dénaturée et un détergent. A titre d'exemple de base tampon, on peut citer un tampon phosphate, un tampon tris-HCI. A titre d'exemple de protéine de charge dénaturée, on peut citer la caséine, l'ovalbumine et l'albumine sérique bovine. A titre de détergent, on peut citer les détergents ioniques tels que le Triton™ X100 et le Tween® 20. De préférence, le tampon de dilution utilisé dans le kit de l’invention est le stabilisateur DNA/RNA ShieldTM commercialisé par Ozyme, ou encore le tampon RNA later® (Ambion) ou le Stool DNA stabilizer (Invitek), ou OMNIgene GUT (DNAGenotek) ou un mélange de EDTA et de DMSO.The dilution buffer present in the liquid sample generally contains a buffer base, a denatured bulking protein and a detergent. By way of example of a buffer base, mention may be made of a phosphate buffer, a tris-HCl buffer. By way of example of a denatured filler protein, mention may be made of casein, ovalbumin and bovine serum albumin. By way of detergent, mention may be made of ionic detergents such as Triton™ X100 and Tween® 20. Preferably, the dilution buffer used in the kit of the invention is the DNA/RNA Shield stabilizerTM marketed by Ozyme, or else the buffer RNA later® (Ambion) or the Stool DNA stabilizer (Invitek), or OMNIgene GUT (DNAGenotek) or a mixture of EDTA and DMSO.
La quantité de selles par volume de tampon de dilution est, de préférence, de 10 à 500 mg/ml de tampon de dilution, de préférence encore de 100 à 300 mg/ml, 100 et 130 mg/ml étant préférés.The amount of stool per volume of dilution buffer is preferably 10 to 500 mg/ml of dilution buffer, more preferably 100 to 300 mg/ml, with 100 and 130 mg/ml being preferred.
Pour pouvoir détecter l’ADN bactérien en toute sécurité, il convient que sa quantité minimale dans l’échantillon soit comprise entre 0.8 et 8.8pg/µl (cette quantité dépend du type de bactérie).To be able to detect bacterial DNA safely, its minimum quantity in the sample should be between 0.8 and 8.8pg/µl (this quantity depends on the type of bacteria).
La méthode de l’invention peut être mise en œuvre sur tout individu humain. De préférence, elle est mise en œuvre sur des individus âgés de plus de quatre ans. En effet, des études ont montré que le microbiote intestinal atteint l’âge adulte à l’âge de 4 ans. De manière encore plus préférée, elle est mise en œuvre sur des individus issus de population européennes. En effet, le microbiote américain serait moins diversifié que le microbiote français et, à l’inverse, les peuples vivant dans des conditions « primitives » auraient une diversité plus élevée.The method of the invention can be implemented on any human individual. Preferably, it is implemented on individuals aged over four years. Indeed, studies have shown that the intestinal microbiota reaches adulthood at the age of 4 years. Even more preferably, it is implemented on individuals from European populations. Indeed, the American microbiota would be less diversified than the French microbiota and, conversely, peoples living in “primitive” conditions would have a higher diversity.
De préférence, l’individu est un humain ne souffre d’aucun symptôme au moment de la collecte de l’échantillon. D’apparence « saine », il peut pourtant présenter une faible diversité bactérienne intestinale et risquer de tomber malade dans un futur proche.Preferably, the individual is a human not suffering from any symptoms at the time of sample collection. Of "healthy" appearance, it can nevertheless present a low intestinal bacterial diversity and risk falling ill in the near future.
L’individu peut également présenter des symptômes d’une maladie ou infection (fièvre, douleurs, gêne, etc.) et la méthode de l’invention sert alors à évaluer si son état peut s’améliorer ou si le traitement auquel il s’astreint est efficace. Notamment, la méthode de l’invention peut être appliquée à un individu à qui un traitement a été prescrit, mais qui ne répond pas à ce traitement.The individual may also present symptoms of a disease or infection (fever, pain, discomfort, etc.) and the method of the invention is then used to assess whether his condition can improve or whether the treatment to which he is compelled is effective. In particular, the method of the invention can be applied to an individual to whom a treatment has been prescribed, but who does not respond to this treatment.
Détection des bactéries par la technologie 16sDetection of bacteria by 16s technology
La technologique de séquençage « ARN16s » est bien connue de l’homme du métier (8). Cette technique innovante est très fiable. Les séquences permettant d’amplifier ce gène ou une partie de ce gène, en particulier les régions hypervariables V3-V4, sont bien connues.The “16s RNA” sequencing technology is well known to those skilled in the art ( 8 ). This innovative technique is very reliable. The sequences making it possible to amplify this gene or part of this gene, in particular the hypervariable regions V3-V4, are well known.
La détection de l’ADN ribosomal 16s peut se faire par n’importe quel moyen connu de l’homme du métier.The detection of 16s ribosomal DNA can be done by any means known to those skilled in the art.
Les amorces utilisées par l’inventeur dans le cadre des exemples ci-dessous sont listées dans le listage de séquences associé à la demande, sous les numéros SEQ ID NO :1 et 2.The primers used by the inventor in the context of the examples below are listed in the sequence listing associated with the application, under the numbers SEQ ID NO: 1 and 2.
SEQ ID NO :1 (amorce sens) =SEQ ID NO:1 (forward primer) =
5' - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG - 3'5' - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG - 3'
SEQ ID NO :2 (amorce anti-sens) =SEQ ID NO:2 (antisense primer) =
5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC - 3'5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC - 3'
La détection des cibles bactériennes par la technologie 16s est bien décrite dans l’art (cf. (8)). Il n’est donc pas nécessaire de reproduire les détails ici.The detection of bacterial targets by 16s technology is well described in the art (cf. ( 8 )). It is therefore not necessary to reproduce the details here.
A partir des échantillons de selles des individus, les principales étapes au préalable de cette détection sont :Based on stool samples from individuals, the main steps prior to this detection are:
i) extraire l’ADN présent dans l’échantillon (lyse cellulaire, séparation des molécules contaminantes non-ADN et récupération des ADNs purifiés, concentrés)i) extract the DNA present in the sample (cell lysis, separation of non-DNA contaminating molecules and recovery of purified, concentrated DNAs)
ii) quantifier l’ADN obtenu pour vérifier qu’il est en quantité suffisante pour réaliser l’analyse 16s (typiquement au moins 5ng/µL)ii) quantify the DNA obtained to verify that it is in sufficient quantity to carry out the 16s analysis (typically at least 5ng/µL)
iii) éventuellement, amplifier l’ADN de l’échantillon avant le séquençage 16s.iii) optionally, amplify sample DNA prior to 16s sequencing.
Il est recommandé d’amplifier l’ADN ribosomal contenu dans l’échantillon par des techniques de PCR, en utilisant des amorces spécifiques des régions hypervariables, pour ensuite séquencer les amplicons obtenus et en détecter la quantité, qui sera représentative de la quantité de bactéries initialement présente dans l’échantillon.It is recommended to amplify the ribosomal DNA contained in the sample by PCR techniques, using specific primers for the hypervariable regions, to then sequence the amplicons obtained and detect the quantity, which will be representative of the quantity of bacteria. initially present in the sample.
L'amplification passe par l'utilisation d'amorces nucléotidiques capables d'hybrider avec des séquences complémentaires présentes dans les molécules d'acides nucléiques servant de matrices. Il s'agit là d'une technique simple, facile à mettre en œuvre en routine, fiable et reproductible car les outils utilisés, notamment les amorces, l'ADN polymérase et, dans le cas des amplifications thermo-dépendantes, les conditions de température, sont spécifiques et adaptées.Amplification involves the use of nucleotide primers capable of hybridizing with complementary sequences present in the nucleic acid molecules serving as templates. This is a simple technique, easy to implement routinely, reliable and reproducible because the tools used, in particular the primers, the DNA polymerase and, in the case of thermo-dependent amplifications, the temperature conditions , are specific and adapted.
Dans le cadre de l'identification des bactéries, l'amplification, notamment la PCR, peut être appliquée seule ou, pour une différenciation plus fine des espèces, couplée à d'autres techniques, parmi lesquelles la détermination de la séquence des produits d'amplification, le RFLP et le polymorphisme de taille des produits d'amplification. La mise en œuvre de ces dernières combinaisons de techniques, plus longue et plus lourde, n'est cependant pas nécessaire à l'établissement d'une analyse de routine.In the context of the identification of bacteria, amplification, in particular PCR, can be applied alone or, for a finer differentiation of species, coupled with other techniques, including the determination of the sequence of the products of amplification, RFLP and length polymorphism of amplification products. The implementation of these last combinations of techniques, longer and more cumbersome, is however not necessary for the establishment of a routine analysis.
Le séquençage 16s peut ensuite être réalisé grâce à une technologie classique, par exemple ABI 3730, 454FLX Titanium, Illumina, PacBio, Ion Torrent, OxfordNanopore, etc. (voir tableau 1 de (8)).16s sequencing can then be performed using conventional technology, e.g. ABI 3730, 454FLX Titanium, Illumina, PacBio, Ion Torrent, OxfordNanopore, etc. (see Table 1 of ( 8 )).
Les fichiers de séquençage obtenus sont des fichiers « fastq », format connu de l’homme de l’art.The sequencing files obtained are “fastq” files, a format known to those skilled in the art.
Calcul de la diversité bactérienneCalculation of bacterial diversity
La diversité bactérienne est déterminée selon la formule de Shannon, sur la base d’un nombre fixé de reads d’ARN16s.Bacterial diversity is determined according to Shannon's formula, based on a fixed number of 16sRNA reads.
La formule pour calculer la diversité de Shannon est la suivante :The formula for calculating Shannon diversity is:
Où n est le nombre d’OTU, Operational Taxonomic Units, détectés à une profondeur donnée, préférentiellement 10.000 reads. p est la fréquence pour chaque OTU. L’équation utilisée ici se base sur un log2, néanmoins elle peut également se baser sur le logarithme naturel (ln).Where n is the number of OTUs, Operational Taxonomic Units, detected at a given depth, preferably 10,000 reads. p is the frequency for each OTU. The equation used here is based on a log2, however it can also be based on the natural logarithm (ln).
La valeur de l’alpha diversité d’un échantillon peut s’obtenir automatiquement à partir de logiciels d’analyses existants comme Mothur, Qiime ou d’autres, connus de l’homme de l’art (10).The value of the alpha diversity of a sample can be obtained automatically from existing analysis software such as Mothur, Qiime or others, known to those skilled in the art ( 10 ).
Kit de l’inventionInvention kit
Dans un autre aspect, la présente invention concerne un kit pour détecter la diversité bactérienne intestinale humaine, ledit kit comprenant les moyens aptes à détecter l’ensemble des bactéries présentes à au moins 1/10000 dans un échantillon d’ADN.In another aspect, the present invention relates to a kit for detecting human intestinal bacterial diversity, said kit comprising the means capable of detecting all the bacteria present at at least 1/10,000 in a DNA sample.
De préférence, ledit kit comprend les moyens aptes à détecter les séquences permettant de caractériser la composition taxonomique bactérienne.Preferably, said kit comprises the means capable of detecting the sequences making it possible to characterize the bacterial taxonomic composition.
De manière encore plus préférée, ledit kit comprend les amorces de la région V3-V4 du gène rARN16s, par exemple les amorces ayant pour séquences SEQ ID NO :1 et/ou 2.Even more preferably, said kit comprises the primers for the V3-V4 region of the rRNA16s gene, for example the primers having the sequences SEQ ID NO: 1 and/or 2.
Ce kit peut être mis en vente et servir à un laboratoire d’analyse médicale ou à un hôpital désireux de mettre en pratique la méthode de l’invention sur les échantillons de selle qu’il reçoit, ou qui sont collectés sur place.This kit can be put on sale and used by a medical analysis laboratory or a hospital wishing to put the method of the invention into practice on the stool samples that it receives, or that are collected on site.
Ledit kit peut également contenir tous moyens permettant de stabiliser l’échantillon de selle, notamment un tube de collecte contenant un tampon de dilution, un stabilisateur d’ADN ou d’ARN, un échantillon contrôle, une notice explicative, etc.Said kit may also contain any means for stabilizing the stool sample, in particular a collection tube containing a dilution buffer, a DNA or RNA stabilizer, a control sample, an explanatory note, etc.
Légendes des figures :Figure legends:
Exemples :Examples:
L’objectif de la présente étude est de démontrer la performance de la méthode diagnostique objet de la présente invention.The objective of the present study is to demonstrate the performance of the diagnostic method object of the present invention.
1. Etude de calibration1. Calibration study
1.1.1.1. Cohorte analyséeCohort analyzed
Une première étude réalisée sur une cohorte de 29 individus sains, sélectionnés en respectant les critères d’inclusion suivants :A first study carried out on a cohort of 29 healthy individuals, selected according to the following inclusion criteria:
Être en bonne santé physique et mentaleBe in good physical and mental health
Ne pas avoir d'historique de maladie grave ou chroniqueDo not have a history of serious or chronic illness
Ne pas prendre actuellement de médicamentsNot currently taking any medications
Ne pas avoir pris d'antibiotique les trois derniers moisNot having taken antibiotics in the last three months
Ne pas être en surpoids ou en sous poidsNot being overweight or underweight
Ne pas fumer.NO SMOKING.
Les participants étaient des volontaires sains recrutés en France et au Luxembourg, ainsi qu’en Suède. Tous les participants à l’étude ont signé un consentement éclairé (HealthyECOMI). Les données sont des données rapportées par les participants.The participants were healthy volunteers recruited in France and Luxembourg, as well as in Sweden. All study participants signed informed consent (HealthyECOMI). The data is data reported by the participants.
Les caractéristiques en termes de pays de recrutement et d’âge sont données ci-après. L’âge minimal était de 12 ans.The characteristics in terms of country of recruitment and age are given below. The minimum age was 12 years old.
1.2.Collecte des échantillons de selle 1.2. Collection of stool samples
Les échantillons de selles ont été prélevés au domicile des individus testés selon le protocole suivant :The stool samples were taken from the homes of the individuals tested according to the following protocol:
a. Le réceptacle à selles EasySampler de GP Medical Devices ApS a été placé sous la lunette des toilettes, et collé comme recommandé par le fabricant. Puis la lunette des toilettes a été rabattue.To. The GP Medical Devices ApS EasySampler stool receptacle was placed under the toilet seat, and glued as recommended by the manufacturer. Then the toilet seat was folded down.
b. Le prélèvement de selle est réalisé par l’individu testé, grâce à un tube de collecte fourni à cet effet.b. The stool sample is taken by the individual tested, using a collection tube provided for this purpose.
Le tube de collecte utilisé est celui de Zymo Research, commercialisé en France par Ozyme sous la référence ZR1101 DNA/RNA Shield - Fecal Collection Tube. Ce tube a deux bénéfices majeurs : premièrement il inclut une cuillère qui est attachée au bouchon du tube, ce qui permet un prélèvement hygiénique. Deuxièmement le tube contient un conservateur qui permet la stabilisation à température ambiante des selles, ce qui permet à son tour un envoi postal, ce qui est essentiel pour la facilité d’utilisation pour le client. Un code barre est apposé sur le tube pour l’identification en vue de l’étape d’analyse.The collection tube used is that of Zymo Research, marketed in France by Ozyme under the reference ZR1101 DNA/RNA Shield - Fecal Collection Tube. This tube has two major benefits: firstly it includes a spoon which is attached to the cap of the tube, which allows for hygienic sampling. Secondly the tube contains a preservative which allows stabilization at room temperature of the stool, which in turn allows mailing, which is essential for ease of use for the customer. A barcode is affixed to the tube for identification for the analysis step.
Dans le tube Zymo, le conservateur utilisé est le DNA/RNA Shield®. Il permet de stocker l’échantillon à une température comprise entre 4°C et 25°C pendant au moins un mois, de sorte que les ADNs et ARNs présents dans l’échantillon ne sont pas dégradés avant l’étape d’analyse génomique.In the Zymo tube, the preservative used is DNA/RNA Shield®. It allows the sample to be stored at a temperature between 4°C and 25°C for at least one month, so that the DNAs and RNAs present in the sample are not degraded before the genomic analysis step.
L’individu a dévissé le tube, et a prélevé un échantillon de selles grâce à la petite cuillère intégrée au bouchon (la taille de l’échantillon est variable, environ celle d’un petit pois). Les individus ne doivent pas toucher la selle avec autre chose que la cuillère. Et la cuillère ne doit rien toucher d’autre que la selle, avant d’être remise dans le tube.The individual unscrewed the tube, and took a stool sample using the small spoon integrated into the cap (the size of the sample is variable, approximately that of a pea). Individuals should not touch the saddle with anything other than the spoon. And the spoon should not touch anything other than the saddle, before it is put back into the tube.
Une fois la cuillère insérée dans le tube, le bouchon a été fermé hermétiquement puis le tube a été agité plusieurs fois afin de dissoudre l’échantillon.Once the spoon was inserted into the tube, the cap was closed tightly and the tube was shaken several times to dissolve the sample.
Toutes ces informations sont consignées dans une notice d’utilisation très précise que l’individu doit scrupuleusement respecter.All this information is recorded in a very precise user manual that the individual must scrupulously respect.
Le testeur a inséré ensuite le tube fermé dans une enveloppe protectrice (fournie) et a placé le tout dans une boite (également fournie) avec le formulaire de retour. La boite a été postée sous un délai d’une semaine, pour être analysée à cette échéance.The tester then inserted the closed tube into a protective envelope (provided) and placed everything in a box (also provided) with the return form. The box was posted within a week, to be analyzed by this deadline.
1.3.Analyse de la diversité bactérienne 1.3. Analysis of bacterial diversity
L’échantillon a été conservé à température ambiante jusqu’à l’extraction de l’ADN.The sample was stored at room temperature until DNA extraction.
Les échantillons collectés ont été analysés avec un processus strictement standardisé. La diversité bactérienne a été mesurée à partir de l’équation de Shannon. Les analyses bio-informatiques ont été réalisées à l’aide du logiciel Qiime2 et la base de données RDP a été utilisée pour l’annotation taxonomique.The collected samples were analyzed with a strictly standardized process. Bacterial diversity was measured using Shannon's equation. Bioinformatics analyzes were performed using Qiime2 software and the RDP database was used for taxonomic annotation.
Les ADN contenus dans les échantillons ont été analysés en amplifiant la région V3-V4 du gène ribosomal ARNr16s à l’aide des amorces SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO:2. La région amplifiée est ainsi de 550 +- 50bp. Puis cette région a été séquencée en utilisant un séquenceur MiSeq d’Illumina. Ce séquençage a permis de générer des séquences appariées de 400 bases pour chaque échantillon.The DNAs contained in the samples were analyzed by amplifying the V3-V4 region of the ribosomal rRNA16s gene using primers SEQ ID NO:1 and SEQ ID NO:2. The amplified region is thus 550 +/- 50bp. This region was then sequenced using an Illumina MiSeq sequencer. This sequencing made it possible to generate paired sequences of 400 bases for each sample.
Les valeurs obtenues p sont présentées dans le tableau 1.The obtained p values are shown in Table 1.
Tableau 1: Valeurs de références de la diversité bactérienne obtenue à partir des 29 individus sains.Table 1: Reference values of bacterial diversity obtained from 29 healthy individuals.
La valeur de 5.573 correspond à la valeur du premier quartile.The value of 5.573 corresponds to the value of the first quartile.
La moyenne de diversité dans la cohorte de calibration saine est de 5.76 et l’écart-type de 0.43.The diversity mean in the healthy calibration cohort is 5.76 and the standard deviation is 0.43.
Dans les publications, la diversité bactérienne mesurée chez les patients malades de Crohn était d’environ 4.7.In the literature, the bacterial diversity measured in Crohn's disease patients was around 4.7.
Un calcul de puissance statistique (par exemple le « Two-sample t test power calculation ») a mis en évidence qu’un test réalisé sur des groupes de 7 patients atteint déjà une puissance statistique de 99% pour détecter une différence entre les groupes sains et malades. Pour une diminution plus faible de la diversité, par exemple de 0.5, la puissance était alors de 64.8%. Un faible échantillonnage est donc suffisant pour identifier une perte de diversité de plus de 0.5.A statistical power calculation (for example the "Two-sample t test power calculation") has shown that a test carried out on groups of 7 patients already reaches a statistical power of 99% to detect a difference between the healthy groups and sick. For a smaller decrease in diversity, for example 0.5, the power was then 64.8%. A small sampling is therefore sufficient to identify a loss of diversity of more than 0.5.
2. Etude de validation2. Validation study
La valeur seuil de 5,57 a été sélectionnée à partir de la valeur estimée du 1erquartile (25% de la population) dans la population de calibrage.The threshold value of 5.57 was selected from the estimated value of the 1st quartile (25% of the population) in the calibration population.
L’étape de validation de la méthode de l’invention a été réalisée en comparant la valeur de référence (5.57) aux valeurs mesurées pour 100 patients dont l’état de santé était rapporté par eux-mêmes via un auto-questionnaire. L’hypothèse statistique testée était que les personnes diagnostiquées avec une faible diversité bactérienne étaient plus fréquemment en mauvaise santé que les autres.The validation step of the method of the invention was carried out by comparing the reference value (5.57) with the values measured for 100 patients whose state of health was reported by themselves via a self-questionnaire. The statistical hypothesis tested was that people diagnosed with low bacterial diversity were more frequently in poor health than those without.
Les analyses ont été menées selon les mêmes paramètres / protocoles que pour l’étape de calibration.The analyzes were carried out according to the same parameters/protocols as for the calibration step.
Cette étude de validation a permis de démontrer l’association entre une perte de diversité bactérienne du microbiote et l’auto déclaration de mauvaise santé des patients.This validation study made it possible to demonstrate the association between a loss of bacterial diversity of the microbiota and the self-declaration of poor health of patients.
Les caractéristiques démographiques, c’est-à-dire le sexe, l’âge et le BMI, des 100 personnes constituants la cohorte de validation sont décrites sur la figure 2A-C.The demographic characteristics, i.e. sex, age and BMI, of the 100 people constituting the validation cohort are depicted in Figure 2A-C.
Les 100 patients testés ont tous répondu à un questionnaire court, contenant notamment l’auto-évaluation de leur état de santé. A la question « Comment décririez-vous votre état de santé général », 5 réponses étaient possibles :The 100 patients tested all answered a short questionnaire, including the self-assessment of their state of health. To the question “How would you describe your general state of health”, 5 answers were possible:
ExcellentExcellent
Très bonVery good
BonGood
Pas très bonNot very good
MauvaisBad
Le taux de réponse a été de 6 « excellent », 20 « très bon », 38 « bon », 29 « pas très bon » et 7 « mauvais ».The response rate was 6 “excellent”, 20 “very good”, 38 “good”, 29 “not very good” and 7 “poor”.
Afin de comparer la diversité entre deux groupes de patients, le test de wilcoxon a été appliqué sur la mesure de diversité. La p-valeur a été calculée en se basant sur l’hypothèse que la diversité est diminuée chez les malades.In order to compare the diversity between two groups of patients, the Wilcoxon test was applied to the measure of diversity. The p-value was calculated based on the assumption that diversity is decreased in patients.
Comme attendu, la diversité des patients qui se déclarent en mauvaise santé est diminuée de façon significative par rapport à la cohorte de référence saine (p-value < 0.01) et par rapport aux patients qui se déclarent en bonne santé (p-valeur=0.01). Une légère différence (non significative statistiquement) s’observe déjà chez les personnes répondant que leur état de santé n’est « pas très bon ».As expected, the diversity of patients who declare themselves to be in poor health is significantly reduced compared to the healthy reference cohort (p-value < 0.01) and compared to patients who declare themselves to be in good health (p-value = 0.01 ). A slight difference (not statistically significant) is already observed among people who answer that their state of health is “not very good”.
La distribution des valeurs de diversité des individus sains, en très bonne santé et en bonne santé est comparable à la cohorte saine de référence validant également ainsi la valeur de référence obtenue dans une population saine indépendante (voir Figure 3).The distribution of diversity values of healthy, very healthy and healthy individuals is comparable to the healthy reference cohort, thus also validating the reference value obtained in an independent healthy population (see Figure 3).
Tableau 2 : Performances du test de l’invention en fonction de l'état de santé et à des seuils différentsTable 2: Performance of the test of the invention according to the state of health and at different thresholds
Cette étude basée sur 100 individus a permis de démontrer l’association entre une perte de diversité bactérienne du microbiote, diagnostiquée par le test de l’invention, et l’auto déclaration de mauvaise santé des patients.This study based on 100 individuals demonstrated the association between a loss of bacterial diversity of the microbiota, diagnosed by the test of the invention, and patients' self-declaration of poor health.
En outre, les résultats obtenus dans le cadre de l’étude de calibration démontrent que, dans une population européenne saine, 25% des personnes sont dans un état de faible diversité bactérienne (seuil à 5.57). Dans une population européenne se déclarant en mauvaise santé, au contraire, 86% des personnes sont dans cet état de faible diversité (seuil à 5.57).In addition, the results obtained in the context of the calibration study show that, in a healthy European population, 25% of people are in a state of low bacterial diversity (threshold at 5.57). In a European population declaring itself to be in poor health, on the contrary, 86% of people are in this state of low diversity (threshold at 5.57).
Le test de l’invention permet donc, à partir d’un simple échantillon de selle, de diagnostiquer une faible diversité bactérienne dans le microbiote intestinal humain et, ainsi, de diagnostiquer un risque accru de maladies, notamment des maladies inflammatoires de l’intestin, comme la maladie de Crohn mais également l’obésité, le diabète et bien d’autres.The test of the invention therefore makes it possible, from a simple stool sample, to diagnose a low bacterial diversity in the human intestinal microbiota and, thus, to diagnose an increased risk of diseases, in particular inflammatory bowel diseases. , such as Crohn's disease but also obesity, diabetes and many others.
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10.Lozupone C.A., Knight R. Species divergence and the measurement of microbial diversity. FEMS Microbiol. Rev. 2008;32:557–578 10. Lozupone CA, Knight R. Species divergence and the measurement of microbial diversity. FEMS Microbiol. Rev. 2008;32:557–578
Claims (9)
a) Mesurer la diversité alpha des bactéries présentes dans un échantillon de selles dudit individu,
b) Comparer la valeur obtenue à l’étape a) avec la valeur seuil de 5.57. In vitro method for diagnosing low intestinal bacterial diversity in a human individual, comprising the steps:
a) Measure the alpha diversity of the bacteria present in a stool sample of said individual,
b) Compare the value obtained in step a) with the threshold value of 5.57.
a) Mesurer la diversité alpha des bactéries présentes dans un échantillon de selles dudit individu,
b) Comparer la valeur obtenue à l’étape a) avec la valeur seuil de 5.57,
dans laquelle, si la diversité alpha calculée à l’étape b) est inférieure strictement à 5.57, alors ledit individu risque de tomber malade. In vitro method for predicting whether an individual is at risk of becoming ill, comprising the steps:
a) Measure the alpha diversity of the bacteria present in a stool sample of said individual,
b) Compare the value obtained in step a) with the threshold value of 5.57,
in which, if the alpha diversity calculated in step b) is strictly less than 5.57, then said individual risks falling ill.
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