FR3088640A1 - Nouveau polypeptide se liant specifiquement a la proteine p16 - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un nouveau polypeptide comprenant au moins un domaine variable (VHH) d’un anticorps à domaine unique se liant spécifiquement à la protéine P16 ou d’un dérivé de celui-ci, caractérisé en ce que le domaine variable comprend des séquences spécifiques pour les CDR1, CDR2 et CDR3 ; et les utilisations de ce polypeptide, notamment dans un procédé de diagnostic in vitro du cancer du col de l’utérus.
Description
Description
Titre de l’invention : NOUVEAU POLYPEPTIDE SE LIANT SPECIFIQUEMENT A LA PROTEINE P16
Domaine technique [0001] La présente invention concerne le domaine du diagnostic et, plus spécifiquement, le domaine du diagnostic du cancer du col de l’utérus.
[0002] Art antérieur à l’invention :
[0003] Le cancer du col de l’utérus constitue aujourd’hui une préoccupation majeure puisqu’il correspond à la deuxième forme la plus fréquente de cancer chez les femmes à l’échelle mondiale après le cancer du sein. Dans près de 99% des cas, il est la résultante d’une infection par le papillomavirus humain.
[0004] Le dépistage des lésions précancéreuses est possible grâce à la pratique du frottis de dépistage, dans laquelle on recherche la présence de lésions visibles à l’œil nu. Maintenant, de nouveaux biomarqueurs, tels que les protéines E6-E7 des virus HPV ou la protéine P16 ont été utilisées lors d’études initiales et ont montré des résultats prometteurs lors d’études cliniques.
[0005] Pour ce qui est de la protéine P16, elle est codée par un cadre ouvert de lecture d’environ 150 acides aminés, au sein du gène cdkn2A, codant pour une protéine de 16 kDa de poids moléculaire qui comprend quatre répétitions ankyrine. Cette protéine P16, également dénommée P16INK4a, présente une activité suppresseur de tumeur qui est liée à son rôle dans la régulation du cycle cellulaire où elle agit en ralentissant la progression de la cellule de la phase G1 à la phase S. Elle est ainsi impliquée dans la prévention des cancers, notamment le mélanome, le cancer du col de l’utérus ou encore le cancer de l’œsophage et est utilisée comme biomarqueur en lien avec de nombreux cancers. La détection de la surexpression de P16INK4a dans des échantillons biologiques est ainsi un marqueur utile de lésions anogénitales comme le carcinome du col de l’utérus (cf. Demande internationale WO 00/01845).
[0006] Maintenant, les tests ciblant ces biomarqueurs, et notamment P16, utilisent des anticorps monoclonaux conventionnels qui sont coûteux à produire et sont peu stables. En conséquence, le prix final de ces tests est loin d’être négligeable ce qui complique d’autant leur utilisation à grande échelle et la mise en place d’une vraie prévention du cancer du col de l’utérus.
[0007] Description détaillé de l’invention :
[0008] Les inventeurs ont maintenant identifié un anticorps à domaine unique présentant une très forte spécificité pour la protéine P16 et permettant d’envisager sa détection, notamment sous la forme d’un kit pour la détection de la surexpression de P16INK4a dans des échantillons biologiques, notamment pour la détection de lésions anogénitales en vue du diagnostique du cancer du col de l’utérus.
[0009] En conséquence, un premier objet de l’invention porte sur un polypeptide comprenant au moins un domaine variable (VHH) d’un anticorps à domaine unique se liant spécifiquement à la protéine P16 ou d’un dérivé de celui-ci, lequel domaine variable comprend les séquences CDR suivantes :
[0010] RYGIG (SEQ id n°l) pour la région CDR1 ;
[0011] GTNLSGGSTYYVDTVKG (SEQ id n°2) pour la région CDR2 ; et [0012] SAYGYVSPELYKY (SEQ id n°3) pour la région CDR3.
[0013] Par protéine P16, on entend la protéine humaine présentant le numéro d’accession P42771.
[0014] Par « capable de se lier spécifiquement à la protéine P16 », on entend un polypeptide présentant une constante de dissociation (KD) avec la protéine P16, laquelle correspond à l’inverse de la constante d’association (KA), comprise entre 10-6 à 10-14 moles/litre (M), de préférence entre 10-7 à 10-14 moles/litre (M) et, de manière particulièrement préférée, entre 10-8 à 10-14 moles/litre (M). Une telle valeur peut être déterminée simplement par l’homme du métier à l’aide de méthodes connues, par exemple à l’aide d’un BIACORE qui utilise la SPR (Surface Plasmon Resonance).
[0015] Les anticorps à domaine unique sont des anticorps identifiés chez les camélidés qui ont la particularité de ne posséder que des chaînes lourdes. Il en résulte que l’activité de liaison de ces anticorps ne dépend d’aucune chaîne légère. Au final, ces anticorps ne comprennent qu’un seul domaine variable (VHH) et deux domaines constants (CH2 et CH3).
[0016] Dans le cas présent, le polypeptide selon l’invention peut comprendre ou non les deux domaines constants CH2 et CH3. Maintenant et préférentiellement, le polypeptide selon l’invention ne comprendra pas ces deux domaines constants.
[0017] Pour ce qui est du domaine variable, dénommé domaine VHH, domaine VHH, fragment d'anticorps VHH, anticorps VHH, NANOBODY® ou domaine NANOBODY®, il présente une structure de type FRI -CDR 1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
[0018] Dans cette structure de type FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, les régions CDR (Complementary-Determining Region) déterminent la complémentarité avec l’antigène et présentent une grande variabilité. D’ailleurs, ce domaine VHH suffit à reconnaître l'antigène avec des propriétés de liaison à l'antigène qui sont similaires à celles des anticorps conventionnels. Maintenant, et avec sa petite taille (15 kDa), ce domaine VHH qui est particulièrement stable et soluble, présente notamment l'avantage de pouvoir être produit de façon recombinante, en masse, chez la bactérie ou d'autres espèces tant procaryotes qu'eucaryotes, le cas échéant en fusion avec une ou plusieurs protéine(s) fonctionnelle(s) d'intérêt, et de pouvoir ainsi être utilisé comme un anticorps monoclonal pour la détection d'un antigène.
[0019] Par séquence dérivé, on entend une séquence polypeptidique présentant un pourcentage d’identité d’au moins 80 %, de préférence d’au moins 90% et de manière particulièrement préférée d’au moins 95% avec la séquence SEQ id n°l, SEQ id n°2 et/ou SEQ id n°3.
[0020] Par pourcentage d’identité entre deux séquences polypeptidiques, on entend le pourcentage d’acides aminés identiques, entre deux séquences devant être comparées, obtenu avec le meilleur alignement possible desdites séquences. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties aléatoirement sur toute la longueur des séquences d’acides aminés. Par meilleur alignement possible ou alignement optimal, on entend l’alignement permettant d’obtenir le pourcentage d’identité le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d’acides aminés sont habituellement réalisées en comparant lesdites séquences après que celles-ci aient été alignées selon le meilleur alignement possible ; la comparaison est alors réalisée sur des segments de comparaison de façon à identifier et comparer des régions de similarité. Le meilleur alignement possible pour effectuer une comparaison peut être réalisé en utilisant l’algorithme d’homologie globale développé par SMITH et WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), en utilisant l’algorithme d’homologie locale développé par NEDDLEMAN et WUNSCH (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970), en utilisant la méthode de similarité développé par PEARSON et LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), en utilisant des programmes d’ordinateur basés sur de tels algorithmes (GAP, BESTPIT, BLAST P, BLAST N, PASTA, TPASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), en utilisant les algorithmes d’alignement multiples MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004 ). Pour obtenir le meilleur alignement possible, on utilisera de préférence le programme BLAST avec la matrice BLOSUM 62 ou la matrice PAM 30. Le pourcentage d’identité est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale, lesdites séquences pourront comprendre des additions ou des délétions au regard de la séquence de référence de sorte d’obtenir le meilleur alignement possible entre ces deux séquences. Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de position identique entre les deux séquences, en divisant le nombre obtenu par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d’identité entre ces deux séquences.
[0021] Dans cette structure de type PR1-CDR1-PR2-CDR2-PR3-CDR3-PR4 toujours, les régions PR (Pramework Region) sont très conservées et participent à la structure 3D.
[0022] Aussi, et en plus des séquences CDR décrites précédemment, le domaine variable de l’anticorps à domaine unique comprend en outre des séquences FR. Ces séquences peuvent être immunogéniques ou non (chez l’homme) selon que l’on envisage ou pas une utilisation thérapeutique du polypeptide selon l’invention. A noter que de telles séquences FR peuvent être simplement identifiées par l’homme du métier.
[0023] De préférence toujours, le VHH est un VHH de camélidé et, de manière particulièrement préférée, il présente la séquence DVQLVESGGGLVQTGGSLRLSCAASGRTFSRYGIGWFRQAPGKEREFVGGTNLSGGSTYYVDTVKGRFTISRDNAKNT VYLQMSSLKPEDTAVYYCAASAYGYVSPELYKYWGQGTQVTVSS (SEQ id n°4).
[0024] A titre d’exemple, le polypeptide selon l’invention comprend la séquence MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADVQLVESGGGLVQTGGSLRLSCAASGRTFSRYGIGW FRQAPGKEREFVGGTNLSGGSTYYVDTVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPE DTAVYYCAASAYGYVSPELYKYWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAA (SEQ id n°5).
[0025] Le polypeptide selon l’invention peut également comprendre un ou plusieurs autres domaines variables (VHH) d’un ou plusieurs autres anticorps à domaine unique se liant spécifiquement soit à la même protéine P16, soit à un autre antigène.
[0026] De préférence, le polypeptide selon l’invention comprend en outre au moins un domaine variable (VHH) d’un anticorps à domaine unique dirigé contre une protéine sérique.
[0027] Une telle protéine sérique peut-être choisie dans le groupe comprenant la sérumalbumine, les immunoglobulines sériques, la transférrine, le fibrinogène et la globuline liant la thyroxine.
[0028] Idéalement, la protéine sérique ciblée est la transférrine.
[0029] De préférence encore, le polypeptide selon l’invention peut comprendre au moins deux domaines variables (VHH) d’un anticorps à domaine unique se liant spécifiquement à la protéine P16, ou d’un dérivé de celui-ci, lequel domaine variable est tel que défini préalablement.
[0030] Les différents domaines variables présents dans le polypeptide selon l’invention peuvent être liés les uns aux autres soit directement, soit par le biais d’un adaptateur. Un tel adaptateur est de préférence un peptide adaptateur sélectionné de manière à ne pas altérer la liaison entre le domaine variable de d’un anticorps à domaine unique avec son épitope. Typiquement, de tels adaptateurs peptidiques présentent une taille d’au moins 3 acides aminés (ex. Ala-Ala-Ala) et, plus généralement, entre 10 et 40 acides aminés.
[0031] Le polypeptide selon l’invention peut également comprendre d’autres séquences protéiques et, notamment, des séquences permettant de faciliter sa purification (Tag Histidine, étiquette GST (Glutathion-S-transférase) ou CBD (domaine de liaison à la chitine) ou sa détection (GFP (Green Fluorescent Protein).
[0032] Le polypeptide selon l’invention peut comprendre en outre des modifications additionnelles comme des résidus glycosyl ou des acides amines présentant des chaînes latérales modifiées, notamment par PEGylation pour augmenter la demi-vie du polypeptide.
[0033] Le polypeptide selon l'invention peut également présenter une séquence N-terminale modifiée, par exemple avec une délétion, d'un ou plusieurs des acides aminés Nterminaux, ou par substitution de sorte d’optimiser son expression en fonction du système d’expression utilisée ou pour être exprimé en tant que corps d'inclusion ou sous forme soluble, ou pour être sécrétés dans le milieu ou dans l'espace périplasmique, pour être contenus dans la cellule ou pour obtenir un produit plus homogène. Les polypeptides de l'invention peuvent avoir une séquence C-terminale modifiée, telle qu'une alanine supplémentaire et / ou d'autres échanges d'acides aminés dans la partie C-terminale ou à d'autres positions définies dans l'une quelconque des régions de la structure, comme expliqué par exemple, dans les demandes internationales WO2012/175741, WO2011/075861 ou WO2013/024059, afin, par exemple, de améliorer encore la stabilité ou réduire l’immunogénicité de ces polypeptides.
[0034] Avantageusement, ledit polypeptide présentant en outre un peptide signal à son extrémité N-terminale, lequel peptide signal permet alors la sécrétion du polypeptide selon l’invention.
[0035] Enfin, le polypeptide peut être couplé à une ou plusieurs autres molécules. A titre d’exemple, on pourra envisager un polypeptide couplé à au moins un fluorophore. A noter que les méthodes permettant de réaliser un tel couplage sont bien connues de l’homme du métier.
[0036] Un deuxième objet de l’invention concerne une composition comprenant un polypeptide tel que décrit précédemment, éventuellement associé à un support acceptable.
[0037] A titre d’exemple de support acceptable, la composition peut comprendre des diluants, des excipients, des stabilisateurs et des conservateurs. De tels additifs sont bien connus de l’homme du métier et sont décrits notamment dans « Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Ed. » (différents éditeurs, 1989-1998, Marcel Dekker); et dans “Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systerri’s (ANSEL et al., 1994, WILLIAMS & WILKINS).
[0038] A titre d’exemple, le polypeptide selon l’invention peut être solubilisé dans un tampon, comme le tampon phosphate salin (PBS), le sérum artificiel (150 mM NaCl dans de l’eau) ou les tampons Tris.
[0039] A noter qu’il existe de nombreuses causes d’instabilité ou de dégradation des polypeptides telles que l’hydrolyse et la dénaturation. Aussi, et avantageusement, la composition peut comprendre au moins un stabilisateur. A titre d’exemple de stabilisateurs, on peut citer les monosaccharrides, les disaccharrides, les polysaccharides, les détergents ioniques et non-ioniques, les sels de métaux alcalins, les phospholipides, les acides gras, les polyols et les peptides stabilisants comme la sérum albumine bovine.
[0040] Un troisième objet de l’invention est un polynucléotide codant pour un polypeptide tel que défini précédemment.
[0041] Ledit polynucléotide correspond à une séquence d’ADN, de préférence ledit polynucléotide est une séquence d’ADN.
[0042] Avantageusement encore, le polynucléotide selon l’invention est lié de façon opérationnelle à une séquence d’expression génique dirigeant l’expression dudit polynucléotide dans une cellule eucaryote ou procaryote, de préférence dans une cellule procaryote. Ladite séquence d’expression génique correspond à toute séquence de régulation, telle qu’une séquence promotrice ou une combinaison entre une séquence promotrice et une séquence activatrice facilitant la transcription et la traduction efficace du polypeptide tel que décrit précédemment.
[0043] Un quatrième objet de l’invention concerne un vecteur d’expression comprenant le polynucléotide tel que décrit précédemment.
[0044] A titre d’exemple de tels vecteurs, on peut citer les plasmides, les cosmides, les virus, les bactériophages dès lors qu’ils présentent les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction de la séquence codant pour le polypeptide selon l’invention dans une cellule donnée.
[0045] Un cinquième objet de l’invention concerne une cellule transformée par un vecteur d’expression tel que décrit précédemment.
[0046] Une telle cellule transformée peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. Si on vise préférentiellement les cellules procaryotes (ex. Escherichia coli), l’utilisation de cellules eucaryotes inférieures (ex. levure comme Saccharomyces cerevisae) peut présenter d’importants avantages.
[0047] La transformation de cellules peut être réalisée selon des techniques bien connues de l’homme du métier (ex. électroporation).
[0048] Un sixième objet de l’invention porte sur un procédé de production d’un polypeptide tel que décrit précédemment, lequel comprend les étapes de :
[0049] La culture de cellules transformées comprenant un vecteur d’expression codant pour un polypeptide selon l’invention dans des conditions permettant l’expression de ce polypeptide ; et [0050] La récupération du polypeptide exprimé par ces cellules transformées ; et [0051] Eventuellement, la purification et/ou la modification et/ou la formulation du polypeptide.
[0052] Il est à noter que la production du polypeptide selon l’invention dans des organismes hôtes tels qu’E. coli ou les levures est particulièrement avantageuse en terme de coûts, en comparaison de ceux nécessaires à la production d’anticorps dans des cellules de mammifères. En outre, les niveaux de production sont particulièrement élevés et compris entre 1 et 10 gZL (E. coli) ou supérieurs à 10 g/1 (levure).
[0053] Un septième objet de l’invention porte sur un procédé in vitro de diagnostic d’un trouble caractérisé par une surexpression de la protéine P16 chez un sujet comprenant les étapes de :
[0054] Mise en contact d’un échantillon biologique provenant dudit sujet avec un polypeptide ou d’une composition tels que décrits précédemment ;
[0055] Détecter la liaison dudit polypeptide au dit échantillon ;
[0056] Comparer la liaison détectée à l’étape b) avec une référence, où une différence dans la liaison par rapport audit échantillon est un diagnostic d’un trouble caractérisé par une surexpression de la protéine P16.
[0057] Tel qu’utilisé ici, le terme « sujet » se réfère à un mammifère, de préférence à un humain et, de manière particulièrement préférée, à une femme.
[0058] Par « trouble caractérisé par une surexpression de la protéine P16 », on entend un cancer dans lequel on peut observer une surexpression de la protéine P16 comme par exemple, le mélanome, le cancer du col de l’utérus, le cancer œsophagien, le carcinome squameux oropharyngé.
[0059] Selon un mode de réalisation préféré, le trouble caractérisé par une surexpression de la protéine P16 est le cancer du col de l’utérus.
[0060] Tel qu’utilisé ici, le terme « échantillon biologique » se réfère à tout échantillon solide ou liquide issu d’un sujet, dès lors qu’il contient des cellules. A titre d’exemple d’échantillons solides, on peut citer un échantillon de peau ou un frottis cervico-utérin et, à titre d’exemple d’échantillons liquides, on peut citer un échantillon de sang. De préférence, l’échantillon biologique est un frottis cervico-utérin.
[0061] Par « surexpression de la protéine P16 », on entend un niveau d’expression au moins cinq (5) fois supérieur au niveau d’expression de référence et, de préférence, au moins dix (10) fois par rapport à ce niveau de référence.
[0062] La détermination du niveau d’expression de la protéine P16 à l’aide du polypeptide de l’invention est fait par des techniques bien connues de l’homme du métier comme Γimmunohistochimie, l’ELISA, l’immunoochromatographie sur membrane et la cytométrie de flux (FACS).
[0063] Par « référence » ou « niveau de référence », on entend le niveau d’expression de la protéine PI6 dans des cellules saines, lequel niveau d’expression peut correspondre à la moyenne d’expression de la protéine P16 dans des cellules saines.
[0064] Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention vise plus particulièrement le suivi d’un traitement thérapeutique d’un trouble caractérisé par une surexpression de la protéine P16 chez un patient caractérisé en ce qu’il comprend la déter mination du niveau d’expression de la protéine P16 dans des échantillons biologiques dudit patient à différents temps de traitement et en ce qu’une augmentation de l’expression de la protéine P16 avec le traitement est indicatif d’une efficacité dudit traitement sur ce patient.
[0065] Dans le cas d’une absence de modification de l’expression ou d’une diminution de l’expression de la protéine P16, ce résultat est indicatif, pour le praticien suivant le sujet, de la nécessité de changer de protocole de traitement.
[0066] Dans ce cas, on entend pus spécifiquement par « trouble caractérisé par une surexpression de la protéine P16 », une pathologie choisie dans le groupe comprenant les ostéosarcomes, le cancer du col de l’utérus et le cancer du sein.
[0067] Un huitième objet de l’invention porte sur un kit pour le diagnostic d’un trouble caractérisé par une surexpression de la protéine P16 comprenant un polypeptide tel que décrit précédemment.
[0068] Les exemples qui suivent sont fournis à titre d’illustration et ne sauraient limiter la portée de la présente invention.
[0069] Identification d’un VHH dirigé contre P16 [0070] En vue d’identifier des VHH dirigés contre la protéine P16, les inventeurs ont utilisés une banque de phages exprimant à leur surface des séquences de domaines VHH.
[0071] En vue d’identifier, parmi ces phages, les séquences VHH se liant à la protéine P16 avec une forte affinité, les inventeurs ont exprimé dans E. coli la protéine P16 humaine fusionnée avec une étiquette histidine et une protéine P16 fusionnée à la protéine MBP (Maltose Binding Protein).
[0072] Ces deux protéines, après purification, ont chacune été adsorbées sur des boîtes de culture. Pour ce faire, ΙΟΟμΙ de solution de protéine cible à une concentration de 20pg/ml ont été déposés par puits de plaque MAXISORP (NUNC) et incubés à 4°C et 650 rpm sur la nuit. Le puits a été par la suite incubé avec 200μ1 d'une solution de PBS- 4%BSA pendant 2h afin de bloquer les sites non occupés par la protéine cible. Suite à cette étape de blocage, ΙΟΟμΙ de solution des phages de la banque ont été déposé dans le puits pour une durée de 2h, à température ambiante, à 650rpm. Ainsi les phages qui exposent à leur surface les VHH spécifiques se fixent à la cible. Les phages présentant des VHH non spécifiques ont été éliminés par 20 lavages avec 250μ1 de PBS-0,l%TWEEN. Les phages présentant des VHH spécifiques de la cible ont ensuite été élués par incubation avec ΙΟΟμΙ de glycine (pH=2,5), pendant 10min sous agitation. Le pH de la solution de phages, élués et prélevés, a été neutralisé par ajout de 60μ1 de Tris (pH=8).
[0073] La caractérisation des tours de sélection se fait d’une part avec le comptage des phages récupérés à la sortie de chaque tour de sélection, et d’autre part, par l’identification de variants isolés qui, exposés sur phages, reconnaissent la cible par un test phage ELISA clonal. Les clones issus des différents tours de sélections sont alors repiqués et les phages correspondants sont produits individuellement pour une meilleure caractérisation.
[0074] Grâce aux sélections faites sur la protéine P16, ce sont finalement 7 séquences de VHH différentes reconnaissant la protéine P16 qui ont été obtenues. A cette étape, les séquences codant pour ces VHH sont dans le phagemide pHEN qui a servi à la construction de la banque. Afin de produire ces VHH à grande échelle dans des bactéries E. coli de la souche BL21, les séquences des 7 VHH retenues ont été clonées dans le vecteur d’expression pET23-NN-GPP ([fig.l]) dans lequel les séquences VHH sont sous la dépendance d’un promoteur inductible par l’IPTG et sont fusionnées avec une séquence GPP et avec une étiquette histidine (6 résidus histidine). A noter que ce polypeptide intègre une séquence de clivage (TEV) permettant de libérer la GPP et l’étiquette histidine et que les sites de restrictions utilisés pour le clonage sont les sites de Ncol et Noth [0075] La production a ensuite été réalisée dans des bactéries E. coli de souche BL21 transformées par choc thermique avec 2μ1 de vecteur et, après une étape d’expression, les cellules ont été récupérées par centrifugation puis le culot a été repris dans un tampon de lyse (50mM TRIS, 25mM HCl, 250mM NaCl, 25mM Imidazole, DNase, Lysosyme), puis soniqué. Les cellules ainsi lysées ont ensuite été centrifugées à 14000g pendant 5 minutes, et le surnageant a été récolté pour procéder à la purification des VHH.
[0076] La purification des VHH a ensuite été effectuée avec une première étape de purification du polypeptide par affinité sur colonne de nickel (HisTrap EE Crude 5ml, GE Healthcare) grâce à la présence de l’étiquette histidine, suivie d’une deuxième étape de purification par passage de l’éluat sur une colonne de gel filtration (HILOAD 26/60 SUPERDEX 75 PG 250ML, HILOAD 26/60 SUPERDEX 200 PG 250ML, GE HEALTHCARE). Les résultats ont montré que sur les 7 séquences VHH, seuls 4 ont pu finalement être produites et purifiées de façon satisfaisante. La figure 2 ([fig.2]) montre un gel SDS-PAGE des 4 VHH obtenus avec une bande à la taille attendue (la protéine de fusion VHH-GEP fait environ 45 kDa) et des bandes contaminantes dont une correspond à la GEP (28kDa).
[0077] L’affinité des 4 VHH obtenu avec la protéine P16 a ensuite été testée. Pour ce faire, les vitesses d’association et de dissociation des 4 VHH ont été mesurées par la méthode de Biolayer Interferometry avec une concentration de VHH de 500 nM.
[0078] Linalement, il ressort de ce travail de criblage qu’un seul et unique VHH (SEQ id n°4) présente une bonne affinité pour P16 (il a pu être déterminé un KD de lOnM (10-9 M) entre ce VHH et P16), les autres VHH ne présentant pas d’affinité pour la protéine P16.
[0079] Détermination de l’affinité du VHH identifié pour la protéine P16 par FACS [0080] En vue de déterminer l’affinité du VHH2 identifié pour sa fixation à la protéine P16 exprimée dans des cellules de mammifères, des cellules des lignées HELA (P16++), HEK (P16+) et CHO (PI6-) incubées avec ce VHH ont été analysées par FACS. A titre de contrôle négatif, un VHH ne se liant pas à P16 a été utilisé (VHH4). Les deux VHH ont été utilisées à une concentration de 100 nM pour cette incubation.
[0081] Les résultats sont montrés dans la figure 3 ([fig.3]) dans laquelle sont présenté les médianes d’intensité de fluorescence (MFI) pour les cellules HELA, HEK et CHO incubées en présence de VHH2 (P 16) ou de VHH4 (contrôle négatif).
[0082] Les résultats montrent que l’on observe bien une fixation spécifique du VHH anti P16 (VHH2) aux cellules exprimant cette protéine (HELA et HEK) et pas aux cellules ne l’exprimant pas (CHO) [0083] La détermination de la constante de dissociation du VHH pour la protéine P16 dans ces deux conditions a révélé un KD de 12,7 nM pour les cellules HELA et de 8,3 nM pour les cellules HEK, soit un KD très proche de celui déterminé préalablement par BLI.
[0084] Aussi, le VHH identifié présente un très bonne spécificité pour la protéine P16, laquelle est maintenue sur cellules, et est donc utilisable dans un test de diagnostic.
[0085] Procédé de diagnostique utilisant le VHH identifié [0086] Par FCAS [0087] Les cellules d’un frottis cervico-utérin sont fixées, perméabilisées avant d’être incubées en présence du VHH dirigé contre la protéine P16, lequel VHH est couplé à un fluorophore. Les cellules sont ensuite sont analysées par FACS (cytométrie de flux).
[0088] Les cellules surexprimant la protéine P16 dans l’échantillon sont alors identifiées simplement.
[0089] Par immunohistochime [0090] Les cellules d’un frottis cervico-utérin sont fixées, perméabilisées avant d’être incubées en présence du VHH dirigé contre la protéine P16, lequel VHH est fusionné à un fragment Fc d’un anticorps humain ou de souris.
[0091] Après lavage, les cellules sont incubées avec un anticorps secondaire dirigé contre le fragment Fc auquel est fusionné le domaine VHH, lequel anticorps secondaire est couplé à une enzyme permettant la détection de cet anticorps (péroxydase, phosphatase alcaline, etc.).
[0092] Après incubation et lavage, la présence de cet anticorps secondaire est mise en évidence à l’aide de l’activité enzymatique de l’enzyme qui lui est couplée.
[0093] Les cellules surexprimant la protéine P16 dans l’échantillon sont alors identifiées simplement.
Claims (1)
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Revendications [Revendication 1] Un polypeptide comprenant au moins un domaine variable (VHH) d’un anticorps à domaine unique se liant spécifiquement à la protéine P16 ou d’un dérivé de celui-ci, caractérisé en ce que le domaine variable comprend les séquences CDR suivantes : - RYGIG (SEQ id n°l) pour la région CDR1 ; - GTNLSGGSTYYVDTVKG (SEQ id n°2) pour la région CDR2 ; et - SAYGYVSPELYKY (SEQ id n°3) pour la région CDR3. [Revendication 2] Le polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit dérivé présente un pourcentage d’identité d’au moins 80 % avec la séquence SEQ id n°l, SEQ id n°2 et/ou SEQ id n°3. [Revendication 3] Le polypeptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le VHH est un VHH de camélidé et, de préférence, il présente la séquence SEQ id n°4. [Revendication 4] Le polypeptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu’il comprend en outre un ou plusieurs autres domaines variables (VHH) d’un ou plusieurs autres anticorps à domaine unique se liant spécifiquement soit à la même protéine P16, soit à un autre antigène. [Revendication 5] Une composition comprenant un polypeptide tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 4, éventuellement associé à un support acceptable. [Revendication 6] Un polynucléotide codant pour un polypeptide tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 4. [Revendication 7] Un vecteur d’expression comprenant le polynucléotide selon la revendication 6. [Revendication 8] Une cellule transformée par un vecteur d’expression selon la revendication 7. [Revendication 9] Un procédé de production d’un polypeptide tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 4, lequel comprend les étapes de : i) La culture de cellules transformées comprenant un vecteur d’expression codant pour un polypeptide tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 4 dans des conditions permettant l’expression de ce polypeptide ; et ii) La récupération du polypeptide exprimé par ces cellules transformées ; θί iii) Eventuellement, la purification et/ou la modification et/ou la for- mulation du polypeptide. [Revendication 10] Un procédé in vitro de diagnostic d’un trouble caractérisé par une surexpression de la protéine P16 chez un sujet comprenant les étapes de : a) Mise en contact d’un échantillon biologique provenant dudit sujet avec un polypeptide tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 4 ou avec une composition tel que défini à la revendication 5; b) Détecter la liaison dudit polypeptide au dit échantillon ; c) Comparer la liaison détectée à l’étape b) avec une référence, où une différence dans la liaison par rapport audit échantillon est un diagnostic d’un trouble caractérisé par une surexpression de la protéine P16. [Revendication 11] Le procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le sujet est une femme. [Revendication 12] Le procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que le trouble caractérisé par une surexpression de la protéine P16 est le cancer du col de l’utérus. [Revendication 13] Le procédé selon l’une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est un frottis cervico-utérin. [Revendication 14] Le procédé selon l’une quelconque des revendications 10 à 14 caractérisé en ce qu’il vise le suivi d’un traitement thérapeutique d’un trouble caractérisé par une surexpression de la protéine P16 chez un patient, en ce qu’il comprend la détermination du niveau d’expression de la protéine P16 dans des échantillons biologiques dudit patient à différents temps de traitement et en ce qu’une augmentation de l’expression de la protéine P16 avec le traitement est indicatif d’une efficacité dudit traitement sur ce patient. [Revendication 15] Un kit pour le diagnostic d’un trouble caractérisé par une surexpression de la protéine P16 comprenant un polypeptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 4. 1/2
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| WO2000001845A2 (fr) | 1998-07-01 | 2000-01-13 | Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung Des Öffentlichen Rechts | Methode de diagnostic precoce de carcinomes |
| WO2011075861A1 (fr) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc | Procédé pour faire baisser l'immunogénicité |
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