FR3075798A1 - PROCESS FOR EXTRACTING ESSENTIALLY NONDESTRUCTIVE INTRACELLULAR HYDROSOLUBLE MOLECULES FROM UNICELLULAR MICROALOGUES - Google Patents
PROCESS FOR EXTRACTING ESSENTIALLY NONDESTRUCTIVE INTRACELLULAR HYDROSOLUBLE MOLECULES FROM UNICELLULAR MICROALOGUES Download PDFInfo
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Abstract
Procédé d'extraction de molécules hydrosolubles intracellulaires essentiellement non-destructif de microalgues unicellulaires, le procédé comprenant : - une étape de fourniture de microalgues unicellulaires dépourvues de paroi cellulaire secondaire ou ayant une paroi cellulaire secondaire d'épaisseur inférieure ou égale à 0.5 µm; - une étape de placement des microalgues dans un milieu de faible conductivité électrolytique pour former une suspension de microalgues, la conductivité électrolytique totale de la suspension de microalgues ayant une valeur allant de 15 et 40 µS.cm-1 à 25°C; - une étape d'application d'un champ électrique pulsé sur la suspension de microalgues afin d'obtenir une suspension de microalgues temporairement perméabilisées, le champ électrique pulsé ayant une force électrique allant de 0,5 à 1 kV.cm-1 ; et, - une étape d'incubation de la suspension de microalgues temporairement perméabilisées, afin d'obtenir des microalgues appauvries en molécules hydrosolubles intracellulaire en suspension dans un milieu enrichi en molécules hydrosolubles extraites, l'étape d'incubation permettant la diffusion de molécules hydrosolubles intracellulaires des microalgues au moins temporairement perméabilisées dans le milieu de faible conductivité électrolytique.A method for extracting essentially non-destructive, intracellular, water-soluble molecules from unicellular microalgae, the process comprising: - a step of providing unicellular microalgae without a secondary cell wall or having a secondary cell wall less than or equal to 0.5 μm in thickness; a step of placing the microalgae in a medium of low electrolytic conductivity to form a suspension of microalgae, the total electrolytic conductivity of the microalgae suspension having a value ranging from 15 and 40 μS.cm-1 at 25 ° C .; a step of applying a pulsed electric field to the suspension of microalgae so as to obtain a suspension of microalgae temporarily permeabilized, the pulsed electric field having an electric force ranging from 0.5 to 1 kV.cm-1; and a step of incubating the suspension of microalgae temporarily permeabilized, in order to obtain microalgae depleted in intracellular water-soluble molecules in suspension in a medium enriched in extracted water-soluble molecules, the incubation step allowing the diffusion of water-soluble molecules intracellular microalgae at least temporarily permeabilized in the medium of low electrolytic conductivity.
Description
Procédé d'extraction de molécules hydrosolubles intracellulaires essentiellement non-destructif de microalgues unicellulaires 1. Domaine de l'inventionMethod for extracting essentially non-destructive intracellular water-soluble molecules from unicellular microalgae 1. Field of the invention
Le domaine de l'invention est celui des procédés d'extraction de molécules hydrosolubles intracellulaires de microalgues unicellulaires.The field of the invention is that of methods of extracting intracellular water-soluble molecules from unicellular microalgae.
Plus précisément, l'invention concerne les procédés d'extraction comprenant l'application d'un champ électrique pulsé. 2. Art antérieurMore specifically, the invention relates to extraction methods comprising the application of a pulsed electric field. 2. Prior art
Les cellules des microalgues sont dotées de chloroplaste(s). Le chloroplaste est essentiellement connu pour sa capacité à réaliser la photosynthèse. Une autre caractéristique du chloroplaste est de posséder de l'acide désoxyribonucléique (ADN), modifiable à façon à l'aide des méthodes de biologie moléculaire en vue de produire des protéines d'intérêt. Il a donc été envisagé de faire produire aux chloroplastes des plantes terrestres et des microalgues des protéines d'intérêt économique afin de remplacer les méthodes actuelles de production. A ce jour, la microalgue verte Chlamydomonas reinhardtii a notamment été utilisée pour produire des protéines d'intérêt thérapeutique. Les microalgues présentent donc un potentiel biotechnologique important car elles produisent des molécules intéressantes, notamment des protéines d'intérêt, pour différents secteurs industriels : alimentaire, santé, parapharmacie, énergétique, cosmétiques, etc.The microalgae cells are provided with chloroplast (s). The chloroplast is mainly known for its ability to carry out photosynthesis. Another characteristic of the chloroplast is that it has deoxyribonucleic acid (DNA), which can be modified using molecular biology methods to produce proteins of interest. It has therefore been envisaged to make chloroplasts from terrestrial plants and microalgae produce proteins of economic interest in order to replace the current production methods. To date, the green microalga Chlamydomonas reinhardtii has notably been used to produce proteins of therapeutic interest. Microalgae therefore have significant biotechnological potential because they produce interesting molecules, in particular proteins of interest, for different industrial sectors: food, health, parapharmacy, energy, cosmetics, etc.
Les procédés biotechnologiques actuels d'extraction de molécules d'intérêt de microalgues présentent généralement les étapes successives suivantes : (1) Obtenir de la biomasse de microalgues ; (2) Induire la production et l'accumulation de molécules d'intérêt dans les microalgues ; (3) Récolter la biomasse ; et (4) Extraire et purifier des molécules d'intérêt. L'un des freins ralentissant le développement à l'échelle industrielle de ces procédés est notamment relié au coût élevé du processus post-culture et de la remise en culture des microalgues. Des méthodes innovantes sont donc recherchées pour diminuer les coûts de production/extraction de molécules d'intérêt, notamment des protéines d'intérêt, issues de microalgues afin que ces dernières soient compétitives avec les méthodes actuelles de production de protéines animales et/ou végétales.Current biotechnological processes for extracting molecules of interest from microalgae generally have the following successive stages: (1) Obtaining microalgae biomass; (2) Induce the production and accumulation of molecules of interest in microalgae; (3) Harvest the biomass; and (4) Extract and purify molecules of interest. One of the brakes slowing the development on an industrial scale of these processes is in particular related to the high cost of the post-culture process and the re-culture of microalgae. Innovative methods are therefore sought to reduce the costs of production / extraction of molecules of interest, in particular proteins of interest, from microalgae so that the latter are competitive with current methods of production of animal and / or plant proteins.
Le phénomène d'électroporation, ou électro-perméabilisation, a été observé pour la première fois en 1754 par Nollet : il correspond à une augmentation de la perméabilité membranaire de cellules lorsque ces dernières sont soumises à un champ électrique. Mais il a fallu attendre les années 1980 pour que les premières applications de procédés par champs électriques pulsés (CEP) soient développées. Les procédés par CEP ont tout d'abord été utilisés dans le domaine de la médecine afin de transférer de l'ADN dans des cellules. Ils ont ensuite pris leur essor dans le domaine des biotechnologies grâce à de nombreuses autres applications. Parmi celles-ci peuvent être citées la transformation génétique et l'inactivation de micro-organismes ainsi que l'extraction de biomolécules.The phenomenon of electroporation, or electro-permeabilization, was observed for the first time in 1754 by Nollet: it corresponds to an increase in the membrane permeability of cells when the latter are subjected to an electric field. However, it was not until the 1980s that the first applications of pulsed electric field (CEP) processes were developed. CEP methods were first used in the medical field to transfer DNA into cells. They then took off in the biotechnology field thanks to many other applications. Among these may be mentioned the genetic transformation and inactivation of microorganisms as well as the extraction of biomolecules.
Plusieurs études récentes portent sur l'extraction de composés hydrosolubles de microalgues grâce à un procédé impliquant un traitement impliquant des champs électriques pulsés (traitement CEP). Ces études sont basées soit sur l'application seule d'un traitement CEP, soit sur une succession de procédés d'extraction différents incluant l'application d'un traitement CEP. Parmi les méthodes constituées d'une succession de procédés, on trouve notamment une combinaison d'un traitement CEP avec un échauffement des suspensions de microalgues ou encore des procédés comprenant une un traitement CEP suivi d'une extraction par solvant. Aucune des méthodes d'extraction utilisées dans les études mentionnées ci-dessus ne s'est révélée complètement satisfaisante. Elles ont toutes pour désavantage d'être destructrices de la biomasse à extraire. Elles produisent donc des déchets biologiques voire organiques dans le cas d'utilisation de solvants d'extraction. De plus la culture de nouvelle biomasse est extrêmement coûteuse et chronophage.Several recent studies relate to the extraction of water-soluble microalgae compounds using a process involving a treatment involving pulsed electric fields (CEP treatment). These studies are based either on the application of a CEP treatment alone, or on a succession of different extraction processes including the application of a CEP treatment. Among the methods consisting of a succession of processes, there is in particular a combination of a CEP treatment with heating of the microalgae suspensions or else processes comprising a CEP treatment followed by a solvent extraction. None of the extraction methods used in the studies mentioned above have been found to be completely satisfactory. They all have the disadvantage of being destructive of the biomass to be extracted. They therefore produce biological or even organic waste when using extraction solvents. In addition, the cultivation of new biomass is extremely expensive and time-consuming.
Certaines méthodes cumulent en outre d'autres désavantages comme par exemple une non-sélectivité des molécules extraites et donc la nécessité d'étapes de purification post-extraction, un faible rendement d'extraction protéique (ne dépassant que dans de très rares cas 10% du contenu protéique cellulaire total), une mauvaise efficacité énergétique (surconsommation électrique), ou encore une mauvaise efficacité de production (temps nécessaire à l'extraction anormalement long). 3. Objectifs de l'invention L'invention a pour objectif de pallier au moins certains inconvénients de l'art antérieur. L'invention a notamment pour objectif de proposer un procédé d'extraction de molécules hydrosolubles intracellulaires de microalgues unicellulaires permettant de préserver la viabilité de l'essentiel de la biomasse extraite.Some methods also combine other disadvantages such as non-selectivity of the extracted molecules and therefore the need for post-extraction purification steps, a low protein extraction yield (only exceeding in very rare cases 10% total cellular protein content), poor energy efficiency (electrical overconsumption), or poor production efficiency (time required for abnormally long extraction). 3. Objectives of the invention The object of the invention is to overcome at least certain drawbacks of the prior art. The object of the invention is in particular to propose a process for the extraction of water-soluble intracellular molecules from unicellular microalgae which makes it possible to preserve the viability of the main part of the biomass extracted.
Un autre objectif de l'invention est, au moins selon certains modes de réalisations avantageux, de proposer un procédé permettant l'extraction de molécules hydrosolubles intracellulaires de microalgues, notamment de protéines, issues essentiellement de chloroplastes.Another objective of the invention is, at least according to certain advantageous embodiments, to propose a process allowing the extraction of water-soluble intracellular molecules of microalgae, in particular of proteins, coming essentially from chloroplasts.
Un autre objectif de l'invention est, au moins selon certains modes de réalisations avantageux, de proposer un procédé permettant l'extraction de molécules hydrosolubles intracellulaires de microalgues, notamment de protéines, avec de bons rendements.Another objective of the invention is, at least according to certain advantageous embodiments, to propose a process allowing the extraction of water-soluble intracellular molecules of microalgae, in particular proteins, with good yields.
Un autre objectif de l'invention est, au moins selon certains modes de réalisations avantageux, de proposer un procédé simple, rapide, efficace énergétiquement et ayant un faible coût de revient.Another objective of the invention is, at least according to certain advantageous embodiments, to propose a simple, rapid, energy efficient process and having a low cost price.
Un autre objectif de l'invention est, au moins selon certains modes de réalisations, de proposer un procédé permettant d'obtenir des protéines à un coût comparable ou moindre que les protéines animales et végétales actuellement disponibles sur le marché. 4. Exposé de l'inventionAnother objective of the invention is, at least according to certain embodiments, to propose a process making it possible to obtain proteins at a comparable or lower cost than the animal and vegetable proteins currently available on the market. 4. Statement of the invention
La présente invention concerne un procédé d'extraction de molécules hydrosolubles intracellulaires essentiellement non-destructif de microalgues unicellulaires. Le procédé comprend : - une étape de fourniture de microalgues unicellulaires, les microalgues étant dépourvues de paroi cellulaire secondaire ou ayant une paroi cellulaire secondaire d'épaisseur inférieure ou égale à 0.5 μιτι ; - une étape de placement des microalgues dans un milieu de faible conductivité électrolytique pour former une suspension de microalgues, la conductivité électrolytique totale de la suspension de microalgues ayant une valeur allant de 15 à 40 pS.cnï1 à 25°C; - une étape d'application d'un champ électrique pulsé sur la suspension de microalgues afin d'obtenir une suspension de microalgues temporairement perméabilisées, le champ électrique pulsé ayant une force électrique allant de 0,5 à 1 kV.cm1; et, - une étape d'incubation de la suspension de microalgues temporairement perméabilisées, afin d'obtenir des microalgues appauvries en molécules hydrosolubles intracellulaires en suspension dans un milieu enrichi en molécules hydrosolubles extraites, l'étape d'incubation permettant la diffusion de molécules hydrosolubles intracellulaires des microalgues au moins temporairement perméabilisées dans le milieu de faible conductivité électrolytique.The present invention relates to a method for extracting essentially non-destructive intracellular water-soluble molecules from unicellular microalgae. The method comprises: - a step of supplying single-cell microalgae, the microalgae being devoid of secondary cell wall or having a secondary cell wall of thickness less than or equal to 0.5 μιτι; - A step of placing the microalgae in a medium of low electrolytic conductivity to form a suspension of microalgae, the total electrolytic conductivity of the suspension of microalgae having a value ranging from 15 to 40 pS.cn1 at 25 ° C; a step of applying a pulsed electric field to the suspension of microalgae in order to obtain a suspension of temporarily permeabilized microalgae, the pulsed electric field having an electric force ranging from 0.5 to 1 kV.cm1; and, - a stage of incubation of the suspension of temporarily permeabilized microalgae, in order to obtain microalgae depleted in water-soluble intracellular molecules in suspension in a medium enriched in water-soluble molecules extracted, the stage of incubation allowing the diffusion of water-soluble molecules intracellular microalgae at least temporarily permeabilized in the medium of low electrolytic conductivity.
Au sens de la présente invention, on entend par « essentiellement non destructif », le fait que le procédé permette de garder viables autant que possible les cellules de microalgues soumises au champ électrique pulsé. Le procédé selon la présente invention permet notamment de garder viables au moins 40%, préférentiellement au moins 60%, et très préférentiellement au moins 80% des cellules de microalgues.For the purposes of the present invention, the term “essentially non-destructive” means that the method makes it possible to keep the microalgae cells subjected to the pulsed electric field as viable as possible. The method according to the present invention makes it possible in particular to keep viable at least 40%, preferably at least 60%, and very preferably at least 80% of the microalgae cells.
On entend par « molécules hydrosolubles intracellulaires », notamment des protéines, des glucides ou encore des ions se trouvant à l'intérieur des cellules avant extraction.The term “intracellular water-soluble molecules” is understood to mean proteins, carbohydrates or even ions present inside the cells before extraction.
Les inventeurs de la présente invention ont pu démontrer expérimentalement qu'il est possible d'extraire de manière efficace des molécules hydrosolubles intracellulaires de microalgues tout en préservant au mieux la viabilité de ces dernières, permettant ainsi de les réutiliser ultérieurement pour une nouvelle extraction selon le procédé d'extraction de l'invention. En particulier, les inventeurs ont mis en évidence qu'à un champ électrique pulsé de force électrique allant de 0,5 kV.cm'1 à 1 kV.cm'1, il est possible de perméabiliser de manière réversible et suffisante (pour une extraction non négligeable de molécules hydrosolubles) la membrane plasmique et le cas échéant les différentes parois la surplombant, en particulier la paroi cellulaire primaire et/ou la paroi cellulaire secondaire, de microalgues unicellulaires dépourvues de paroi cellulaire secondaire ou ayant une paroi cellulaire secondaire d'épaisseur inférieure ou égale à 0,5 pm. A contrario, un champ électrique pulsé de force électrique strictement inférieure à 0,5 kV.cm1 est trop faible pour perméabiliser de manière suffisante la membrane plasmique et le cas échéant les différentes parois surplombant la microalgue et ne permet pas l'extraction en quantité non-négligeable de molécules hydrosolubles intracellulaires. Par ailleurs, un champ électrique pulsé de force électrique strictement supérieure à 1 kV.cm1 entraîne une perméabilisation irréversible de la membrane plasmique et le cas échéant des parois cellulaires la surplombant pour une partie voire la totalité des microalgues, sans gain supplémentaire sur le rendement en extraction des molécules hydrosolubles intracellulaire. Une perméabilisation irréversible de la membrane plasmique et le cas échéant des parois cellulaires la surplombant implique in fine la destruction des cellules soumises au champ électrique pulsé, ce qui n'est pas souhaité dans la présente invention. Le placement des microalgues dans un milieu de faible conductivité électrolytique, la conductivité électrolytique totale du milieu de faible conductivité électrolytique comprenant les microalgues ayant une valeur allant de 15 à 40 pS.cm'1 à 25°C, permet de garantir que les microalgues de la suspension de microalgues s'échauffent peu, voire très peu lors de l'application du champ électrique pulsé. En effet, plus la conductivité du milieu de suspension des microalgues est importante, plus ce dernier est apte à emmagasiner de la chaleur lors de l'application du champ électrique pulsé. Or des températures trop hautes entraînent la dénaturation des molécules extraites et la destruction des cellules de microalgues.The inventors of the present invention have been able to demonstrate experimentally that it is possible to efficiently extract intracellular water-soluble molecules from microalgae while preserving the viability of the latter as well as possible, thus allowing them to be reused later for a new extraction according to the extraction method of the invention. In particular, the inventors have demonstrated that at a pulsed electric field of electric force ranging from 0.5 kV.cm'1 to 1 kV.cm'1, it is possible to permeabilize reversibly and sufficiently (for a non-negligible extraction of water-soluble molecules) the plasma membrane and, where appropriate, the different walls overhanging it, in particular the primary cell wall and / or the secondary cell wall, of unicellular microalgae lacking a secondary cell wall or having a secondary cell wall of thickness less than or equal to 0.5 μm. Conversely, a pulsed electric field with an electrical force strictly less than 0.5 kV.cm1 is too weak to sufficiently permeabilize the plasma membrane and, if necessary, the various walls overhanging the microalga and does not allow extraction in non-quantitative quantities. - negligible of water-soluble intracellular molecules. Furthermore, a pulsed electric field with an electrical force strictly greater than 1 kV.cm1 leads to an irreversible permeabilization of the plasma membrane and, where appropriate, of the cell walls overhanging it for some or all of the microalgae, without additional gain in yield. extraction of intracellular water-soluble molecules. An irreversible permeabilization of the plasma membrane and, where appropriate, of the cell walls overhanging it ultimately involves the destruction of the cells subjected to the pulsed electric field, which is not desired in the present invention. The placement of the microalgae in a medium of low electrolytic conductivity, the total electrolytic conductivity of the medium of low electrolytic conductivity comprising the microalgae having a value ranging from 15 to 40 pS.cm'1 at 25 ° C, makes it possible to guarantee that the microalgae the suspension of microalgae heats up little or very little during the application of the pulsed electric field. Indeed, the higher the conductivity of the microalgae suspension medium, the more it is able to store heat during the application of the pulsed electric field. However, too high temperatures lead to the denaturation of the extracted molecules and the destruction of microalgae cells.
La première étape du procédé selon l'invention est une étape de fourniture de microalgues unicellulaires, c'est à dire d'algues microscopiques formées par une seule cellule.The first step of the method according to the invention is a step of supplying unicellular microalgae, that is to say microscopic algae formed by a single cell.
La membrane plasmique des microalgues unicellulaires sépare le milieu intracellulaire du milieu extracellulaire. Selon les différents stades de développement de la microalgue unicellulaire, une paroi primaire peut recouvrir la membrane plasmique et une paroi secondaire peut recouvrir la paroi primaire. La paroi cellulaire secondaire est moins flexible que la paroi primaire cellulaire.The plasma membrane of unicellular microalgae separates the intracellular medium from the extracellular medium. According to the different stages of development of the unicellular microalga, a primary wall can cover the plasma membrane and a secondary wall can cover the primary wall. The secondary cell wall is less flexible than the primary cell wall.
Les microalgues utilisées dans le procédé selon l'invention sont dépourvues de paroi secondaire ou alternativement ont une paroi cellulaire secondaire d'épaisseur inférieure ou égale à 0,5 micromètres (pm).The microalgae used in the method according to the invention have no secondary wall or alternatively have a secondary cell wall of thickness less than or equal to 0.5 micrometers (pm).
Préférentiellement, les microalgues utilisées dans le procédé selon l'invention ont un diamètre moyen compris entre 15 et 30 pm.Preferably, the microalgae used in the process according to the invention have an average diameter of between 15 and 30 μm.
En particulier, les microalgues unicellulaires peuvent appartenir à l'ordre des Chlamydomonadales, de la classe des Chlorophyceae, du phylum Chlorophyta. Les microalgues de cet ordre sont des microalgues vertes possédant à un stade végétatif deux flagelles. Leur cytoplasme comprend au moins un chloroplaste. Comme indiqué précédemment, grâce au génie génétique, les chloroplastes peuvent être avantageusement utilisés pour produire des molécules hydrosolubles d'intérêt.In particular, the unicellular microalgae can belong to the order of Chlamydomonadales, of the class of Chlorophyceae, of the phylum Chlorophyta. Microalgae of this order are green microalgae with two flagella at a vegetative stage. Their cytoplasm includes at least one chloroplast. As indicated above, thanks to genetic engineering, chloroplasts can be advantageously used to produce water-soluble molecules of interest.
De manière spécifique, les microalgues unicellulaires peuvent appartenir à la famille Haematococcaceae.Specifically, the unicellular microalgae can belong to the family Haematococcaceae.
De manière encore plus spécifique, les microalgues unicellulaires peuvent appartenir au genre Haematococcus.Even more specifically, the unicellular microalgae can belong to the genus Haematococcus.
En particulier, les microalgues unicellulaires peuvent appartenir à l'espèce Haematococcus pluvialis, telle la souche de micro-organismes déposée au Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP), Scottish Marine Institute, Royaume-Uni ayant comme numéro d'ordre : CCAP 34/19 Haematococcus pluvialis.In particular, the unicellular microalgae may belong to the species Haematococcus pluvialis, such as the strain of microorganisms deposited in the Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP), Scottish Marine Institute, United Kingdom having as serial number: CCAP 34 / 19 Haematococcus pluvialis.
La microalgue de l'espèce Haematococcus pluvialis peut être trouvée dans les flaques, les gouttières et autres points d'eau peu profonds. Sa capacité à survivre dans ces milieux pouvant être considérés comme hostiles est liée à son cycle de vie, à la fois très complexe et flexible. Cette microalgue présente trois principaux stades de développement: macrozoïde, palmella et kyste. Les stades macrozoïde et palmella sont observables au cours de la phase de croissance végétative (croissance par mitose) alors que le stade kyste n'apparaît qu'après arrêt des divisions cellulaires.The microalgae of the Haematococcus pluvialis species can be found in puddles, gutters and other shallow water points. Its ability to survive in environments that can be considered hostile is linked to its life cycle, which is both very complex and flexible. This microalga has three main stages of development: macrozoid, palmella and cyst. The macrozoid and palmella stages can be observed during the vegetative growth phase (growth by mitosis) while the cyst stage only appears after cell divisions have stopped.
Les microalgues Haematococcus pluvialis au stade macrozoïde sont des cellules ovoïdes mobiles dont le diamètre peut varier entre 8 et 50 pm, le diamètre moyen étant généralement compris entre 20 et 25 pm. Elles possèdent deux flagelles de longueur égale et sont entourées d'une matrice glycoprotéique multicouche traversée de prolongements cytoplasmiques. A ce stade les cellules se multiplient par simple mitose : une cellule mère donne deux cellules filles qui ensuite se sépareront, s'entoureront de leur propre gangue et deviendront ainsi indépendantes.The macroalga Haematococcus pluvialis microalgae are mobile ovoid cells whose diameter can vary between 8 and 50 μm, the average diameter generally being between 20 and 25 μm. They have two flagella of equal length and are surrounded by a multilayer glycoprotein matrix crossed by cytoplasmic extensions. At this stage the cells multiply by simple mitosis: a mother cell gives two daughter cells which will then separate, surround themselves with their own gangue and thus become independent.
Le second stade observable durant la phase végétative est le stade palmella. Les palmellas ont également généralement un diamètre moyen compris entre 20 et 25 pm A la différence des macrozoïdes, les palmellas ne possèdent pas de flagelles et ont une forme sphérique. La matrice glycoprotéique entourant la cellule est moins épaisse que chez les macrozoïdes et une paroi primaire se met en place entre cette matrice et la membrane plasmique. La division des cellules à ce stade de développement peut mener à la formation soit de nouvelles palmellas ou bien de nouveaux macrozoïdes. Le stade palmella est observable lorsque les conditions environnementales sont favorables aux microalgues. Cependant, il peut aussi apparaître quand ces conditions commencent à se dégrader et que les cellules doivent se préparer à entrer dans une phase de repos au cours de laquelle elles seront au stade de kystes. L'apparition de cellules au stade kystes est précédée d'un accroissement de la taille des microalgues, dont le diamètre peut dépasser les 50 pm. En raison d'une accumulation importante d'astaxanthine (jusqu'à 99 % des caroténoïdes totaux des cellules et 5 % du poids sec de la biomasse), la composition pigmentaire des cellules subit elle aussi d'importantes variations. La phase d'enkystement s'accompagne également de modifications à la fois structurales et compositionnelles de la paroi extracellulaire, conduisant à un épaississement progressif de cette dernière. En effet, les différentes couches de la matrice glycoprotéique caractérisant le stade macrozoïde se désintègrent les unes après les autres au cours de l'enkystement et plusieurs nouvelles structures sont progressivement mises en place pour les remplacer. La première structure mise en place est la paroi primaire, composée en grande partie de cellulose (la paroi primaire, présente au stade palmella, est transitoire puisqu'elle disparaît au cours de la maturation des kystes). La deuxième structure, également mise en place est une gaine trilaminaire. Elle est composée d'algaenan, un biopolymère non hydrolysable. La troisième et dernière structure mise en place correspond à la paroi secondaire. Son constituant majeur est le mannane (terme regroupant les polysaccharides essentiellement composés de mannose), et plus particulièrement le mannane I granuleux non fibrillaire. L'épaisseur maximale atteinte par la paroi secondaire des kystes est d'environ 2,5 pm.The second stage observable during the vegetative phase is the palmella stage. Palmellas also generally have an average diameter of between 20 and 25 µm. Unlike macrozoids, palmellas do not have flagella and have a spherical shape. The glycoprotein matrix surrounding the cell is thinner than in macrozoids and a primary wall is established between this matrix and the plasma membrane. The division of cells at this stage of development can lead to the formation of either new palmellas or new macrozoids. The palmella stage is observable when the environmental conditions are favorable for microalgae. However, it can also appear when these conditions start to deteriorate and the cells must prepare to enter a resting phase during which they will be in the stage of cysts. The appearance of cells at the cyst stage is preceded by an increase in the size of the microalgae, the diameter of which can exceed 50 μm. Due to a large accumulation of astaxanthin (up to 99% of the total carotenoids of cells and 5% of the dry weight of biomass), the pigment composition of cells also undergoes significant variations. The encystment phase is also accompanied by both structural and compositional changes to the extracellular wall, leading to a gradual thickening of the latter. Indeed, the different layers of the glycoprotein matrix characterizing the macrozoid stage disintegrate one after the other during the encystment and several new structures are gradually put in place to replace them. The first structure put in place is the primary wall, composed largely of cellulose (the primary wall, present at the palmella stage, is transient since it disappears during the maturation of the cysts). The second structure, also in place, is a trilaminar sheath. It is composed of algaenan, a non-hydrolyzable biopolymer. The third and last structure put in place corresponds to the secondary wall. Its major constituent is mannan (term grouping together polysaccharides essentially composed of mannose), and more particularly granular non-fibrillar mannan I. The maximum thickness reached by the secondary wall of the cysts is approximately 2.5 μm.
Avantageusement, la microalgue de l'espèce Haematococcus pluvialis utilisée dans le procédé selon la présente invention est à un stade végétatif, macrozoïde et/ou palmella. En effet, il est connu que la microalgue de l'espèce Haematococcus pluvialis à un stade végétatif comprend de 25% à 30% en poids de matière sèche de protéines. De plus, de récentes études ont mis en évidence que les protéines hydrosolubles produites à ce stade du cycle cellulaire d'Haematococcus pluvialis avaient de bonnes propriétés émulsifiantes, présentant un intérêt réel dans les domaines de la cosmétologie, et de l'alimentation (Ba. et al., 2016).Advantageously, the microalga of the species Haematococcus pluvialis used in the process according to the present invention is at a vegetative, macrozoid and / or palmella stage. Indeed, it is known that the microalgae of the species Haematococcus pluvialis at a vegetative stage comprises from 25% to 30% by weight of protein dry matter. In addition, recent studies have shown that the water-soluble proteins produced at this stage of the Haematococcus pluvialis cell cycle have good emulsifying properties, which are of real interest in the fields of cosmetology and food (Ba. et al., 2016).
La microalgue de l'espèce Haematococcus pluvialis utilisée pour le procédé de la présente invention peut également être au début d'une phase d'enkystement, transition entre un stade macrozoïde et/ou palmella et un stade kyste, quand la paroi cellulaire secondaire a une épaisseur inférieure ou égale à 0,5 pm.The microalga of the species Haematococcus pluvialis used for the process of the present invention can also be at the beginning of an encystment phase, transition between a macrozoid and / or palmella stage and a cyst stage, when the secondary cell wall has a thickness less than or equal to 0.5 μm.
La deuxième étape du procédé selon l'invention est l'étape de placement des microalgues dans un milieu de faible conductivité électrolytique. Le milieu de faible conductivité électrolytique doit être biocompatible pour ne pas endommager les microalgues. La conductivité électrolytique totale du milieu de faible conductivité électrolytique comprenant les microalgues a une valeur allant de 15 à 40 micro-siemens par centimètre (pS.cm1) à 25°C (température de référence de la mesure de conductivité). Le milieu de faible conductivité électrolytique permet de garantir que les microalgues de la suspension de microalgues s'échauffent peu, voire très peu lors de l'étape d'application du champ électrique pulsé. Avantageusement, la suspension de microalgues s'échauffe de moins de 1°C lors de l'étape d'application du champ électrique pulsé.The second step of the method according to the invention is the step of placing the microalgae in a medium of low electrolytic conductivity. The medium with low electrolytic conductivity must be biocompatible so as not to damage the microalgae. The total electrolytic conductivity of the medium of low electrolytic conductivity comprising the microalgae has a value ranging from 15 to 40 micro-siemens per centimeter (pS.cm1) at 25 ° C (reference temperature of the conductivity measurement). The medium of low electrolytic conductivity makes it possible to guarantee that the microalgae in the suspension of microalgae heat up little, or even very little during the step of applying the pulsed electric field. Advantageously, the suspension of microalgae heats up by less than 1 ° C. during the step of applying the pulsed electric field.
Selon un mode de réalisation particulier, le milieu de faible conductivité électrolytique est de l'eau, notamment de l'eau distillée.According to a particular embodiment, the medium of low electrolytic conductivity is water, in particular distilled water.
Préférentiellement, la densité des microalgues dans la suspension de microalgues est inférieure ou égale à 106 cellules/mL de milieu de faible conductivité électrolytique. Ceci a pour avantage de garantir que le champ électrique ressenti par chaque cellule est essentiellement uniforme lors de l'étape d'application du champ électrique pulsé. A contrario pour des densités de microalgues strictement supérieure à 106 cellules/mL, un effet d'écran, d'autant plus important que la densité de microalgues est importante, implique que certaines microalgues ressentent un champ électrique plus important que d'autres lors de l'étape d'application du champ électrique pulsé. De manière davantage préférée, la densité de microalgues dans la suspension de microalgues est de l'ordre de 105 cellules/mL de milieu de faible conductivité électrolytique.Preferably, the density of microalgae in the suspension of microalgae is less than or equal to 106 cells / ml of medium of low electrolytic conductivity. This has the advantage of guaranteeing that the electric field felt by each cell is essentially uniform during the step of applying the pulsed electric field. On the contrary for microalgae densities strictly greater than 106 cells / mL, a screen effect, all the more important as the density of microalgae is high, implies that certain microalgae feel a greater electric field than others during the step of applying the pulsed electric field. More preferably, the density of microalgae in the suspension of microalgae is of the order of 105 cells / ml of medium of low electrolytic conductivity.
Préférentiellement, la suspension de microalgues est maintenue à un pH allant de 6,5 à 8.Preferably, the suspension of microalgae is maintained at a pH ranging from 6.5 to 8.
La troisième étape du procédé selon l'invention est l'étape d'application d'un champ électrique pulsé sur la suspension de microalgues afin d'obtenir une suspension de microalgues temporairement perméabilisées. L'application d'un champ électrique pulsé permet la formation spontanée de pores dans la membrane plasmique et le cas échéant dans la paroi cellulaire primaire et la paroi cellulaire secondaire. Ceci est à l'origine d'une perméabilisation. De plus, durant l'application du champ électrique, un transport électrophorétique rapide se met en place, entraînant les molécules chargées et les ions intracellulaires.The third step of the method according to the invention is the step of applying a pulsed electric field on the suspension of microalgae in order to obtain a suspension of temporarily permeabilized microalgae. The application of a pulsed electric field allows the spontaneous formation of pores in the plasma membrane and, where appropriate, in the primary cell wall and the secondary cell wall. This is the cause of permeabilization. In addition, during the application of the electric field, a rapid electrophoretic transport takes place, carrying the charged molecules and the intracellular ions.
Un champ électrique pulsé est un champ électrique formé grâce à des impulsions électriques. Selon l'amplitude des impulsions électriques, différentes forces électriques de champ électrique pulsé peuvent être obtenues. La force électrique est exprimée ici en kilovolt par centimètre (kV.cm1)A pulsed electric field is an electric field formed by electric pulses. Depending on the amplitude of the electric pulses, different electric forces of the pulsed electric field can be obtained. The electric force is expressed here in kilovolt per centimeter (kV.cm1)
La force électrique du champ électrique pulsé va de 0,5 à 1 kV.cm"1. Du fait que la force électrique est inférieure ou égale à 1 kV.cm"1, la perméabilisation est rendue essentiellement temporaire, ou autrement dit, essentiellement réversible. C'est ce qui permet de préserver au mieux la viabilité des microalgues. A contrario, pour des forces électriques de champ plus élevées, une partie plus importante des microalgues voire la totalité des microalgues sont perméabilisées de manière irréversible, sans qu'un gain significatif sur le rendement d'extraction en molécules hydrosolubles extraites ne soit observé. En outre, il semble que des forces électriques de champ supérieures ou égales à 0,5 kV.cm"1 soient nécessaires pour assurer une ouverture suffisante des pores.The electric force of the pulsed electric field ranges from 0.5 to 1 kV.cm "1. Because the electric force is less than or equal to 1 kV.cm" 1, permeabilization is made essentially temporary, or in other words, essentially reversible. This is what best preserves the viability of microalgae. Conversely, for higher electric field strengths, a larger part of the microalgae or even all of the microalgae are permeabilized in an irreversible manner, without a significant gain in the extraction yield of extracted water-soluble molecules being observed. In addition, it seems that electric field forces greater than or equal to 0.5 kV.cm "1 are necessary to ensure sufficient opening of the pores.
Il n'est pas nécessaire d'appliquer un grand nombre d'impulsions pour obtenir la perméabilisation temporaire des microalgues. Le nombre d'impulsions est supérieur ou égal à un. Le nombre d'impulsions peut notamment être supérieur ou égal à 2. Dans ce cas, le champ électrique pulsé est préférentiellement périodique. Le champ électrique pulsé peut par exemple avoir une fréquence ayant une valeur allant de 0,1 à 19 Hz, notamment une valeur de 9,62 Hz. Dans le cas où le nombre d'impulsions est supérieur ou égal à 2, les impulsions peuvent être alternativement de signe positif et de signe négatif. Le champ électrique pulsé est alors qualifié de bipolaire. Un champ électrique bipolaire permet d'empêcher l'oxydation des électrodes et d'augmenter la durée de vie de ces dernières. Par ailleurs, il réduit la formation d'espèces réactives à l'oxygène.It is not necessary to apply a large number of pulses to obtain temporary permeabilization of microalgae. The number of pulses is greater than or equal to one. The number of pulses can in particular be greater than or equal to 2. In this case, the pulsed electric field is preferably periodic. The pulsed electric field can for example have a frequency having a value ranging from 0.1 to 19 Hz, in particular a value of 9.62 Hz. In the case where the number of pulses is greater than or equal to 2, the pulses can be alternately of positive sign and negative sign. The pulsed electric field is then qualified as bipolar. A bipolar electric field makes it possible to prevent the oxidation of the electrodes and to increase the lifetime of the latter. Furthermore, it reduces the formation of reactive oxygen species.
Le nombre d'impulsions peut aussi être supérieur ou égal à 5. Selon un mode de réalisation, le nombre d'impulsions est égal à 5.The number of pulses can also be greater than or equal to 5. According to one embodiment, the number of pulses is equal to 5.
Les impulsions du champ électrique pulsé peuvent avoir une durée comprise entre 1 microseconde (ps) et 10 millisecondes (ms). Cette gamme de valeurs a pour avantage de permettre la perméabilisation de la membrane plasmique et le cas échéant les différentes parois surplombant la microalgue tout en ayant un impact limité sur le cytosquelette, le noyau et l'ADN de la microalgue nécessaires à sa viabilité. Il est à noter que plus la durée des impulsions est longue, plus les pores formés sont grands. De préférence, les impulsions ont une durée comprise entre 0,1 ms et 5 ms. Ceci permet également de cibler la perméabilisation des chloroplastes. Dans cette même perspective, la durée des impulsions est avantageusement choisie entre 1 ms et 3 ms.The pulses of the pulsed electric field can have a duration between 1 microsecond (ps) and 10 milliseconds (ms). This range of values has the advantage of permitting the permeabilization of the plasma membrane and, where appropriate, the different walls overhanging the microalga while having a limited impact on the cytoskeleton, the nucleus and the DNA of the microalga necessary for its viability. It should be noted that the longer the duration of the pulses, the larger the pores formed. Preferably, the pulses have a duration of between 0.1 ms and 5 ms. This also makes it possible to target the permeabilization of chloroplasts. In this same perspective, the duration of the pulses is advantageously chosen between 1 ms and 3 ms.
La quatrième étape du procédé selon l'invention est une étape d'incubation de ladite suspension de microalgues temporairement perméabilisées, afin d'obtenir des microalgues appauvries en molécules hydrosolubles intracellulaires en suspension dans un milieu enrichi en molécules hydrosolubles extraites. Les pores formés lors de l'étape d'application du champ électrique pulsé étant temporairement ouverts, une diffusion de molécules hydrosolubles intracellulaires des microalgues temporairement perméabilisées a lieu dans le milieu de faible conductivité électrolytique. Même si le transport électrophorétique, ayant lieu lors de l'application d'un champ électrique pulsé, est plus efficace que la diffusion en quantité de molécules extraites par unité de temps, il dure beaucoup moins longtemps. En effet, la période pendant laquelle la membrane plasmique est perméabilisée suite à l'application des CEP peut s'étendre sur plusieurs minutes, voire sur quelques dizaines de minutes, alors que la durée d'une impulsion ne dépasse pas 10 ms. La durée de diffusion est donc environ 10 000 fois supérieure à celle des impulsions. La majorité des molécules hydrosolubles extraites passe donc du milieu intracellulaire au milieu extracellulaire via le phénomène de diffusion pendant l'étape d'incubation de la suspension de microalgues temporairement perméabilisées. L'étape d'incubation peut avoir une durée allant de 3 à 45 minutes. Préférentiellement, elle a une durée allant de 5 à 10 minutes.The fourth step of the method according to the invention is a step of incubating said suspension of temporarily permeabilized microalgae, in order to obtain microalgae depleted in intracellular water-soluble molecules in suspension in a medium enriched in extracted water-soluble molecules. The pores formed during the step of applying the pulsed electric field being temporarily open, diffusion of intracellular water-soluble molecules of the temporarily permeabilized microalgae takes place in the medium of low electrolytic conductivity. Even if the electrophoretic transport, which takes place during the application of a pulsed electric field, is more efficient than the diffusion in quantity of molecules extracted per unit of time, it lasts much less time. Indeed, the period during which the plasma membrane is permeabilized following the application of CEP can extend over several minutes, even over a few tens of minutes, while the duration of a pulse does not exceed 10 ms. The diffusion time is therefore approximately 10,000 times greater than that of the pulses. The majority of the water-soluble molecules extracted therefore pass from the intracellular medium to the extracellular medium via the diffusion phenomenon during the stage of incubation of the suspension of temporarily permeabilized microalgae. The incubation stage can last from 3 to 45 minutes. Preferably, it has a duration ranging from 5 to 10 minutes.
Parmi les molécules hydrosolubles intracellulaires, le procédé selon l'invention permet notamment d'extraire des protéines.Among the intracellular water-soluble molecules, the method according to the invention makes it possible in particular to extract proteins.
Ces protéines peuvent notamment avoir un poids moléculaire allant jusqu'à 120 kilo-Daltons (kDa - 1 Dalton étant défini comme étant 1/12 de la masse d'un atome du nucléide 12C). Selon des modes avantageux de réalisation de l'invention, où une forte perméabilisation (essentiellement réversible) est obtenue, le poids moléculaire des protéines extraites peut aller jusqu'à 150 kDa sur gel d'électrophorèse (notamment gel de polyacrylamide) et aller jusqu'à 265 kDa (environ) par spectrométrie de masse.These proteins can in particular have a molecular weight of up to 120 kilo-Daltons (kDa - 1 Dalton being defined as being 1/12 of the mass of an atom of nuclide 12C). According to advantageous embodiments of the invention, where a high permeabilization (essentially reversible) is obtained, the molecular weight of the proteins extracted can go up to 150 kDa on electrophoresis gel (in particular polyacrylamide gel) and go up to at 265 kDa (approximately) by mass spectrometry.
Les protéines peuvent être issues du cytoplasme, des chloroplastes, de l'appareil de Golgi, du réticulum endoplasmique ou des mitochondries. Les protéines peuvent notamment être issues, au moins en partie, des chloroplastes des microalgues. Selon certains modes de réalisation, au moins 50% des protéines extraites est issu des chloroplastes des microalgues. Ceci peut notamment être le cas quand la durée des impulsions du champ électrique pulsé pendant l'étape d'application d'un champ électrique pulsé est comprise entre 1 ms et 3 ms.Proteins can come from the cytoplasm, chloroplasts, the Golgi apparatus, the endoplasmic reticulum or the mitochondria. Proteins can in particular be derived, at least in part, from chloroplasts in microalgae. According to certain embodiments, at least 50% of the proteins extracted comes from the chloroplasts of microalgae. This can in particular be the case when the duration of the pulses of the pulsed electric field during the step of applying a pulsed electric field is between 1 ms and 3 ms.
Le procédé d'extraction selon l'invention peut en outre comprendre une étape de séparation après l'étape d'incubation de la suspension de microalgues temporairement perméabilisées. L'étape de séparation permet de séparer les microalgues appauvries en molécules hydrosolubles extraites et le milieu enrichi en molécules hydrosolubles extraites. Elle est mise en œuvre par des méthodes usuelles, comme notamment la centrifugation. Les molécules hydrosolubles extraites, notamment les protéines, peuvent ensuite être isolées de leur milieu par des méthodes usuelles, notamment par chromatographie et/ou électrophorèse.The extraction method according to the invention can also comprise a separation step after the incubation step of the suspension of temporarily permeabilized microalgae. The separation step makes it possible to separate the microalgae depleted in extracted water-soluble molecules and the medium enriched in extracted water-soluble molecules. It is implemented by usual methods, such as in particular centrifugation. The water-soluble molecules extracted, in particular the proteins, can then be isolated from their medium by usual methods, in particular by chromatography and / or electrophoresis.
Le procédé d'extraction selon l'invention peut en outre comprendre une étape de récupération/régénération des microalgues appauvries en molécules hydrosolubles extraites après l'étape de séparation. L'étape de récupération/régénération consiste en une incubation des microalgues appauvries en molécules hydrosolubles extraites, dans un milieu nutritif adapté à la culture des microalgues. Cette étape permet notamment de rétablir le bon fonctionnement de la machinerie photosynthétique (récupération) des cellules appauvries en molécules hydrosolubles extraites après que ces dernières ont recommencé à synthétiser de novo les molécules électro-extraites. Ceci permet également aux cellules de se multiplier de nouveau (régénération).The extraction method according to the invention can also comprise a stage of recovery / regeneration of microalgae depleted in water-soluble molecules extracted after the stage of separation. The recovery / regeneration stage consists of an incubation of microalgae depleted in water-soluble molecules extracted, in a nutritive medium suitable for the culture of microalgae. This step notably makes it possible to restore the proper functioning of the photosynthetic machinery (recovery) of the cells depleted in water-soluble molecules extracted after the latter have started to synthesize de novo the electro-extracted molecules. This also allows cells to multiply again (regeneration).
Un milieu nutritif adapté à la culture des microalgues peut notamment être un milieu de croissance pour micro-organismes comprenant de l'azote, du phosphore et une source de carbone organique. En particulier, le milieu nutritif adapté à la culture des microalgues peut être du médium tri-acétate-phosphate (TAP). Le milieu dit TAP, est bien connu de l'Homme du Métier pour la culture de microalgues, notamment pour la très étudiée microalgue Chlamydomonas reinhardtii. Le milieu TAP est constitué de Trishydroxyméthylaminométhane (tampon, connu sous le nom TRIS), d'ions acétate, d'une solution de phosphate, des sels de Beijerinck (NH4CI+MgS04+CaCI2) et des oligo-éléments sous forme de traces. L'étape de récupération/régénération a, le cas échéant, une durée supérieure ou égale à un jour, de préférence une durée supérieure ou égale à deux jours et, de manière très préférentielle, une durée supérieure à trois jours. En particulier, il est estimé qu'après trois jours de récupération/régénération, les cellules de microalgues ont récupéré un état physiologique similaire à celui de cellules non traitées.A nutritive medium suitable for the cultivation of microalgae can in particular be a growth medium for microorganisms comprising nitrogen, phosphorus and a source of organic carbon. In particular, the nutrient medium suitable for the cultivation of microalgae can be tri-acetate-phosphate medium (TAP). The medium known as TAP is well known to those skilled in the art for the cultivation of microalgae, in particular for the well-studied microalga Chlamydomonas reinhardtii. The TAP medium consists of Trishydroxymethylaminomethane (buffer, known as TRIS), acetate ions, a phosphate solution, Beijerinck salts (NH4CI + MgS04 + CaCI2) and trace elements in the form of traces. The recovery / regeneration stage has, if necessary, a duration greater than or equal to one day, preferably a duration greater than or equal to two days and, very preferably, a duration greater than three days. In particular, it is estimated that after three days of recovery / regeneration, the microalgae cells have recovered a physiological state similar to that of untreated cells.
Le procédé comprenant une étape finale de récupération/régénération permet notamment de garder viables au moins 85%, préférentiellement au moins 95%, très préférentiellement au moins 99% des cellules de microalgues. 5. Liste des figuresThe process comprising a final recovery / regeneration step makes it possible in particular to keep viable at least 85%, preferably at least 95%, very preferably at least 99% of the microalgae cells. 5. List of figures
La Figure 1 représente un profil typique d'impulsions bipolaires (abscisses : Temps en millisecondes (ms) - ordonnées : Tension en millivolts (mV)).Figure 1 shows a typical profile of bipolar pulses (abscissa: Time in milliseconds (ms) - ordinate: Voltage in millivolts (mV)).
La Figure 2 représente la concentration en protéines hydrosolubles extraites (dans le milieu extracellulaire) en fonction de la force électrique du champ électrique pulsé appliqué (nombre d'impulsions 5 ou 9).FIG. 2 represents the concentration of water-soluble proteins extracted (in the extracellular medium) as a function of the electric force of the pulsed electric field applied (number of pulses 5 or 9).
La Figure 3 représente Réchauffement des suspensions en fonction de la force électrique du champ électrique pulsé appliqué (température de référence : 21,1°C).Figure 3 represents Heating of the suspensions according to the electric force of the applied pulsed electric field (reference temperature: 21.1 ° C).
La Figure 4 représente le pourcentage de cellules mobiles en fonction de la force électrique du champ électrique pulsé appliqué.Figure 4 represents the percentage of mobile cells as a function of the electric force of the applied pulsed electric field.
La Figure 5 représente le pourcentage de cellules perméabilisées en fonction de la force électrique du champ électrique pulsé appliqué.Figure 5 represents the percentage of permeabilized cells as a function of the electric force of the applied pulsed electric field.
La Figure 6 représente l'activité photosynthétique brute (« APb »)/le taux de respiration (« R ») en fonction de la force électrique du champ électrique pulsé appliqué.Figure 6 represents the gross photosynthetic activity (“APb”) / the respiration rate (“R”) as a function of the electric force of the applied pulsed electric field.
La Figure 7 représente le rendement quantique maximum de la PS II (<DPo) en fonction de la force électrique du champ électrique pulsé appliqué.Figure 7 shows the maximum quantum efficiency of the PS II (<DPo) as a function of the electric force of the applied pulsed electric field.
La Figure 8 représente le pourcentage de cellules mobiles en fonction du temps de récupération/régénération.Figure 8 shows the percentage of mobile cells as a function of recovery / regeneration time.
La Figure 9 représente le pourcentage de cellules perméabilisées en fonction du temps de récupération/régénération.Figure 9 represents the percentage of permeabilized cells as a function of recovery / regeneration time.
La Figure 10 représente la densité cellulaire en fonction du temps de récupération/régénération.Figure 10 shows cell density as a function of recovery / regeneration time.
La Figure 11 représente l'activité photosynthétique brute en fonction du temps de récupération/régénération.Figure 11 represents the gross photosynthetic activity as a function of the recovery / regeneration time.
La Figure 12 représente le rendement quantique maximum de la PS II (ΦΡο) en fonction du temps de récupération/régénération.Figure 12 shows the maximum quantum yield of PS II (ΦΡο) as a function of the recovery / regeneration time.
La Figure 13 représente le taux de respiration en fonction du temps de récupération/régénération. 6. Description détaillée d'un mode de réalisation 6.1 - Obtention d'une souche axénisée de Haematococcus pluvialisFigure 13 shows the respiration rate as a function of recovery / regeneration time. 6. Detailed description of an embodiment 6.1 - Obtaining an axenized strain of Haematococcus pluvialis
Une souche a été prélevée en milieu naturel dans un bassin de rétention des eaux pluviales. Elle a tout d'abord été isolée puis axénisée grâce à un traitement à l'hypochlorite de sodium.A strain was collected from the wild in a rainwater retention basin. It was first isolated and then axenized by treatment with sodium hypochlorite.
La nouvelle souche isolée et axénisée a été identifiée sur la base de critères morphologiques comme appartenant à l'espèce Haematococcus pluvialis. Afin de compléter l'identification morphologique de la nouvelle souche, une analyse phylogénétique a été réalisée. Le positionnement taxonomique de la nouvelle souche a été précisé suite à la création d'un arbre phylogénétique basé sur un jeu de données regroupant la séquence du gène codant l'ARNr 18S de plusieurs espèces appartenant à l'ordre taxonomique des Chlamydomonadales, dont celle de la nouvelle souche isolée. Les résultats obtenus montrent que notre nouvelle souche appartient au même clade que les espèces Haematococcus pluvialis et Haematococcus lacustris (ces deux dénominations étant des synonymes taxonomiques).The new isolated and axenized strain was identified on the basis of morphological criteria as belonging to the species Haematococcus pluvialis. In order to complete the morphological identification of the new strain, a phylogenetic analysis was carried out. The taxonomic positioning of the new strain was clarified following the creation of a phylogenetic tree based on a dataset grouping the gene sequence coding for 18S rRNA of several species belonging to the taxonomic order of Chlamydomonadales, including that of the new isolated strain. The results obtained show that our new strain belongs to the same clade as the Haematococcus pluvialis and Haematococcus lacustris species (these two names being taxonomic synonyms).
La souche isolée et axénisée a été déposée le 11 décembre 2017 au Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP), Scottish Marine Institute, au Royaume-Uni et a comme numéro d'ordre : CCAP 34/19 Haematococcus pluvialis 6.2 - Obtention de cellules végétatives vertes (stades macrozoïde et palmella)The isolated and axenized strain was deposited on December 11, 2017 at the Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP), Scottish Marine Institute, in the United Kingdom and has as serial number: CCAP 34/19 Haematococcus pluvialis 6.2 - Obtaining cells green plants (macrozoic and palmella stages)
Les microalgues de la souche isolée et axénisée, ci-après appelées « les microalgues », ont été cultivées en conditions stériles dans des erlenmeyers de 250 ou 500 mL contenant le quart de leur capacité volumique en milieu de culture. La densité cellulaire initiale de chaque culture a été fixée à 104 cellules.mL1, l'inoculum étant composé de cellules provenant d'une culture mère âgée d'environ 3 à 4 semaines. La température de la chambre de culture a été maintenue à 19 °C.The microalgae of the isolated and axenized strain, hereinafter called "microalgae", were cultured under sterile conditions in 250 or 500 ml Erlenmeyer flasks containing a quarter of their volume capacity in culture medium. The initial cell density of each culture was fixed at 104 cells.mL1, the inoculum being composed of cells originating from a mother culture aged approximately 3 to 4 weeks. The temperature of the culture chamber was maintained at 19 ° C.
Les meilleurs paramètres de culture ont été obtenus dans un milieu TAP en conditions mixotrophes (exposées à un éclairement de 35 pmoles de photons.m^.s'1 avec une photopériode de 14 h).The best culture parameters were obtained in a TAP medium under mixotrophic conditions (exposed to an illumination of 35 pmol of photons.m ^ .s'1 with a photoperiod of 14 h).
Avec ces paramètres de culture, il n'est pas observé de microalgues au stade kyste. La phase d'enkystement pourrait néanmoins être provoquée par carence en azote (conditions de stress).With these culture parameters, microalgae are not observed at the cyst stage. The encystment phase could however be caused by nitrogen deficiency (stress conditions).
Les paramètres de culture pour d'autres espèces de l'ordre Chlamydomonadales peuvent être aménagés raisonnablement sans représenter une charge excessive pour l'Homme du Métier. Les paramètres à adapter sont notamment la température de culture et/ou les conditions autotrophe, mixotrophe ou hétérotrophe. 6.3 - Préparation d'une suspension de microalguesThe culture parameters for other species of the order Chlamydomonadales can be adjusted reasonably without representing an excessive burden for the skilled person. The parameters to be adapted are in particular the culture temperature and / or the autotrophic, mixotrophic or heterotrophic conditions. 6.3 - Preparation of a microalgae suspension
Les microalgues cultivées (voir section 6.2) ont été collectées par centrifugation (5 min à 400 g, 19°C) avant d'être transférées en conditions stériles dans de l'eau distillée pour obtenir une suspension de microalgues ayant une densité de 105cellules/mL. La suspension a une conductivité d'environ 20 pS.crrf1. 6.4 - Application de champs électriques pulsés et incubation de la suspension temporairement perméabilisée - étude expérimentaleThe cultured microalgae (see section 6.2) were collected by centrifugation (5 min at 400 g, 19 ° C) before being transferred under sterile conditions into distilled water to obtain a suspension of microalgae having a density of 105 cells / mL. The suspension has a conductivity of approximately 20 pS.crrf1. 6.4 - Application of pulsed electric fields and incubation of the temporarily permeabilized suspension - experimental study
Un banc d'électro-perméabilisation a été utilisé pour l'application de champs électriques pulsés. Les principaux appareillages composant le banc d'électro-perméabilisation utilisé dans cette étude ont été les suivants : - deux générateurs d'impulsions interconnectés (DEEX-Bio, 3tech, France) permettant l'application d'impulsions bipolaires aux suspensions cellulaires, - deux chambres d'électroporation (CNRS). En fonction de la force électrique de champ désirée, l'une ou l'autre des deux chambres disponibles a été sélectionnée. En effet, la distance entre les deux électrodes situées à l'intérieur de chaque chambre étant de 6 ou 3 mm, la force électrique maximale des impulsions pouvant être délivrées entre ces deux électrodes est respectivement de 3 ou 6 kV.cm'1.An electro-permeabilization bench was used for the application of pulsed electric fields. The main devices making up the electro-permeabilization bench used in this study were: - two interconnected pulse generators (DEEX-Bio, 3tech, France) allowing the application of bipolar pulses to cell suspensions, - two electroporation chambers (CNRS). Depending on the desired electric field strength, one of the two available chambers has been selected. Indeed, the distance between the two electrodes located inside each chamber being 6 or 3 mm, the maximum electrical force of the pulses that can be delivered between these two electrodes is respectively 3 or 6 kV.cm'1.
Un train d'impulsions bipolaires a été délivré à chaque suspension cellulaire traversant la chambre d'électroporation grâce à l'action d'une pompe péristaltique (Fisher Scientific™ Variable-Flow Peristaltic Pump, Fisher Scientific, Pittsburgh, USA). Le débit devant être appliqué par cette pompe (Q en mL.s'1) a été calculé grâce à l'équation suivante :A train of bipolar pulses was delivered to each cell suspension crossing the electroporation chamber thanks to the action of a peristaltic pump (Fisher Scientific ™ Variable-Flow Peristaltic Pump, Fisher Scientific, Pittsburgh, USA). The flow to be applied by this pump (Q in mL.s'1) was calculated using the following equation:
Q= (F x V) / N où N est le nombre moyen d'impulsions délivrées à chaque microalgue au cours de son passage dans la chambre, F est la fréquence de répétition des impulsions (F = 9,62 Hz) et V est la capacité volumique de la chambre d'électroporation (0,54 ou 0,27 mL pour la chambre de 6 ou 3 mm, respectivement).Q = (F x V) / N where N is the average number of pulses delivered to each microalga during its passage in the chamber, F is the frequency of repetition of the pulses (F = 9.62 Hz) and V is the volume capacity of the electroporation chamber (0.54 or 0.27 mL for the 6 or 3 mm chamber, respectively).
Un profil typique des impulsions bipolaires délivrées par les deux générateurs est représenté Figure 1.A typical profile of the bipolar pulses delivered by the two generators is shown in Figure 1.
Pour chaque valeur de nombre d'impulsions sélectionnée (N = 5 ou 9), cinq forces de champ différentes ont été testées (0,5, 1, 2, 3 et 6 kV.cm1). Les forces de champ égales à respectivement 0,5 et 1 kV.cm"1 correspondent aux forces électriques de champ selon l'invention. Les forces de champ égales à 2, 3 et 6 kV.cm"1 ne correspondent pas aux forces électriques de champ selon l'invention.For each value of number of pulses selected (N = 5 or 9), five different field strengths were tested (0.5, 1, 2, 3 and 6 kV.cm1). The field forces equal to 0.5 and 1 kV.cm "1 respectively correspond to the electric field forces according to the invention. The field forces equal to 2, 3 and 6 kV.cm" 1 do not correspond to the electric forces field according to the invention.
La durée de chaque impulsion a été fixée à 2 ms. La condition "0 kV.cm"1" a été utilisée comme condition témoin : le protocole de traitement a été identique à celui utilisé dans le cas des autres forces excepté qu'aucune impulsion n'a été délivrée lors du passage de la suspension dans la chambre. Par ailleurs, afin d'évaluer réchauffement par effet Joule des suspensions de microalgues dû au traitement par CEP, la température de chacune d'elles a été mesurée juste avant et immédiatement après l'application des impulsions électriques à l'aide d'une sonde thermométrique. La même procédure a été utilisée pour évaluer l'impact des CEP sur la conductivité des suspensions.The duration of each pulse has been set at 2 ms. The condition "0 kV.cm" 1 "was used as a control condition: the treatment protocol was identical to that used in the case of the other forces except that no impulse was delivered during the passage of the suspension in In addition, in order to assess the Joule effect heating of the microalgae suspensions due to the treatment with CEP, the temperature of each was measured just before and immediately after the application of the electrical pulses using The same procedure was used to assess the impact of the CEPs on the conductivity of the suspensions.
Suite à ces mesures, les suspensions cellulaires ont été incubées pendant 45 min à température ambiante afin de laisser suffisamment de temps aux composés intracellulaires pour diffuser hors des cellules. Après une étape de centrifugation (5 min à 400 g, 19°C), les surnageants ont été collectés afin de doser les protéines hydrosolubles extraites ayant diffusé à travers la membrane plasmique des microalgues traitées. 6.4- A. Influence de la force et du nombre des impulsions sur le rendement d'extraction des protéines 6.4- A.i) Impact de l'incubation des cellules dans de l'eau distillée sur la diffusion des protéines hydrosolublesFollowing these measurements, the cell suspensions were incubated for 45 min at room temperature in order to allow sufficient time for the intracellular compounds to diffuse out of the cells. After a centrifugation step (5 min at 400 g, 19 ° C), the supernatants were collected in order to assay the water-soluble proteins extracted having diffused through the plasma membrane of the treated microalgae. 6.4- A. Influence of the strength and the number of pulses on the protein extraction yield 6.4- A.i) Impact of the incubation of cells in distilled water on the diffusion of water-soluble proteins
Trois contrôles différents ont été préparés : - une condition témoin "0 kV.cm'1" pour laquelle le même protocole de traitement que celui utilisé dans le cas des autres forces a été appliqué, excepté qu'aucune impulsion électrique n'a été délivrée lors du passage de la suspension dans la chambre d'électroporation. - un contrôle négatif pour lequel les cellules ont été incubées pendant 45 min (durée identique à celle de la période d'incubation post-traitement) dans de l'eau distillée, tout comme les cellules traitées, sans qu'aucun autre traitement ne leur soit appliqué. Ce contrôle a été réalisé afin de déterminer la quantité de protéines diffusant hors des cellules placées dans un milieu hypotonique pendant une durée déterminée (45 min). - un contrôle positif pour lequel les microalgues ont été broyées à l'aide de microbilles de verre afin d'en extraire toutes les protéines hydrosolubles.Three different controls were prepared: - a control condition "0 kV.cm'1" for which the same treatment protocol as that used in the case of the other forces was applied, except that no electrical pulse was delivered during the passage of the suspension in the electroporation chamber. - a negative control for which the cells were incubated for 45 min (duration identical to that of the post-treatment incubation period) in distilled water, just like the treated cells, without any other treatment be applied. This control was carried out in order to determine the quantity of proteins diffusing out of the cells placed in a hypotonic medium for a determined duration (45 min). - a positive control for which the microalgae were ground using glass microbeads in order to extract all the water-soluble proteins therefrom.
Selon la Figure 2, aucune différence significative en terme de concentration en protéines extraites n'a pu être décelée entre le contrôle négatif et la condition témoin "0 kV.cm'1". Cette observation suggère donc que les forces mécaniques appliquées sur les cellules en raison de l'utilisation de la pompe péristaltique ne conduisent pas à une diffusion supplémentaire (par rapport au contrôle négatif) des protéines vers le milieu extracellulaire. 6.4- A.ii) Influence de la force de champ sur la diffusion des protéines hydrosolublesAccording to FIG. 2, no significant difference in terms of concentration of extracted proteins could be detected between the negative control and the control condition "0 kV.cm'1". This observation therefore suggests that the mechanical forces applied to the cells due to the use of the peristaltic pump do not lead to an additional diffusion (compared to the negative control) of the proteins towards the extracellular medium. 6.4- A.ii) Influence of the field strength on the diffusion of water-soluble proteins
Les différents traitements CEP entraînent une augmentation significative de la concentration en protéines extraites par rapport au contrôle négatif et à la condition témoin (Figure 2). Cependant, l'efficacité d'extraction des protéines n'est pas proportionnelle à la force du champ : elle augmente de manière constante et significative (au maximum d'un facteur 5, comparé à la condition témoin) avec des forces de champ inférieures ou égales à 1 kV.cm'1, puis elle tend à se stabiliser lorsque des forces de champ supérieures sont utilisées. La perméabilisation membranaire induite par le traitement CEP (1 kV.cm'1) est telle qu'après 45 min d'incubation post-traitement, environ 50 % des protéines hydrosolubles extraites par broyage avec des microbilles de verre (contrôle positif) peuvent être collectés (Figure 2). 6.4- A.iii) Influence du nombre d'impulsions sur la diffusion des protéines hydrosolubles L'évolution de la concentration en protéines dans le milieu extracellulaire en fonction de la force du champ suit toujours la même tendance, que ce soit avec l'un ou l'autre des deux nombres d'impulsions (N = 5 ou 9 ; Figure 2). De plus, une augmentation de la valeur de ce paramètre (de 5 à 9) n'influence pas significativement la concentration en protéines électro-extraites dosée dans le surnageant (Figure 2). Ces résultats permettent donc de conclure que le nombre d'impulsions n'a pas d'effet synergique avec la force du champ électrique sur le rendement d'extraction des protéines hydrosolubles, et donc potentiellement sur le degré de perméabilisation de la membrane plasmique.The different CEP treatments lead to a significant increase in the concentration of extracted proteins compared to the negative control and the control condition (Figure 2). However, the extraction efficiency of proteins is not proportional to the strength of the field: it increases steadily and significantly (at most by a factor of 5, compared to the control condition) with lower field strengths or equal to 1 kV.cm'1, then it tends to stabilize when higher field forces are used. The membrane permeabilization induced by the CEP treatment (1 kV.cm'1) is such that after 45 min of post-treatment incubation, approximately 50% of the water-soluble proteins extracted by grinding with glass microbeads (positive control) can be collected (Figure 2). 6.4- A.iii) Influence of the number of pulses on the diffusion of water-soluble proteins The evolution of the protein concentration in the extracellular medium according to the strength of the field always follows the same trend, whether with one either of the two pulse numbers (N = 5 or 9; Figure 2). In addition, an increase in the value of this parameter (from 5 to 9) does not significantly influence the concentration of electro-extracted proteins assayed in the supernatant (Figure 2). These results therefore make it possible to conclude that the number of pulses has no synergistic effect with the strength of the electric field on the extraction yield of water-soluble proteins, and therefore potentially on the degree of permeabilization of the plasma membrane.
Par conséquent, le nombre d'impulsions est fixé à une valeur de 5 pour la suite des expériences. 6.4- B. Influence de la force des impulsions sur l'état physiologique des cellules traitées L'impact de l'intensité des champs électriques sur l'état physiologique des microalgues a été évalué par la mesure des cinq paramètres suivants : la mobilité cellulaire, la perméabilisation de la membrane plasmique, l'activité photosynthétique, le rendement quantique maximal de la photochimie des PS II (ΦΡο) et le taux de respiration. Ces mesures ont été réalisées après une période de récupération de 30 min au cours de laquelle les microalgues ont été replacées dans les conditions de culture mixotrophes définies précédemment (milieu TAP, éclairement de 35 pmoles de photons.m"2.s"1). L'intérêt de cette période de récupération est de laisser du temps aux cellules transférées dans du milieu TAP pour se remettre (au moins en partie) du stress induit par leur séjour dans l'eau distillée, et ainsi pouvoir principalement étudier l'impact des CEP sur leur viabilité. 6.4- B.i) L'échauffement par effet Joule des suspensionsConsequently, the number of pulses is fixed at a value of 5 for the rest of the experiments. 6.4- B. Influence of the force of the pulses on the physiological state of the treated cells The impact of the intensity of the electric fields on the physiological state of the microalgae was evaluated by measuring the following five parameters: cell mobility, permeabilization of the plasma membrane, photosynthetic activity, the maximum quantum yield of photochemistry of PS II (ΦΡο) and the respiration rate. These measurements were carried out after a recovery period of 30 min during which the microalgae were replaced in the mixotrophic culture conditions defined above (TAP medium, illumination of 35 pmol of photons.m "2.s" 1). The advantage of this recovery period is to allow the cells transferred to TAP medium time to recover (at least in part) from the stress induced by their stay in distilled water, and thus be able to mainly study the impact of CEP on their viability. 6.4- B.i) Joule heating of suspensions
Selon la Figure 3, l'échauffement pour des champs électriques pulsés dont la force électrique est égale à 0,5 ou 1 kV.cm"1 est inférieur à 1°C. L'échauffement maximum observé est de 7,1°C pour le champ électrique pulsé dont la force électrique est égale à 6 kV.crrT1. 6.4- B.ii) La mobilité des microalguesAccording to Figure 3, the heating for pulsed electric fields whose electric force is equal to 0.5 or 1 kV.cm "1 is less than 1 ° C. The maximum heating observed is 7.1 ° C for the pulsed electric field whose electric force is equal to 6 kV.crrT1 6.4- B.ii) The mobility of microalgae
La mobilité cellulaire a été analysée afin d'évaluer la capacité des CEP à affecter l'appareil locomoteur (composé de deux flagelles) de la microalgue H. pluvialis au stade macrozoïde. Les résultats obtenus indiquent que seules 40 % des cellules totales de la condition témoin sont mobiles (voir Figure 4). La proportion plus importante de microalgues au stade palmella qu'au stade macrozoïde au sein de la culture mère explique cette observation, qui n'est d'ailleurs pas singulière puisqu'elle coïncide avec les résultats obtenus sur des cellules cultivées pendant 8 jours en conditions mixotrophes. En effet, la proportion de cellules mobiles calculée dans ces conditions est de 52 ± 1,8 %, ce qui n'est pas biologiquement différent de la valeur mesurée pour la condition témoin (40 ± 8 %). Quelque soit la force du champ électrique, le traitement CEP entraîne une diminution du pourcentage de cellules mobiles (comparé à la condition témoin). La perte de mobilité entre les cellules de la condition témoin et celles de la condition "0,5 kV.cm'1" est de 50 %. L'augmentation subséquente de la force des impulsions (de 0,5 à 2 kV.cm'1) entraîne une diminution proportionnelle du pourcentage de cellules mobiles. Pour les plus fortes intensités de CEP (3 et 6 kV.cm'1), la valeur de ce pourcentage reste proche de 4 %. L'absence de mobilité n'implique pas nécessairement la mort des cellules sans mobilité. En effet, l'appareil locomoteur peut être affecté par le traitement CEP sans impliquer nécessairement la mort des cellules. A contrario, la présence de mobilité cellulaire indique la viabilité des cellules. 6.4- B.iii) La perméabilisation de la membrane plasmique L'impact des différents traitements CEP sur la membrane plasmique a été étudié à l'aide du bleu Evans. Il s'agit d'un marqueur de perméabilité capable de traverser la membrane plasmique lorsque cette dernière est perméabilisée. Les cellules ayant incorporé le marqueur sont colorées en bleu alors que les microalgues dont la membrane plasmique est intacte restent vertes. La principale limitation de ce marqueur est qu'il ne permet pas de différencier les cellules perméabilisées de manière transitoire (et donc toujours viables) des cellules irréversiblement perméabilisées qui sont déjà mortes ou qui vont le devenir. Néanmoins, d'après le protocole de coloration utilisé, les mesures de perméabilité ont été réalisées 75 min après la fin du traitement (45 min d'incubation post-traitement + 30 min de récupération en milieu TAP (similaire à l'étape de récupération/régénération présentée en section 8), ce qui est suffisant pour qu'une majorité de cellules perméabilisées de manière transitoire reviennent à leur conformation d'origine (de l'ordre de quelques minutes à une dizaine de minutes lorsque la durée des impulsions est de l'ordre de la ms).Cell mobility was analyzed in order to assess the ability of the CEPs to affect the musculoskeletal system (composed of two flagella) of the microalga H. pluvialis at the macrozoid stage. The results obtained indicate that only 40% of the total cells of the control condition are mobile (see Figure 4). The higher proportion of microalgae at the palmella stage than at the macrozoid stage within the mother culture explains this observation, which is not unusual since it coincides with the results obtained on cells cultivated for 8 days under conditions mixotrophs. Indeed, the proportion of mobile cells calculated under these conditions is 52 ± 1.8%, which is not biologically different from the value measured for the control condition (40 ± 8%). Whatever the strength of the electric field, the CEP treatment results in a decrease in the percentage of mobile cells (compared to the control condition). The loss of mobility between the cells of the control condition and those of the "0.5 kV.cm'1" condition is 50%. The subsequent increase in pulse strength (from 0.5 to 2 kV.cm'1) results in a proportional decrease in the percentage of mobile cells. For the highest CEP intensities (3 and 6 kV.cm'1), the value of this percentage remains close to 4%. The lack of mobility does not necessarily imply the death of cells without mobility. Indeed, the musculoskeletal system can be affected by CEP treatment without necessarily implying the death of cells. Conversely, the presence of cell mobility indicates the viability of the cells. 6.4- B.iii) Permeabilization of the plasma membrane The impact of the various CEP treatments on the plasma membrane was studied using Evans blue. It is a permeability marker capable of crossing the plasma membrane when the latter is permeabilized. The cells that have incorporated the marker are colored blue while the microalgae whose plasma membrane is intact remain green. The main limitation of this marker is that it does not make it possible to differentiate transiently permeabilized (and therefore always viable) cells from irreversibly permeabilized cells which are already dead or which will become so. However, according to the staining protocol used, the permeability measurements were carried out 75 min after the end of the treatment (45 min post-treatment incubation + 30 min recovery in TAP medium (similar to the recovery step). / regeneration presented in section 8), which is sufficient for a majority of cells permeabilized transiently to return to their original conformation (of the order of a few minutes to ten minutes when the pulse duration is the order of the ms).
Les résultats liés à l'utilisation du bleu Evans qui seront discutés dans la suite donnent une indication, mais ne permettent pas de conclure de manière quantitative, sur la capacité des CEP à tuer les microalgues via une perméabilisation irréversible de leur membrane plasmique. Seul l'aspect qualitatif des résultats (voir section 8 pour plus de détails sur la pertinence de cette méthode au niveau quantitatif), incorporation, respectivement non-incorporation, du colorant est à considérer et indique que les cellules sont perméabilisées (irréversiblement mais aussi dans une certaine mesure réversiblement), respectivement les cellules sont non-perméabilisées.The results related to the use of Evans blue which will be discussed below give an indication, but do not allow a quantitative conclusion, on the ability of CEPs to kill microalgae via an irreversible permeabilization of their plasma membrane. Only the qualitative aspect of the results (see section 8 for more details on the relevance of this method at the quantitative level), incorporation, respectively non-incorporation, of the dye is to be considered and indicates that the cells are permeabilized (irreversibly but also in some measure reversibly), respectively the cells are not permeabilized.
Les résultats obtenus pour la condition témoin (0 kV.cm'1) indiquent que 24,2 % des cellules non exposées aux CEP sont perméabilisées (voir Figure 5). Cela signifie que 24,2% des cellules ne seraient pas viables dès l'origine dans la culture témoin. La concentration en protéines dosée dans le surnageant pour la condition témoin et la condition "0,5 kV.cm'1" (Figure 2) est en faveur d'une surestimation de la proportion de cellules perméabilisées pour la condition témoin. En effet, la concentration en protéines dosée suite à l'application de CEP de 0,5kV.cm_1 est en moyenne trois fois supérieure à celle enregistrée pour la condition témoin. Or, si la proportion de cellules perméabilisées pour la condition témoin est en réalité comprise entre 8 et 10 %, alors qu'elle est trois fois plus faible que la proportion calculée pour la condition "0,5 kV.cm"1", ce qui lève l'incohérence entre les données d'extraction et celles de perméabilisation. Les résultats présentés dans la figure 5 vont donc être décrits et discutés sur la base d'une proportion de cellules perméabilisées pour la condition témoin de 9 %.The results obtained for the control condition (0 kV.cm'1) indicate that 24.2% of the cells not exposed to CEP are permeabilized (see Figure 5). This means that 24.2% of the cells would not be viable from the start in the control culture. The protein concentration assayed in the supernatant for the control condition and the "0.5 kV.cm'1" condition (FIG. 2) is in favor of an overestimation of the proportion of cells permeabilized for the control condition. Indeed, the protein concentration assayed following the application of CEP of 0.5kV.cm_1 is on average three times higher than that recorded for the control condition. However, if the proportion of cells permeabilized for the control condition is actually between 8 and 10%, while it is three times lower than the proportion calculated for the condition "0.5 kV.cm" 1 ", this which raises the inconsistency between the extraction and permeabilization data. The results presented in FIG. 5 will therefore be described and discussed on the basis of a proportion of cells permeabilized for the control condition of 9%.
Quelle que soit la force des impulsions délivrées, la proportion de cellules perméabilisées augmente par rapport à la condition témoin (Figure 5). Cependant, cette augmentation n'est pas constante : avec des CEP de 0,5 et 1 kV.cm'1, la proportion de cellules colorées par le bleu Evans est multipliée respectivement par un facteur 3 (27% de cellules perméabilisées) et 6 (54% de cellules perméabilisées) comparé à la condition témoin, alors qu'avec les forces de champ électrique les plus fortes (de 2 à 6 kV.cm'1), la proportion de cellules perméabilisées se stabilise à une valeur d'en moyenne 67 %. 6.4- B.iv) Les paramètres photosynthétiquesWhatever the strength of the pulses delivered, the proportion of permeabilized cells increases compared to the control condition (Figure 5). However, this increase is not constant: with CEPs of 0.5 and 1 kV.cm'1, the proportion of cells stained with Evans blue is multiplied by a factor of 3 (27% of permeabilized cells) and 6, respectively. (54% of permeabilized cells) compared to the control condition, whereas with the strongest electric field forces (from 2 to 6 kV.cm'1), the proportion of permeabilized cells stabilizes at a value of average 67%. 6.4- B.iv) Photosynthetic parameters
Afin d'étudier l'impact des CEP sur le fonctionnement de l'appareil photosynthétique des microalgues, deux paramètres ont été mesurés : l'activité photosynthétique brute (APb) et le rendement quantique maximum de la photochimie des PS II (ΦΡο). L'activité photosynthétique brute renseigne sur la capacité réelle des cellules à réaliser la photosynthèse puisqu'elle correspond à la quantité d'02 produite à la lumière lors de la réaction d'oxydation de l'eau. Le paramètre ΦΡο traduit quant à lui l'efficacité photochimique maximale des PS II. Ce paramètre repose sur le principe selon lequel la lumière captée par les antennes collectrices des PS II peut être utilisée pour réaliser la photochimie, ou bien être réémise dans l'environnement sous forme de chaleur et/ou de fluorescence. Le paramètre ΦΡο est proportionnel au rendement quantique maximum de la photochimie. La valeur optimale de ΦΡο varie entre 0,78 et 0, 85. L'impact des CEP sur le fonctionnement de l'appareil photosynthétique dépend de la force des impulsions. Comme il peut être vu sur les figures 6 et 7, les valeurs de l'activité photosynthétique (Figure 6) et du paramètre ΦPo(Figure 7) ne sont significativement différentes de celles de la condition témoin qu'avec les forces de champs supérieures ou égales à 1 kV.cm'1.In order to study the impact of CEPs on the functioning of the microalgae photosynthetic apparatus, two parameters were measured: gross photosynthetic activity (APb) and the maximum quantum yield of PS II photochemistry (PSο). The gross photosynthetic activity provides information on the actual capacity of cells to carry out photosynthesis since it corresponds to the quantity of O2 produced in light during the oxidation reaction of water. The ΦΡο parameter translates the maximum photochemical efficiency of PS II. This parameter is based on the principle according to which the light captured by the collecting antennas of the PS IIs can be used to carry out photochemistry, or else be re-emitted in the environment in the form of heat and / or fluorescence. The parameter ΦΡο is proportional to the maximum quantum efficiency of photochemistry. The optimal value of ΦΡο varies between 0.78 and 0.85. The impact of CEPs on the functioning of the photosynthetic apparatus depends on the strength of the pulses. As can be seen in Figures 6 and 7, the values of photosynthetic activity (Figure 6) and of the parameter ΦPo (Figure 7) are only significantly different from those of the control condition with higher field forces or equal to 1 kV.cm'1.
Le fait que les CEP entraînent une baisse de la valeur de ces deux paramètres implique que de longues impulsions (> 1 ps), telles que celles utilisées dans la présente étude, associées à une force de champ suffisamment intense peuvent impacter les chloroplastes ainsi que les thylakoïdes, et donc le bon fonctionnement des processus qui s'y déroulent. 6.4- B.v) La respiration cellulaire L'impact de la force du champ électrique sur le taux de respiration cellulaire est similaire à celui observé sur l'activité photosynthétique (voir Figure 6).The fact that the POCs cause a drop in the value of these two parameters implies that long pulses (> 1 ps), such as those used in the present study, associated with a sufficiently strong field strength can impact the chloroplasts as well as the thylakoids, and therefore the proper functioning of the processes taking place there. 6.4- B.v) Cellular respiration The impact of the strength of the electric field on the rate of cellular respiration is similar to that observed on photosynthetic activity (see Figure 6).
En conclusion des sections 6.4-A et 6.4-B, les résultats indiquent que le meilleur compromis entre le rendement d'extraction des protéines et la survie des microalgues est atteint pour un champ électrique pulsé dont la force électrique va de 0,5 à lkV.cm'1. 7) Identification des protéines électro-extraitesIn conclusion of sections 6.4-A and 6.4-B, the results indicate that the best compromise between the efficiency of protein extraction and the survival of microalgae is reached for a pulsed electric field whose electric force goes from 0.5 to lkV .cm'1. 7) Identification of electro-extracted proteins
Les extraits protéiques obtenus avec 0,5 et 1 kV.cm'1 ont été séparés par électrophorèse 1D. Les strips ont été recueillis pour procéder à l'identification de toutes les protéines présentes sur ceux-ci. Grâce aux analyses par Nano-LC ESI MS-MS, 52 protéines ont été caractérisées et identifiées (au moins en partie). Parmi celles-ci, 36 protéines n'ont été électro-extraites qu'avec des CEP de lkV.cm'1. Les 16 autres protéines ont été électroextraites avec les deux conditions CEP. L'augmentation du nombre de "peptides matches" pour la condition "1 kV.cm'1" (comparé à la condition "0,5 kV.cm'1") suggère qu'en plus de la variété des protéines, la quantité électro-extraite d'une même protéine augmente avec la force des impulsions.The protein extracts obtained with 0.5 and 1 kV.cm'1 were separated by 1D electrophoresis. The strips were collected to identify all the proteins present on them. Thanks to Nano-LC ESI MS-MS analyzes, 52 proteins have been characterized and identified (at least in part). Among these, 36 proteins were only electro-extracted with CEPs of lkV.cm'1. The other 16 proteins were electro-extracted with the two CEP conditions. The increase in the number of "peptide matches" for the condition "1 kV.cm'1" (compared to the condition "0.5 kV.cm'1") suggests that in addition to the variety of proteins, the amount electro-extracted from the same protein increases with the force of the impulses.
Les protéines électro-extraites avec les deux forces de champ ont également été séparées par électrophorèse 2D. Les profils électrophorétiques ont permis d'étudier l'impact de la force des impulsions sur le nombre et l'intensité des spots. L'augmentation du nombre (nouveaux spots) et de l'intensité des spots (pour ceux déjà présents avec 0,5 kV.cm1) visibles pour la condition "1 kV.cm1" confirme que l'électro-perméabilisation membranaire et l'électro-extraction des protéines dépendent de la force des impulsions. Néanmoins, la coloration à l'argent ayant été utilisée pour visualiser les spots, seules les protéines présentes pour la condition "1 kV.cm1" mais absentes pour la condition "0,5 kV.cm1" ont été recueillies afin d'être analysées par spectrométrie de masse (microséquençage). Seules 3 ont pu être caractérisées (numéros « 88 », « 186 », « 205 »). Par ailleurs, quatre spots (A, B, C et D) plus intenses pour 1 kV.cm1 que pour 0,5 kV.cm1 ont été sélectionnés de manière aléatoire afin d'être analysés par spectrométrie de masse.The proteins electro-extracted with the two field strengths were also separated by 2D electrophoresis. The electrophoretic profiles made it possible to study the impact of the force of the pulses on the number and intensity of the spots. The increase in the number (new spots) and the intensity of the spots (for those already present with 0.5 kV.cm1) visible for the condition "1 kV.cm1" confirms that the membrane electro-permeabilization and Electro-extraction of proteins depend on the strength of the pulses. However, since silver staining was used to visualize the spots, only the proteins present for the condition "1 kV.cm1" but absent for the condition "0.5 kV.cm1" were collected in order to be analyzed by mass spectrometry (microsequencing). Only 3 could be characterized (numbers “88”, “186”, “205”). In addition, four spots (A, B, C and D) more intense for 1 kV.cm1 than for 0.5 kV.cm1 were randomly selected in order to be analyzed by mass spectrometry.
Les résultats obtenus sont regroupés dans le tableau 1 ci-dessous. Les trois premières protéines (n° 88, 186 et 205) correspondent aux spots, prélevés à partir des gels d'électrophorèses 2D, qui ne sont visibles que pour la condition "1 kV.cm'1". Les quatre protéines suivantes (n° A, B, C et D) correspondent aux spots, prélevés à partir des mêmes gels, qui sont plus intenses pour la condition "1 kV.cm'1" que pour la condition "0,5 kV.cm'1". Les 52 protéines suivantes (n° 1 à 52) proviennent des strips recueillis après les électrophorèses 1D SDS-PAGE. Les protéines 1 à 16 ont été électro-extraites avec des CEP de 0,5 et 1 kV.cm 1 alors que 36 autres (n° 17 à 52) n'ont été électro-extraites qu'avec des CEP de lkV.cm"1.The results obtained are collated in Table 1 below. The first three proteins (nos. 88, 186 and 205) correspond to the spots, taken from 2D electrophoresis gels, which are only visible for the condition "1 kV.cm'1". The following four proteins (n ° A, B, C and D) correspond to the spots, taken from the same gels, which are more intense for the condition "1 kV.cm'1" than for the condition "0.5 kV .cm'1 ". The following 52 proteins (n ° 1 to 52) come from strips collected after 1D SDS-PAGE electrophoresis. Proteins 1 to 16 were electro-extracted with CEPs of 0.5 and 1 kV.cm 1 while 36 others (nos. 17 to 52) were only electro-extracted with CEPs of lkV.cm "1.
Tableau 1Table 1
La caractérisation des protéines électro-extraites et l'analyse des spots visibles sur les profils électrophorétiques correspondant aux conditions "0,5 kV.cm1" et "1 kV.cm1" ontThe characterization of the electro-extracted proteins and the analysis of the visible spots on the electrophoretic profiles corresponding to the conditions "0.5 kV.cm1" and "1 kV.cm1" have
montré que l'efficacité des CEP en matière de variété de protéines et, pour une même protéine, de quantité de matière électro-extraite dépend de la force des impulsions. L'identification des protéines électro-extraites avec des CEP de 1 kV.cm"1 nous a permis de déterminer la localisation intracellulaire initiale de celles-ci et donc les compartiments affectés par les CEP. D'après les résultats obtenus, le cytoplasme, le chloroplaste, l'appareil de Golgi, le réticulum endoplasmique et, potentiellement, la mitochondrie en font partie. Des CEP de 1 kV.crrT1 sont donc suffisamment forts pour entraîner la perméabilisation de la/des membrane(s) des organites et affecter les processus qui s'y déroulent. En revanche, aucune protéine de la paroi cellulaire n'a été identifiée parmi les protéines extraites. De plus, près de la moitié des protéines identifiées sont localisées (avant extraction) dans le chloroplaste. 8) Récupération/Régénération des microalguesshown that the effectiveness of CEPs in terms of variety of proteins and, for the same protein, quantity of electro-extracted matter depends on the strength of the pulses. The identification of the electro-extracted proteins with CEPs of 1 kV.cm "1 allowed us to determine the initial intracellular localization of these and therefore the compartments affected by the CEPs. According to the results obtained, the cytoplasm, the chloroplast, the Golgi apparatus, the endoplasmic reticulum and, potentially, the mitochondrion are among them. 1 kV.crrT1 PECs are therefore strong enough to cause permeabilization of the organelle membrane (s) and affect On the other hand, no protein from the cell wall has been identified among the extracted proteins. In addition, almost half of the proteins identified are located (before extraction) in the chloroplast. 8) Recovery / Regeneration of microalgae
Les culots cellulaires obtenus après l'étape de centrifugation sont placés dans du milieu de culture TAP. La densité cellulaire des nouvelles suspensions ainsi obtenues a été fixée à 5.104 cellules.mL"1.The cell pellets obtained after the centrifugation step are placed in TAP culture medium. The cell density of the new suspensions thus obtained was fixed at 5.104 cells.mL "1.
Afin d'étudier la capacité de récupération/régénération des microalgues, différents paramètres traduisant leur état physiologique ont été mesurés pendant les trois jours suivant leur exposition à des CEP de 1 kV.cm'1 (N = 5) : la mobilité, la perméabilisation de la membrane plasmique, la multiplication cellulaire, l'activité photosynthétique, le rendement quantique maximum de la photochimie des PS II et la respiration. Les valeurs obtenues ont été comparées à celle d'une condition témoin (0 kV.cm'1) pour laquelle le même protocole de traitement a été utilisé excepté qu'aucune impulsion n'a été délivrée lors du passage des cellules dans la chambre d'électroporation.In order to study the recovery / regeneration capacity of microalgae, various parameters reflecting their physiological state were measured during the three days following their exposure to CEP of 1 kV.cm'1 (N = 5): mobility, permeabilization of the plasma membrane, cell multiplication, photosynthetic activity, maximum quantum yield of photochemistry of PS II and respiration. The values obtained were compared with that of a control condition (0 kV.cm'1) for which the same treatment protocol was used except that no pulse was delivered during the passage of the cells in the chamber. electroporation.
Dans les deux conditions (0 et 1 kV.cm'1), le pourcentage de cellules mobiles augmente dès le premier jour de la période de récupération et continue d'augmenter durant les deux jours suivants pour finalement atteindre 85 % du nombre total de microalgues dans les deux populations (voir Figure 8). Pour expliquer ce résultat, l'hypothèse suivante peut être formulée : l'augmentation de la mobilité est le résultat de l'apparition de nouvelles cellules flagellées (stade macrozoïde) grâce à la reprise des divisions cellulaires. L'augmentation proportionnelle de la densité cellulaire (voir Figure 10) et du pourcentage de cellules mobiles dans les deux conditions (0 et 1 kV.cm'1) renforce la validité de cette hypothèse. Dans le cas de la condition "1 kV.cm'1", la proportion de cellules mobiles augmente plus fortement que pour la condition témoin. Une seconde hypothèse (valable uniquement pour les cellules de la condition "1 kV.cm'1") peut donc être envisagée : au cours de la période de récupération, la machinerie flagellaire des cellules traitées par CEP se remet à fonctionner normalement (réparation des dommages, augmentation de la synthèse d'ATP).In both conditions (0 and 1 kV.cm'1), the percentage of mobile cells increases from the first day of the recovery period and continues to increase during the following two days, finally reaching 85% of the total number of microalgae in both populations (see Figure 8). To explain this result, the following hypothesis can be formulated: the increase in mobility is the result of the appearance of new flagellated cells (macrozoid stage) thanks to the resumption of cell divisions. The proportional increase in cell density (see Figure 10) and in the percentage of mobile cells under the two conditions (0 and 1 kV.cm'1) reinforces the validity of this hypothesis. In the case of the "1 kV.cm'1" condition, the proportion of mobile cells increases more strongly than for the control condition. A second hypothesis (valid only for cells with the condition "1 kV.cm'1") can therefore be considered: during the recovery period, the flagellar machinery of cells treated with CEP resumes functioning normally (repair of damage, increased ATP synthesis).
Le pourcentage de cellules perméabilisées (Figure 9) au sein des suspensions traitées par des CEP de 1 kV.cm'1 est significativement plus fort (55 % en moyenne du nombre total de cellules) que celui calculé pour la condition témoin durant les premières 24 h de la période de récupération. Il retourne à un niveau basal au cours des 24 h suivantes. Dans le cas de la condition témoin (0 kV.cm'1), la proportion de cellules perméabilisées reste stable et inférieure à 10 % (en moyenne) de la population totale tout au long de la période de suivi. Or une membrane plasmique perméabilisée de manière transitoire suite à l'application d'impulsions électriques de l'ordre de la ms retrouve sa conformation initiale en seulement quelques minutes (au maximum). La première mesure de perméabilisation étant réalisée 75 min après la fin du traitement, le pourcentage de cellules perméabilisées au jour 0 (57,5 %) devrait donc correspondre à la proportion de cellules irréversiblement perméabilisées. Ces microalgues ne devraient par conséquent plus être viables. La diminution de la proportion de cellules perméabilisées observée entre les jours 1 et 2 serait donc a priori due à la multiplication des cellules restées viables suite au traitement (c'est-à-dire les 42,5 % de cellules non perméabilisées). Néanmoins, la comparaison de l'évolution de la proportion de cellules (irréversiblement) perméabilisées par rapport à celle de la densité cellulaire révèle une incohérence au jour 1. En effet, la densité cellulaire des cultures traitées avec des CEP de 1 kV.cm'1 augmente continuellement au cours de la période de suivi et (presque) à la même vitesse que celle des cultures de la condition témoin (Figure 10). Le nombre de cellules ayant doublé entre le jour 0 et le jour 1, la proportion de cellules ayant été exposées aux CEP au sein de la population totale est donc réduite de moitié. Or, la proportion de cellules perméabilisées ne varie pas significativement au cours des premières 24 h, ce qui indiquerait qu'une partie des cellules issues des divisions ayant eu lieu après le traitement serait perméabilisée alors que ces cellules "filles" n'ont pas été exposées aux impulsions électriques. De part leur capacité à se diviser, les cellules incorporant le bleu Evans sont donc visiblement toujours viables. Ce résultat remet en cause la pertinence du choix du bleu Evans comme marqueur quantitatif de perméabilisation réversible/irréversible, et donc de viabilité/mortalité.The percentage of permeabilized cells (Figure 9) in suspensions treated with 1 kV.cm'1 CEP is significantly higher (55% on average of the total number of cells) than that calculated for the control condition during the first 24 h of the recovery period. It returns to a basal level over the next 24 hours. In the case of the control condition (0 kV.cm'1), the proportion of permeabilized cells remains stable and less than 10% (on average) of the total population throughout the follow-up period. However, a plasma membrane permeabilized in a transient manner following the application of electrical pulses of the order of the ms regains its initial conformation in only a few minutes (at most). The first permeabilization measurement being carried out 75 min after the end of the treatment, the percentage of cells permeabilized on day 0 (57.5%) should therefore correspond to the proportion of cells irreversibly permeabilized. These microalgae should therefore no longer be viable. The decrease in the proportion of permeabilized cells observed between days 1 and 2 would therefore be a priori due to the multiplication of cells which remained viable following the treatment (that is to say the 42.5% of non-permeabilized cells). Nevertheless, the comparison of the evolution of the proportion of cells (irreversibly) permeabilized compared to that of cell density reveals an inconsistency on day 1. Indeed, the cell density of cultures treated with CEPs of 1 kV.cm ' 1 increases continuously during the follow-up period and (almost) at the same speed as that of the cultures of the control condition (Figure 10). The number of cells having doubled between day 0 and day 1, the proportion of cells having been exposed to CEP within the total population is therefore halved. However, the proportion of permeabilized cells does not vary significantly during the first 24 h, which would indicate that a part of the cells originating from divisions which took place after treatment would be permeabilized while these "daughter" cells have not been exposed to electrical impulses. Due to their ability to divide, cells incorporating Evans blue are therefore obviously always viable. This result calls into question the relevance of the choice of Evans blue as a quantitative marker of reversible / irreversible permeabilization, and therefore of viability / mortality.
La densité cellulaire des cultures traitées par CEP augmente dès le début de la période de récupération. Les premières divisions post-traitement ont donc lieu au cours des 24 h suivant le transfert des cellules dans du milieu TAP frais. Les microalgues se divisent cependant un peu plus lentement (0,5 versus 0,63 j-1) que les cellules non traitées (Figure 10) même si la différence de densité cellulaire entre les deux conditions n'est pas significative (p value > 0,05) durant les trois jours de suivi. L'augmentation rapide de la densité cellulaire des cultures traitées indique que les microalgues produisent très vite suffisamment d'énergie sous forme d'ATP pour se multiplier. Deux processus sont responsables de la synthèse d'ATP : la respiration et la photophosphorylation (photosynthèse). Au cours des deux premiers jours de la période de récupération, le taux de respiration des cellules traitées augmente (Figure 13), ce qui pourrait indiquer une augmentation de la production d'ATP. Néanmoins, l'augmentation parallèle du taux de respiration des cellules de la condition témoin suggère une contamination bactérienne des cultures (traitées et non traitées) significative dès le début de la période de suivi. Par conséquent, il est probable que des bactéries soient responsables de l'augmentation du taux de respiration mesurée pour les deux conditions.The cell density of cultures treated with CEP increases from the start of the recovery period. The first post-treatment divisions therefore take place within 24 hours of the transfer of the cells to fresh TAP medium. However, microalgae divide a little more slowly (0.5 versus 0.63 d-1) than untreated cells (Figure 10) even if the difference in cell density between the two conditions is not significant (p value> 0.05) during the three days of follow-up. The rapid increase in cell density of the treated cultures indicates that microalgae very quickly produce enough energy in the form of ATP to multiply. Two processes are responsible for the synthesis of ATP: respiration and photophosphorylation (photosynthesis). During the first two days of the recovery period, the respiration rate of the treated cells increases (Figure 13), which could indicate an increase in ATP production. However, the parallel increase in the respiration rate of cells of the control condition suggests significant bacterial contamination of cultures (treated and untreated) from the start of the follow-up period. Therefore, it is likely that bacteria are responsible for the increase in respiration rate measured for both conditions.
Dans le même temps, les valeurs de l'activité photosynthétique (Figure 11) et du rendement quantique maximal de la photochimie des PS II (Figure 12) des cellules traitées restent significativement inférieures à celles des cellules de la condition témoin (0 kV.cm1). L'énergie fournie par la photophosphorylation est donc réduite pendant cette période. L'ATP (manquant) n'étant pas produit par une respiration plus intense, la capacité des cellules traitées à réaliser la photochimie semble par conséquent être suffisamment grande pour fournir l'énergie indispensable à la multiplication des microalgues. A partir du 2ème jour de récupération, les valeurs de l'activité photosynthétique et du paramètre <DPo des cellules traitées par CEP augmentent pour atteindre des valeurs qui ne sont plus significativement inférieures à celles des cellules non traitées (Figures 11 et 12). La densité cellulaire des cultures traitées augmentant dès le début de la période de suivi, la proportion de cellules ayant été exposées aux CEP dans ces cultures diminue au cours du temps. Cependant, comme les valeurs des paramètres photosynthétiques n'augmentent que plus tardivement, les dommages causés par les CEP à la machinerie photosynthétique semblent se "transmettre" aux cellules issues des divisions post-traitement. Les résultats présentés précédemment suggèrent fortement que le traitement CEP conduit à la perméabilisation des enveloppes chloroplastiques et des membranes thylacoïdales, permettant ainsi la diffusion des protéines et éventuellement de molécules de chlorophylles et de caroténoïdes. L'hypothèse que la récupération lente (72h) de la machinerie photosynthétique suite au traitement CEP est liée au temps nécessaire (1) à la synthèse de novo des molécules électro-extraites et (2) à la chaîne de transport des électrons photosynthétique pour fonctionner à nouveau normalement peut donc être émise.At the same time, the values of photosynthetic activity (Figure 11) and of the maximum quantum yield of the photochemistry of PS II (Figure 12) of the treated cells remain significantly lower than those of the cells of the control condition (0 kV.cm1 ). The energy supplied by photophosphorylation is therefore reduced during this period. Since ATP (missing) is not produced by more intense respiration, the capacity of the treated cells to carry out photochemistry therefore appears to be sufficiently great to supply the energy essential for the multiplication of microalgae. From the 2nd day of recovery, the values of the photosynthetic activity and of the parameter <DPo of the cells treated with CEP increase to reach values which are no longer significantly lower than those of the untreated cells (FIGS. 11 and 12). The cell density of the treated cultures increasing from the start of the follow-up period, the proportion of cells having been exposed to CEP in these cultures decreases over time. However, as the values of the photosynthetic parameters only increase later, the damage caused by the CEP to the photosynthetic machinery seems to be "transmitted" to the cells resulting from the post-processing divisions. The results presented above strongly suggest that the CEP treatment leads to the permeabilization of the chloroplastic envelopes and the thylacoid membranes, thus allowing the diffusion of proteins and possibly molecules of chlorophylls and carotenoids. The hypothesis that the slow recovery (72h) of the photosynthetic machinery following the CEP treatment is linked to the time required (1) to de novo synthesis of the electro-extracted molecules and (2) to the photosynthetic electron transport chain to function again normally can therefore be issued.
Les résultats présentés dans cette section permettent de conclure que les cellules traitées avec des CEP de 1 kV.cm"1 (N = 5) sont capables de retrouver un état physiologique similaire à celui de cellules non traitées dans un délai de 3 jours suivant l'application du traitement. 9) Optimisation de l'étape d'incubation L'objectif a été d'améliorer l'état physiologique des cellules traitées sans que le rendement d'extraction des protéines hydrosolubles soit réduit. L'eau distillée n'étant pas un milieu optimal pour la culture d'H. pluvialis, l'impact de la durée de la période d'incubation post-traitement des cellules dans l'eau distillée a été étudié. Les paramètres de CEP définis précédemment (1 kV.cm'1 et N = 5) n'ont quant à eux pas été modifiés.The results presented in this section allow to conclude that cells treated with CEP of 1 kV.cm "1 (N = 5) are able to recover a physiological state similar to that of untreated cells within 3 days of application of the treatment 9) Optimization of the incubation step The objective was to improve the physiological state of the treated cells without reducing the extraction efficiency of the water-soluble proteins. not an optimal medium for the culture of H. pluvialis, the impact of the duration of the post-treatment incubation period of the cells in distilled water was studied. The CEP parameters defined previously (1 kV.cm '1 and N = 5) have not been modified.
Les résultats montrent qu'une période d'incubation réduite à 5 min, constitue un bon compromis entre le rendement d'extraction des protéines et la viabilité cellulaire.The results show that an incubation period reduced to 5 min constitutes a good compromise between the protein extraction yield and the cell viability.
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