FR3074501A1 - Isolement et culture pure d'une archee de l'ordre des methanomassiliicoccales - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé d'isolement d'une archée de l'ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal, l'utilisation d'un milieu de culture et/ou d'isolement comprenant un extrait stérile d'une culture bactérienne d'une bactérie du genre Eggerthella, pour l'isolement et/ou la culture d'une archée de l'ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal, ainsi qu'une archée Methanomethylophilus alvus Mx-05 pure isolée. Elle concerne également une méthode de culture d'une archée de l'ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal.
Description
Isolement et culture pure d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales
La présente invention concerne un procédé d’isolement d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal, l’utilisation d’un milieu de culture et/ou d’isolement comprenant un extrait stérile d’une culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella, pour l’isolement et/ou la culture d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal, ainsi qu’une archée Methanomethylophilus alvus Mx-05 pure isolée. Elle concerne également une méthode de culture d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal.
L’ordre taxinomique des Methanomassiliicoccales, micro-organismes procaryotes de type archée, est constitué de 2 grands clades (Sollinger et al, 2015 ; Borrel et al, 2017). L’un d’eux est formé quasi-exclusivement de micro-organismes vivant dans le tractus digestif des animaux (des insectes à l’homme), dit « host-associated cluster » ou clade commensal. Ce clade comprend notamment des membres naturels du microbiote intestinal de l’homme, et parmi ceux-ci certains capables de transformer la triméthylamine (TMA) en méthane en utilisant l’hydrogène comme donneur d’électrons. La TMA est un composé pro-athérogène issu du métabolisme microbien intestinal de nutriments variés. L’utilisation possible de ces organismes comme probiotiques afin notamment de prévenir les maladies cardio-vasculaires (« archaebiotics »), en abaissant le taux de TMA intestinal a été décrit (Brugère et al, 2014). Ceci entraîne en conséquence une diminution de son dérivé plasmatique (oxyde de TMA plasmatique ou pTMAO) issu de son passage hépatique après absorption intestinale (oxydation hépatique par des flavines monoxygénases), métabolite impliqué dans divers mécanismes concourant à l’athérosclérose. Il n’existe pour l’heure aucun autre composant du microbiote intestinal humain dont on sache qu’il puisse remédier la TMA en un métabolite considéré inerte pour l’homme, le méthane.
Or, aucun représentant de ce groupe de microorganismes (clade commensal), possédant cette activité de bio-remédiation, n’a pour l’heure été isolé et obtenu en culture pure.
Au-delà des problèmes techniques liés à la microbiologie anaérobie de ces microorganismes connus pour être hautement sensibles à l’oxygène (EOS, Extremely Oxygen Sensitive), la pratique usuelle pour l’isolement de ce type de micro-organisme nécessite des conditions opératoires particulières. Après obtention d’un enrichissement où les archées méthanogènes deviennent dominantes, 2 approches sont alors réalisées: (i) « clonage » de la culture en passant par des milieux solides en utilisant la technique des
Roll-tubes (Hungate, 1969) ou (ii) dilutions/extinctions de l’enrichissement en milieu liquide pour éliminer en particulier les microorganismes fermentaires non méthanogènes.
Jusqu’à maintenant, ces techniques se sont révélées inefficaces pour isoler en culture axénique les Methanomassiliicoccales du clade commensal, quelles que soient les conditions d’isolement utilisées (rapporté dans divers articles scientifiques, notamment Sôllinger et al, 2015).
Or, disposer d’une souche pure et contrôler sa croissance sont des prérequis pour pouvoir envisager une application à visée thérapeutique.
Dans le cadre de la présente invention, l’espèce Methanomethylophilus alvus souche Mx-05 pure a été isolée en appliquant une approche tout à fait innovante.
La présente invention concerne ainsi une archée (domaine Archaea) Methanomethylophilus alvus Mx-05 isolée pure, souche déposée selon le Traité de Budapest, le 18 septembre 2017, auprès du Leibniz-Institut (DSMZ, Braunschweig, Allemagne) sous le numéro DSM32684 (déposant : Université Clermont Auvergne, France).
Elle concerne également l’utilisation d’un milieu de culture et/ou d’isolement comprenant un extrait stérile d’une culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella pour l’isolement et/ou la culture pure (axénique) d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal. Avantageusement, ledit milieu de culture et/ou d’isolement comprend un/des facteur(s) de croissance obtenu(s) à partir de ladite culture d’une bactérie du genre Eggerthella.
La présente invention concerne par ailleurs un procédé d’isolement d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal comprenant :
a) l’inoculation d’un échantillon biologique susceptible de comprendre une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal, de préférence un échantillon de selles animales ou humaines, en conditions anaérobies sous une atmosphère gazeuse contenant du dihydrogène H2 dans des conditions mésothermiques dans un milieu de culture comprenant (i) un milieu de base comprenant du KH2PO4, du NaCI, du MgSO4.7H2O, du NH4CI, du CaCI2.2H2O, de l’acétate de sodium, de la CysteineHCI, de la résazurine, une solution d’oligoéléments de Widdel, une solution de sélénitetungstate, (ii) du Na2S à 2% et NaHCO3 à 10%, un mélange de vitamines (par exemple solution de vitamines de Balch), auquel est ajouté (iii) un ou plusieurs composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casamino acides, de l’extrait de levure, et (iv) des composés méthylés tels que des méthylamines ou du méthanol;
b) le remplacement du milieu de culture de l’étape a) par un milieu de culture identique appauvri en composés apportant des acides aminés et dans lequel des vitamines sont ajoutées;
c) la détection d’un enrichissement positif en une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal dans ledit échantillon inoculé, en particulier par microscopie, production de méthane et consommation d’H2, PCR, qPCR ou séquençage; et
d) la réalisation de séries de dilutions liquides ou par la technique des roll tubes dudit enrichissement positif obtenu à l’étape c) en utilisant un milieu tel que défini à l’étape
a) ou b) auquel sont ajoutés un extrait stérile d’une culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella selon l’invention, jusqu’à l’obtention d’un clone d’archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal.
Elle concerne enfin une méthode de culture d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal, pure ou présente dans un consortium microbien, comprenant :
a) l’inoculation soit d’un échantillon biologique comprenant une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal, de préférence un échantillon de selles animales ou humaines dans un milieu de culture, soit d’une archée pure de l’ordre des Methanomassiliicoccales comprenant (i) un milieu de base comprenant du KH2PO4, du NaCI, du MgSO4.7H2O, du NH4CI, du CaCI2.2H2O, de l’acétate de sodium, de la CystéineHCI, de la résazurine, une solution d’oligoéléments de Widdel, une solution de sélénitetungstate, Na2S à 2% et/ou NaHCO3 à 10%, auquel est ajouté (ii) un ou plusieurs composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casamino-acides, de l’extrait de levure, (iii) des composés méthylés tels que des méthylamines ou du méthanol et (iv) un extrait stérile d’une culture bactérienne de la bactérie du genre Eggerthella, selon l’invention,
b) le placement de l’inoculum obtenu à l’étape a) en conditions anaérobies sous une atmosphère gazeuse comprenant du dihydrogène H2, et
c) une incubation dans des conditions mésothermiques, pour atteindre une phase de croissance exponentielle avec production de méthane en au moins 2 jours, de préférence pas plus de 15 jours.
Archée Methanomethylophilus alvus Mx-05
Tel que susmentionné, la présente invention concerne une archée Methanomethylophilus alvus Mx-05 pure isolée, souche déposée selon le Traité de Budapest, le 18 septembre 2017, auprès du Leibniz-Institut (DSMZ, Braunschweig,
Allemagne) sous le numéro DSM32684 (déposant : Université Clermont Auvergne, France).
Ce dépôt a été effectué par l’Université Clermont Auvergne, 49 boulevard François Mitterrand - 63000 Clermont-Ferrand - France.
Par « pure », on entend le sens couramment employé par l’homme du métier dans le domaine de l’invention. En particulier, par pure, on entend l’absence de contaminants et la seule présence d’une souche, colonie ou clone de l’archée Methanomethylophilus alvus Mx-05. Les critères de pureté sont ceux habituellement utilisés par l’homme du métier. En particulier, dans le cadre de la présente invention, les critères sont la morphologie uniforme des cellules, la production de méthane, et l'absence de croissance dans un milieu complexe (SMS) contenant des hydrates de carbone non consommés par l’archée méthanogène, mais permettant de mettre en évidence des contaminants méthanogènes s’il y a lieu.
Par « isolée », on entend le sens communément employé par l’homme du métier dans le domaine technique de l’invention. Une archée Methanomethylophilus alvus Mx-05 isolée sera une archée séparée des autres archées et/ou bactéries et/ou levures ou autres contaminants eucaryotes potentiellement présents dans l’échantillon de départ.
Tel que susmentionné, les Methanomassiliicoccales sont des micro-organismes procaryotes de type archéen constitués de 2 grands clades, dont le clade dit « commensal » auquel appartient la souche susmentionnée, formé quasi-exclusivement de micro-organismes vivant dans le tractus digestif des animaux (des insectes à l’homme), ladite souche appartenant à celles capables de transformer la TMA en méthane en utilisant l’hydrogène comme donneur d’électrons.
Utilisation d’un milieu de culture et/ou d’isolement comprenant un extrait stérile d’une culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella,
Tel que susmentionné la présente invention concerne également l’utilisation d’un milieu de culture et/ou d’isolement comprenant un extrait stérile d’une culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella, pour l’isolement et/ou la culture pure d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal.
Tel que susmentionné, avantageusement, ledit milieu de culture et/ou d’isolement comprend un/des facteur(s) de croissance obtenu(s) à partir de ladite culture d’une bactérie du genre Eggerthella.
Ledit milieu de culture et/ou d’isolement peut comprendre en outre tout composé qui peut être utile à la culture ou l’isolement d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal.
En particulier, le milieu comprend en outre un ou plusieurs composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casamino acides, et de l’extrait de levure.
Par exemple, le milieu comprend en outre de 0,5 à 50 g/L de Biotrypcase, de peptone, de casamino acides, d’extrait de levure (en particulier 10g/L de chacun de ces composés). En outre, le milieu peut comprendre du coenzyme M. Ce co-facteur est indispensable à la méthanogenèse. Dans le cas de l’archée Methanomethylophilus alvus Mx-05, le coenzyme M peut être omis.
Encore plus particulièrement, le milieu comprend en outre du KH2PO4, du NaCI, du MgSO4.7H2O, du NH4CI, du CaCI2.2H2O, de l’acétate de sodium, de la Cystéine-HCI, de la résazurine, une solution d’oligoéléments de Widdel, une solution de sélénite-tungstate, du Na2S à 2% et/ou du NaHCO3 à 10%.
Toujours plus particulièrement ; le milieu comprend des composés méthylés tels que des méthylamines ou du méthanol.
Par « méthylamines », on entend notamment la mono-, di- ou tri-méthylamine.
Un exemple d’un tel milieu appelé milieu de base est donné dans le tableau 3 présenté dans les exemples.
Tous ces composés sont des composés disponibles commercialement et/ou bien connus de l’homme du métier.
Le milieu de base est par exemple préparé sous une atmosphère gazeuse N2/CO2 (80 :20 % v/v).
Une solution de tungstate-sélénite a par exemple la composition suivante pour un litre: 0,4 g NaOH, 2 mg Na2SeO3et 4 mg Na2WO4.5H2O.
Une solution d’oligoéléments de Widdel a par exemple la composition suivante et peut être préparée comme suit :
Dissoudre du chlorure ferreux dans de l'acide chlorhydrique. Ajouter l'eau bidistillée puis les sels des différents oligo-éléments. Ajuster le pH entre 7,1 et 7,3 avec HCl ou Na2CO3.
Cette solution d'oligo-éléments peut par exemple être utilisée à raison de 1 mL par litre de milieu de culture.
Tableau 1 : Composition d’une solution d’oligoéléments de Widdel
| Acide nitrilotriacétique | 1,50 | g |
| MgCI2, 6H2O | 2,50 | g |
| NaCI | 1,00 | g |
| MnCI2, 4H2O | 0,60 | g |
| FeCI2, 4H2O | 100,00 | mg |
| CoCI2, 6H2O | 100,00 | mg |
| CaCI2, 2H2O | 100,00 | mg |
| ZnCI2 | 100,00 | mg |
| CuCI2, 2H2O | 10,00 | mg |
| AlCIg | 10,00 | mg |
| h3bo3 | 10,00 | mg |
| Na2Mo04, 2H2O | 10,00 | mg |
| pH (ajusté avec solution KOH 10M) | 6,50 | |
| H2O bidistillée q.s.p. | 1000 | mL |
Le milieu de culture selon l'invention peut se trouver à l'état liquide auquel cas il comporte de l'eau distillée ou dans un état lyophilisé apte à être régénéré par ajout d'eau distillée ou encore à l'état solide, notamment sous forme gélosée, plus particulièrement par ajout d'agar, plus particulièrement agar à 2% final.
Par « Eggerthella », on entend un genre bactérien d'Actinobacteria de la famille Coriobacteriaceae. Les membres de ce genre sont des bacilles anaérobies, non sporulants, non mobiles, Gram-positifs qui se développent de manière isolée, en paires ou en chaînes courtes. On les trouve notamment dans le côlon humain.
Dans le cadre de la présente invention, l’extrait stérile_d’une culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella, provient en particulier d’une bactérie choisie parmi Eggerthella tenta ou la souche dénommée Eggerthella sp. Eg01-Mx05 déposée selon le Traité de Budapest, le 13 juillet 2017, auprès du Leibniz-Institut (DSMZ, Braunschweig, Allemagne) sous le numéro DSM 32565.
Ce dépôt a été effectué par l’Université Clermont Auvergne, 49 boulevard François Mitterrand - 63000 Clermont-Ferrand - France.
Par « extrait stérile », on entend le sens communément employé par l’homme du métier dans le domaine technique de l’invention, c’est-à-dire dépourvu de tout organisme viable.
En particulier dans le cadre de la présente invention, l’extrait stérile est obtenu par toute technique connue de l’homme du métier tant qu’elle n’altère pas l’activité biologique de l’extrait. En particulier, dans le cadre de la présente invention, l’extrait stérile est un filtrat bactérien d’une bactérie du genre Eggerthella.
Par « filtrat », on entend le sens communément employé par l’homme du métier, c’est-à-dire ici le liquide recueilli à l’issu de l’étape de filtration sur un filtre d’une porosité empêchant le passage de cellules vivantes.
En particulier, dans le cadre de la présente invention, le filtrat d’une culture de la bactérie du genre Eggerthella est préparé selon le procédé comprenant :
a) la culture d’une bactérie du genre Eggerthella dans un milieu tels que par exemple les milieux conventionnels ATCC 260 ou 1490 et DSMZ 78 ou 209, ledit milieu comprenant du Biotrypcase, de l’extrait de levure, de la peptone, des acides aminés, de l’extrait de viande, de l’hémine, et/ou de la vitamine K1 ou K3; et des sucres simples ;
b) l’incubation du milieu de culture comprenant ladite bactérie à une température de 20 à 40°C, de préférence à 37°C, pendant au moiis 1 jour, de préférence pas plus de 15 jours ;
c) la filtration du milieu de culture comprenant ladite bactérie, de préférence à l’aide de filtres ne laissant pas passer les organismes vivants, en particulier sur un filtre dont la taille des pores est de 0,2 pm ; et
d) la récupération du filtrat obtenu à l’issu de l’étape c).
Par « sucres simples », on entend des monosides ou oses à 5 ou 6 atomes de carbone, par exemple du glucose.
En particulier, le milieu de culture de l’étape a) de procédé de préparation du filtrat comprend par exemple de 0,5 à 50 g/L de Biotrypcase, de peptone, de casamino acides, d’extrait de levure (préférentiellement 10 g/L) et 0 à 100 mM de glucose (préférentiellement 20mM).
La température mentionnée à l’étape b) est comprise entre 20 et 40°C. Elle est donc par exemple comprise entre 30 et 40 °C ou entre 35 et 40 °C. Elle est donc par exemple de 21,22, 25, 27, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39°C, en particulier de 37°C.
L’incubation est réalisée par toute technique connue de l’homme du métier, en conditions anaérobies, comme par exemple celles décrites pour les espèces dEggerthella tenta par les organismes de collections de microorganismes tels que ATCC ou DSMZ.
L’incubation dure au moins 1 jour et de préférence pas plus de 15 jours. Elle est donc par exemple de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 jours, en particulier de 7 jours.
La stérilisation par filtration mentionnée à l’étape c) du procédé de préparation d’un filtrat bactérien peut être remplacée par toute technique connue de l’homme du métier permettant d’obtenir l’extrait selon l’invention sous forme stérile, tant que le procédé mis en œuvre n’altère pas l’activité biologique de l’extrait.
Dans le cadre du filtrat bactérien, elle est par exemple réalisée par filtration sur un filtre, de préférence à l’aide de filtres ne laissant pas passer les organismes vivants, en particulier sur un filtre dont la taille des pores est de 0,2 pm, et plus particulièrement sur un filtre dont la taille des pores est de 0,22 pm. Ces filtres sont disponibles commercialement, par exemple les filtres radio-stérilisés Basix™ de Fisher Scientific en PES (polyéthersulfone), de diamètre de 25 mm (ref : 13-100-106, Fisher Scientific) adaptables à des seringues (ref : SLGP033RS chez Merck).
L’étape c) permet en particulier d’éliminer toute cellule d’Eggerthella vivante ou tout autre contaminant viable possible.
Le filtrat est récupéré à l’issu de l’étape c) dans des conditions permettant sa bonne conservation, en particulier sous atmosphère anaérobie à température ambiante ou à 4°C si les périodes de conservation s’étendentà plusieurs mois.
En particulier, dans le cadre de l’utilisation selon la présente invention, l’archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal est une archée Methanomethylophilus alvus, en particulier une archée Methanomethylophilus alvus Mx05 pure isolée, plus particulièrement la souche déposée selon le Traité de Budapest, le 18 septembre 2017, auprès du Leibniz-Institut (DSMZ, Braunschweig, Allemagne) sous le numéro DSM32684 (déposant : Université Clermont Auvergne, France).
Procédé d’isolement d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal
Tel que susmentionné, la présente invention concerne également un procédé d’isolement d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal comprenant :
a) l’inoculation d’un échantillon biologique susceptible de comprendre une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal, de préférence un échantillon de selles animales ou humaines, en conditions anaérobies sous une atmosphère gazeuse contenant du dihydrogène H2 dans des conditions mésothermiques dans un milieu de culture comprenant (i) un milieu de base comprenant du KH2PO4, du NaCI, du MgSO4.7H2O, du NH4CI, du CaCI2.2H2O, de l’acétate de sodium, de la CysteineHCI, de la résazurine, une solution d’oligoéléments de Widdel, une solution de sélénitetungstate, (ii) du Na2S à 2% et NaHCO3 à 10%, un mélange de vitamines (par exemple solution de vitamines de Balch), auquel est ajouté (iii) un ou plusieurs composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casaminoacides, de l’extrait de levure, et (iv) des composés méthylés tels que des méthylamines ou du méthanol;
b) le remplacement du milieu de culture de l’étape a) par un milieu de culture identique appauvri en composé apportant des acides aminés et dans lequel des vitamines sont ajoutées ;
c) la détection d’un enrichissement positif en une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal dans ledit échantillon inoculé, en particulier par microscopie, production de méthane et consommation d’H2, PCR, qPCR ou séquençage ; et
d) la réalisation de séries de dilutions liquides ou par la technique des roll tubes dudit enrichissement positif obtenu à l’étape c) en utilisant un milieu tel que défini à l’étape
a) ou b) auquel est ajouté un extrait stérile d’une culture bactérienne de bactérie du genre Eggerthella selon l’invention, jusqu’à l’obtention d’un clone d’archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal.
En particulier, le procédé selon l’invention comprend en outre une étape c’) entre l’étape c) et l’étape d) dans laquelle le milieu de culture comprenant l’échantillon biologique est filtré, de préférence sur un filtre dont la taille des pores est d’au moins 0,45 pm, avantageusement de 0,45 pm, le filtrat obtenu à l’issu de cette étape c’) étant par la suite utilisé lors de l’étape d) pour réaliser les séries de dilution.
L’étape de filtration, de préférence sur un filtre dont la taille des pores est d’au moins 0,45 pm, est optionnelle : elle permet d’augmenter la proportion de Methanomassiliicoccales du clade commensale par rapport aux autres microbes présents, car ce clade est composé de cellules de petite taille (de l’ordre de 0,5 pm +/- 0,2), passant en partie à travers le filtre, contrairement à de nombreuses cellules non désirées. Cette étape favorise/accélère l’enrichissement en Methanomassiliicoccales.
Par « inoculation », on entend le sens commun employé par l’homme du métier dans le domaine technique de l’invention, en particulier l’action d’ensemencement du milieu de culture par l’échantillon biologique, ici dans des conditions anaérobies.
Par « échantillon biologique », on entend un échantillon humain ou animal, en particulier des selles humaines ou animales.
Par « conditions anaérobies », on entend le sens connu par l’homme du métier dans le domaine technique selon l’invention, en particulier, des conditions dans lesquelles il n’y a pas d'oxygène sous forme de dioxygène.
Par « atmosphère gazeuse », on entend par exemple une atmosphère formée de dihydrogène (en particulier 2 bar).
Par « conditions mésothermiques », on entend une température comprise entre 20 et 40 °C, par exemple comprise entre 30 et 40 °C ou ©tre 35 et 40 °C. La température est donc par exemple de 21, 22, 25, 27, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39°C, en particulier de 37°C.
Le terme « milieu de base >> est un terme couramment utilisé par l’homme du métier dans le domaine technique de l’invention et désigne un milieu comportant des composés nécessaires à la culture de l’archée dans les conditions énoncées ci-dessus. Un tel milieu est par exemple décrit en détail dans le tableau 3 des exemples. Une solution d’oligoéléments de Widdel et une solution de sélénite-tungstate sont définis dans la section précédente relative à l’utilisation d’un milieu de culture et/ou d’isolement comprenant un filtrat bactérien d’une bactérie du genre Eggerthella,
Les composés entrant dans la composition du milieu de base sont des composés disponibles commercialement et bien connus de l’homme du métier.
Le milieu de base est par exemple préparé sous une atmosphère gazeuse N2/CO2 (80:20 % v/v).
Le milieu de culture de base peut se trouver à l'état liquide auquel cas il comporte de l'eau distillée ou dans un état lyophilisé apte à être régénéré totalement ou en partie par ajout d'eau distillée ou encore à l'état solide, notamment sous forme gélosée, plus particulièrement par ajout d'agar, plus particulièrement agar à 2% final.
Tel que susmentionné, l’échantillon biologique est inoculé dans un milieu de base auquel sont ajoutés des composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casamino acides, de l’extrait de levure et des composés méthylés.
Ainsi, selon un mode de réalisation du procédé d’isolement selon l’invention, l’échantillon biologique est inoculé dans un milieu de base auquel est ajouté du Biotrypcase, de la peptone, des casamino acides, de l’extrait de levure, et des composés méthylés.
Les composés méthylés sont par exemple du méthanol et/ou des méthylamines. Par « méthylamines >>, on entend par exemple, la mono-, di- et/ou tri-méthylamine.
Selon un mode de réalisation du procédé selon l’invention, 1 g/L d’extrait de levure et 10 à 80 mM de composés simples méthylés sont ajoutés au milieu de base.
Dans un mode de réalisation de l’étape a) du procédé d’isolement susmentionné, l’échantillon biologique comprend une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal.
Tel qu’indiqué dans l’étape b) du procédé d’isolement selon l’invention, le milieu de culture de l’étape a) est ensuite remplacé par un milieu de culture identique appauvri en composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casamino acides, en extrait de levure et dans lequel des vitamines sont ajoutées.
Par « appauvri », on entend que la concentration en composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone ou des casamino acides et de l’extrait de levure dans le milieu est plus basse que la concentration présente initialement dans l’étape a). Cette concentration peut même être nulle, c’est-à-dire que les composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casamino acides, et de l’extrait de levure peuvent ne pas être présents dans ce deuxième milieu.
Les vitamines pouvant être ajoutées sont des vitamines connues de l’homme du métier comme étant appropriées.
On peut citer par exemple une solution de vitamines de Balch (Balch et al, 1979).
Une telle solution peut être préparée comme indiqué ci-dessous avec la composition mentionnée dans le tableau 2 en mg par litre d’eau distillée :
Tableau 2
| Biotine | 2 |
| Acide Folique | 2 |
| Pyridoxine hydrochloride | 10 |
| Thiamine hydrochloride | 5 |
| Riboflavine | 5 |
| Acide nicotinique | 5 |
| Calcium panthoténate | 5 |
| Vitamine B12 | 0,1 |
| Acide p-aminobenzoïque | 5 |
| Acide lipoïque | 5 |
Le milieu de culture selon l’étape a) peut être remplacé au bout de 3 à 15 jours, par exemple 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15 jours ou le milieu de culture de l’étape
a) est remplacé par celui de l’étape b) selon les résultats de suivi d’un indicateur de croissance des Methanomassiliicoccales, par exemple dès que le relevé régulier de production de méthane de la souche indique l’apparition d’un plateau.
Comme indiqué dans le procédé d’isolement susmentionné, l’abondance de l’archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal est ensuite vérifiée par l’une des techniques mentionnées à l’étape c).
Ces techniques sont toutes des techniques bien connues de l’homme du métier pour détecter un enrichissement.
La microscopie permet de déterminer les formes des cellules, la mesure de méthane et d’H2 est par exemple effectuée par chromatographie en phase gazeuse, la qPCR permet la quantification des populations, et le séquençage la détermination des espèces dominantes de l’enrichissement. Ces techniques peuvent être utilisées individuellement ou ensemble. Le séquençage est en particulier le séquençage de marqueurs moléculaires généraux ou spécifiques (par exemple 16S et mcrA, gènes codant respectivement l’ARN 16S de la petite sous-unité ribosomique16S et la sous-unité alpha de la méthyl coenzyme M réductase, spécifique à la méthanogenèse), ou une approche métagénomique de séquençage sans a priori.
L’isolement en tant que tel est ensuite réalisé dans l’étape d) du procédé susmentionné.
Le milieu enrichi en archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal est dilué par dilutions liquides ou solides, c’est-à-dire en utilisant les techniques connues de l’homme du métier de dilution en milieu liquide, par exemple dans des tubes de Hungate contenant du milieu de culture ou de dilution en milieu solide (roll tube contenant également du milieu de culture). Les dilutions sont réalisées jusqu’à l’obtention d’un clone d’archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal.
« Clone » est utilisé au même titre que « souche », le procédé d’isolement selon l’invention ayant pour but d’isoler dans son étape finale une souche d’archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal pure.
Le milieu de culture utilisé dans l’étape d) est un milieu tel que défini à l’étape a) ou b) auquel est ajouté un extrait stérile d’une culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella tel que défini dans le cadre de la présente invention.
Le milieu de culture peut donc comprendre un milieu de base exempt de composés organiques complexes (composés apportant des acides aminés) mais comprenant des vitamines ou un milieu de base comprenant un ou plusieurs composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casamino acides, de l’extrait de levure par exemple à la concentration de 2 g/L, et des composés méthylés,
Dans le cas de dilutions solides, il est possible de repiquer les colonies obtenues en milieu liquide puis de les rediluer en milieu liquide, la dernière dilution liquide positive représentant la souche isolée.
En particulier, dans le procédé d’isolement selon l’invention, la détermination de l’obtention d’un clone d’archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal est réalisée par microscopie, production de méthane et consommation d’H2, qPCR ou séquençage. Le séquençage est en particulier le séquençage de marqueurs moléculaires généraux ou spécifiques (par exemple 16S et mcrA, gènes codant respectivement l’ARN 16S de la petite sous-unité ribosomique16S et la sous-unité alpha de la méthyl coenzyme M réductase, spécifique à la méthanogenèse), ou une approche métagénomique de séquençage sans a priori.
De plus, tel que susmentionné, dans un mode de réalisation du procédé selon l’invention, le procédé selon l’invention comprend en outre une étape c’) entre l’étape c) et l’étape d) dans laquelle le milieu de culture comprenant l’échantillon biologique est filtré. L’étape de filtration est réalisée par toute technique connue de l’homme du métier dans le domaine technique de l’invention.
En particulier, la filtration a lieu sur un filtre dont la taille des pores est d’au moins 0,45 pm, avantageusement de 0,45 pm. Ces filtres sont disponibles commercialement, par exemple auprès de Fisher Scientific, sous forme de filtres 0,45 pm Basix™ en PES (polyéthersulfone) stériles (référence 13-100-107).
Le filtrat obtenu à l’issu de cette étape c’) est par la suite utilisé lors de l’étape d) pour réaliser les séries de dilution.
En particulier, dans le cadre du procédé selon la présente invention, l’extrait stérile de culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella est un filtrat bactérien d’une bactérie du genre Eggerthella.
Plus particulièrement, ledit filtrat est préparé selon le procédé comprenant :
a) la culture d’une bactérie du genre Eggerthella dans un milieu tels que par exemple les milieux conventionnels ATCC 260 ou 1490 et DSMZ 78 ou 209, ledit milieu comprenant du Biotrypcase, de l’extrait de levure, de la peptone, des acides aminés, de l’extrait de viande, de l’hémine, et/ou de la vitamine K1 ou K3, et des sucres simples.
b) l’incubation du milieu de culture comprenant ladite bactérie à une température de 20 à 40°C, de préférence à 37°C, pendant au moiis 1 jour, de préférence pas plus de 15 jours ;
c) la filtration du milieu de culture comprenant ladite bactérie, de préférence à l’aide de filtres ne laissant pas passer les organismes vivants, en particulier sur un filtre dont la taille des pores est de 0,2 pm; et
d) la récupération du filtrat obtenu à l’issu de l’étape c).
Ce procédé est défini dans la section précédente relative à l’utilisation d’un milieu de culture et/ou d’isolement comprenant un extrait stérile de culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella,
En particulier, dans le cadre du procédé selon la présente invention, l’archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal est une archée Archaea Methanomethylophilus alvus, en particulier une Archaea Methanomethylophilus alvus Mx05 pure isolée, souche déposée selon le Traité de Budapest, le 18 septembre 2017, auprès du Leibniz-Institut (DSMZ, Braunschweig, Allemagne) sous le numéro DSM32684 (déposant : Université Clermont Auvergne, France).
Méthode de culture d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal
Tel que susmentionné, la présente invention concerne également une méthode de culture d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal, pure ou présente dans un consortium microbien, comprenant :
a) l’inoculation soit d’un échantillon biologique comprenant une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal, de préférence un échantillon de selles animales ou humaines, soit d’une archée pure de l’ordre des Methanomassiliicoccales, dans un milieu de culture comprenant un milieu de base comprenant du KH2PO4, du NaCI, du MgSO4.7H2O, du NH4CI, du CaCI2.2H2O, de l’acétate de sodium, de la CystéineHCI, de la résazurine, une solution d’oligoéléments de Widdel, une solution de sélénitetungstate, Na2S à 2% et/ou NaHCO3 à 10%, auquel est ajouté (ii) un ou plusieurs composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casamino-acides et de l’extrait de levure, (iii) des composés méthylés tels que des méthylamines ou du méthanol et (iv) un extrait stérile de culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella, selon l’invention,
b) le placement de l’inoculum obtenu à l’étape a) en conditions anaérobies sous une atmosphère gazeuse contenant du dihydrogène H2, et
c) une incubation dans des conditions mésothermiques, pour atteindre une phase de croissance exponentielle avec dégagement de méthane en au moins 2 jours, de préférence pas plus de 15 jours.
Les termes « inoculation », « échantillon biologique », « extrait stérile », « pure », « conditions anaérobies », « atmosphère gazeuse » et « conditions mésothermiques » ont les mêmes définitions que celles mentionnées dans les sections précédentes.
Par « consortium microbien », on entend un ensemble de microorganismes, formés de différentes espèces (/.e. ne se présentant pas en culture pure) et qui vivent en communauté.
L’incubation dure au moins 2 jours et de préférence pas plus de 15 jours. Elle est donc par exemple de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 jours.
L’incubation est réalisée par toute technique connue de l’homme du métier comme par exemple en tube de Hungate.
Tel que susmentionné, le milieu de base est composé de KH2PO4, de NaCI, de MgSO4.7H2O, de NH4CI, de CaCI2.2H2O, d’acétate de sodium, de Cystéine-HCI, de résazurine, d’une solution d’oligoéléments de Widdel, d’une solution de sélénite-tungstate, de Na2S à 2% et/ou NaHCO3 à 10%, auquel est ajouté (ii) un ou plusieurs composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casaminoacides, de l’extrait de levure, (iii) des composés méthylés tels que des méthylamines ou du méthanol et (iv) un extrait stérile d’une culture bactérienne de la bactérie du genre Eggerthella, selon l’invention.
En outre, le milieu peut comprendre du coenzyme M. Ce co-facteur est indispensable à la méthanogenèse. Dans le cas de l’archée Methanomethylophilus alvus Mx-05, le coenzyme M peut être omis.
En particulier, dans le cadre de la méthode selon la présente invention, l’extrait stérile d’une culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella est un filtrat bactérien d’une bactérie du genre Eggerthella.
Plus particulièrement, ledit filtrat est préparé selon le procédé comprenant :
a) la culture d’une bactérie du genre Eggerthella dans un milieu tels que par exemple les milieux conventionnels ATCC 260 ou 1490 et DSMZ 78 ou 209 , ledit milieu comprenant du Biotrypcase, de l’extrait de levure, de la peptone, des acides aminés, de l’extrait de viande, de l’hémine, et/ou de la vitamine K1 ou K3, et des sucres simples.;
b) l’incubation du milieu de culture comprenant ladite bactérie à une température de 20 à 40°C, de préférence à 37°C, pendant au moiis 1 jour, de préférence pas plus de 15 jours ;
c) la filtration du milieu de culture comprenant ladite bactérie, de préférence à l’aide de filtres ne laissant pas passer les organismes vivants, en particulier sur un filtre dont la taille des pores est de 0,2 pm; et
d) la récupération du filtrat obtenu à l’issu de l’étape c).
Ce procédé est défini dans la section précédente relative à l’utilisation d’un milieu de culture et/ou d’isolement comprenant un extrait stérile de culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella,
En particulier, dans le cadre de la méthode selon la présente invention, l’archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal est une archée Archaea Methanomethylophilus alvus, en particulier Methanomethylophilus alvus Mx-05 pure isolée, souche déposée selon le Traité de Budapest, le 18 septembre 2017, auprès du Leibniz-Institut (DSMZ, Braunschweig, Allemagne) sous le numéro DSM DSM32684 (déposant : Université Clermont Auvergne, France).
La présente concerne également un kit de détection d'une archée Archaea selon l'invention pour la mise en œuvre d'un procédé d’isolement selon l'invention ou d’une méthode de culture selon l’invention caractérisé en ce qu'il comprend :
- un ou plusieurs milieux de culture tels que ceux susmentionnés dans le cadre de 5 l’invention, de préférence lyophilisé ou sous forme solide, et/ou
-des réactifs de mise en œuvre d'une amplification enzymatique d'ADN de type PCR, et/ou
- un extrait stérile d’une culture bactérienne tel que susmentionné dans le cadre de l’invention.
La présente invention sera illustrée plus en détails par les exemples suivants.
Exemples
Composition d’un milieu de base (MB) pour 1 Litre :
Tableau 3
| Nom | Quantité |
| KH2PO4 | 0,5 g |
| MgSO4.7H2O | 0,4 g |
| NaCI | 5g |
| NH4CI | 1 g |
| CaCI2.2H2O | 0,05 g |
| Na-acetate | 1,6g |
| Cysteine-HCI | 0,5 g |
| Résazurine | 1mL à partir d’une solution stock (1 g/L) |
| Solution d’oligoéléments de Widdel | 1mL à partir d’une solution stock (1 g/L) |
| Solution de Selenite-tungstate | 1mL |
Après autoclavage, ajouter :
| Na2S à 2% (p/v) | 0,1 mL pour 5mL de milieu de culture |
| NaHCO3 à 10% (p/v) | 0,1 mL pour 5mL de milieu de culture |
| Solution de vitamins de Balch | 0,1 mL pour 5mL de milieu de culture |
Composition de la solution de vitamines de Balch (Balch et al, 1979)
Tableau 4 (en mg par litre d’eau distillée)
| Biotine | 2 |
| Acide Folique | 2 |
| Pyridoxine hydrochloride | 10 |
| Thiamine hydrochloride | 5 |
| Riboflavine | 5 |
| Acide nicotinique | 5 |
| Calcium panthoténate | 5 |
| Vitamine B12 | 0,1 |
| Acide p-aminobenzoïque | 5 |
| Acide lipoïque | 5 |
Composition et préparation d’une solution d’oligoéléments de Widdel
Du chlorure ferreux a été dissous dans de l'acide chlorhydrique. De l'eau bidistillée a été ajoutée puis les sels des différents oligo-éléments. Le pH a été ajusté entre 7,1 et 5 7,3 avec HCl ou Na2CO3.
Cette solution d'oligo-éléments a été utilisée à raison de 1 mL par litre de milieu de culture.
Tableau 5
| Acide nitrilotriacétique | 1,50 | g |
| MgCI2, 6H2O | 2,50 | g |
| NaCI | 1,00 | g |
| MnCI2, 4H2O | 0,60 | g |
| FeCI2, 4H2O | 100,00 | mg |
| CoCI2, 6H2O | 100,00 | mg |
| CaCI2, 2H2O | 100,00 | mg |
| ZnCI2 | 100,00 | mg |
| CuCI2, 2H2O | 10,00 | mg |
| AICI3 | 10,00 | mg |
| h3bo3 | 10,00 | mg |
| Na2Mo04, 2H2O | 10,00 | mg |
| pH (ajusté avec solution KOH 10M) | 6,50 | |
| H2O bidistillée q.s.p. | 1000 | mL |
Enrichissement en archée Methanomethylophilus alvus Mx-05
Le milieu de base a été préparé en condition anaérobie sous une atmosphère gazeuse N2/CO2 (80 :20 % v/v). Les enrichissements ont été réalisés dans ce milieu de base MB dans lequel a été ajouté 1g/L d’extrait de levure et 10 à 80 mM de composés méthylés (méthanol, méthylamines) comme accepteurs finaux d’électrons. Ils ont été menés en présence d’une atmosphère gazeuse anaérobie, formée de dihydrogène H2 comme donneur d’électrons (2 bar), dans des conditions mésothermiques (incubation de 20 à 40 °C).
Le milieu de culture utilisé ensuite (contenant de la solution de vitamines de Balch) a été identique à l’exception qu’il a été appauvri en extrait de levure (jusqu’à son absence totale (0 g/L d’extrait de levure) selon les cas) de manière à obtenir une population dominante de l’archée Methanomethylophilus alvus Mx-05.
La vérification de l’abondance de l’archée Methanomethylophilus alvus Mx-05 a été réalisée par :
- Microscopie pour déterminer les formes des cellules et le degré de pureté de notre enrichissement ;
- Mesure de production de méthane et de consommation d’H2 par chromatographie phase gazeuse ;
- qPCR pour quantifier les populations de bactéries et d’archées, à l’aide d’amorces et de protocoles décrits et connus de l’homme du métier (Borrel et al, 2017) ;
- Séquençage pour déterminer les espèces dominantes de l’enrichissement.
Les expériences de dilution en milieu liquide (tubes de Hungate contenant 5 mL de milieu de culture) ou en milieu solide (roll tubes contenant également 5 mL de milieu de culture) en présence d’H2 et de composés méthylés ont alors été entreprises. Elles ont été réalisées par une filtration préalable (filtre de 0,45pm) pour éliminer une majorité de bacilles, l’archée Methanomethylophilus alvus Mx-05 pure isolée se présentant sous forme de coques de petites tailles, dont des cellules de taille inférieures à 500pm de diamètre. La croissance de l’archée Methanomethylophilus alvus Mx-05 n’a été obtenue qu’en présence d’un extrait stérile d’une culture d’Eggerthella sp. préparé par filtration (filtre de 0,22 pm) (voir préparation du filtrat ci-dessous).
Préparation du filtrat dEooerthella sp.
Eggerthella sp. souche Eg01-Mx-05 (souche déposée selon le Traité de Budapest, le 13 juillet 2017, auprès du Leibniz-Institut (DSMZ, Braunschweig, Allemagne) sous le numéro DSM 32565 a été cultivée dans le milieu de base contenant 10g/L de Biotrypcase, 10g/L d’extrait de levure, 10g/L de peptone, 10g/L de casamino acides et 20mM de glucose. L’incubation a été réalisée à 37°C pendant une semàne. Après filtration du milieu de culture (filtre de 0,22 pm) d'Eggerthella, 0,5 mL de filtrat a été ajouté pour 5 mL de milieu de culture contenus dans les tubes servant à la dilution de l’enrichissement en archée
Methanomethylophilus alvus Mx-05.
Isolement de l’archée Methanomethyloohilus alvus Mx-05 sous forme pure
Afin d’obtenir l’archée Methanomethylophilus alvus Mx-05 pure isolée en culture axénique, les séries de dilution en milieux liquide ou solide ont été réalisées en utilisant un milieu de base MB exempt de composés organiques complexes (e.g. extrait de levure, biotrypcase, etc.) mais en présence de la solution de vitamines de Balch et de la solution d’oligoéléments de Widdel ou au contraire en ajoutant ces composés (extrait de levure, biotrypcase, peptone, casaminoacids à raison de 2 g/L). Cette dernière opération a permis de repérer plus facilement la présence éventuelle de contaminants hétérotrophes dans les dernières dilutions positives. Après obtention de colonies en milieu solide, cellesci ont été repiquées en milieu liquide puis rediluées en milieu liquide, la dernière dilution liquide positive représentant la souche de collection à étudier.
La souche d’archée Methanomethylophilus alvus Mx-05 pure isolée a été déposée auprès du Leibniz-Institut (DSMZ, Braunschweig, Allemagne) sous le numéro DSM32684 (déposant : Université Clermont Auvergne, France) le 18 septembre 2017.
Claims (13)
1Utilisation d’un milieu de culture et/ou d’isolement comprenant un extrait stérile d’une culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella, pour l’isolement et/ou la culture pure d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal.
2. - Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle le milieu comprend en outre un ou plusieurs composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casamino acides, et de l’extrait de levure.
3. - Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1ou 2, dans laquelle le milieu comprend en outre du coenzyme M.
4. - Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le milieu comprend en outre du KH2PO4, du NaCI, du MgSO4.7H2O, du NH4CI, du CaCI2.2H2O, de l’acétate de sodium, de la Cysteine-HCI, de la résazurine, une solution d’oligoéléments de Widdel, une solution de sélénite-tungstate, du Na2S à 2% et/ou du NaHCO3à10%.
5. - Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la bactérie du genre Eggerthella est choisie parmi Eggerthella tenta ou la souche Eggerthella sp. Eg01-Mx05 déposée selon le Traité de Budapest, le 13 juillet 2017, auprès du Leibniz-Institut (DSMZ, Braunschweig, Allemagne) sous le numéro DSM 32565.
6. - Procédé d’isolement d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal comprenant :
a) l’inoculation d’un échantillon biologique susceptible de comprendre une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal, de préférence un échantillon de selles animales ou humaines, en conditions anaérobies sous une atmosphère gazeuse contenant du dihydrogène H2 dans des conditions mésothermiques dans un milieu de culture comprenant (i) un milieu de base comprenant du KH2PO4, du NaCI, du MgSO4.7H2O, du NH4CI, du CaCI2.2H2O, de l’acétate de sodium, de la CysteineHCI, de la résazurine, une solution d’oligoéléments de Widdel, une solution de sélénitetungstate, (ii) du Na2S à 2% et NaHCO3 à 10%, un mélange de vitamines, auquel est ajouté (iii) un ou plusieurs composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casamino acides, et de l’extrait de levure, et (iv) des composés méthylés tels que des méthylamines ou du méthanol ;
b) le remplacement du milieu de culture de l’étape a) par un milieu de culture identique appauvri en composés apportant des acides aminés et dans lequel des vitamines sont ajoutées ;
c) la détection d’un enrichissement positif en une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccalesdu clade commensal dans ledit échantillon inoculé, en particulier par microscopie, production de méthane et consommation d’H2, PCR, qPCR ou séquençage ; et
d) la réalisation de séries de dilutions liquides ou par la technique des roll tubes dudit enrichissement positif obtenu à l’étape c) en utilisant un milieu tel que défini à l’étape
a) ou b) auquel est ajouté un extrait stérile d’une culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 5, jusqu’à l’obtention d’un clone d’archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal.
7. - Procédé d’isolement selon la revendication 6, comprenant en outre une étape c’) entre l’étape c) et l’étape d) dans laquelle le milieu de culture comprenant l’échantillon biologique est filtré, de préférence sur un filtre dont la taille des pores est d’au moins 0,45 pm, le filtrat obtenu à l’issu de cette étape c’) étant par la suite utilisé lors de l’étape d) pour réaliser les séries de dilution.
8. - Procédé d’isolement selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7 dans lequel la détermination de Tobtention d’un clone d’archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal est réalisée par microscopie, production de méthane et consommation d’H2, PCR, qPCR ou séquençage.
9. - Méthode de culture d’une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal, pure ou présente dans un consortium microbien, comprenant :
a) l’inoculation soit d’un échantillon biologique comprenant une archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal, de préférence un échantillon de selles animales ou humaines dans un milieu de culture, soit d’une archée pure de l’ordre des Methanomassiliicoccales comprenant (i) un milieu de base comprenant du KH2PO4, du NaCI, du MgSO4.7H2O, du NH4CI, du CaCI2.2H2O, de l’acétate de sodium, de la CystéineHCI, de la résazurine, une solution d’oligoéléments de Widdel, une solution de sélénite- tungstate, Na2S à 2% et/ou NaHCO3 à 10%, auquel est ajouté (ii) un ou plusieurs composés apportant des acides aminés tel que du Biotrypcase, de la peptone et/ou des casamino acides, et de l’extrait de levure, (iii) des composés méthylés tels que des méthylamines ou du méthanol et (iv) un extrait stérile d’une culture bactérienne de la bactérie du genre Eggerthella, tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 5,
b) le placement de l’inoculum obtenu à l’étape a) en conditions anaérobies sous une atmosphère gazeuse comprenant du dihydrogène H2, et
c) une incubation dans des conditions mésothermiques, pour atteindre une phase de croissance exponentielle avec dégagement de méthane en au moins 2 jours, de préférence pas plus de 15 jours.
10. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle le milieu comprend en outre du coenzyme M.
11. - Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, ou méthode selon la revendication 9 ou 10, dans laquelle ou dans lequel l’extrait stérile d’une culture bactérienne d’une bactérie du genre Eggerthella est un filtrat bactérien d’une bactérie du genre Eggerthella.
12. - Utilisation selon la revendication 11, procédé selon la revendication 11, ou méthode selon la revendication 11, dans laquelle ou dans lequel le filtrat bactérien d’une bactérie du genre Eggerthella est préparé selon le procédé comprenant :
a) la culture d’une bactérie du genre Eggerthella dans un milieu tels que par exemple les milieux conventionnels ATCC 260 ou 1490 et DSMZ 78 ou 209, ledit milieu comprenant du Biotrypcase, de l’extrait de levure, de la peptone, des acides aminés, de l’extrait de viande, de l’hémine, et/ou de la vitamine K1 ou K3, et des sucres simples ;
b) l’incubation du milieu de culture comprenant ladite bactérie à une température de 20 à 40°C, de préférence à Ί37°Ο, pendant au moins 1 jour, de préférence pas plus de 15 jours ;
c) la filtration du milieu de culture comprenant ladite bactérie, de préférence à l’aide de filtres ne laissant pas passer les organismes vivants, en particulier sur un filtre dont la taille des pores est de 0,2 pm; et
d) la récupération du filtrat obtenu à l’issu de l’étape c).
13. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 et 11 à 12, procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 8 et 11 à 12, ou méthode selon l’une quelconque des revendications 9 à 12, dans lequel ou dans laquelle l’archée de l’ordre des Methanomassiliicoccales du clade commensal est une archée Methanomethylophilus 5 alvus, en particulier une archée Methanomethylophilus alvus Mx-05, souche déposée selon le Traité de Budapest, le 18 septembre 2017, auprès du Leibniz-Institut (DSMZ, Braunschweig, Allemagne) sous le numéro DSM32684.
RÉPUBLIQUE FRANÇAISE irpi — I INSTITUT NATIONAL
DE LA PROPRIÉTÉ
INDUSTRIELLE
RAPPORT DE RECHERCHE PRÉLIMINAIRE établi sur la base des dernières revendications déposées avant le commencement de la recherche
N° d'enregistrement national
FA 849022
FR 1761536
Date d'achèvement de la recherche
Examinateur
31 mai 2018
Lejeune, Robert
CATÉGORIE DES DOCUMENTS CITÉS
EPO FORM 1503 12.99 (P04C14)
X : particulièrement pertinent à lui seul
Y : particulièrement pertinent en combinaison avec un autre document de la même catégorie
A : arrière-plan technologique
O : divulgation non-écrite
P : document intercalaire
T : théorie ou principe à la base de l'invention
E : document de brevet bénéficiant d'une date antérieure à la date de dépôt et qui n'a été publié qu'à cette date de dépôt ou qu'à une date postérieure.
D : cité dans la demande
L : cité pour d'autres raisons & : membre de la même famille, document correspondant page 1 de 2
RÉPUBLIQUE FRANÇAISE irai — I INSTITUT NATIONAL
DE LA PROPRIÉTÉ
INDUSTRIELLE
RAPPORT DE RECHERCHE PRÉLIMINAIRE établi sur la base des dernières revendications déposées avant le commencement de la recherche
N° d'enregistrement national
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