FR3066118A1 - Extrait de sechium edule pour lutter contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets - Google Patents

Abstract

Extrait de Sechium edule et son utilisation dans une méthode de traitement pour lutter contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau.

Description

EXTRAIT DE Sechium edule POUR LUTTER CONTRE LES EFFETS NOCIFS DES RAYONNEMENTS ULTRAVIOLETS L’invention concerne un extrait de Chayotte ou Sechium edule et son utilisation pour le traitement de la peau pour lutter contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets. Elle vise également une composition cosmétique comprenant ledit extrait.

Les rayonnements ultraviolets (UV) sont des rayonnements électromagnétiques dont la longueur d’onde est comprise entre 100 et 400 nm. Le spectre UV est sous-divisé en 3 catégories : les UVA (320-400 nm), les UVB (280-320 nm) et les UVC (100-280 nm). Les rayonnements ultraviolets représentent 5% du rayonnement solaire et constituent, d’un point de vue énergétique, la partie la plus active du rayonnement solaire auquel sont soumis les organismes vivants. La peau est exposée quotidiennement aux rayonnements du soleil et est bien entendu la première cible de ces rayonnements UV.

Alors que les UVC sont stoppés par la couche d'ozone, les UVB et les UVA pénètrent dans les couches profondes de l'épiderme pour atteindre les cellules responsables du renouvellement cellulaire et de la réparation tissulaire. Ils sont donc responsables de la grande majorité des effets délétères liés à l’exposition solaire. Même si les UV ont des effets bénéfiques dans la peau (synthèse de mélanine, synthèse de vitamine D3, production d'endorphines), ils sont responsables d'effets nocifs à court-terme, tel que l'érythème actinique (coup de soleil) et d'effet nocifs à long terme, tels que le photovieillissement et la photo-carcinogenèse. Dans ce contexte, les UVB sont déclarés cancérogènes de classe I dès 1992 alors que les UVA ont rejoint cette classification, plus récemment, en 2009. A court terme, les UV sont responsables de dommages cellulaires structuraux comme l'oxydation des lipides des membranes plasmiques, de dégâts fonctionnels comme l'altération des protéines et de dommages génomiques tels que des modifications chimiques et des lésions de l'acide désoxyribonucléique (ADN). Les UVB sont directement absorbés par l'ADN et occasionnent des lésions volumineuses appelées « photo-produits » comme des CPDs (dimère cyclobutane de pyrimidines) et des 6-4PP (photoproduit pyrimidine(6-4)pyrimidone).

Quant aux UVA qui sont faiblement absorbés par l'ADN, ils génèrent des espèces chimiques toxiques appelés ROS (espèces réactives oxygénées) qui oxydent les lipides, les protéines et l'ADN.

En particulier, dans l'ADN, les UVA sont associés à des dommages oxydatifs, tels que la 8-oxoG (8-oxo-7,8-dihydroguanine), des pyrimidines glycols, des S SB (cassures simple brin ou « single strand break ») et à la formation de CPD. L'inhibition de la réparation des CPD après un stress génotoxique UVA rend finalement les UVA plus mutagènes que les UVB.

Pour se protéger du stress génotoxique UV-induit, l'organisme possède différents systèmes de protection naturelle : 1/ la pigmentation de l'épiderme pour former un écran absorbant les UV et protéger les noyaux des cellules ; 2/ les défenses anti-oxydantes pour neutraliser les radicaux libres ; 3/ les systèmes de réparation de l'ADN pour réparer l'ADN endommagé, tels que le BER (réparation par excision de base ou « bases excision repair »), le NER (réparation par excision de nucléotides, ou « nucléotides excision repair ») et le MMR (réparation de mésappariements ou « mismatch repair »).

Au cours des dernières années, les habitudes d'exposition au soleil ont fortement évolué avec la définition de la beauté (la mode du teint halé), en augmentant parallèlement le risque de cancers cutanés. Face à des durées d'exposition particulièrement longues, les systèmes naturels de protection ne sont plus suffisamment efficaces pour lutter contre les effets nocifs des UV. C'est pourquoi des protections externes ont été développées telles que des crèmes solaires à effet de filtre ou des compléments alimentaires antioxydants.

Le développement de produits dermo-cosmétiques (crème, spray, huile...) utilisent un ou plusieurs filtres UV dont le rôle est de réduire l'intensité et l'énergie des rayonnements UV. Les filtres organiques (ou chimiques) sont composés de molécules aromatiques qui absorbent les photons à des longueurs d’ondes définies ; par conséquent, il est souvent nécessaire d'associer plusieurs filtres pour couvrir le spectre UVA et UVB. Les filtres organiques sont souvent instables avec la génération de ROS et peuvent déclencher des réactions allergiques cutanées. Quant aux filtres inorganiques qui sont principalement des pigments (particules d'oxyde métalliques, oxyde de zinc, dioxyde de titane), ils diffusent la lumière. De nos jours, la taille des particules est de l'ordre du nanomètre pour des questions esthétiques (pas de coloration blanche des crèmes solaires) et d'efficacité ; ces filtres restent photo-réactifs.

Aujourd'hui, la photo-protection consiste à utiliser des filtres solaires pour absorber et/ou diffuser les UV avant qu'ils n'atteignent les cellules de la peau. Des molécules naturelles ont très largement gagné du terrain dans le domaine de la photo-protection grâce à leurs propriétés absorbantes (effet « filtre »), comme les acides phénoliques, les flavonoïdes ou encore certains polyphénols.

En complément d'une protection exogène, la photo-protection peut également être d'ordre biologique avec l'utilisation de molécules présentant des effets anti-inflammatoires ou antioxydants. Par exemple, en neutralisant au préalable les ROS induits par les UV, des molécules anti-oxydantes peuvent diminuer les dommages oxydatifs à l'ADN induits par les UV. Egalement, des molécules peuvent stimuler des mécanismes antioxydants endogènes pour diminuer les dommages oxydatifs à l'ADN induits par les UV. De telles molécules peuvent être intégrées dans des formulations cosmétiques et des crèmes solaires pour compléter la photo-protection apportée par les filtres solaires. Parallèlement, une supplémentation alimentaire en antioxydants, tels que des caroténoïdes, peut encore apporter un niveau supplémentaire de photo-protection.

La Chayotte ou Chouchou (Sechium edule (Jacq.) Sw.) est une liane vivace de la famille des Cucurbitaceae. Originaire d'Amérique du Sud, la plante s'est acclimatée dans la plupart des régions tropicales et subtropicales où elle est consommée à la fois pour ses fruits, ses jeunes pousses et ses tubercules. De 5-6 m de longueur, la plante émet de longues tiges grimpantes qui s'adaptent et s'accrochent sur un support grâce à des vrilles trifides. Le fruit à maturité, la tige et le tubercule, riche en amidon, sont comestibles.

En médecine traditionnelle, on attribuait au fruit de la Chayotte des vertus médicinales pour favoriser la lactation et guérir la coqueluche. Des extraits de jus de fruit sont décrits pour présenter des efficacités thérapeutiques et préventives pour lutter contre le stress oxydatif (Tiwari et al., 2013) via des propriétés inhibitrices de péroxydation lipidique (Firdous et al., 2012). Les feuilles de Chayotte auraient la propriété de modifier le rythme cardiovasculaire aussi bien que d'abaisser la pression sanguine et de dissoudre les calculs rénaux. Les tubercules sont considérés comme un diurétique puissant et sont aussi utilisés contre les troubles pulmonaires et pour soulager l'inflammation intestinale.

Le Chouchou est peu connu en utilisation cosmétique. La pulpe crue du fruit, astringente, est utilisée en masque pour effacer les tâches sur le visage. Le document KR 984163B1 décrit une composition cosmétique hydratante contenant un extrait de fruit/feuille de Sechium edule. Des compositions cosmétiques contenant un extrait de Sechium edule seul et/ou en association avec d'autres ingrédients sont aussi décrites pour des propriétés antiâge, antiride, apaisante, anti-radicalaire et blanchissante, et pour inhiber la production d'endothéline-1, notamment dans le document JP 5124810B2. A la connaissance du Demandeur, aucune solution de photo-protection biologique, contre les effets nocifs des UV à court terme et à long terme n’a été décrite.

En résumé, la photo-protection, apportée aujourd'hui par les solutions de l'Homme de l'Art, cible uniquement les dommages des UV à court terme. La photo-protection de demain doit être capable de protéger la peau de tous les effets nocifs des UV notamment les effets génotoxiques, à court terme mais aussi à long terme. De plus, une photo-protection à long terme permet de garantir un niveau de sécurité additionnel pour lutter contre le photovieillissement et la photo-carcinogenèse. En complément d'une photo-protection classique, il est nécessaire de protéger l'ADN des cellules de l'épiderme (notamment les kératinocytes) pour maintenir leur intégrité et leur capacité à renouveler un épiderme sain.

Le problème que se propose de résoudre l’invention est celui de mettre au point une composition susceptible d’apporter une photo-protection d’ordre biologique pour lutter contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau à court terme et à long terme.

En d’autres termes, le problème que se propose de résoudre l’invention est celui de maintenir l'intégrité de l'ADN, afin de lutter contre les effets génotoxiques à court terme et à long terme induits par les rayonnements UV, notamment les UVA.

De manière inattendue, le Demandeur a constaté qu’un extrait de Sechium edule est particulièrement efficace pour lutter contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau, notamment des rayonnements ultraviolets A, à court terme et à long terme.

Dans la suite de la description et dans les revendications, par l’expression « à court terme », on désigne la période de temps de 24h qui suit l’irradiation UVA.

De même, par l’expression « à long terme », on désigne la période de temps de 14 jours qui suit l’irradiation UVA.

Dans la suite de la description et dans les revendications, par l’expression « protection à court terme », on entend la période de temps de 24h qui suit l’irradiation UVA à l’issue de laquelle aucun dommage n’est constaté. Ainsi, les dommages à court terme induits par les UVA apparaissent dans les 24 h qui suivent l’irradiation UVA.

Parallèlement, par l’expression « protection à long terme », on désigne la période de temps de 14 jours qui suit l’irradiation UVA à l’issue de laquelle aucun dommage n’est constaté. Ainsi, les dommages à long terme induits par les UVA apparaissent 14 jours après l’irradiation UVA.

Selon la première caractéristique de l’invention, le traitement pour lutter contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau consiste à lutter contre les effets génotoxiques des UV, notamment des UVA, à court terme et à long terme.

Selon l’invention, toute ou partie de la plante Sechium edule peut être utilisée comme extrait pour lutter contre le stress génotoxique UV-induit à court terme et à long terme. En pratique, la partie de la plante utilisée comme extrait est choisie dans le groupe comprenant le fruit, la fleur, la graine, la feuille, la tige, la jeune pousse.

De manière particulièrement préférée, la partie de la plante mise en œuvre est le fruit. Il peut s’agir d’un fruit frais, congelé, séché, entier, coupé et/ou broyé. Avantageusement, il s’agit d’un fruit séché.

De manière particulière, la lutte contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau à court terme et/ou à long terme consiste en une protection de l’acide désoxyribonucléique, une réparation de l’acide désoxyribonucléique, une accélération de la réparation de l’acide désoxyribonucléique ce qui conduit à un maintien de la prolifération des kératinocytes à long terme pendant 14 jours. L’invention concerne également un extrait de Sechium edule susceptible d’être obtenu par un procédé d’extraction comprenant une étape d’extraction solide/liquide d’au moins une partie de la plante, suivie d’une seconde étape de séparation solide /liquide et enfin d’une troisième étape de récupération de la phase liquide.

Les extraits de plantes étant souvent destinés à être formulés dans des compositions cosmétiques, il importe d’éviter les solvants d’extraction comprenant des sels ou des acides, dont on retrouvera nécessairement au moins des traces dans l’extrait. En effet, il est bien connu que la formulation, en gel ou en émulsion, d’ingrédients à base de sels au-delà d’une dose de 0,1% est particulièrement complexe. En outre, les acides, en abaissant le pH des extraits obtenus, ont pour effet de rendre la formulation en gel ou en émulsion difficile. En particulier, les produits cosmétiques destinés à l’application cutanée doivent avoir un pH adapté, de préférence proche de celui de la peau (environ pH 6,5), ou neutre. Dans ces conditions, l’utilisation de solvants contenant des acides requiert par conséquent l’ajout d’excipients, notamment des régulateurs de pH.

Selon l’invention, le solvant utilisé consiste en un mélange de fructose et de glycérine.

Le solvant peut contenir de l’eau, ou en être dépourvu. La présence d’eau dans le solvant a toutefois pour avantage de fluidifier le solvant, et ainsi de faciliter l’extraction. En d’autres termes et selon un premier mode de réalisation avantageux, le solvant consiste en un mélange de fructose, de glycérine et d’eau.

En outre, lorsque les composants de ce solvant sont présents dans certains rapports molaires, le solvant possède les propriétés d’un solvant NaDES, c’est-à-dire un solvant eutectique composé de molécules d’origine végétale, et liées entre elles par des interactions intermoléculaires, en particulier des liaisons hydrogènes. Le solvant est notamment liquide à température ambiante, ce qui facilite la mise en œuvre du procédé conduisant à l’extrait de l’invention.

Dans un mode de réalisation particulier, le solvant consiste en un mélange de fructose, de glycérine et d’eau dans des proportions molaires préférentiellement d’environ 1:1:5.

En pratique, le solvant utilisé peut être produit en mélangeant le fructose et la glycérine, ou le fructose, la glycérine et l’eau, dans un réacteur agité, jusqu'à l'obtention d'un mélange limpide incolore. Ce mélange peut être réalisé à une température comprise entre 2°C et 100°C et pendant 30 minutes à 6 heures, préférentiellement 40°C à 70°C pendant 1 heure à 2 heures. L’extrait selon l’invention est susceptible d’être obtenu par un procédé mettant en œuvre une étape d’extraction solide/liquide. L’extraction solide/liquide peut être effectuée par différentes techniques bien connues de l’homme du métier, telles que macération, remacération, digestion, macération dynamique, décoction, extraction en lit fluide, extraction assistée par micro-ondes, extraction assistée par ultra-sons, extraction à contre-courant, percolation, re-percolation, lixiviation, extraction sous pression réduite, diacolation.

En pratique le rapport massique plante/solvant appliqué pour l’étape d’extraction est compris entre 1/99 et 50/50. L’étape d’extraction est effectuée de préférence à une température comprise entre 2°C et 100°C, plus préférentiellement entre 20°C et 80°C. L’étape d’extraction peut être maintenue pendant quelques minutes à plusieurs jours.

De manière à optimiser l’extraction des composés actifs tout en protégeant ces composés de l’oxydation par l’oxygène de l’air, l’étape d’extraction solide/liquide est avantageusement réalisée sous agitation et/ou sous atmosphère d’azote.

Selon l’invention, l’étape d’extraction solide/liquide est suivie d’une étape de séparation solide/liquide, l’objectif étant de récupérer la phase liquide, aussi appelée filtrat de séparation solide/liquide, contenant la matière active. Cette séparation peut être effectuée par toute technique connue de l’homme du métier, en particulier l’égouttage, le pressage, l’essorage, la centrifugation ou la filtration.

De manière optionnelle l’étape de séparation solide/liquide peut aussi être suivie d’une étape de fractionnement de l’extrait brut, laquelle permet d’obtenir une fraction enrichie en une ou plusieurs familles de molécules extraites de la plante. En pratique, l’étape de fractionnement peut être effectuée par des techniques connues de l’Homme du métier, en particulier la chromatographie basse pression ou la filtration membranaire tangentielle.

De manière optionnelle, l’étape de séparation liquide/solide ou l’étape de fractionnement peut être suivie d’une étape de concentration de l’extrait brut ou de la fraction, laquelle permet d’obtenir un concentré, sous forme liquide ou semi-solide selon le facteur de concentration. En pratique, l’étape de concentration peut être effectuée par évaporation sous pression réduite ou osmose inverse.

De préférence, le filtrat de séparation solide/liquide ou le concentré subissent en outre une ou plusieurs étapes de clarification. Pour réaliser cette étape de clarification, l’Homme du métier pourra utiliser tout type de filtration connue dans le domaine considéré.

Enfin, en vue d’un conditionnement, le procédé permettant l’obtention de l’extrait selon l’invention peut comprendre une étape de stérilisation par filtration stérilisante ou pasteurisation par exemple. La filtration stérilisante est classiquement réalisée en filtrant le produit à travers un filtre comprenant des pores d’un diamètre d’environ 0,22 pm. De préférence, l’étape de filtration stérilisante est l’étape finale du procédé. En outre un conservateur microbiologique peut-être ajouté à l’extrait préalablement à l’étape de stérilisation, préférentiellement un mélange d’acide citrique et de sorbate de potassium. L’invention vise aussi des compositions comprenant l’extrait de l’invention, de préférence des compositions cosmétiques, c’est-à-dire adaptées à l’application topique sur la peau et/ou les muqueuses, et/ou les phanères.

La composition selon l’invention peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées pour une application topique sur la peau et/ou les muqueuses, et/ou les phanères, par exemple sous forme anhydre, sous forme d’une émulsion huile-dans-eau, d’une émulsion eau-dans-huile, d’une émulsion multiple, d’une émulsion siliconée, d’une microémulsion, d’une nanoémulsion, d’un gel, d’une solution aqueuse ou d’une solution hydro-alcoolique.

Cette composition peut être plus ou moins fluide et se présenter sous forme d’une crème blanche ou colorée, d’une pommade, d’un lait, d’une lotion, d’un sérum, ou d’un gel.

La composition cosmétique et/ou dermatologique peut contenir les excipients habituellement utilisés dans les domaines cosmétique et dermatologique, tels que les matières grasses, les tensioactifs détergents et/ou conditionnants, les émulsionnants et coémulsionnants, les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les agents exfoliants, les parfums, les charges, les filtres hydrophiles et lipophiles, les matières colorantes, les neutralisants, les agents pro-pénétrants, et les polymères. Ces types d’excipients sont tous bien connus de l’Homme du métier.

En pratique, les quantités de ces différents excipients sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés, et la somme des excipients représente de préférence 0,01% à 30% du poids total de la composition.

Comme matières grasses appropriées, on peut citer les huiles minérales, les huiles d’origine animale (telle la lanoline), les huiles végétales, les huiles de synthèse (comme par exemple l’isopropyl le myristate, l’octyldodecyl, l’isostearyl isostearate, le decyl oleate, l’isopropyl le palmitate), les huiles siliconées (la cyclomethicone, la diméthicone) et les huiles fluorées. On peut utiliser comme matières grasses des alcools gras, des acides gras, des cires et des gommes, et en particulier des élastomères de silicone.

Comme tensioactifs détergents et/ou conditionnants appropriés, on peut citer les tensioactifs non ioniques, anioniques, cationiques ou amphotères, et leurs mélanges, tels que par exemple les alkyl sulfates, les alkyléthersulfates tels que le lauryl éther sulfate de sodium, les alkyl bétaïnes telles que la cocamidopropylbetaïne, ou les sels d’ammonium quaternaires.

Comme émulsionnants et co-émulsionnants appropriés, on peut citer par exemple les esters de polyglycérols et d’acide gras, les esters de sucrose et d’acide gras, les esters de sorbitane et d’acide gras, les esters d’acide gras et de sorbitane oxyéthylénés, les ethers d’alcool gras et de PEG, les esters de glycérol et d’acide gras, les alkyl sulfates, les alkyl ether sulfates, les alkyl phosphates, les alkyl polyglucosides, les diméthicone copolyols.

Comme gélifiants hydrophiles appropriés, on peut citer par exemple les polymères carboxyvinyliques (carbomers), les copolymères acryliques tels que les copolymères d’acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides tels que la gomme xanthane, la gomme guar, les gommes naturelles telles que la gomme de cellulose et dérivés, les amidons et leurs dérivés, les argiles et les copolymères d’acide 2-acrylamido-2-méthylpropane.

Comme gélifiants lipophiles appropriés, on peut citer par exemple les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d’acides gras, la silice hydrophobe et l’éthylcellulose.

Comme conservateurs appropriés, on peut citer par exemple les acides benzoïque, sorbique, propionique, salicylique, dehydroacétique et leurs sels, l’alcool benzylique, l’éthylhexylglycérine, les parabens, leurs sels et esters, le triclosan, l’imidazolidinyl urée, le 5 phénoxyéthanol, la DMDM hydantoïne, le diazolidinyl urée, la chlorphenesine.

Comme antioxydants appropriés, on peut citer par exemple les agents chelatants tels que l’EDTA et ses sels, le metabisulfite de sodium, les acides salicylique, ascorbique et citrique et leurs sels, le tartrate de sodium, le gluconate de sodium, les caroténoïdes et les tocophérols.

Comme solvants utilisables dans la composition cosmétique (distinct du solvant d’extraction), on peut citer l’eau, l’éthanol, la glycérine, le propylène glycol, le propanediol, le butylène glycol, le sorbitol.

Comme agents exfoliants appropriés, on peut citer par exemple les exfoliants chimiques tels que les AHA, et les exfoliants physiques tels que les poudres naturelles ou synthétiques.

Comme charges appropriées, on peut citer par exemple le talc, le kaolin, le mica, la serecite, le magnésium carbonate, l’aluminium silicate, le magnésium silicate, les poudres organiques telles que le nylon.

Comme colorants appropriés, on peut citer par exemple les colorants lipophiles, les colorants hydrophiles, les pigments et les nacres habituellement utilisés dans les compositions cosmétiques ou dermatologiques, et leurs mélanges.

Comme neutralisants appropriés, on peut citer par exemple la soude, la triethanolamine, l’aminomethyl propanol, l’hydroxyde de potassium.

Comme agents pro-pénétrants appropriés, on peut citer par exemple les alcools et glycols (éthanol, propylène glycol), l’éthoxydiglycol, les alcools et acides gras (acide oléique), les esters d’acides gras, le diméthyl isosorbide.

La composition de l’invention peut également contenir en outre d’autres actifs que l’extrait selon l’invention. Comme actifs appropriés, on peut citer par exemple les anti-radicalaires ou plus généralement les antioxydants, les blanchissants, les pigmentants, les émollients, les hydratants, les anti-séborrhéiques, les anti-inflammatoires, les anti-acnéiques, les agents kératolytiques et/ou desquamants, les agents anti-rides et tenseurs, les agents drainants, les agents anti-irritants, les agents apaisants, les vitamines et leurs mélanges, les agents matifiants, les actifs anti-âge tel que le rétinol, les cicatrisants, les antiseptiques et les huiles essentielles. L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront bien des exemples de réalisation suivants.

FIGURES

Figure 1 : Visualisation des noyaux des kératinocytes humains normaux traités (ou non) par un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à 0,5% puis irradiés par une dose de 50 J/cm2 d'UVA.

Figure 2 : Test de clonogénicité de kératinocytes humains normaux traités (ou non) par un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à 0,5% puis irradiés par une dose de 50 J/crn2 d'UVA.

Figure 3 : Quantification des holoclones/méroclones (test de clonogénicité) dans une culture clonale de kératinocytes humains normaux traités (ou non) par un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à 0,5% puis irradiés par une dose de 50 J/cm2 d'UVA.

EXEMPLES

Exemple n°l : Fabrication de l'extrait NaDES fruit de Sechium edule

On mélange 1 partie de fruits séchés et broyés de Sechium edule et 19 parties d'un mélange fructose/glycérine/eau en ratio molaire 1:1:5 (solvant NaDES). Le mélange est extrait à 70°C pendant 3h dans un réacteur agité. La séparation solide/liquide est réalisée par centrifugation (centrifugeuse à godets 4600 rpm - 20min). Le jus brut est ensuite filtré dans un filtre frontal sous pression (2 bars) sur membrane en acétate de cellulose jusqu’au seuil final de 0,22 pm.

On obtient ainsi un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) qui est limpide et de couleur jaune orangé.

Exemple n°2 : Effet d'un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) selon l'invention sur les activités enzymatiques de réparation à court terme de l'ADN dans des kératinocytes humains normaux

Les activités enzymatiques de réparation de l'ADN ont été mesurées à l’aide de la biopuce plasmide LX-Repair. L'activité de réparation (ou excision resynthèse) se traduit par l'incorporation de nucléotides fluorescents (dCTP-Cya3) au niveau du site où se situe la lésion.

La quantification de la réparation de l’ADN est mesurée pour 3 plasmides (CPD-64 plasmid, AbaS plasmid, glycol plasmid) déposés sur la biopuce et portant chacun une classe spécifique de dommages. Parmi les dommages, on retrouve des lésions CPD, des sites abasiques et des thymines glycols.

Protocole :

Des kératinocytes humains normaux sont traités pendant 24h avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit), obtenu à l'exemple 1, à la concentration finale de 0,5%. Les kératinocytes non traités sont utilisés comme contrôle. Les kératinocytes sont ensuite lavés avec un tampon phosphate salin et les lysats nucléaires sont préparés selon la méthode décrites par Millau et al. 2008.

Les lysats nucléaires (0,15 mg/ml) sont déposés en présence de nucléotides fluorescents sur la biopuce contenant les 3 plasmides. Le système est incubé pendant lh à 60°C.

La biopuce est scannée à 532 nm avec le scanner InnoScan710AL (Innopsy) et l'intensité de fluorescence est quantifiée avec le logiciel Mapix (Innopsys). Les données sont normalisées en utilisant le logiciel Normatizelt. L'expérience est réalisée 3 fois (n=3).

Les résultats sont exprimés en activité de réparation (tableau 1). Les valeurs représentent les rapports de fluorescence entre les kératinocytes traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) et les kératinocytes non traités (contrôle). Le contrôle est rapporté à 1. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± EC (écart type) de 3 expériences.

Tableau 1 : Activités enzymatiques de réparation des lésions ADN dans des kératinocytes humains normaux traités (ou non) par un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à 0,5%.

Conclusion : L'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) obtenu selon l'invention augmente significativement les activités enzymatiques de réparation des lésions à L'ADN à court terme. Les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) présentent donc un phénotype de réparation augmenté pour les dommages CPD (+ 93%), sites abasiques (+31%) et thymines glycols (+66%). Par conséquent, les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) puis irradiés aux UVA sont protégés à court terme des effets génotoxiques des UVA.

Exemple n°3 : Effet d'un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) selon l'invention sur la protection à court terme de l'ADN contre les CPP induits par les UVA dans des kératinocytes humains normaux

La quantification du taux de lésions CPD dans un extrait d’ADN est obtenue par la technique de chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée à la spectrométrie de masse en tandem (MS-MS).

Protocole :

Des kératinocytes humains normaux sont traités pendant 24h avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit), obtenu à l'exemple 1, à la concentration finale de 0,5%. Les kératinocytes non traités sont utilisés comme contrôle. Les kératinocytes sont ensuite irradiés (ou non) à la dose de 50 J/cm2 d'UVA avec le système UVA 700L (Waldmann). Les kératinocytes sont ensuite lavés avec un tampon phosphate salin. Des lysats d'ADN hydrolysé sont préparés selon la méthode décrite par Genies et al., 2013, puis injectés dans le système HPLC-MS/MS (Agitent sériés 1100). L'expérience est réalisée 3 fois (n=3).

Les résultats sont exprimés en nombre de CPD/106 bases (tableau 2). L'induction de CPD est exprimée en pourcentage (%) d'augmentation du nombre de lésions avant et après irradiation UVA. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± EC (écart type) de 3 expériences.

Tableau 2 : Nombre de CPD/106 bases et taux d'induction des lésions dans des kératinocytes humains normaux traités (ou non) par un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à 0,5% puis irradiés par une dose de 50 J/cm2 d'UVA.

Conclusion : L'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) obtenu selon l'invention diminue significativement le nombre de lésions CPD dans des kératinocytes humains normaux irradiés aux UVA. Les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) puis irradiés aux UVA présentent donc un génotype moins

endommagé. Par conséquent, les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) puis irradiés aux UVA sont protégés à court terme des effets génotoxiques des UVA.

Exemple n°4 : Effet d'un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) selon l'invention sur la protection à court terme de l'ADN contre les lésions 8-oxoG induites par les UVA dans des kératinocytes humains normaux

Pour révéler les dommages oxydatifs tels que la 8- oxoG le test de Comètes a été utilisé, en condition alcaline après traitement enzymatique avec la Fpg (formamidopyrimidine-ADN glycosylase). Cette technique micro-électrophorétique sensible permet de visualiser les fragments d'ADN endommagé qui migrent sous l'effet d'un champ électrique. Les fragments, encore appelés « queue de la comète » sont alors mesurés quantitativement par fluorescence couplée à de l'analyse d'image.

Protocole :

Des kératinocytes humains normaux sont traités pendant 24h avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit), obtenu à l'exemple 1, à la concentration finale de 0,5%. Les kératinocytes non traités sont utilisés comme contrôle. Les kératinocytes sont ensuite irradiés (ou non) à la dose de 50 J/cm2 d'UVA avec le système UVA 700L (Waldmann). Les kératinocytes sont ensuite lavés avec un tampon phosphate salin.

Une suspension de kératinocytes (2.105 cellules/50pl) est injectée dans un gel d'agarose qui, ensuite, est coulé sur une lame en verre. Des étapes de lyse cellulaire et de dénaturation de l'ADN sont effectuées avant de faire migrer l'ADN par électrophorèse. Enfin, un colorant fluorescent des acides nucléiques (Gel Red) est incorporé dans le gel.

La fluorescence est observée avec le microscope Axioskop 2 plus (Zeiss) puis quantifiée par analyse d'image avec le logiciel Komet six software.

Les résultats sont présentés sur la figure 1. Les kératinocytes non traités et non irradiés ou « Contrôle-Non irradié » présentent un ADN intact qui est sous la forme d'une sphère avec des contours bien marqués. Les kératinocytes non traités et irradiés avec les UVA ou « Contrôle-UVA » ont un ADN fortement endommagé qui se visualise avec de nombreux fragments qui migrent à côté du noyau pour former une traînée assimilable à la queue d'une comète. Les kératinocytes traités avec l'extrait NaDES Sechium edule (fruit) et irradiés avec les UVA ont un ADN peu endommagé avec une ébauche de queue. L'ADN dégradé ou queue de la comète est quantifié par fluorescence. Les résultats sont exprimés en intensité moyenne de fluorescence de l'ADN dégradé (tableau 3). L'induction de 8-oxoG est exprimée en pourcentage (%) d'augmentation du nombre de lésions avant et après l'irradiation UVA. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± EC (écart type) de 3 expériences.

Tableau 3 : Quantification de l'ADN endommagé (queue de la comète) et taux d'induction de 8-oxoG dans des kératinocytes humains normaux traités (ou non) par un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à 0,5% puis irradiés par une dose de 50 J/cm2 d'UVA.

Conclusion : L'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) obtenu selon l'invention protège l'ADN des noyaux des kératinocytes humains normaux et diminue significativement la dégradation de l'ADN et le nombre de lésions 8-oxoG après une irradiation UVA. Les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) puis irradiés aux UVA présentent donc un génotype moins endommagé. Par conséquent, les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) puis irradiés aux UVA sont protégés à court terme des effets génotoxiques des UVA.

Exemple n°5 : Effet d'un extrait NaDES de Sechium edule (fruit) selon l'invention sur la protection à long terme de l'ADN contre les dommages induits par les UVA

La survie cellulaire à long terme a été étudiée par le test de clonogénicité. Cette technique de culture cellulaire met en évidence la capacité des kératinocytes à former des clones (ou des colonies) en culture, et permet de distinguer les 3 types de clones : les holoctones (à fort potentiel prolifératif), les méroclones (à potentiel prolifératif intermédiaire) et les paraclones (à faible potentiel prolifératif). Ainsi, une population de kératinocytes, riche en cellules souches, produira un nombre très important de colonies à grande taille.

Protocole :

Des kératinocytes humains normaux sont traités pendant 24h avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit), obtenu à l'exemple 1, à la concentration finale de 0,5%. Les kératinocytes non traités sont utilisés comme contrôle. Les kératinocytes sont ensuite irradiés (ou non) à la dose de 50 J/cm2 d'UVA avec le système UVA 700L (Waldmann). Après irradiation, les kératinocytes sont, à nouveau, traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) à la concentration finale de 0,5%. Enfin, les kératinocytes sont lavés avec un tampon phosphate salin.

Une suspension de kératinocytes (60 cellules/cm2) est ensemencée à densité clonale sur une couche nourricière de fibroblastes humains normaux inactivés. La culture est maintenue pendant 14 jours avec un changement de milieux 3 fois par semaine.

Les clones cellulaires sont ensuite fixés et colorés avec de la rhodamine (Sigma). Les 3 types de clones (holoclones, méroclones et paraclones) sont comptés en utilisant le stéréomicroscope SZX9 (Olympus).

Les résultats sont présentés sur les figures 2 et 3. La culture clonale de kératinocytes non traités et non irradiés « Contrôle-Non irradié » présente des clones avec des caractéristiques d'holoclones (colonie de grande taille, à bord net, bien colorée) et de méroclones (colonie de taille moyenne) (figure 2). La culture clonale de kératinocytes non traités et irradiés avec les UVA ou « Contrôle-UVA » présente peu/pas d'holoclones mais majoritairement des clones de type méroclone. La culture clonale de kératinocytes traités avec l'extrait NaDES Sechium edule (fruit) et irradiés aux UVA présente des clones avec des caractéristiques d'holoclones et de méroclones.

Le nombre de colonies est quantifié par visualisation en stéréomicroscopie (figure 3). Les valeurs sont exprimées en moyenne ± EC (écart type) de 3 expériences.

Conclusion : L'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) obtenu selon l'invention protège le pouvoir clonogénique des kératinocytes humains normaux après une irradiation UVA. Par conséquent, les kératinocytes humains normaux traités avec l'extrait NaDES de Sechium edule (fruit) puis irradiés aux UVA sont protégés à long terme des effets génotoxiques des UVA.

Exemple n°6 :

Crème de jour

Gel crème naturel hydratant

Spray nourrissant

Emulsion eau dans huile

Claims (11)

1. REVENDICATIONS

   1. Extrait de Sechium edule destiné à être utilisé dans une méthode de traitement pour lutter contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau.
2. 2. Extrait selon la revendication 1, caractérisé en ce que les rayonnements ultraviolets sont des rayons ultraviolets A.
3. 3. Extrait selon les revendications 1 à 2, caractérisé en ce que la lutte contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau consiste en une protection de l’acide désoxyribonucléique.
4. 4. Extrait selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la lutte contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau consiste en une réparation de l’acide désoxyribonucléique.
5. 5. Extrait selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la lutte contre les effets nocifs des rayonnements ultraviolets sur la peau consiste en une accélération de la réparation de l’acide désoxyribonucléique.
6. 6. Extrait selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l’extrait est un extrait de fruit avantageusement séché.
7. 7. Extrait de Sechium edule susceptible d’être obtenu par un procédé d’extraction solide/liquide, suivi d’une seconde étape de séparation solide/liquide et enfin d’une troisième étape de récupération de la phase liquide, caractérisée en ce que le solvant consiste en un mélange de fructose, glycérine et éventuellement d’eau.
8. 8. Extrait selon la revendication 7, caractérisé en ce que le solvant consiste en un mélange de fructose, glycérine et d’eau.
9. 9. Extrait selon l’une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que le solvant consiste en un mélange de fructose, glycérine et d’eau, préférentiellement dans des proportions molaires d’environ 1 :1 :5.
10. 10. Extrait selon Tune des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que l’extrait est un extrait de fruit, avantageusement séché.
11. 11. Composition cosmétique comprenant l’extrait selon l’une des revendications 7 à 10.