FR3051197A1 - Particule virale pour le transfert d'arns dans les cellules impliquees dans la reponse immune - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à une particule rétrovirale comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou dans l'intégrase, et l'une au moins dédites séquences d'intérêt des ARN non viraux encapsidés comporte une partie codant pour au moins un épitope et/ou au moins une structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un épitope.

Description

La présente invention concerne un système rétroviral de transfert d’ARN non viraux dans des cellules cibles et plus particulièrement une particule rétrovirale capable de délivrer de multiples ARN. L’invention concerne également des compositions comportant ces particules rétrovirales, des kits de production de celles-ci, les procédés de fabrication afférents ainsi que les utilisations des particules et des compositions.

Introduire des ARN multiples dans une cellule cible est en enjeu majeur en recherche et développement comme en thérapie génique. L'utilisation de vecteurs dérivés de virus est devenue une méthode cruciale de transfert de gènes. Les vecteurs viraux se répartissent aujourd’hui en deux catégories principales: les vecteurs intégratifs, qui s’intégrent dans le génome receveur, et les vecteurs non-intégratifs, qui forment habituellement un élément génétique extra-chromosomique.

Les vecteurs intégratifs tels que les vecteurs gamma-rétroviraux (RV) et vecteurs lentiviraux (LV) sont intégrés de façon stable. Les vecteurs non-intégratifs, tels que les vecteurs adénoviraux (ADV) et les vecteurs adéno-associés (AAV) sont rapidement éliminés des cellules qui se divisent rapidement. Certains facteurs influençant le choix d'un vecteur particulier, comprennent sa capacité d’encapsidation, sa gamme de cellules cibles ou hôtes, son profil d'expression génique, son efficacité de transduction et sa capacité à induire une réponse immunitaire, ce qui est particulièrement problématique si des transductions répétées sont nécessaires.

Certaines applications nécessitent l’utilisation de vecteurs non-intégratifs comme en thérapie génique ou dans de nombreuses applications in vitro, ex vivo et in vivo. A titre d’exemples, on peut citer : • l’induction de la reprogrammation de cellules spécialisées en cellules pluripotentes, ainsi que l’induction de la différenciation de cellules souches ou pluripotentes en cellules spécialisées, • l’expression d’antigènes ou de protéines (toxiques ou non) simultanément dans une cellule cible. • l’expression de systèmes d’ingénierie du génome comme par exemple la protéine CRE, TALEN ou le système CRISPR, ou de toute autre système nécessitant une expression de protéine ou d’ARN.

Un moyen d’introduire des ARN dans une cellule cible met en œuvre des vecteurs viraux basé sur des virus appartenant à la famille des Retrovihdae (également désignée sous l’appellation famille des Rétrovirus ou virus à ARN). En effet, durant son cycle de réplication, un virus de la famille des Retrovihdae possède la capacité de convertir son génome, constitué d’ARN, en ADN double brin qui sera intégré dans le génome de la cellule cible. Des exemples particuliers de cette famille de Rétrovirus sont les gamma-rétrovirus et les lentivirus.

Le cycle réplicatif d’un rétrovirus comporte une première phase de reconnaissance de la cellule cible (ou hôte) via la fixation à un récepteur membranaire. Cette phase de reconnaissance aboutit, après fusion membranaire, à l’entrée du rétrovirus dans la cellule hôte. L’ARN rétroviral est alors copié en ADN double brin par la transcriptase inverse, codée par le rétrovirus, puis intégré au génome de la cellule hôte. Ce génome viral est alors transcrit par la cellule hôte comme tous les autres gènes de la cellule. Ce génome code l’ensemble des protéines et des séquences permettant la fabrication d’autres virus.

Plus particulièrement, trois gènes sont communs à l’ensemble des rétrovirus : gag, pol et env.

Gag est un gène codant pour une polyprotéine, les protéines issues de cette polyprotéine par clivage, étant des protéines de structure impliquées dans l’assemblage des virus lors de la réplication. Ces protéines de structure sont plus spécifiquement la protéine de matrice (MA), la protéine de capside (CA) et la protéine de nucléocapside (NC).

Pol est un gène codant pour les enzymes intégrase, transcriptase inverse et protéase.

Env est un gène codant pour des glycoprotéines d’enveloppe.

Ces trois gènes permettent donc de copier TARN rétroviral en ADN double brin, d’intégrer cet ADN au génome de la cellule hôte puis de générer la structure des rétrovirus néo-synthétisés : protéines d’enveloppe, de capside et de nucléocapside. Toutefois, afin que les rétrovirus néo-synthétisés soient complets, il est nécessaire d’encapsider dans chacune de ces structures deux copies de TARN rétroviral. Cette encapsidation de deux copies de i’ARN rétroviral dans la structure s’effectue par la reconnaissance par la protéine de nucléocapside, d’une séquence d’encapsidation appelée Psi (pour « Packaging Signal ») portée par la copie de TARN rétroviral.

Lorsqu’un vecteur viral dérivé d’un rétrovirus est utilisé à des fins de thérapie génique, au moins une partie des régions codantes de gag, pol et/ou env est dissociée entre le système d’encapsidation et le système d’expression de la séquence d’intérêt. Les séquences codantes gag et pol, par exemple, sont portées par le plasmide d’encapsidation apportant en trans les protéines nécessaires à la production de vecteurs viraux. La séquence d’encapsidation comme la séquence d’intérêt sont portée par des systèmes indépendants, afin de rendre le rétrovirus non réplicatif.

Toutefois, dans certains cas, l’intégration de la séquence d’ARN d’intérêt dans le génome de la cellule hôte de façon aléatoire peut interrompre une phase ouverte de lecture et bloquer l’expression de gênes importants. De plus, pour certaines applications, telles que la reprogrammation de cellules, l’édition des génomes ou la différenciation de cellules souches, il est recommandé que l’expression d’une séquence d’intérêt soit réalisée de manière transitoire.

La demande W02007/072056 décrit un système de vectorisation viral comprenant env, gag, optionnellement gag/pol ainsi qu’une séquence d’ARN contenant un signal d’encapsidation hétérologue qui est reconnu par un domaine de liaison à ARN correspondant associé à gag ou à gag/pol. Ce système est décrit dans la demande comme étant non intégratif et permettant une expression transitoire.

Toutefois, l’efficacité de tels systèmes reste limitée. En particulier, pour qu’une cellule cible exprime un ARN d’intérêt véhiculé par ces systèmes, il est généralement nécessaire d’introduire dans la cellule plusieurs copies de cet ARN d’intérêt et par conséquent, d’utiliser de fortes multiplicités d’infection (« multiplicity of infection » ou MOI). La MOI correspond au ratio du nombre de systèmes de vectorisation introduit sur le nombre de cellules à infecter. Une forte MOI permet en effet d’introduire dans les cellules plusieurs copies de l’ARN d’intérêt en permettant qu’une même cellule subisse plusieurs infections. Or, si elle permet d’améliorer le niveau d’expression de TARN d’intérêt véhiculé, l’utilisation de fortes MOI, du fait des multiples infections subies par la cellule, engendre également une certaine toxicité.

Ce type de système de transfert d’ARN présente également un intérêt pour l’immunothérapie, et notamment l’immunothérapie anti-tumorale L'immunothérapie anti-tumorale est une stratégie thérapeutique qui s’appuie sur le système immunitaire afin d'éradiquer les cellules tumorales. De nouvelles approches consistent à modifier génétiquement les cellules du patient pour induire une réponse immunitaire et améliorer le ciblage. Pour que ces nouvelles thérapies géniques puissant être utilisées en clinique, une méthode de transfert de gènes sécurisée et efficace est nécessaire. La transfection d’ARN et l’utilisation de vecteurs lentiviraux ont respectivement émergé comme des technologies adaptées pour transférer soit un récepteur spécifique des lymphocytes T dans des lymphocytes soit un antigène dans des cellules dendritiques. L’identification moléculaire d’antigènes spécifiques de cellules tumorales humaines est un élément clé du développement d’immunothérapie spécifique d’antigènes ciblés: • Une des approches qualifiée d’immunothérapie passive consiste à amplifier des cellules T spécifiques d’antigènes ex vivo et à les réimplanter chez les patients (Cellules T TCR & CAR). Le transfert de gènes est ici utilisé pour introduire des récepteurs chimériques d’antigènes synthétiques (CARs) ou des nouveaux récepteurs de cellules T (TCRs) dans ces cellules T avant de les réimplanter par transfert adoptif pour le traitement de cancers. Ici, les vecteurs lentiviraux sont largement utilisés et des résultats très encourageants ont été obtenus au stade clinique. « L’autre approche qualifiée d’immunothérapie active est la vaccination. Les cellules dendritiques (DCs) sont des agents naturels de la présentation des antigènes. Les cellules dendritiques sont au centre de nombreuses stratégies thérapeutiques anti-tumorales du fait de leur capacité à stimuler des cellules T naïves. En effet, les cellules dendritiques sont les “détecteurs” de l’environnement et transmettent les informations récoltées aux cellules T et B du système immunitaire. Ces cellules sont donc des cibles essentielles pour générer une immunité thérapeutique anti-tumorale et sont, de ce fait, qualifiées de Cellules Présentatices d’Antigènes (CPAs) professionnelles. La finalité de la vaccination basée sur les cellules dendritiques est à la fois d’induire in vivo une réponse des cellules T effectrices pour réduire la masse tumorale spécifiquement et également d’installer une réponse mémoire.

Ces deux approches thérapeutiques impliquent deux spécificités pour obtenir une réponse immunitaire anti-tumorale efficace et reproductible. Premièrement, l’expression de séquences exogènes telles que les antigènes, dans les cellules cibles doit être contrôlée pour obtenir une réponse immunitaire sans induire de toxicité. La co-expression de plusieurs antigènes au même moment est une bonne opportunité pour augmenter la réponse tumorale et éviter l’échappement de cellules tumorales. Le second point est l’expression dans les cellules cibles d’agents immuno-modulateurs qui déclenchent la maturation ou l’activation des cellules immunitaires ainsi modifiées. Ces co-expressions multiples au sein des cellules immunitaires vont permettre de mimer les réponses immunes innées et adoptives. Ainsi ces procédés vont d’une part fournir des cellules exprimant spécifiquement des antigènes et d’autre part induire leur maturation ou différenciation qui est essentielle à une réponse immunitaire complète et efficace. Ces deux approches basées respectivement sur des cellules T et des cellules dendritiques sont plus particulièrement ciblées par l’invention.

Il existe donc toujours un besoin pour des systèmes de vectorisation viraux plus efficaces, moins toxiques et plus spécifiquement adaptés à l’immunothérapie.

Le travail des inventeurs a permis de réaliser un système de vectorisation capable de délivrer plusieurs ARN d’intérêt dans une même cellule en une seule infection.

La présente invention se rapporte donc à une particule rétrovirale comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag, une protéine d’enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d’ARN d’intérêt liée à une séquence d’encapsidation, chaque séquence d’encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou dans l’intégrase, et l’une au moins dédites séquences d’intérêt des ARN non viraux encapsidés comporte une partie codant pour au moins un épitope et/ou au moins une structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un épitope.

La particule rétrovirale selon l’invention permet d’introduire au moins deux ARN non viraux, préférentiellement 3, dans une cellule par une seule infection. L’introduction de telles particules dans les cellules peut être effectuée par un procédé in vivo, in vitro ou ex vivo.

Par « protéine issue de la polyprotéine Gag », on entend toute protéine résultant du clivage de la polyprotéine Gag. Plus particulièrement, il s’agit d’une protéine de nucléocapside, d’une protéine de matrice (par exemple, dans des particules rétrovirales dérivées du virus murins de type MoMuLV) ou de la protéine p12, spécifique aux gammaretrovirus.

Par « protéine d’enveloppe », on entend toute protéine d’enveloppe, y compris une protéine d’enveloppe de pseudotypage. A titre d’exemple, on peut citer la protéine d’enveloppe Ampho, la protéine d’enveloppe écotrope, la protéine d’enveloppe du virus Moloney de la leucémie murine (MoMuLV), la protéine d’enveloppe du virus de l’Immunodéficience Féline (FIV), la protéine d’enveloppe du virus du sarcome murin d’Harvey (HaMuSV), la protéine d’enveloppe du virus de la tumeur mammaire murine (MuMTV), la protéine d’enveloppe du virus du Sarcome de Rous (RSV), la protéine d’enveloppe du virus de la rougeole (aussi MV pour measles virus), la protéine d’enveloppe du virus de la leucémie du Gibbon (GalV), la protéine du virus endogène félin (RD114) ou la protéine d’enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G). Plus particulièrement, la protéine d’enveloppe est la protéine d’enveloppe Ampho, la protéine d’enveloppe écotrope, la protéine d’enveloppe du virus Moloney de la leucémie murine (MoMuLV), la protéine d’enveloppe du virus de l’Immunodéficience Féline (FIV), la protéine d’enveloppe du virus du sarcome murin d’Harvey (HaMuSV), la protéine d’enveloppe du virus de la tumeur mammaire murine (MuMTV), la protéine d’enveloppe du virus du Sarcome de Rous (RSV), la protéine d’enveloppe du virus de la rougeole (aussi MV pour measles virus), la protéine d’enveloppe du virus de la leucémie du Gibbon (GalV) ou la protéine d’enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G). La protéine d’enveloppe peut ainsi être modifiée pour cibler certains types cellulaires ou certaines applications (utilisation de récepteurs de surface comme protéine d’enveloppe).

Il est également possible de modifier la protéine d’enveloppe avec un anticorps, un glycolipide et/ou un ligand particulier afin de cibler un récepteur et/ou un type cellulaire particulier.

Préférentiellement, la protéine d’enveloppe est la protéine VSV-G.

Par « intégrase », on entend la protéine enzymatique codée par le gène pol, qui permet l'intégration de l’ADN rétroviral dans l'ADN de la cellule infectée par le rétrovirus lors de la réplication dudit rétrovirus.

Par « séquence d’encapsidation », on désigne un motif (séquence et structure tridimensionnelle) ARN reconnu spécifiquement par un domaine de liaison. Préférentiellement, la séquence d’encapsidation est un motif tige-boucle. Plus préférentiellement encore, la séquence d’encapsidation de la particule rétrovirale est le motif tige-boucle de l’ARN du bactériophage MS2 ou du phage PP7 tel que par exemple, celui résultant de la séquence ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N°1) ou (ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID N°2) respectivement. Le motif tige-boucle et plus particulièrement le motif tige-boucle de l’ARN du bactériophage MS2 ou celui de l’ARN du phage PP7, peut être utilisé seul ou répété plusieurs fois, de préférence de 2 à 25 fois, plus préférentiellement de 2 à 18 fois, par exemple de 6 à 18 fois.

Par « domaine de liaison », on désigne tout ou partie d’une protéine se liant spécifiquement à la séquence d’encapsidation liée à la séquence d’ARN d’intérêt. Plus particuliérement, il s’agit d’une protéine mutante ou non, définie par une structure tridimensionnelle, se liant spécifiquement à la séquence d’encapsidation. Préférentiellement, le domaine de liaison est un domaine hétérologue. Plus préférentiellement, le domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2, du phage PP7 ou du phage Οβ, la protéine nun du prophage HK022, la protéine U1A ou encore la protéine hPum.

Plus préférentiellement, le domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2 ou du phage PP7.

Plus préférentiellement encore, lorsque le domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7, la séquence de celle-ci est déficiente pour l’auto-assemblage, grâce à une délétion des acides aminés 67 à 75 (PCPAFG) (Chao et ai. 2008). Préférentiellement, la séquence de la protéine Coat du phage PP7 est codon-optimisée pour les cellules humaines, c’est-à-dire que les bases de l’ADN sont choisies pour coder pour des acides aminés préférentiellement présents dans l’espèce humaine.

Par « chaque séquence », on entend que les séquences d’encapsidation peuvent être identiques ou différentes, selon que ces séquences d’encapsidation sont reconnues par un domaine de liaison identique ou différent. En effet, la particule rétrovirale selon l’invention peut comporter un ou plusieurs domaines de liaison. Lorsque plusieurs domaines de liaison sont introduits, ceux-ci peuvent l’être dans la polyprotéine Gag et/ou dans l’intégrase.

Le domaine de liaison permet non seulement la reconnaissance de la séquence d’encapsidation mais également l’encapsidation des ARN portant la séquence d’encapsidation dans la particule (ou dans le cas présent, d’un ARN non viral lié à une séquence d’encapsidation).

Par « encapsidation », on entend l’empaquetage d’un ARN dans la capside virale d’une particule virale. On notera que dans la présente invention, l’encapsidation des ARN non viraux s’effectue par la reconnaissance d’un signal d’encapsidation non viral, en particulier autre que Psi.

Par « séquence d’intérêt », on vise une séquence codant pour une fonction présentant un intérêt pour l’utilisateur. Plus particulièrement, la séquence d’intérêt portée par chacun des deux ARN non viraux encapsidés peut être identique ou différente. A l’aide des particules selon l’invention, il est possible de transférer dans des cellules cibles des ARN non viraux identiques ou différents.

Les ARN encapsidés étant non viraux, ces ARN ne présentent pas les sites de reconnaissance des protéines codées par le gène pol.

En effet, ces ARN non viraux n’entrent pas dans les étapes précoces du cycle réplicatif des rétrovirus, à savoir :

La copie de l’ARN viral simple brin en ADN double brin par la transcriptase inverse ; - La maturation de l’ADN viral double brin par reconnaissance des extrémités LTR par i’intégrase et maturation du complexe de pré-intégration cytoplasmique en complexe de pré-intégration nucléaire.

Ces protéines virales (transcriptase inverse, intégrase), codées par le gène pol sont donc optionnelles dans la particule et le gène pol peut donc être soit présent, soit délété partiellement ou totalement. Préférentiellement, le gène pol est soit présent, soit délété partiellement.

On notera que les particules rétrovirales selon l’invention comportent un matériel génétique à la fois viral et non viral : - le gène gag, qui peut être viral ou chimérique. Plus particulièrement, le gène gag est chimérique lorsque le ou les domaine(s) de liaison est/sont introduit(s) dans celui-ci.

Optionnellement, le gène pol, qui peut être viral ou chimérique. Le gène pol codant pour plusieurs enzymes, les séquences afférentes à ces enzymes peuvent être délétées totalement ou partiellement, présentes et non fonctionnelles, ou présentes et fonctionnelles. Plus particulièrement, le gène pol est chimérique lorsque le ou les domaine(s) de liaison est/sont introduit(s) dans l’intégrase. - Au moins deux ARN non viraux, chaque ARN non viral étant porteur d’une séquence d’intérêt et d’une séquence d’encapsidation. Plus particulièrement, par "ARN non viral", on entend un ARN dépourvu de toute séquence rétrovirale (qui peut également être désigné par "ARN non rétroviral").

Plus spécifiquement, les particules rétrovirales selon l’invention permettent d’introduire dans des cellules cibles des ARN capables d’induire : • Le transfert d’une ou plusieurs séquences d’intérêt codantes endogènes ou exogènes de la cellule cible. • Le transfert d’un ou plusieurs ARN non codants comme des ARN capables d’induire un effet sur l’expression génétique, par exemple par le biais de shRNA, miRNA, sgRNA, LncRNA ou circRNA. • Le transfert d’ARN cellulaires, de type ARN messagers ou autres (miRNA...), des réplicons sous génomique de virus à ARN (VHC, etc...) ou de génomes complets de virus à ARN, • l’expression simultanée de séquences codantes ou non codantes endogènes, exogènes de la cellule cible.

Plus particulièrement, les particules virales selon l’invention permettent d’introduire dans des cellules cibles des acides nucléiques capables d’induire : - L’expression d’un ou plusieurs épitope(s) et notamment d’un ou plusieurs antigène(s) dans des cellules impliquées dans la réponse immune (cellules dendritiques ou autres cellules présentatrices d’antigènes) ; L’activation des cellules transduites pour déclencher leur maturation ou leur activation ou celle de cellules avec lesquelles elles pourront interagir et contrecarrer par exemple les mécanismes d’immunosuppression induits par des mécanismes variés et complexes. Une telle activation peut être effectuée par des agents immuno-modulateurs. Ce type d’approche peut créer un micro-environnement favorable au déclenchement d’une réponse immune contre les cellules tumorales.

Il est à noter que cette méthode peut être appliquée à d’autres types de systèmes d’induction de réponse immunitaire.

Par « épitope », on entend une structure qui peut être reconnue spécifiquement par un anticorps ou un récepteur lymphocytaire.

Avantageusement, la séquence d’intérêt code pour plusieurs épitopes, notamment pour un antigène.

Par « antigène », on entend une substance étrangère à l’organisme capable de déclencher une réponse immunitaire visant à l’éliminer. Ils peuvent être naturels ou synthétiques. Un antigène est généralement une macromolécule naturelle ou synthétique, généralement des protéines, des polysaccharides et leurs dérivés lipidiques. C'est la reconnaissance de l'antigène par les cellules immunocompétentes, directement ou via les cellules présentatrices d'antigène (CPA), qui active l'immunité spécifique. Un même antigène peut comporter plusieurs épitopes (identiques ou différents) et ainsi induire une réponse immunitaire variée. La reconnaissance de l'antigène par les lymphocytes dépend de la nature de l'épitope. Les lymphocytes B se lient directement aux épitopes conformationnels grâce aux immunoglobulines de leur membrane. Les lymphocytes T reconnaissent les épitopes séquentiels, correspondant à une séquence d’acides aminés, présentés par les cellules présentatrices d'antigènes.

Préférentiellement, l’épitope ou l’antigène provient d’un agent pathogène, notamment d’un virus, d’une bactérie, d’un parasite, d’une cellule tumorale, etc. L’épitope ou l’antigène peut être déduit à partir des biomarqueurs identifiés comme exprimés en grande quantité sur les cellules tumorales ou à partir de virus ou de toxine. Sa taille peut être variable. En général, un criblage est réalisé pour sélectionner le meilleur épitope ou antigène. A partir de la séquence protéique de l’épitope ou de l’antigène, la séquence des acides désoxyribonucléiques et des acides ribonucléiques peut être déduite. L’épitope est de préférence choisi parmi les peptides. Plus préférentiellement, l’épitope est un épitope peptidique comportant de 1 à 50 acides aminés (AA), de préférence moins de 30 AA, préférentiellement de 3 à 12 acides aminés. L’antigène est de préférence choisi parmi les peptides, les protéines, les glycoprotéines. En effet, la machinerie cellulaire de la cellule (hôte) pouvant traduire l’ARN encapsidé, elle peut également réaliser une ou plusieurs étapes supplémentaires de modifications post traductionnelles telles qu’une glycosylation. En effet, lorsque la production de l’antigène a lieu dans des cellules dendritiques, l’antigène peut être maturé comme le biomarqueur qui a permis son obtention.

La particule selon l’invention permettant l’introduction d’ARN présentant une taille allant jusqu’à lOkb, il est possible d’introduire dans celle-ci des séquences antigéniques de taille conséquente. Toutefois, la taille de la séquence antigénique est variable. De façon générale, plus une molécule est de grande taille et plus elle est immunogène.

Par « séquence antigénique », on vise une séquence d’ADN codant pour un épitope ou un antigène.

Avantageusement, l’épitope ou l’antigène est immunogène, c’est-à-dire qu’il peut initier une réponse immunitaire.

Par « immunogène » on entend le potentiel d’un antigène à un induire une réponse immune. Une substance peut être antigénique sans être immunogène. Ce potentiel dépend de l’espèce, du degré de similitude entre l’antigène et les molécules de l’hôte, des caractéristiques physico-chimiques de l’antigène (taille, forme, rigidité) et de la dose d’antigène reçue.

De préférence, l’épitope est choisi parmi la liste constituée par des molécules qui sont identifiées comme reconnues par la partie variable d'un anticorps ou d'un récepteur membranaire des lymphocytes T (TCR). Ces derniers sont identifiés et sélectionnés selon leur potentiel immunogène.

De préférence, l’antigène est un antigène tumoral c’est-à-dire une molécule spécifiquement présente à la surface des cellules tumorales, absente ou peu abondante sur les cellules normales environnantes. Plus préférentiellement, l’antigène est choisi parmi le groupe constitué par les antigènes du groupe « cancer testis » (Ex Mage-A12, MAGE-A3, MAGE-A10, MAGE-A2, MAGE-A1, CT7/MAGE-C1, CT10, SSX4, B R DT, NY-ES01, SSX2, Xagelb, MAGE-A4...) qui sont exprimés spécifiquement par le tissu tumoral en dehors d’une expression ectopique par les cellules germinales ; les antigènes de différenciation qui sont exprimés dans un tissu donné aussi bien par des cellules normales que par les cellules tumorales correspondantes ; les antigènes exprimés uniquement dans les cellules tumorales qui peuvent correspondre à des antigènes mutés (Alpha-actinin-4, NY-FC, P53, élongation factor 2, enzyme malic, EGF-R, Kras, CaspS, ACYN4, ALK-EML14...) ; les néoantigènes générés à la suite d’une translocation chromosomique (Bcr-AbI) ; les antigènes exprimés par des cellules normales qui peuvent être surexprimés par la tumeur (WT1, ACE, Muc1, Survivin 2B, Telomerase ctalytic protein, Her2/neu, EGF-R, EGF, TGFalpha, cyclophillin B...) ; les antigènes dérivés d’agents pathogènes notamment des virus (papillomavirus et cancers du col de l’utérus ou des voies aérodigestives supérieures, virus des hépatites B et C et cancers du foie) ; et les antigènes dérivés des bactéries (Hélicobacter pylori et cancer de l’estomac) ou des parasites (schistosome et cancer de la vessie), notamment chez l’homme. En particulier, les antigènes tumoraux associés aux mélanomes ont été classés dans trois catégories selon qu’ils soient spécifiques de tissu (MART-1, tyrosinases TRP-1 et TRP-2, gp-100), spécifiques de tumeurs, pour ceux qui sont également exprimés par une grande variété de cancer (MAGE-1, NY-ESO-1), ou qu’ils soient des antigènes tumoraux uniques et mutés (β-catenin, CDC27).

Une particule rétrovirale selon l’invention comportant un ARN non viral encapsidé dont la séquence d’intérêt comporte une partie codant pour au moins un épitope est particulièrement avantageuse pour transduire des cellules présentatrices d’antigène, notamment les cellules dendritiques.

Par « structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un épitope » ou « paratope », on vise une structure capable d’établir une interaction spécifique avec un épitope, et notamment un antigène. Il s’agit généralement d’un immunorécepteur constitué par la partie variable d’un anticorps ou d’un récepteur membranaire des lymphocytes. De préférence, il s’agit d’immunorécepteur de type TCR (T cell receptor) ou de CAR (récepteur chimérique) présent à la surface d’un lymphocyte T.

De préférence, la structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un épitope est choisie parmi le groupe constitué par les récepteurs des lymphocytes T (TCR), natifs, modifiés ou chimériques ; les récepteurs des lymphocytes B, membranaires (BCR) ou secrétés (immunoglobulines) ; et les récepteurs d’autres cellules du système immunitaire intervenant dans la réponse immune, telles que les lymphocytes NK ou NKT.

Une particule rétrovirale selon l’invention comportant un ARN non viral encapsidé dont la séquence d’intérêt comporte une partie codant pour au moins une structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un antigène est particulièrement avantageuse pour transduire des cellules lymphocytaires.

Avantageusement, la particule rétrovirale selon l’invention comporte une protéine de nucléocapside, une protéine d’enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d’ARN d’intérêt liée à une séquence d’encapsidation, chaque séquence d’encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside et/ou dans l’intégrase.

Par « protéine de nucléocapside », on entend la protéine de structure NC codée par le gène gag. Lorsque le domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside, alors cette protéine est une protéine chimérique, issue d’un gène gag chimérique.

Lorsque le domaine de liaison est introduit dans l’intégrase, alors l’intégrase est une protéine chimérique, issue d’un gène pol chimérique.

Par « protéine chimérique », on désigne une protéine recombinante comprenant plusieurs séquences protéiques différentes fusionnées.

Selon un premier mode de réalisation, dans la particule rétrovirale selon l’invention, le domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside et les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d’ARN.

Ce premier mode de réalisation permet une expression précoce et transitoire des ARN d’intérêt, sans événement d’intégration associé dans le génome des cellules cibles.

En effet, lors de la mise en contact d’une particule selon ce premier mode de réalisation avec une cellule cible, la membrane de la particule rétrovirale et celle de la cellule cible vont fusionner et permettre la libération du contenu de la particule dans la cellule cible. Les ARN sont alors libérés dans le cytoplasme et la machinerie cellulaire permet de traduire directement ces ARN en protéine(s), c’est-à-dire sans étapes supplémentaires comme la transcription inverse, la translocation dans le noyau ou l’intégration dans le génome de la cellule cible.

Plus particulièrement, les au moins deux ARN non viraux présentent la même séquence d’encapsidation. Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d’ARN d’intérêt, c’est-à-dire que les séquences d’ARN d’intérêt comprises dans les deux ARN non viraux encapsidés sont différentes. Par « différentes », on vise des séquences d’intérêt non identiques ou présentant une différence ne résultant pas d’une mutation spontanée ou non intentionnellement choisie par le manipulateur.

Alternativement, les au moins deux ARN non viraux présentent deux séquences d’encapsidation différentes. Ces au moins deux séquences d’encapsidation sont alors reconnues par au moins deux domaines de liaison différents, au moins un de ces domaines étant introduit dans la protéine de nucléocapside. Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent comporter des séquences d’intérêt identiques ou différentes.

Il est possible d’encapsider au moins deux ARN non viraux, préférentiellement trois ARN non viraux.

Selon un mode de réalisation particulier du premier mode de réalisation, un second domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside de la particule rétrovirale selon l’invention. A titre d’exemple, le second domaine de liaison peut être la protéine « Coat » du bactériophage MS2 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine « Coat » du phage PP7 ou le second domaine de liaison peut être la protéine « Coat » du phage PP7 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine « Coat » du bactériophage MS2.

Dans ce cas, au moins deux ARN non viraux encapsidés portent des séquences d’encapsidation différentes, chaque séquence d’encapsidation correspondant respectivement au premier et second domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside.

Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés : - au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même séquence d’encapsidation correspondant au premier domaine de liaison et se distinguent uniquement par leur séquence d’ARN d’intérêt, - le troisième ARN non viral encapsidé peut porter une séquence d’encapsidation identique ou différente. Lorsque la séquence d’encapsidation est différente, celle-ci peut correspondre à un second domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside. D’autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans la protéine de nucléocapside.

Outre le ou les domaine(s) de liaison introduit(s) dans la protéine de nucléocapside, il est également possible d’introduire un domaine de liaison dans l’intégrase. L’intégrase est alors une protéine chimérique, issue d’un gène pol chimérique.

Préférentiellement, lorsque le domaine de liaison est introduit dans l’intégrase, la séquence de l’intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminai afin d’insérer la séquence du domaine de liaison. Plus préférentiellement encore, la séquence de l’intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminal de manière à introduire celle de la protéine « Coat » du bactériophage MS2 ou du phage PP7.

Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent porter des séquences d’encapsidation différentes, chaque séquence d’encapsidation correspondant aux domaines de liaison introduits dans la protéine de nucléocapside et dans l’intégrase respectivement.

Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés : - au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même séquence d’encapsidation correspondant au premier domaine de liaison et se distinguent uniquement par leur séquence d’ARN d’intérêt, - le troisième ARN non viral encapsidé portant une séquence d’encapsidation différente, correspondant à un second domaine de liaison introduit dans l’intégrase. D’autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans l’intégrase.

Avantageusement, la particule rétrovirale selon l’invention est une particule lentivirale.

Préférentiellement, dans une telle particule lentivirale : - le domaine de liaison est la protéine « Coat » du bactériophage MS2, - la séquence d’encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de MS2, - la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, chimérique, la séquence de NC étant mutée au niveau du second doigt de zinc afin d’insérer la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage MS2.

Avantageusement :

La protéine d’enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine d’enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.

La séquence d’encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de MS2, préférentiellement, de 6 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore de 10 à 14, par exemple 12 répétitions. De préférence, la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N°1).

Ou, préférentiellement, dans une telle particule lentivirale : - le domaine de liaison est la protéine « Coat » du phage PP7, - la séquence d’encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de PP7, la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, chimérique, la séquence de NC étant mutée au niveau du second doigt de zinc afin d’insérer la séquence de la protéine « Coat » du phage PP7.

Avantageusement :

La protéine d’enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine d’enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.

La séquence d’encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de PP7, préférentiellement, de 2 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore de 2 à 12, par exemple 6 répétitions. De préférence, la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N°2). Optionnellement, le second domaine de liaison introduit dans l’intégrase peut être la protéine Coat du phage PP7 si le premier domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2, ou le second domaine de liaison introduit dans l’intégrase peut être la protéine Coat du bactériophage MS2 si le premier domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7.

Selon un second mode de réalisation, l’invention concerne une particule rétrovirale comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag, préférentiellement une protéine de nucléocapside, une protéine d’enveloppe, une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d’ARN d’intérêt liée à une séquence d’encapsidation, chaque séquence d’encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans l’intégrase et, optionnellement par un domaine de liaison introduit dans une protéine issue de la polyprotéine Gag, préférentiellement une protéine de nucléocapside.

Ce second mode de réalisation permet une expression transitoire des ARN d’intérêt, sans événement d’intégration associé dans le génome des cellules cibles.

Préférentiellement, dans ce second mode de réalisation, la séquence de l’intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminal afin d’insérer la séquence du domaine de liaison.

Avantageusement, le domaine de liaison est un domaine hétérologue. Plus particuliérement, le domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2, du phage PP7 ou du phage Οβ, la protéine nun du prophage HK022, la protéine U1A ou encore la protéine hPum.

De préférence, la séquence de l’intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminal de manière à introduire celle de la protéine « Coat » du bactériophage MS2 ou du phage PP7.

Les au moins deux ARN non viraux peuvent présenter ou non la même séquence d’encapsidation.

De même, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent présenter ou non la même séquence d’ARN d’intérêt.

Préférentiellement, les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d’ARN d’intérêt c’est-à-dire que les séquences d’ARN d’intérêt comprises dans les deux ARN non viraux encapsidés sont différentes.

Plus particulièrement, les au moins deux ARN non viraux présentent la même séquence d’encapsidation, celle-ci étant reconnue par le domaine de liaison introduit dans l’intégrase.

Il est possible d’encapsider au moins deux ARN non viraux, préférentiellement trois ARN non viraux.

Selon un mode de réalisation particulier du second mode de réalisation, un second domaine de liaison est introduit dans l’intégrase de la particule rétrovirale selon l’invention. A titre d’exemple, le second domaine de liaison peut être la protéine « Coat » du bactériophage MS2 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine « Coat » du phage PP7 ou le second domaine de liaison peut être la protéine « Coat » du phage PP7 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine « Coat » du bactériophage MS2.

Dans ce cas, au moins deux ARN non viraux encapsidés portent des séquences d’encapsidations différentes, chaque séquence d’encapsidation correspondant respectivement au premier et second domaine de liaison introduit dans l’intégrase.

Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés : - au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même séquence d’encapsidation correspondant au premier domaine de liaison, ces deux ARN non viraux pouvant éventuellement se distinguer par leur séquence d’ARN d’intérêt, - le troisième ARN non viral encapsidé peut porter une séquence d’encapsidation identique ou différente. Lorsque la séquence d’encapsidation est différente, celle-ci peut correspondre à un second domaine de liaison introduit dans l’intégrase. D’autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans l’intégrase.

Outre le ou les domaine(s) de liaison introduit(s) dans l’intégrase, il est également possible d’introduire un domaine de liaison dans la protéine de nucléocapside.

La protéine de nucléocapside est alors une protéine chimérique, issue d’un gène gag chimérique.

Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent porter des séquences d’encapsidation différentes, chaque séquence d’encapsidation correspondant aux domaines de liaison introduits dans l’intégrase et dans la protéine de nucléocapside respectivement.

Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés : - au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même séquence d’encapsidation correspondant au premier domaine de liaison introduit dans l’intégrase, ces ARN non viraux pouvant éventuellement se distinguer par leur séquence d’ARN d’intérêt, - le troisième ARN non viral encapsidé porte une séquence d’encapsidation différente, correspondant à un second domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside. D’autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans la protéine de nucléocapside. L’invention vise donc une particule rétrovirale comportant une protéine de nucléocapside, une protéine d’enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d’ARN d’intérêt liée à une séquence d’encapsidation, chaque séquence d’encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside et/ou dans l’intégrase.

Optionnellement, les séquences d’intérêt des au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent être identiques.

Alternativement et de préférence, les au moins deux ARN non viraux encapsidés dans la particule rétrovirale se distinguent par leur séquence d’ARN.

Dans ce cas, il est avantageux que la séquence d’intérêt de l’autre ARN non viral encapsidé code soit pour un second épitope ou antigène, soit pour une protéine immunomodulatrice.

Dans le cas où la séquence d’intérêt de l’autre ARN non viral encapsidé code pour un second épitope ou antigène, il est ainsi possible d’exprimer plusieurs épitopes et/ou antigène à la fois et de déclencher une réponse immunitaire combinée et coordonnée. A titre d’exemple dans le domaine de l’immunothérapie tumorale, les cellules tumorales deviennent la cible de plusieurs réponses immunitaires indépendantes.

Il existe de nombreux agents immunomodulateurs, c’est-à-dire des molécules pouvant être utilisées pour contrôler et orienter le système immunitaire. L’introduction de ces agents immunomodulateurs par les particules selon l’invention peut donc concerner toutes les cellules du système immunitaire (lymphocytes, monocytes) dont il est souhaité de moduler la réponse spécifique, l’activation ou la différenciation. Dans le cas des cellules dendritiques, ces agents exercent deux fonctions principales. A l’état immature, les cellules dendritiques capturent l’antigène au niveau des tissus ciblés ou infectés puis migrent vers l’organe lymphoïde secondaire le plus proche tout en se différenciant. A l’état mature, les cellules dendritiques présentent l’antigène aux lymphocytes T afin de les activer spécifiquement.

Cette activation spécifique des cellules dendritiques conduit à la production de cytokines essentielles pour la mise en place et le maintien de la réponse immune. Ces cytokines permettent de lier le système inné au système adaptif par un mécanisme très complexe. C’est pourquoi, généralement l’activation des cellules in vitro ou ex vivo est provoquée par l’ajout de cytokines ou de facteurs dans le milieu de culture.

Le micro-environnement, mais aussi différents agents immunomodulateurs, peuvent induire ou contribuer à l’activation des cellules dendritiques. Par exemple, les PAMP (Pathogen Associated Molecular Pattern), les TLR (Toll-like Receptor), des molécules d’inflammation DAMP (Damage associated Molecular pattern Molécules) peuvent conduire à l’activation des cellules dendritiques. Beaucoup de molécules sont capables d’activer des cellules dendritiques. Le MCM (Monocyte-Conditioned Medium), les cytokines (TNFa, IL-Ιβ, PGL6), la prostaglandine E2, le CD40L ou des ligands des TLRs. L’ensemble des protéines capables d’agir sur la voie d’activation des cellules dendritiques est potentiellement capable d’avoir un effet modulateur sur leur maturation. De la même façon, des agents immunomodulateurs des Lymphocytes T ou B peuvent être de puissants régulateurs de la production et de l'activité de ces cellules et stimuler ainsi les interactions entre les différents acteurs de la réponse immune et donc améliorer celle-ci.

Par "protéine immunomodulatrice", on entend un agent immunomodulateur se présentant sous la forme d’une protéine.

Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux lorsque des cellules présentatrices d’antigène et notamment les cellules dendritiques, ou des lymphocytes sont transduits pour exprimer directement ces agents immunomodulateurs et amplifier la réponse immunitaire.

Ainsi l’induction de la maturation des cellules présentatrices d’antigène, et notamment des cellules dendritiques, concomitante à l’expression d’un antigène est une stratégie particulièrement porteuse pour induire une réponse immune. L’objectif est d’amorcer le système immunitaire pour répondre au mieux à (aux) l’antigène(s) cible(s). Une telle stratégie d’amorçage visant à pousser le système immunitaire est susceptible de conduire à un renforcement de la réponse immunitaire.

De préférence, la protéine immunomodulatrice est choisie parmi les cytokines telles que TNFa, IL-Ιβ, PGL6, les interleukines telles que IL-2, IL-4, IL-12, IL-15, des agents comme le GM-CSF, CD28, NCOS (« Inducible Costimulator »), 0X40, CD80, ICOSL ou OX40L, et des protéines permettant de réguler les voies d’activation décrites telles que des ligands des TLR ou des NLR (Nod-like récepteurs) comme l’imiquimod ou les CpGs.

Avantageusement, la particule rétrovirale comporte un troisième ARN non viral encapsidé.

Le troisième ARN non viral encapsidé peut présenter une séquence d’intérêt identique à au moins l’une des séquences d’intérêt des deux premiers ARN non viraux encapsidés ou se distinguer de chacune des séquences d’intérêt des deux premiers ARN non viraux encapsidés.

En particulier, la particule rétrovirale peut comporter plus de trois ARN non viraux encapsidés.

Avantageusement, dans le cas où la particule selon l’invention comporte une protéine de nucléocapside, le domaine de liaison peut être introduit dans la protéine de nucléocapside, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l’intégrase.

Alternativement, dans la particule rétrovirale selon l’invention, le domaine de liaison peut être introduit dans l’intégrase, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l’intégrase.

Avantageusement, la particule rétrovirale selon l’invention est une particule lentivirale.

Lorsque la particule rétrovirale est une particule lentivirale, il est possible d’exprimer transitoirement des ARN d’intérêt, sans événement d’intégration associé dans le génome des cellules cibles, en particulier des cellules quiescentes.

En effet, en dehors de son rôle dans la réaction d’intégration elle-même, l’intégrase (IN) participe à différentes étapes du cycle réplicatif des rétrovirus comme la morphogénèse de la particule virale, la transcription inverse et l’import nucléaire du complexe de préintégration (PIC).

Plus particulièrement, chez les lentivirus, l’intégrase contient des séquences de localisation nucléaire (NLS) permettant sa localisation dans le noyau grâce au PIC. Par conséquent, lorsque l’encapsidation des ARN non viraux est effectuée par un domaine de liaison porté par une intégrase d’un lentivirus, les ARN non viraux encapsidés seront transportées dans le noyau de la cellule cible. En effet, lors de la mise en contact d’une particule lentivirale selon ce second mode de réalisation avec une cellule cible, la membrane de la particule et celle de la cellule cible vont fusionner et permettre la libération du contenu de la capside dans la cellule cible. Les ARN sont alors pris en charge par l’intégrase qui, via les PIC, va permettre l’import des ARN dans le noyau. Cette prise en charge est particulièrement intéressante pour certaines applications, telles que l’expression dans des cellules quiescentes. Dans le cas de particules rétrovirales, autres que les lentivirus, Γintégrase ne contient pas ces N LS et se trouve donc localisée dans le cytoplasme. Il est toutefois possible de rajouter dans ce type d’intégrase, les séquences NLS afin d’induire une localisation nucléaire de l’intégrase, et donc des ARN pris en charge par cette intégrase.

Cette prise en charge est également particuliérement utile pour un système CRISPR, qui fait appel à des guides ARN qui viennent s’hybrider spécifiquement au génome de la cellule cible. Une fois hybridés, ces guides ARN guident une endonucléase (Cas9), qui va permettre la modification d’un locus spécifique du génome de la cellule cible.

Pour l’immunothérapie, le fait que la transduction soit réalisée en particulier par des particules lentivirales, permet une expression transitoire des ARN transduits.

La particule selon l’invention est en conséquence capable de délivrer des ARNs multiples, optionnellement distincts génétiquement, sans événement d’intégration dans le génome des cellules hôtes afin d’exprimer, d’une part de multiples séquences antigéniques tumorales différentes par exemple, et d’autre part des protéines immuno-modulatrices capables de déclencher l’activation des cellules transduites dans le mécanisme de réponse immunitaire.

Plus particulièrement, dans une telle particule lentivirale ; - le domaine de liaison est la protéine « Coat » du bactériophage MS2, la séquence d’encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de MS2, l’intégrase est une protéine enzymatique chimérique dont la séquence est mutée au niveau du domaine C-terminal afin d’insérer la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage MS2.

Ou, plus particulièrement, dans une telle particule lentivirale : le domaine de liaison est la protéine « Coat » du phage PP7, la séquence d’encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de PP7, l’intégrase est une protéine enzymatique chimérique dont la séquence est mutée au niveau du domaine C-terminal afin d’insérer la séquence de la protéine « Coat » du phage PP7.

Optionnellement, le second domaine de liaison introduit dans la nucléocapside peut être la protéine Coat du phage PP7 si le premier domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2 ou le second domaine de liaison introduit dans l’intégrase peut être la protéine Coat du bactériophage MS2 si le premier domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7.

En effet, l’intégrase (IN) est composée de 3 domaines fonctionnels distincts, chacun indispensable pour assurer une réaction d’intégration complète. Le domaine N-terminal contient un motif de type doigt de zinc qui stabilise la structure repliée de ΓΙΝ et augmente l’activité catalytique de l’enzyme. Le domaine central de l’IN contient le motif d’acides aminés DDE auquel est attribué l’activité catalytique de l’enzyme. Ce domaine centrai est aussi impliqué dans la reconnaissance de la séquence nucléotidique conservée à chaque extrémité de l’ADN rétroviral. Le domaine C-terminal est le moins conservé parmi la famille des rétrovirus. il possède l’activité de liaison à l’ADN et est indispensable pour les réactions de maturation des extrémités 3’ de transfert de brin. En dehors de son rôle dans la réaction d’intégration elle-même, IN participe à différentes étapes du cycle réplicatif des rétrovirus comme la morphogénèse de la particule virale, la transcription inverse et l’import nucléaire du complexe de préintégration.

Comme décrit par Petit et al. (1999; J. Virol. P5079-5088), l’insertion d’une séquence exogène en C-terminal de ΓΙΝ ne perturbe pas les étapes de production et de transduction de cellules cibles alors qu’une même insertion en N-terminal ne permet pas la détection d’un événement de transduction.

La particule rétrovirale a donc été modifiée pour contenir la protéine « Coat » du bactériophage MS2 en fusion avec la protéine de l’intégrase (voir Figure I) ou la protéine « Coat » du phage PP7 (voir Figure XXXVII). Le plasmide d’encapsidation p8.74, porteur du gène pol codant pour la protéine de l’intégrase, est modifié afin d’insérer la séquence codant la protéine Coat en C-terminal de l’intégrase par PCR d’assemblage. Le plasmide p8.74 est linéarisé par PCR puis la séquence Coat, préalablement amplifiée par PCR, est clonée au niveau C-terminal de l’intégrase, soit directement bout-à-bout soit avec l’ajout un linker.

Avantageusement :

La protéine d’enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine d’enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.

La séquence d’encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de MS2 et/ou de PP7, selon le domaine de liaison introduit, préférentiellement, de 2 à 18 répétitions, plus préférentiellement de 2 à 18 répétitions, tel que de 6 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore pour la séquence tige-boucle de MS2, de 10 à 14, par exemple 12 répétitions.

Préférentiellement, la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N°1) lorsque le domaine de liaison est la protéine Coat de MS2 et/ou la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N°2) lorsque le domaine de liaison est la protéine Coat de PP7.

Plusieurs exemples de particule lentivirale selon l’invention sont décrits ci-aprés, certains étant décrits de manière plus détaillée dans les exemples qui suivent : - une particule MS2RLP ou MS2 (NC)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par encapsidation d’ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 12 fois, par l’insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans la nucléocapside, - une particule MS2 (NC)-RLP 2X est une particule lentivirale formée par encapsidation d’ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 2 fois, par l’insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans la nucléocapside, - une particule MS2 (NC)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par encapsidation d’ARNs portant le motif tige boude du bactériophage MS2, répété 6 fois, par l’insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans la nucléocapside, - une particule MS2 (IN)-RLP 2X est une particule lentivirale formée par encapsidation d’ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 2 fois, par l’insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans l’intégrase, - une particule MS2 (IN)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par encapsidation d’ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 6 fois, par l’insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans l’intégrase, - une particule MS2 (IN)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par encapsidation d’ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 12 fois, par l’insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans l’intégrase, - une particule PP7 (NC)-RLP 2X est une particule lentivirale formée par encapsidation d’ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 2 fois, par l’insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans la nucléocapside, une particule PP7 (NC)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par encapsidation d’ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 6 fois, par l’insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans la nucléocapside, une particule PP7RLP ou PP7 (NC)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par encapsidation d’ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 12 fois, par l’insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans la nucléocapside, - une particule PP7 (IN)-RLP 2X est une particule lentivirale formée par encapsidation d’ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 2 fois, par l’insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans l’intégrase, - une particule PP7 (IN)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par encapsidation d’ARNs portant le motif tige boude du phage PP7, répété 6 fois, par l’insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans l’intégrase, - une particule PP7 (IN)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par encapsidation d’ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 12 fois, par l’insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans l’intégrase.

Préférentiellement, la particule lentivirale formée par encapsidation d’ARNs porte un motif tige boucle du bactériophage MS2 ou du phage PP7, répété de 2 à 25 fois, préférentiellement encore 2, 6 ou 12 fois.

Plus préférentiellement encore, la particule selon l’invention est choisie parmi MS2 (NC)-RLP 12X, PP7 (NC)-RLP 6X, PP7 (NC)-RLP 2X, MS2 (IN)-RLP 12X, PP7 (IN)-RLP 6X et PP7 (IN)-RLP 2X. L’invention concerne également des compositions comportant des particules selon l’invention.

Plus particulièrement, les compositions selon l’invention sont des compositions concentrées. Avantageusement, les compositions sont également purifiées. Ces compositions peuvent être concentrées et purifiées selon le procédé décrit dans la demande WO2013/014537.

Typiquement, les compositions selon l’invention comportent moins de 30 % de contaminants ADN et moins de 45% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut. Plus particuliérement, les compositions selon l’invention comportent moins de 30 % de contaminants ADN et moins de 2% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut.

Par « surnageant brut », on vise le surnageant de culture(s) cellulaire(s), comportant des particules rétrovirales selon l’invention, après clarification. Une telle étape de clarification est plus particulièrement décrite ci-après dans les procédés de fabrication des particules selon l’invention. Lorsque la récupération du surnageant est effectué en plusieurs fois, le surnageant brut correspond alors à l’ensemble des surnageants collectés, réunis (ou « poolés ») puis clarifié.

Optionnellement, les compositions selon l’invention comportent moins de 1 % de contaminants ADN et moins de 1% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut. L’invention se rapporte aussi à des kits de production de particules selon l’invention et aux procédés de fabrication de ces kits.

Plus particulièrement, l’invention concerne un kit de production de particules selon l’invention, comportant : (i) un plasmide d’expression comportant au moins une séquence d’intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d’encapsidation, (ii) un plasmide d’encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase, chimérique, comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d’encapsidation, et, (iii) un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe.

Un tel kit peut également comporter une notice d’utilisation des plasmides contenus dans le kit.

Plus spécifiquement, lorsque le kit vise à produire des particules selon le premier mode de réalisation, ce kit comporte : (i) un plasmide d’expression comportant au moins deux séquences d’ARN non virales différentes, chaque séquence d’ARN comportant une séquence d’intérêt pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence d’intérêt est insérée une séquence d’encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d’expression comportant chacun une séquence d’intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d’encapsidation, (ii) un plasmide d’encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d’encapsidation, et, (iii) un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe.

Les au moins deux séquences d’ARN non virales sont différentes parce que les séquences d’intérêt sont différentes et/ou les séquences d’encapsidation sont différentes.

Préférentiellement, le kit produisant des particules selon le premier mode de réalisation comporte : (i) un plasmide d’expression comportant au moins deux séquences d’intérêt, pour lesquelles en amont ou en aval de chacune de ces séquences est insérée une séquence d’encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d’expression comportant chacun une séquence d’intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d’encapsidation, les séquences d’intérêt étant différentes et les séquences d’encapsidation étant identiques, (ii) un plasmide d’encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d’encapsidation, et, (iii) un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe. Avantageusement, le kit produit des particules lentivirales.

Préférentiellement : - Dans le plasmide d’expression, la séquence d’encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de MS2, préférentiellement de 6 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore de 10 à 14, par exemple 12 répétitions. Avantageusement, la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N“1). - Dans le plasmide d’encapsidation, la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, laquelle NC est mutée au niveau du second doigt de zinc afin d’insérer la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage MS2. - Dans le plasmide d’enveloppe, la protéine d’enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine d’enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.

Ou, préférentiellement ; - Dans le plasmide d’expression, la séquence d’encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de PP7, préférentiellement, de 2 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore de 2 à 12, par exemple 6 répétitions. Avantageusement, la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N°2).

Dans le plasmide d’encapsidation, la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, laquelle NC est mutée au niveau du second doigt de zinc afin d’insérer la séquence de la protéine « Coat » du phage PP7.

Dans le plasmide d’enveloppe, la protéine d’enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine d’enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire. Optionnellement, le kit comporte un second plasmide d’encapsidation codant pour une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d’encapsidation. Le second domaine de liaison peut être identique ou différent du domaine de liaison de la protéine de nucléocapside chimérique. A titre d’exemple de domaines de liaison différents : le domaine de liaison introduit dans la nucléocapside peut être la protéine Coat de MS2 et le domaine de liaison introduit dans l’intégrase peut être la protéine Coat de PP7, ou le domaine de liaison introduit dans la nucléocapside peut être la protéine Coat de PP7 et le domaine de liaison introduit dans l’intégrase peut être la protéine Coat de MS2.

Plusieurs domaines de liaison peuvent être introduits dans chacune des protéines chimériques.

Alternativement, lorsque le kit vise à produire des particules selon le second mode de réalisation, ce kit comporte : (i) un plasmide d’expression comportant au moins une séquence d’intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d’encapsidation, (ii) un plasmide d’encapsidation codant pour une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d’encapsidation, et, (iii) un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe.

Des procédés de fabrication des kits selon l’invention sont également proposés. Typiquement, un procédé de fabrication d’un kit selon l’invention comporte : (i) la préparation d’un plasmide d’expression comportant au moins une séquence d’intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d’encapsidation (il) la préparation d’un plasmide d’encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase, chimérique, comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d’encapsidation, et (iii) la préparation d’un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe.

Plus spécifiquement, lorsque le procédé concerne un kit qui vise à produire des particules selon le premier mode de réalisation, il comporte : (i) la préparation d’un plasmide d’expression comportant au moins deux séquences d’ARN non virales différentes, chaque séquence d’ARN comportant une séquence d’intérêt pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence d’intérêt est insérée une séquence d’encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d’expression comportant chacun une séquence d’intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d’encapsidation, (ii) la préparation d’un plasmide d’encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d’encapsidation, et, (iii) la préparation d’un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe.

Les au moins deux séquences d’ARN non virales sont différentes parce que les séquences d’intérêt sont différentes et/ou les séquences d’encapsidation sont différentes.

Préférentiellement, ce procédé comporte : (i) la préparation d’un plasmide d’expression comportant au moins deux séquences d’intérêt, pour lesquelles en amont ou en aval de chacune de ces séquences est insérée une séquence d’encapsidation, ou alternativement d’un premier et d’un second plasmide d’expression comportant chacun une séquence d’intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d’encapsidation, les séquences d’intérêt étant différentes et les séquences d’encapsidation étant identiques, (ii) la préparation d’un plasmide d’encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d’encapsidation, et (iii) la préparation d’un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe.

Alternativement, lorsque le procédé concerne un kit qui vise à produire des particules selon le second mode de réalisation, ce procédé comporte : (i) la préparation d’un plasmide d’expression comportant au moins une séquence d’intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d’encapsidation, (ii) la préparation d’un plasmide d’encapsidation codant pour une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d’encapsidation, et, (iii) la préparation d’un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe. L’invention se rapporte également à des procédés de fabrication des particules selon l’invention.

Un tel procédé comporte une étape de co-transfection de cellules avec : (i) un plasmide d’expression comportant au moins une séquence d’intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d’encapsidation, (ii) un plasmide d’encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d’encapsidation, et, (iii) un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe. et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.

Les cellules mises en œuvre dans les procédés de fabrication de particules selon l’invention sont des cellules productrices, c’est-à-dire des cellules, qui une fois transfectées avec les plasmides portant le matériel génétique nécessaire à la formation des particules rétrovirales, permettent la formation desdites particules. A titre d’exemple de cellules productrices, on peut citer HEK293T.

Par « étape de co-transfection », on entend une étape de transfection lors de laquelle la transfection est effectuée par mise en contact des cellules productrices avec l’ensemble des plasmides du procédé de fabrication des particules.

Plus spécifiquement, lorsque le procédé de fabrication vise à produire des particules selon le premier mode de réalisation, il comporte une étape de co-transfection de cellules avec : (i) un plasmide d’expression comportant au moins deux séquences d’ARN non virales différentes, chaque séquence d’ARN comportant une séquence d’intérêt pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence d’intérêt est insérée une séquence d’encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d’expression comportant chacun une séquence d’intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d’encapsidation, (ii) un plasmide d’encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d’encapsidation, et, (iii) un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe, et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.

Les au moins deux séquences d’ARN non virales sont différentes parce que les séquences d’intérêt sont différentes et/ou les séquences d’encapsidation sont différentes.

Préférentiellement, ce procédé de fabrication de particules comporte une étape de co-transfection de cellules avec : (i) un plasmide d’expression comportant au moins deux séquences d’intérêt, pour lesquelles en amont ou en aval de chacune de ces séquences est insérée une séquence d’encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d’expression comportant chacun une séquence d’intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d’encapsidation, les séquences d’intérêt étant différentes et les séquences d’encapsidation étant identiques, (ii) un plasmide d’encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d’encapsidation, et, (iii) un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe, et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.

Alternativement, lorsque le procédé de fabrication vise à produire des particules selon le second mode de réalisation, ce procédé comporte une étape de co-transfection de cellules avec : (i) un plasmide d’expression comportant au moins une séquence d’intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d’encapsidation, (ii) un plasmide d’encapsidation codant pour une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d’encapsidation, et, (iii) un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe, et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.

Préférentiellement, tous les procédés de fabrication de particules selon l’invention sont réalisés conformément aux procédés décrits dans la demande WO2013/014537.

Plus particulièrement, ces procédés de fabrication de particules sont réalisés sur des cellules productrices cultivées en milieu sans sérum et aucune induction au sodium butyrate n’est effectuée.

Avantageusement, le surnageant est collecté en plusieurs fois, par exemple entre 3 et 6 fois, à des intervalles de temps spécifiques, tels qu’à des intervalles de temps de l’ordre de la demi vie des particules rétrovirales. Typiquement, la récupération du surnageant est effectuée en 4 à 5 fois, à des intervalles de temps de l'ordre de 6 à 18h, préférentiellement de 8 à 16h, tels que 8h, 12h et/ou 16h. Préférentiellement, cette collecte est effectuée après changement du milieu de culture des cellules, ce changement étant effectué préférentiellement à 24h post-transfection.

Les procédés de fabrication de particules selon l’invention comportent également une étape dans laquelle le surnageant est clarifié.

Préférentiellement, la clarification du surnageant est effectuée par centrifugation.

Plus préférentiellement encore, ces procédés de fabrication de particules selon l’invention comportent en outre une étape dans laquelle le surnageant est concentré et/ou purifié.

De préférence, la concentration et purification est effectuée par ultrafiltration frontale sur des unités de centrifugation.

Avantageusement, le surnageant subit une ou plusieurs étapes supplémentaires de purification. Ces étapes de purification sont effectuées de préférence par ultrafiltration tangentielle et/ou diafiltration. Plus préférentiellement encore, le surnageant subit une étape d’ultrafiltration tangentielle suivie d’une étape de diafiltration. L’ultrafiltration tangentielle est avantageusement effectuée sur des cartouches de fibres creuses en polysulfone.

Optionnellement, la composition peut ensuite subir une étape de chromatographie par échange d’ions, en particulier une chromatographie par échange d’anions. L’éluât issu de cette étape de chromatographie est ensuite récupéré puis concentré à nouveau par ultrafiltration frontale sur des unités centrales de centrifugation. Une composition résultant d’un tel procédé comporte moins de 1 % de contaminants ADN et moins de 1% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut. L’invention concerne également des compositions susceptibles d’être obtenues par l’un quelconque des procédés de fabrication de particules selon l’invention.

Typiquement, ces compositions comportent moins de 30 % de contaminants ADN et moins de 45% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut. Plus particulièrement, les compositions selon l’invention comportent moins de 30 % de contaminants ADN et moins de 2% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut.

Optionnellement, les compositions selon l’invention comportent moins de 1 % de contaminants ADN et moins de 1% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut.

Enfin, l’invention concerne l’utilisation d’une particule selon l’invention, ou d’une composition selon l’invention pour transduire des cellules, et notamment des cellules impliquées dans la réponse immune. L’utilisation des particules et des compositions selon l’invention est particulièrement avantageuse pour transduire des cellules primaires et des lignées immortalisées, afin de les modifier de façon transitoire. Les cellules peuvent être des cellules de mammifères ou d’autres eucaryotes. En particulier, la transduction de ces cellules peut être effectuée in vivo, in vitro ou ex vivo.

Les cellules impliquées dans la réponse immune sont notamment les cellules présentatrices d’antigène (CPA) et les cellules du système immunitaire. Plus particulièrement il s’agit des monocytes (les cellules dendritiques, les macrophages), les lymphocytes T ou B, les Naturel Killers et les cellules souches hématopoïétiques.

Ces particules ou compositions peuvent être qualifiés de « vaccins » et ont pour but d’induire des cellules T effectrices spécifiques de cancer ou de virus pour diminuer la taille de tumeurs ou éradiquer un développement viral et aussi pour induire des cellules T mémoires qui pourront éviter la perte de contrôle sur la tumeur ou le virus.

Introduire des acides nucléiques multiples et hétérogènes dans une cellule cible est en enjeu majeur en recherche & développement comme en thérapie pour des applications in vitro, ex vivo et in vivo. L’invention sera mieux comprise au vu des exemples qui suivent donnés à titre illustratif, avec référence aux figures, qui représentent respectivement ;

La figure I est de constructions de piasmide d’expression portant comme séquence d’ARN d’intérêt, un rapporteur fluorescent, ce piasmide d’expression étant utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l’invention ;

La figure II présente un schéma de construction d’un piasmide d’encapsidation lentiviral p8.74 dans lequel un domaine de liaison MS2 Coat a été introduit dans la séquence de nucléocapside, ce piasmide d’encapsidation étant utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l’invention ;

La figure III est un schéma de construction d’un piasmide d’enveloppe ;

La figure IV présente trois schémas de construction de piasmide d’expression lentiviral intégratif portant comme séquence d’intérêt la luciférase (IVa), un gène fluorescent (IVb) ou Cre (IVc) ;

La figure V est un schéma de construction du piasmide d’encapsidation p8.74 utilisé pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ;

La figure Via est un diagramme illustrant l’efficacité de la transduction de lymphocytes humains avec une particule selon l’invention ;

La figure VIb est un diagramme illustrant l’efficacité de la transduction de lymphocytes humains avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;

La figure Vlla est un diagramme illustrant l’efficacité de la transduction de lymphocytes murins avec une particule selon l’invention ;

La figure Vllb est un diagramme illustrant l’efficacité de la transduction de lymphocytes murins avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;

La figure Villa est un diagramme illustrant l’efficacité de la transduction de cellules dendritiques humaines immatures avec une particule selon l’invention ;

La figure Vlllb est un diagramme illustrant l’efficacité de la transduction de cellules dendritiques humaines immatures avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;

La figure Ville illustre la cinétique d’expression de la ZsGreen dans des cellules dendritiques humaines immatures transduites avec une particule selon l’invention ;

La figure Vllld illustre la cinétique d’expression de la ZsGreen dans des cellules dendritiques humaines immatures transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;

La figure Ville est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules dendritiques humaines immatures transduites avec une particule selon l’invention ;

La figure Vlllf est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules dendritiques humaines immatures transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;

La figure IXa est un diagramme illustrant l’efficacité de la transduction de cellules dendritiques humaines matures avec une particule selon l’invention ;

La figure IXb est un diagramme illustrant l’efficacité de la transduction de cellules dendritiques humaines matures avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;

La figure IXc est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules dendritiques humaines matures transduites avec une particule selon l’invention ;

La figure IXd est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules dendritiques humaines matures transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;

La figure Xa est un diagramme illustrant l’efficacité de la transduction de cellules dendritiques issues de la moelle osseuse de souris (BMDC) avec une particule selon l’invention ;

La figure Xb est un diagramme illustrant l’efficacité de la transduction de cellules BMDC avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;

La figure Xc illustre la cinétique d’expression de la ZsGreen dans des cellules BMDC transduites avec une particule selon l’invention ;

La figure Xd illustre la cinétique d’expression de la ZsGreen dans des cellules BMDC transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;

La figure Xe est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules BMDC transduites avec une particule selon l’invention ;

La figure Xf est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules BMDC transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;

La figure Xla est un schéma de construction de plasmide d’expression portant comme séquence d’ARN d’intérêt, une séquence antigénique complète codant pour l’antigène MAGE A3, ce plasmide d’expression étant utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l’invention ;

La figure XIb est un schéma de construction de plasmide d’expression portant comme séquence d’ARN d’intérêt, une séquence antigénique partielle codant pour l’antigène MAGE A3, ce plasmide d’expression étant utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l’invention ;

La figure Xlc est un schéma de construction de plasmide d’expression portant comme séquence d’ARN d’intérêt, une séquence antigénique partielle codant pour l’antigène gp100, ce plasmide d’expression étant utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l’invention ;

La figure Xld est un schéma de construction de plasmide d’expression portant comme séquence d’ARN d’intérêt, une séquence antigénique partielle codant pour la tyrosinase, ce plasmide d’expression étant utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l’invention ;

La figure Xlla est un schéma de construction de plasmide d’expression portant comme séquence d’ARN d’intérêt, une séquence antigénique complète codant pour l’antigène MAGE A3, ce plasmide d’expression étant utilisé pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ; - La figure XIIb est un schéma de construction de plasmide d’expression portant comme séquence d’ARN d’intérêt, une séquence antigénique partielle codant pour l’antigène MAGE A3, ce plasmide d’expression étant utilisé pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ;

La figure Xllc est un schéma de construction de plasmide d’expression portant comme séquence d’ARN d’intérêt, une séquence antigénique partielle codant pour l’antigène gp100, ce plasmide d’expression étant utilisé pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ;

La figure Xlld est un schéma de construction de plasmide d’expression portant comme séquence d’ARN d’intérêt, une séquence antigénique partielle codant pour la tyrosinase, ce plasmide d’expression étant utilisé pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ; - La figure Xllla est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules BMDC transduites avec une particule selon l’invention comportant des ARN codant pour l’antigène MAGE A3 ; - La figure Xlilb est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules BMDC transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) comportant un ARN codant pour l’antigène MAGE A3 ; - La figure XIV est un diagramme illustrant le suivi de la croissance tumorale induite par des cellules Renca exprimant MAGE A3 chez la souris ; - La figure XV présente le schéma du plasmide d’expression portant comme séquence d’ARN d’intérêt la Luciférase utilisé pour la production de particules lentivirales PP7RLP, comprenant le motif tige-boucle PP7 répété 12 fois, selon l’invention ;

La figure XVI présente un schéma de la modification du plasmide d’encapsidation lentiviral p8.74 afin d’insérer un domaine de liaison dans la séquence de l’Intégrase ; et

La figure XVII présente un schéma du plasmide d’encapsidation utilisé pour la production de particules lentivirales PP7 (IN)-RLP selon l’invention, obtenu par la modification du plasmide d’encapsidation lentiviral p8.74 présenté Figure XVI.

Dans les exemples qui suivent, l'ensemble des tests de transduction sont réalisés avec des vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ou avec des particules lentivirales porteuses d'ARN (RLP) porteurs de matériel génétique codant pour une protéine fluorescente. Les particules RLP étant non intégratives, le titre des lots est déterminé en particules physiques par millilitre (PP/ml) alors que pour les vecteurs lentiviraux intégratifs le titre est classiquement exprimé en unités de transduction par millilitre (TU/ml). Ainsi la multiplicité d'infection (MOI) avec les particules RLP est exprimée en PP ou pg de protéine p24 par cellule et la MOI avec les vecteurs ILV est exprimée en TU/ml. Les tests de transduction sont réalisés pour chaque type de vecteurs en prenant soin de ne pas se placer dans des conditions saturantes et de privilégier des conditions permettant de visualiser un effet dose pour chaque type de particules. Il est important de rappeler que les deux types de produits RLP et ILV sont produits sans sérum et de de façon à minimiser la production de protéines toxiques dans le surnageant en privilégiant des récupérations séquentielles des virions. Une fois clarifiés les surnageants sont concentrés et purifiés par ultrafiltration tangentielle de façon à obtenir une grande pureté. EXEMPLE 1 : Transduction de cellules du système immunitaire par la particule virale selon l’invention et comparaison de l’efficacité de transduction avec d’autres systèmes I. Préparation de la particule virale selon l’invention et des systèmes comparatifs 1. Constructions des plasmides 1.1 Plasmides pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l’invention • Plasmide d’expression d’une séquence d’intérêt : Le plasmide d’expression est porteur d’une cassette d’expression promoteur-séquence d’intérêt-polyA avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d’ARN. Afin de véhiculer les ARNm dans les particules lentivirales, 12 répétitions du motif tige-boucle de l’ARN MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N°1) ont été insérées au sein d’une cassette d’expression en aval du gène rapporteur. Le promoteur utilisé peut être celui du CMV ou EF1 mais d’autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence d’intérêt peut être un ADN codant une protéine reportrice comme la luciférase Firefly native, une protéine fluorescente verte (ZsGreenll), rouge (mCherry) ou bleue (mtBFP) (Figure I). La séquence d’intérêt peut également être celle d’un ADNc, d’un shRNA, d’un miRNA, d’un sgRNA, d’un LncRNA ou d’un circRNA. • Plasmide d’encapsidation : La particule ientivirale a été modifiée pour contenir au sein de la protéine de nucléocapside, en lieu et place du second domaine en doigt de Zn, la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage MS2. Le plasmide d’encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Poi), utilisé pour la production des particules MS2RLP est modifié selon la stratégie suivante : ce plasmide p8.74 est utilisé pour générer, par PCR d’assemblage, un plasmide dépourvu du second doigt de zinc de la protéine de nucléocapside ρ8.74ΔΖΡ. Le second doigt de zinc est substitué par la protéine Coat du phage MS2 par clonage Hpal, pour générer le plasmide p8.74AZF-MS2-Coat (Figure II). La séquence codant Poi peut être délétée ou mutée dans certains éléments de fonction comme par exemple la séquence codant la transcriptase inverse (RT) ou l’intégrase (IN) sans altérer la fonction des MS2RLP. • Plasmide de l’enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant une protéine d’enveloppe, qui peut être par exemple la séquence du gène VSVG codant la protéine d’enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (Figure III).

1.2 Plasmides pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs ILV • Plasmide d’expression d’une séquence d’intérêt : Le plasmide d’expression est porteur d’une cassette d’expression promoteur-séquence d’intérêt. La séquence du gène d’intérêt peut être par exemple celle de la luciférase (Figure Iva), d’un rapporteur fluorescent (Figure iVb) ou de la CRE recombinase (Figure IVc). Ce plasmide peut contenir d’autres éléments comme la séquence native WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Elément) ou encore la séquence cPPT/CTS. La pathogénicité virale est éliminée par la substitution de régions du génome virai requises pour la réplication rétrovirale par le transgéne. • Plasmide d’encapsidation : Le plasmide d’encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol) est utilisé pour la production des vecteurs lentiviraux intégratifs (Figure V). • Plasmide de l’enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant une protéine d’enveloppe, qui peut être par exemple la séquence du gène VSVG codant la protéine d’enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (Figure III). 2. Productions des lots

Après la transfection des plasmides sur des cellules, les surnageants sont récoltés et utilisés bruts ou concentrés/purifiés selon le procédé décrit dans la demande WO 2013/014537. 2.1 Production des vecteurs lentiviraux et particules lentivirales

Les productions sont réalisées en CellSTACK 10 étages (6360 cm^, Corning) avec des cellules HEK293T (ATCC, CRL-11268), cultivées dans Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco, Paisley, UK) supplémenté par 1% penicillin/streptomycin et 1% d’ultraglutamine (PAA) à 37°C en atmosphère humide à 5% CO2. Pour l’expérience d’étude de l’impact du sérum, le DMEM est supplémenté avec 10% de SVF. En particulier, aucune induction au sodium butyrate n’est effectuée. Pour chaque lot (MS2RLP et ILV), le mélange de transfection est composé des trois plasmides suivants :

Un des plasmides d’expression décrit ci-avant, selon que l’on forme une particule (MS2RLP) ou un vecteur ILV, - Ρ8.74ΔΖΕ Coat (MS2RLP), p8.74 (ILV) et pENV portant l’enveloppe VSV-G. 24 heures après transfection standard au phosphate de calcium, le surnageant de culture est remplacé par du milieu DMEM frais et non supplémenté. Les cellules sont incubées à 37°C / 5% C02. Après changement du milieu, le surnageant est collecté quatre fois (32h, 48h, 56h et 72h post transfection). Chaque récupération est clarifiée par centrifugation 5min à 3000g avant d’être microfiltrée sur filtre de 0,45pm (Stericup, Millipore). Toutes les récupérations sont alors mélangées pour composer le surnageant brut. 2.2 Concentration et purification des vecteurs lentiviraux et particules lentivirales Les vecteurs et particules sont concentrés et purifiés selon l’une des deux procédés ci-après : • Le procédé PI vise à réaliser une ultrafiltration frontale du surnageant sur des unités centrales de centrifugation. • Le procédé P2 vise à réaliser une ultrafiltration tangentieile puis une diafiltration du surnageant. Le surnageant brut est concentré et purifié par ultrafiltration tangentieile via l’utilisation de cartouches de fibres creuses en polysulfone. Le surnageant est traité par diafiltration pour 20 diavolumes en mode continu contre du tampon DMEM ou TSSM. Après la diafiltration, le rétentat est récupéré puis concentré à nouveau par ultrafiltration frontale sur des unités centrales de centrifugation. 3. Titration

3.1 Titration des particules fonctionnelles par aPCR

Les cellules HCT116 (ATCC, CCL-247) sont ensemencées en plaque 96 puits dans lOOpL de DMEM supplémenté de 10% SVF, 100 pg/mL Stretomycin, 100 U/mL Penicillin et 2mM L-GIn puis incubées 24h à 37°C / 5% C02. Six dilutions sériées sont réalisées pour chaque vecteur ainsi que pour un étalon interne. Les cellules sont transduites par ces dilutions sériées en présence de Polybrene® 8pg/mL (Sigma) puis incubées trois jours à 37°C / 5% C02. Pour chaque série d’échantillons, un puits de cellules non transduites est rajouté en contrôle. Les cellules sont ensuite trypsinées et le titre (Unité de Transduction/mL) est déterminé par qPCR après extraction de l’ADN génomique en utilisant le Nucleospin tissue gDNA extraction kit (Macherey-Nagei). Le titre obtenu (TU/mL) par qPCR est normalisé par l’étalon interne dont le titre a été précédemment déterminé par FACS. 3.2 Quantification des particules physiques par test ELISA P24

La protéine de capside p24 est détectée directement sur le surnageant viral en utilisant et en suivant les recommandations du kit HIV-1 p24 ELISA kit (Perkin Elmer). La protéine p24 capturée est complexée avec un anticorps polyclonal biotinylé, puis détectée par une streptavidine conjuguée à la péroxydase MRP. Le complexe résultant est détecté par spectrophotométrie après incubation avec le substrat ortho-phenylenediamine-HCI (OPD) produisant une coloration jaune qui est directement proportionnelle à la quantité de protéine p24 capturée. L’absorbance de chaque puits est quantifiée au lecteur de plaque Synergy H1 Hybrid (Biotek) et calibrée contre l’absorbance d’une gamme étalon de protéine p24. Le titre viral exprimé en particules physiques par mL est calculé à partir de la concentration de protéine p24 obtenue sachant que 1pg de protéine p24 correspond à 104 particules physiques. II. Transduction de cellules du système immunitaire 1. Cellules lymphocytaires 1.1 Préparation des cellules lymphocytaires humaines

Les lymphocytes humains totaux sont préparés à partir de sang total humain par isolation des cellules mononucléaires périphériques ou PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) sur gradient de Ficoil. Le prélèvement de sang est récupéré à température ambiante et dilué au avec du PBS IX pH 7,4 dans un tube adéquat (15 ou 50 ml). 1 volume de solution de Ficoli (GE Healthcare) est déposé délicatement sous 2 volumes de sang dilué, il est important d’obtenir 2 phases distinctes non mixées ; Une phase inférieure correspondant au Ficoil et une phase supérieure correspondant au sang dilué. Le tube est centrifugé 30 minutes à 400g à température ambiante. Le frein de la centrifugeuse est arrêté pour éviter de perturber les différentes phases obtenues après centrifugation.

La phase supérieure correspond au plasma, la phase inférieure correspond au Ficoll et un anneau s’est formé entre ces deux phases, qui contient la population d’intérêt (PBMC). L’anneau de PBMC est pipeté délicatement et transféré dans un nouveau tube. Les PBMC sont ensuite lavées 2 fois avec au moins 3 volumes de solution de P BS 1X pH 7,4. Les cellules sont centrifugées 10 minutes à 100g à température ambiante.

Une fois le surnageant retiré, les PBMC sont resuspendues dans un milieu de culture RPMI, 10 % Sérum de Veau Fœtal, 2mM L-Glutamine, 1% Pénicilline/Streptomycine et numérées.

Les cellules sont resuspendues à une concentration de 1.10e6 cellules par ml et sont déposées sur un support de culture en plastique pendant 2h à 37°C / 5% C02. Cette étape permet aux cellules monocytaires d’adhérer au plastique alors que les lymphocytes restent en suspension et peuvent donc être récupérés dans le surnageant des cultures avant d’être ensemencés à 1,56.10e5 cellules par cm^ en prévision de la transduction. 1.2 Préparation des cellules lymphocytaires murines

Les lymphocytes murins sont préparés à partir de rate. La rate d’une souris est récupérée après euthanasie de l’animal par dislocation cervicale. La rate est déposée dans un puits d’une plaque de culture 6 puits et gonflée par injection de 1 ml de solution de collagénase D (Roche diagnostics) à 2mg/ml avec une seringue montée d’une aiguille 26G 1/2. La rate est émincée en petits morceaux dans le puits avec un scalpel stérile dans 1 ml de solution de collagénase D à 2 mg/ml. Les 2 ml de solution contenant les éminçâts de rate sont transférés dans un tube de 15 ml et incubés 30 minutes dans un bain-marie à +37°C. La digestion enzymatique est stoppée par ajout de 13 ml de Tampon MACS froid (PBS IX pH 7.4, 0.5% SVF, 2mM EDTA) pour un volume final de 15 ml. La suspension cellulaire est filtrée sur un tamis cellulaire de 70 pm posé sur un tube de 50 ml. Le volume est complété à 30 ml avec du tampon MACS froid. La suspension cellulaire est centrifugée 10 minutes à 300 g, à +4°C.

Un tri positif sur l’expression du marqueur CD8 est ensuite réalisé. Pour cela, le surnageant est éliminé par aspiration et le culot cellulaire est repris dans 90 μΙ de tampon MACS froid et 10 μΙ de billes anti-CD8 (Miltenyi Biotec) pour 10e7 cellules. Le mélange est incubé 15 minutes à +4°C. A la fin de l’incubation, un volume de tampon MACS qsp 15 ml est rajouté à la suspension. La suspension est centrifugée 10 minutes à 300 g, à +4°C. Le surnageant est éliminé et le culot cellulaire est repris dans l’équivalent de 500 μΙ de tampon MACS froid pour lOeS cellules. La suspension est déposée sur une colonne de type MS (Miltenyi Biotec) adaptée sur un aimant et préalablement équilibrée avec du tampon MACS froid. La colonne est lavée avec 3 x 500μΙ de tampon MACS froid. La fraction négative (environ 2 ml) est complétée à 5 ml avec du tampon MACS froid puis on réalise une numération cellulaire. La suspension cellulaire est centrifugée 10 minutes à 300 g, à +4°C et les cellules resuspendues dans une plaque 6 puits type TCT (Corning) à raison de 1.10e6 cellules par ml en milieu RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Fœtal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine pour être transduites.

Après tri, les différentes fractions obtenues sont analysées par cytométrie en flux (Miltenyi Biotec) avec des marquages anticorps anti-CD8 pour contrôler la pureté des populations triées. 1.3 Transduction des lymphocytes (humains et murins)

Le jour de la transduction, les lymphocytes sont resuspendus à raison de 0,5x10® cellules par ml dans une plaque 96 puits à fond plat, traitée pour la culture cellulaire, dans un volume de 50μΙ par puits. Un milieu de transduction contenant 4pg/ml final de Polybrene® et les différents vecteurs aux MOI choisies est préparé et ajouté aux cellules dans un volume de 50 μΙ, pour un volume final de 100 μΙ par puits. La plaque est ensuite centrifugée pendant 75 minutes, à 1000g, à 30°C. Le milieu de transduction est laissé sur les cellules pendant 4 h après l'étape de centrifugation, à 37°C, 5% C02. Après cette incubation, 80% du milieu de transduction (80μΙ) est retiré et 180μΙ de milieu RPMI, 10% Sérum de Veau Fœtal, 2mM L-Glutamine, 1% Péniciline/Streptomycine est rajouté à chaque puits. Les cellules sont incubées à 37''C, 5% C02 jusqu’à l’analyse. 2. Cellules dendritiques 2.1 Préparation des cellules dendritiques humaines 2.1.1 Isolation des cellules mononucléaires périphériques (PBMC) humaines à partir de sang total humain

Les cellules dendritiques humaines sont préparées à partir de sang total humain par isolation des PBMC sur gradient de Ficoil. Le prélèvement de sang est récupéré à température ambiante et dilué au ½ avec du PBS 1X pH 7,4 dans un tube adéquat (15 ou 50 ml). 1 volume de solution de Ficoil (GE Healthcare) est déposé délicatement sous 2 volumes de sang dilué. Il est important d’obtenir 2 phases distinctes non mixées ; Une phase inférieure correspondant au Ficoil et une phase supérieure correspondant au sang dilué. Le tube est centrifugé 30 minutes à 400g à température ambiante. Le frein de la centrifugeuse est arrêté pour éviter de perturber les différentes phases obtenues après centrifugation.

La phase supérieure correspond au plasma, la phase inférieure correspond au Ficoil, et un anneau s’est formé entre ces deux phases, qui contient la population d’intérêt (PBMC). L’anneau de PBMC est pipeté délicatement et transféré dans un nouveau tube. Les PBMC sont ensuite lavées 2 fois avec au moins 3 volumes de solution de PBS IX pH 7,4. Les cellules sont centrifugées 10 minutes à 100g à température ambiante.

Une fois le surnageant retiré, les PBMC sont resuspendues dans un milieu de culture SFM, 2mM L-Glutamine, 1% Pénici11ine/Streptomycine et numérées.

Les cellules sont resuspendues à une concentration de 1.10e6 cellules par ml (2,5.10e6 cellules par cm2) et sont déposés en plaque 48 puits type TCT (Corning) pendant 2h à 37°C / 5% C02. Cette étape permet aux cellules monocytaires d’adhérer au plastique alors que les lymphocytes restent en suspension. Après 2h d’incubation la plaque est lavée avec du PBS1X afin de ne garder que les monocytes en culture, qui vont être transduits. 2.1.2 Différenciation de la population des monocytes en cellules dendritiques

Les cellules dendritiques sont cultivées dans une plaque 48 puits type TCT (Corning) à raison de1.10e6 cellules par ml en milieu SFM supplémenté 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, 200 nM IL4 humain et 50 mM GM-CSF humain. Ces conditions de culture permettent d’obtenir des cellules dendritiques de phénotype immature (iDC). Les cellules dendritiques sont laissées en culture pendant 5 jours à 37°C / 5% C02 avec un renouvellement du milieu de culture le troisième jour.

Pour obtenir des cellules dendritiques matures (mDC), au troisième jour de culture les cellules sont mises dans un milieu de maturation contenant 0.1 pg/ml de LPS. 2.2 Préparation des cellules dendritiques murines

Les cellules dendritiques (DC) murines sont préparées à partir de moelle osseuse issue des membres inférieurs (culture de BMDC). Les os longs que sont les fémurs et les tibias sont récupérés à partir de souris adultes et transférés dans un tube de 50 ml contenant du milieu RPMI 1640 supplémenté 1% Pénicilline/Streptomycine. Les os sont vidés de leur moelle à l’aide d’une seringue portant une aiguille 26G ½ et contenant du milieu RPMI 1640 supplémenté 1% Pénicilline/Streptomycine. La suspension cellulaire est centrifugée 5 minutes 300 g, +4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans 1 ml de milieu RPMI 1640 supplémenté 1% Pénicilline/Streptomycine + 3 ml de solution de Gey’s (155 mM NH4CI, 1 mM KHC03). La suspension est incubée 5 minutes à température ambiante afin de lyser des globules rouges contenus dans la suspension cellulaire. Après l’incubation, le volume est ajusté à 15 ml avec du milieu RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine pour stopper la réaction et la suspension cellulaire est centrifugée 5 minutes 300 g, +4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans un volume de milieu RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Foetal, 1% Pénici11ine/Streptomycine, 2mM L-Glutamine. Cette suspension cellulaire est filtrée sur un tamis cellulaire de 70 pm posé sur un tube de 50 ml. Le tamis est rincé jusqu’à obtenir un volume final d’environ 30 ml. Les cellules sont comptées et la suspension cellulaire est centrifugée 5 minutes 300 g. Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans volume de milieu RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Fœtal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, 50μΜ 2-MercaptoEthanol, 25nM IL4 murine et 25 mM GM-CSF murine, permettant d’obtenir une concentration cellulaire de 1.10e6 cellules par ml. Les cellules dendritiques sont mises en culture dans une plaque 6 puits type TCT (Corning) à raison de 1.10e6 cellules par ml. Les cellules dendritiques sont laissées en culture pendant 5 jours à 37°C / 5% C02 avec un renouvellement du milieu de culture tous les 2-3 jours. 2.3 Transduction des cellules dendritiques humaines

Le jour correspondant à l’isolation des PBMC, les cellules sont transduites en milieu de culture SFM, 2mM L-Glutamine, 1% Pénicilline/Streptomycine avec les agents de transfection suivant: Polybrene® à 8pg/mL (Sigma) et BX795 12μΜ (Invivogen) et incubées à +37°C / 5% C02. 4h après la transduction, le milieu de transduction est remplacé par le milieu de différenciation spécifique aux cellules dendritiques (SFM, 2mM L-Glutamine, 1% Pénicilline/Streptomycine, 200 nM IL4 humaine et 50 mM GM-CSF humaine). Ce milieu permet la culture des cellules dendritiques immatures (iDC). Les cellules sont transduites 4h post-ensemencement par les différents vecteurs (RLP ou ILV) pour établir une mise au point de transduction sur la cassette EF1 .ZsGreenI.

Les cellules transduites sont analysées à différents temps (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction).

Pour obtenir des cellules dendritiques matures (mDC), les cellules sont mises dans un milieu de maturation contenant 0.1 pg/ml de LPS au troisième jour de culture et elles sont analysées au jour 4.

2.3.1 Transduction des cellules dendritiques humaines par RLP.ZsGreenI

Les cellules dendritiques transduites par le vecteur RLP.ZsGreenI ont fait l’objet d’une mise au point liée à la caractérisation de l’expression de la fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules RLP allant de 1 pg p24 à 4 pg p24 et à différents temps d’analyse (1,2, 3 et 4 jours posttransduction pour les iDC et 5 jours post-transduction pour les mDC). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec uniquement le milieu contenant les agents de transduction Polybrene® à 8pg/mL (Sigma) et BX795 12μΜ (Invivogen).

Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des anticorps spécifiques anti-CDIIc, anti-CD209 DC SIGN, anti-CD86 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux.

2.3.2 Transduction des cellules dendritiques humaines par ILV.EF1.ZsGreenI

Les cellules dendritiques transduites par le vecteur ILV.EF1.ZsGreenI ont fait l’objet d’une mise au point liée à la caractérisation de l’expression de la fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules lentiviraies ILV allant d’une multiplicité de d’infection MOI de 25 à 75 et à différents temps d’analyse (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction pour les iDC et 4é jour post-transduction pour les mDC). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec le milieu contenant uniquement les agents de transduction Polybrene® à 8pg/mL (Sigma) et BX795 12μΜ (Invivogen).

Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des anticorps spécifiques anti-CDIIc, anti-CD209 DC SIGN, anti-CD86 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux. 2.4 Transduction des cellules dendritiques murines (BMDC) 5 jours après la mise en culture, les cellules dendritiques sont récupérées par grattage du fond du puits avec un grattoir et centrifugées 5 min à 300 g. Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans 1 ml de RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Fœtal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, et centrifugées 5 min à 300 g. Les cellules dendritiques sont ensemencées à 0,5.10e6 cellules/ml en plaque 96 puits ou 24 puits en RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Fœtal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, 50μΜ 2-MercaptoEthanol, 25nM IL4 murine et 25 mM GM-CSF murine. Les cellules sont transduites 24h post-ensemencement par les différents vecteurs (RLP ou ILV) pour établir une mise au point de transduction grâce à l’expression de la fluorescence ZsGreenl. Les transductions se font en présence de Polybrene® 4pg/mL (Sigma), suivi d’une spinoculation de la plaque à 1000 g pendant 75 minutes à +30°C. Le milieu de transduction est ensuite laissé pendant 4h à +37°C / 5% C02.

Après l’incubation 80% du milieu de transduction est éliminé par pipetage et remplacé par un volume équivalent de RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Fœtal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, 50μΜ 2-MercaptoEthanol, 25nM IL4 murine et 25 mM GM-CSF murine préchauffé. Les cellules sont ensuite remises à 37°C / 5% C02.

2.4.1 Transduction des cellules dendritiques murines par RLP.ZsGreenI

Les cellules dendritiques transduites par le vecteur RLP.ZsGreenI ont fait l’objet d’une mise au point liée à la caractérisation de l’expression de la fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules RLP allant de 0,1 pg p24 à 5 pg p24 et à différents temps d’analyse (1, 2, 3 et 4 jours posttransduction). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec uniquement le milieu contenant l’agent de transduction Polybrene® à 4pg/mL (Sigma).

Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des anticorps spécifiques anti-CDIIc, anti-CD86, anti-CD80, anti-H2k(d), anti-CMH classe Il et anti-CD40 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux. 2.4.2 Transduction des cellules dendritiques murines par ILV.EF1.ZsGreenl

Les cellules dendritiques transduites par le vecteur ILV.EF1.ZsGreenl ont fait l’objet d’une mise au point liée à la caractérisation de l’expression de la fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules lentivirales ILV allant d’une multiplicité de d’infection MOI de 5 à 75 et à différents temps d’analyse (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec uniquement le milieu contenant l’agent de transduction Polybrene® à 4pg/mL (Sigma).

Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-CD86, anti-CD80, anti-H2k(d), anti-CMH classe Il et anti-CD40 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux. 3. Phénotypage et caractérisation des cellules 3.1 Immunomarquage des cellules lymphocytaires

Après tri ou bien aux différents temps d’analyse après transduction les lymphocytes sont récupérés des plaques de culture dans lesquels ils sont en suspension et les cellules sont transférées dans les puits d’une plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une solution de P BS IX pH 7.4, 5% SVF et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement.

Les cellules lymphocytaires sont phénotypées par immunomarquage avec les anticorps spécifiques suivants conjugués à des fluorochromes ; anti-CD8, anti-CD4, anti-CD3 ou anti-TCR (Miltenyi Biotec). Pour cela, des mélanges de solution d’anticorps sont réalisés et 50 μΙ par puits sont déposés sur les cellules. Les cellules sont incubées 20 minutes à température ambiante dans le noir. 50μΙ de PBS IX pH 7.4, 5% SVF sont ajoutés et les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans ΙΟΟμΙ de PBS IX pH 7.4, 5% SVF. Les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans ΙΟΟμΙ de PBS IX pH 7.4, 5% SVF et analysées en cytométrie en flux. 3.2 Immunomarquage des cellules dendritiques humaines A chaque temps d’analyse, les puits sont grattés avec un cône de pipette ou un grattoir, selon le format de la plaque de culture, et les cellules sont transférées dans les puits d’une plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une solution de PBS IX pH 7.4, 5% SVF et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement.

Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec les anticorps spécifiques suivants conjugués à des fluorochromes: anti-CD11c, anti-CD209 DC SIGN, anti-CD86 (Miltenyi Biotec). Pour cela, des mélanges de solution d’anticorps sont réalisés et 50 μΙ par puits sont déposés sur les cellules dendritiques récupérées. Les cellules sont incubées 20 minutes à température ambiante dans le noir. 50μΙ de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF sont ajoutés et les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 100μΙ de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF. Les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 100μΙ de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF et analysées en cytométrie en flux. 3.3 Immunomarquage des cellules dendritiques murines A chaque temps d’analyse, les puits sont grattés avec un cône de pipette ou un grattoir selon le format de la plaque de culture et les cellules sont transférées dans les puits d’une plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une solution de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement.

Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec les anticorps spécifiques suivants conjugués à des fluorochromes : anti-CD11c, anti-CD86, anti-CD80, anti-H2k(d), anti-CMH classe II et anti-CD40 (Miltenyi Biotec). Pour cela, des mélanges de solution d’anticorps sont réalisés et 50 μΙ par puits sont déposés sur les cellules dendritiques récupérées. Les cellules sont incubées 20 minutes à température ambiante dans le noir. 50μΙ de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF sont ajoutés et les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 100μΙ de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF. Les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 100μΙ de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF et analysées en cytométrie en flux. 3.4 Cytométrie en flux

Les cellules dendritiques immunomarquées sont analysées en cytométrie en flux (Miltenyi Biotec) et analysées. Les échantillons ont été calibrés selon leur taille (SSC) et leur granulosité (FSC). Les cellules sont caractérisées sur le MacsQuantVYB (Miltenyi Biotec) jusqu’à 5 couleurs et analysées avec le logiciel MacsQuant (Miltenyi

Biotec). III. Résultats : Comparaison de l’efficacité de transduction de cellules

immunitaires par RLP et ILV

1. Lymphocytes T

La transduction de lymphocytes T par les particules RLP ou les vecteurs ILV montre une efficacité plus importante chez l'Homme (Figures Via et VIb) que chez la souris (Figures Vlla et Vllb). En effet, les lymphocytes T humains naïfs sont transduits avec une efficacité de 70% avec RLP de façon comparable à ce qui est obtenu avec des vecteurs ILV. De même, nous obtenons plus de 90% de cellules positives après activation avec RLP comme avec ILV. En revanche les lymphocytes T murins restent plus difficiles à transduire avec un résultat allant de 20% pour RLP à 70% avec ILV dans les conditions de multiplicité d'infection testées. En augmentant la multiplicité d'infection (MOI), nous pourrions obtenir des efficacités plus fortes sur les lymphocytes T murins mais risquons d'induire une toxicité cellulaire. 2. Cellules dendritiques

Les premiers tests de transduction de cellules dendritiques (DC) ont été réalisés sur des cellules humaines préparées à partir de sang périphérique provenant de donneurs humains sains.

La transduction de cellules dendritiques humaines (DC) immatures par les particules lentivirales porteuses d'ARN (RLP) ou les vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) montre une efficacité comparable. Cette expression reste stable jusqu'à 4 jours post-transduction (Figure Ville). La transduction des DC humaines par les particules RLP à une MOI de 4 pg/cellule (Figure Villa) conduit à 40% de cellules positives. Cette même efficacité de 40% est obtenue avec des vecteurs ILV à MOI 75 (Figure Vlllb). Du fait de l'intégration, l'expression résultant de la transduction par les vecteurs ILV reste stable au cours du temps (Figure Vllld). L'analyse de 4 bio-marqueurs caractéristiques des DC humaines sur les DC transduites montre que l'expression de ces bio marqueurs n'est pas significativement modifiée par la transduction par les particules RLP (Figure Ville) démontrant que la transduction ne modifie pas le phénotype des cellules cibles. Le même résultat est obtenu avec les vecteurs lentiviraux intégratifs avec seulement une légère hausse du marqueur CD209 (Figure Vlllf). Ces résultats indiquent que la transduction par des vecteurs ILV et particules RLP ne vient pas perturber le phénotype immature des DC immatures et ne les engagent pas dans un processus ou une voie d'activation ou de différenciation.

En parallèle des tests de transductions ont été menés sur des cellules dendritiques maturées par l’ajout de LPS dans les cultures. Les résultats montrent une efficacité de transduction des DC matures de 30% avec les particules RLPs à une MOI de 4 pg/cellule (Figure IXa) et de 50% avec les vecteurs ILVs à une MOI de 75 (Figure IXb). Comme précédemment les transductions par les particules RLPs (Figure IXc) et par les vecteurs ILVs (Figure Xd) ne perturbent pas significativement l’expression des biomarqueurs caractéristiques des cellules dendritiques.

Les mêmes tests de transductions ont été réalisés sur des cellules dendritiques issues de la moelle osseuse de souris (BMDC). Les résultats obtenus montrent une transduction des BMDCs par les particules RLPs de 80% à une MOI de 5pg/cellule (Figure Xa) et de 90% par les vecteurs ILVs à une MOI de 75 (Figure Xb). Dans les deux cas, les transductions par les particules RLPs ou les vecteurs ILVs mettent en évidence un effet dose. La cinétique de transduction des BMDCs par les particules RLPs montre que la fluorescence reste stable à 4 jours post-transduction (Figure Xc). La cinétique d’expression de la fluorescence dans les BMDC transduites par le vecteur ILV n’a été regardée que de façon classique pour un vecteur intégratif, à partir du troisième jour (Figure Xd). En parallèle, l’expression des biomarqueurs spécifiques des DCs murines ne sont pas modifiés après transduction, que ce soit avec les particules RLP (Figure Xe) ou le vecteur ILV (Figure Xf). EXEMPLE 2 : Efficacité de l’expression de récepteurs ou d’antigènes simples et multiples dans les cellules immunitaires I. Préparation de la particule virale selon l’invention et des systèmes comparatifs 1. Constructions des plasmides 1.1 Plasmides pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l’invention • Plasmide d’expression d’une séquence d’intérêt : Le piasmide d’expression est porteur d’une cassette d’expression promoteur-séquence d’intérêt-polyA avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d’ARN. Afin de véhiculer les ARNm dans les particules lentivirales, 12 répétitions du motif tige-boucle de l’ARN MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N°1) ont été insérées au sein d’une cassette d’expression en aval du gène rapporteur. Le promoteur utilisé peut être celui du CMV ou EF1 mais d’autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence d’intérêt peut séquence d’intérêt peut coder un antigène ou un épitope. De nombreux biomarqueurs ont été identifiés sur les cellules tumorales et leur séquence complète et/ou des séquences partielles sont utilisées en immunothérapie. Par exemple, les séquences utilisées pour exprimer MAGEA3 peuvent être entières (Figure XIa) ou partielles (Figure XIb). D’autres séquences partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisés comme celles de gpl 00 (Figure Xic) ou de la tyrosinase (Figure Xld). Beaucoup d’autres exemples de séquences complètes ou partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisées. • Plasmide d’encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à l’Exemple 1 (Figure II). • Plasmide de l’enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à l’Exemple 1 (Figure III). 1.2 Plasmides pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs ILV. • Plasmide d’expression d’une séquence d’intérêt : Le plasmide d’expression est porteur d’une cassette d’expression promoteur-séquence d’intérêt (Figure XII). Ce plasmide peut contenir d’autres éléments comme la séquence native WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Elément) ou encore la séquence cPPT/CTS. La pathogénicité virale est éliminée par la substitution de régions du génome viral requises pour la réplication rétrovirale par le transgène. Comme précédemment, la séquence d’intérêt peut coder une protéine antigénique entière, un antigène ou un épitope. De nombreux biomarqueurs ont été identifiés sur les cellules tumorales et leur séquence complète et/ou des séquences partielles sont utilisées en immunothérapie. Par exemple les séquences utilisées pour exprimer MAGEA3 peuvent être entières (Figure XIla) ou partielles (Figure Xllb). D’autres séquences partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisés comme celles de gplOO (Figure XIle) ou de la tyrosinase (Figure Xlld). Beaucoup d’autres exemples de séquences complètes ou partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisées. • Plasmide d’encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à l’Exemple 1 (Figure V). • Plasmide de l’enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à l’Exemple 1 (Figure III). 2. Productions des lots et titration

La production des lots et la titration est effectuée selon un procédé identique à celui décrit à l’Exemple 1. 3. Transduction des cellules immunitaires

La préparation des cellules dendritiques murines est effectuée selon un procédé identique à celui décrit à l’Exemple 1. 3.1 Transduction des cellules dendritiques murines avec un antigène tumoral

simple, par un RLP-MAGE A3-IRES-GFP

Les cellules dendritiques transduites par le vecteur RLP.MAGE A3-IRES-GFP ont fait l’objet d’une mise au point liée à la caractérisation de l’expression de la fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules RLP allant de 0,1 pg p24 à 5 pg p24 et à différents temps d’analyse (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec le milieu contenant uniquement l’agent de transduction Polybrene® à 4pg/mL (Sigma).

Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des anticorps spécifiques anti-CDIIc, anti-CD86, anti-CDSO, anti-H2k(d), anti-CMH classe Il et anti-CD40 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux. 3.2 Transduction des cellules dendritiques murines avec un antigène tumoral

simple, par un rRV-MAGE A3-IRES-GFP

Les cellules dendritiques transduites par le vecteur ILV-MAGE A3-IRES-GFP ont fait l’objet d’une mise au point liée à la caractérisation de l’expression de la fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules lentivirales ILV allant d’une multiplicité de d’infection MOI de 5 à 75 et à différents temps d’analyse (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec le milieu contenant uniquement l’agent de transduction Polybrene® à 4pg/mL (Sigma).

Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des anticorps spécifiques anti-CDIIc, anti-CD86, anti-CD80, anti-H2k(d), anti-CMH classe Il et anti-CD40 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux. 4. Phénotypage et caractérisation des cellules 4.1 Immunomarguage des cellules dendritiques murines A chaque temps d’analyse, les puits sont grattés avec un cône de pipette ou un grattoir selon le format de la plaque de culture et les cellules sont transférées dans les puits d’une plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une solution de PBS IX pH 7.4, 5% SVF et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement.

Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec les anticorps spécifiques suivants conjugués à des fluorochromes : anti-CD11c, anti-CD86, anti-CDSO, anti-H2k(d), anti-CMH classe II et anti-CD40 (Miltenyi Biotec). Pour cela, des mélanges de solution d’anticorps sont réalisés et 50 μΙ par puits sont déposés sur les cellules dendritiques récupérées. Les cellules sont incubées 20 minutes à température ambiante dans le noir. 50μΙ de PBS IX pH 7.4, 5% SVF sont ajoutés et les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans ΙΟΟμΙ de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF. Les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 100μΙ de PBS IX pH 7.4, 5% SVF et analysées en cytométrie en flux. 4.2 Cytométrie en flux

Les cellules dendritiques immunomarquées sont analysées en cytométrie en flux (Miltenyi Biotec) et analysées. Les échantillons ont été calibrés selon leur taille (SSC) et leur granulosité (FSC). Les cellules sont caractérisées sur le MacsQuantVYB (Miltenyi Biotec) jusqu’à 5 couleurs et analysées avec le logiciel MacsQuant (Miltenyi Biotec). 5. Comparaison de l’efficacité de l’expression d’un antigène simple par RLP,

ILV et transfection d’ARN 5.1 Réimplantation de BMDC murines in vivo 5.1.1 Modèle tumoral Renca

Ce modèle utilise les cellules tumorales du cancer rénal murin (Balb/c) de type Renca. Ces cellules sont préalablement transduites avec le vecteur ILV.EF1.MAGE A3.IRES.GFP (MOI 100) de façon à exprimer l’antigène MAGE A3 qui est d’origine humaine. Le modèle consiste ensuite à réimplanter un nombre prédéfini de ces cellules (0.2 à 1.10e6 cellules) par voie sous cutané dans le flanc de souris adultes syngéniques Balb/c. Les animaux proviennent d’un éleveur agrée (Janvier Europe ou Charles River Labs) et le protocole mis en place pour l’ensemble de ces expérimentations a été soumis et approuvé par un comité d’éthique local (comité d’éthique CEEA-122 / projet 2016022216425215). 5.1.2 Réimplantation des cellules dendritiques modifiées

Les BMDC transduites comme précédemment décrit avec les vecteurs de type RLP ou ILV sont réimplantées chez les souris Balb/c par voie intra-dermique au niveau du ganglion inguinal situé du même côté que celui de la réimplantation tumorale. Différentes quantités de cellules sont réimplantées pour évaluer leur pouvoir thérapeutique dans ce modèle. 5.1.3 Suivi du développement tumoral

Tous les animaux sont surveillés quotidiennement pour leur état général. Trois fois par semaine ils sont pesés et on mesure le développement tumoral par mesure manuelle à l’aide d’un Caliper. Le volume tumoral est donné en mm3 selon la formule suivante : V= a*(b^/2) où a=le plus grand diamètre et b=le plus petit diamètre. Pour des raisons éthiques le développement tumoral est limité à un volume de 2 000 mm3, les animaux atteignant cette limite ou ayant perdu plus de 20% de leur poids initial (= au jour de la réimplantation des cellules tumorales) seront sacrifiés. II. Résultats

Une première expérience a été réalisée pour tester l’efficacité de présentation antigénique d’un antigène tumoral (MAGE A3) par des cellules dendritiques murines (BMDC). Des BMDC ont été transduites par des particules RLP.MAGE A3.IRES.GFP ou un vecteur ILV.EF1.MAGE A3.IRES.GFP dans les conditions optimales déterminées par les essais avec la fluorescence ZsGreenl. Une gamme de MOI a été faite dans les deux cas et les cellules ont été phénotypées le troisième jour pour l’expression des marqueurs spécifiques des cellules dendritiques (Figure Xllla et Xlllb). Comme précédemment, ces analyses montrent que le phénotype n’est pas altéré par la transduction, quelle que soit la MOI appliquée.

Des BMDC transduites par des particules RLP.ZsGreenI ou RLP.MAGE A3 ont été par ailleurs utilisées pour tester le développement de tumeurs exprimant MAGE A3 in vivo, chez la souris Balb/c. Deux groupes de souris ont reçus des cellules tumorales syngéniques de type Renca (1x10e6 cellules), elles-mêmes préalablement modifiées pour exprimer l’antigène tumoral MAGE A3 d’origine humaine. Le même jour ces animaux ont reçu par voir indra-dermique, près du ganglion Inguinal correspondant, une suspension de BMDC (1x1 OeS cellules) modifiées par RLP-ZsGreenI pour le groupe contrôle ou par RLP.MAGE A3 pour le groupe test (Schéma ci-dessous). Le suivi du développement tumoral a ensuite montré que les animaux ayant reçu les BMDC.MAGE A3 ne développaient pas de tumeur, à l’inverse des animaux du groupe contrôle (Figure XIV). EXEMPLE 3 : Construction de particules lentivirales PP7(IN)-RLP par modification de l’intégrase I. Matériel & Méthodes 1. Constructions des plasmides • Plasmide d’expression d’une séquence d’intérêt : Le plasmide d’expression est porteur d’une cassette d’expression promoteur-séquence d’intérêt-polyA (voir Figure XXX) avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d’ARN. Afin de véhiculer les ARNm dans les particules lentivirales, 12 répétions du motif tige-boucle de l’ARN PP7 (ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID N°2) ont été insérées au sein d’une cassette d’expression en aval du gène rapporteur (Figure XXV).

Le promoteur utilisé peut être celui du CMV ou EF1 (Figure XXV) mais d’autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence d’intérêt peut être un ADN codant une protéine reportrice comme la Luciferase Firefly native (Figure XXV), une protéine fluorescente verte (ZsGreenI), rouge (mCherry) ou bleue (mtBFP), ou un ADNc codant une protéine, par exemple la protéine CRE. La séquence d’intérêt peut également être celle d’un shRNA, d’un miRNA, d’un sgRNA, d’un LncRNA ou d’un circRNA. • Plasmide d’encapsidation : La particule lentivirale a été modifiée pour contenir au sein de l’intégrase, la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage PP7. Le plasmide d’encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol), utilisé pour la production des particules PP7(IN)-RLP est modifié selon la stratégie illustrée par la Figure XVI : ce plasmide p8.74 est utilisé pour générer, par PCR d’assemblage, un plasmide sur lequel la protéine Coat du phage PP7 est fusionnée au domaine C terminal de l’intégrase. Cette fusion, obtenue par clonage Hpal, permet de générer le plasmide P8.74- POL-PP7 Coat. On obtient ainsi la construction illustrée en Figure XVII. La séquence codant Pol peut être délétée ou mutée dans certains éléments de fonction comme par exemple la séquence codant la transcriptase inverse (RT). • Plasmide de l’enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant une protéine d’enveloppe, qui peut être la VSVG codant la protéine d’enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (Figure III). 2. Production, concentration/purification et titration des particules lentivi raies

Les particules lentivirales sont produites comme décrit à l’Exemple 1, selon le procédé P1. 3. Cinétique d’expression de la Luciferase

Les cellules HCT116 (ATCC, CCL-247) sont ensemencées en plaque 96 puits et incubées 24h à 37°C / 5% C02. La transduction par les particules PP7(IN)-RLP-Luc 12X produites selon le procédé PI est réalisée à une dose de 2,8 pg p24/cellule, en présence de 8pg/mL Polybrene. Le surnageant de transduction est éliminé 4 heures après et remplacé par du milieu de culture supplémenté frais. A 4h, 8h, 24, 32, et 48h post-transduction, les cellules sont récupérées et l’expression de la Luciferase est analysée à l’aide du kit OneGIo Luciferase assay (Promega) en suivant les recommandations du fournisseur et en utilisant le lecteur de plaque Synergy H1 Hybrid (Biotek). Ce test est réalisé en triplicat. Le contrôle est réalisé par des cellules HCT116 non transduites. II. Résultats

Il est possible de véhiculer des ARN dans les particules lentivirales avec PP7-Coat dans l’intégrase. Le maximum d’expression de la Luciferase est atteint à 8h. Après 8h, l’activité de la Luciferase diminue. Les particules PP7(IN)-RLP permettent donc de délivrer des ARN.

Claims (19)

1. REVENDICATIONS

   1. Particule rétrovirale comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag, une protéine d’enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d’ARN d’intérêt liée à une séquence d’encapsidation, chaque séquence d’encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou dans l’intégrase, et l’une au moins dédites séquences d’intérêt des ARN non viraux encapsidés comporte une partie codant pour au moins un épitope et/ou au moins une structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un épitope.
2. 2. Particule rétrovirale selon la revendication 1, comportant une protéine de nucléocapside, une protéine d’enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés. les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d’ARN d’intérêt liée à une séquence d’encapsidation, chaque séquence d’encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside et/ou dans i’intégrase.
3. 3. Particule rétrovirale selon la revendication 2, dans laquelle les séquences d’intérêt des au moins deux ARN non viraux encapsidés sont identiques.
4. 4. Particule rétrovirale selon la revendication 2, dans laquelle les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d’ARN.
5. 5. Particule selon la revendication 4, dans laquelle la séquence d’intérêt de l’autre ARN non viral encapsidé code pour une protéine immunomodulatrice.
6. 6. Particule rétrovirale selon l’une quelconque des revendications 3 à 5. comportant en outre un troisième ARN non viral encapsidé.
7. 7. Particule rétrovirale selon l’une quelconque des revendications 2 à 6, dans laquelle le domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l’intégrase.
8. 8. Particule rétrovirale selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le domaine de liaison est introduit dans l’intégrase, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l’intégrase.
9. 9. Particule rétrovirale selon l’une quelconque des revendications 2 à 8, laquelle est une particule lentivirale.
10. 10. Particule lentivirale selon la revendication 9, dans laquelle : le domaine de liaison est la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage MS2, la séquence d’encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de MS2, la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, laquelle NC est mutée au niveau du second doigt de zinc afin d’insérer la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage MS2.
11. 11. Particule lentivirale selon la revendication 9, dans laquelle : le domaine de liaison est la séquence de la protéine « Coat » du phage PP7, la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de PP7, la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, laquelle NC est mutée au niveau du second doigt de zinc afin d’insérer la séquence de la protéine « Coat » du bactériophage PP7.
12. 12. Composition comportant des particules selon l’une quelconque des revendications 1 à 11.
13. 13. Kit de production de particules selon l’une quelconque des revendications 1 à 11. comportant : (i) un plasmide d’expression comportant au moins une séquence d’intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d’encapsidation, (ii) un plasmide d’encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase, chimérique, comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d’encapsidation, et, (iii) un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe.
14. 14. Procédé de fabrication d’un kit selon la revendication 13, comportant : (i) la préparation d’un plasmide d’expression comportant au moins une séquence d’intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d’encapsidation (ίί) la préparation d’un plasmide d’encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d’encapsidation, et (iii) la préparation d’un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe.
15. 15. Procédé de fabrication des particules selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, comportant une étape de co-transfection de cellules avec : (i) un plasmide d’expression comportant au moins une séquence d’intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d’encapsidation, (ii) un plasmide d’encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d’encapsidation, et, (iii) un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe. et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.
16. 16. Procédé de fabrication des particules selon l’une quelconque des revendications 4 à 11, comportant une étape de co-transfection de cellules avec : (i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d’ARN non virales différentes, chaque séquence d’ARN comportant une séquence d’intérêt pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence d’intérêt est insérée une séquence d’encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d’expression comportant chacun une séquence d’intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d’encapsidation, (ii) un plasmide d’encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d’encapsidation, et, (iii) un plasmide d’enveloppe codant pour une protéine d’enveloppe, et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.
17. 17. Procédé de fabrication selon la revendication 16, dans lequel le surnageant est clarifié, puis éventuellement concentré et/ou purifié.
18. 18. Composition de particules susceptible d’être obtenue par le procédé de fabrication des particules selon l’une des revendications 16 ou 17.
19. 19. Utilisation d’une particule selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, ou d’une composition selon la revendication 12 ou 18 pour transduire in vitro des cellules du système immunitaire.