FR2929011A1 - Procede et dispositif de mesure quantitative a haute cadence de cibles biomoleculaires presentes sur ou dans un support d'analyse biologique. - Google Patents
Procede et dispositif de mesure quantitative a haute cadence de cibles biomoleculaires presentes sur ou dans un support d'analyse biologique. Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne un dispositif et un procédé de mesure quantitative à haute cadence de cibles biomoléculaires à la surface ou dans l'épaisseur d'un support plan d'analyse biologique.Le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes :a) on focalise et superpose sur chaque point de mesure de ce support au moins deux faisceaux laser (F") par croisements simultanés de ces faisceaux, pour en extraire un plasma chaud (P) confiné comprenant un élément chimique à quantifier présent dans les cibles et un autre élément chimique exogène aux cibles et présent en quantité connue sur ce support,b) on détecte et analyse, pour chaque point de mesure, des raies lumineuses d'émission de chaque plasma qui correspondent à l'élément à quantifier et à l'élément exogène, en mesurant les intensités de ces raies, puisc) on détermine, via un étalonnage préalable des raies de l'élément à quantifier établissant une corrélation entre les intensités des raies propres à cet élément et les concentrations de ce dernier dans des mélange:; en proportions connues de l'élément à quantifier et de l'élément exogène, Ici concentration dans chaque point de mesure de l'élément à quantifier.
Description
PROCEDE ET DISPOSITIF DE MESURE QUANTITATIVE A HAUTE CADENCE DE CIBLES BIOMOLECULAIRES PRESENTES SUR OU DANS UN SUPPORT D'ANALYSE BIOLOGIQUE La présente invention concerne un procédé de mesure quantitative à haute cadence de cibles biomoléculaires à la surface ou dans l'épaisseur d'un support plan d'analyse biologique, et un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé. L'invention s'applique notamment à la mesure quantitative d'acides nucléiques ou de protéines non marqués ségrégués à la surface ou dans l'épaisseur d'un support d'analyse biologique de préférence plan, tel qu'une biopuce par exemple à matrice de sondes, une membrane de transfert, un gel d'électrophorèse ou de chromatographie ou un support en verre ou en polyimide (e.g. en Kapton ), à titre non limitatif.
La technique de spectroscopie d'émission optique induite par laser ( Laser-induced breakdown spectroscopy en anglais ou LIBS ) est une méthode très puissante pour déterminer la composition élémentaire de la surface d'un matériau. Cette composition est obtenue en mesurant les raies d'émission provenant des atomes ou des ions constitutifs d'un plasma transitoire induit à la surface du matériau par un faisceau laser, et l'analyse élémentaire de cette surface peut être obtenue en balayant celle-ci par une source laser effectuant des tirs successifs selon une grille régulière, de manière à cartographier la surface de ce matériau. A chaque tir laser, le spectre d'émission des éléments chimiques recherchés est enregistré, ainsi que les coordonnées de focalisation du faisceau à la surface du matériau. Il est alors possible de reconstituer une image point à point de la surface du matériau à une longueur d'onde sélectionnée correspondant à un élément chimique déterminé. Si une méthode de calibration est appliquée, les variations d'intensité de l'image obtenue par cartographie indiquent l'abondance de cet élément à la surface du matériau. Toutefois, un inconvénient majeur de cette technique est que le nombre très élevé de tirs laser nécessaires pour réaliser une cartographie à haute résolution de la surface (résolution comprise entre 300 nm et 1 Kim), implique des temps d'analyse de plusieurs heures voire de plusieurs jours, dès que la surface analysée excède quelques millimètres carrés. Cette lenteur de l'acquisition de l'image rend la LIBS inapplicable comme méthode d'analyse pour un grand nombre d'applications en biologie, et plus particulièrement pour la génomique et la protéomique. Dans le domaine de la génomique, les biopuces représentent une révolution majeure dans les techniques de biologie moléculaire de ces dix dernières années. En permettant l'étude simultanée du niveau d'expression de plusieurs centaines, voire de plusieurs milliers de gènes, elles permettent d'appréhender l'impact d'une maladie ou d'un stress (e.g. résultant d'une radiation, d'une pollution ou de la prise d'un médicament) au niveau du génome complet d'un individu. Ces techniques deviennent ainsi de plus en plus utilisées en biologie moderne.
Les biopuces se répartissent en deux grandes familles, comprenant les puces microfluidiques et les puces à matrices de sondes. Ces dernières sont organisées en matrices de spots ou points de mesure, et elles sont généralement obtenues en déposant ou en synthétisant à des coordonnées précises sur un support passif des sondes moléculaires formées de biopolymères tels que de l'ADN, des protéines ou des anticorps, par exemple. Ces biopuces à matrices de sondes permettent d'identifier les cibles présentes dans un échantillon biologique lorsque ces cibles viennent s'hybrider spécifiquement au niveau de chaque spot de sondes. Il existe, d'une part, les biopuces à haute complexité (plus de 5000 spots) pour les études pan-génomiques et, d'autre part, les biopuces à basse et à moyenne complexité, qui sont dédiées à une thématique donnée (e.g. tests thérapeutiques, détecteur biologique). La technologie actuelle des biopuces à matrices de sondes présente un certain nombre de limitations majeures, notamment : - le fort encombrement stérique des ma'queurs fluorescents, qui modifie de façon sporadique la reconnaissance entre les sondes et les cibles et entraîne ainsi de nombreux artéfacts de mesure diminuant la reproductibilité des expériences ; - l'absence de mesure quantitative, qui interdit de comparer les niveaux d'expression entre deux cibles différentes ; et - e coût élevé de cette technologie actuelle, tant en production qu'en mise en oeuvre.
C'est la raison pour laquelle plusieurs alternatives à cette technologie ont été développées récemment, avec en particulier : - les technologies RT PCR en carte microfluidique ( Reverse Transcriptase Polymerase Chain Re,action , soit une amplification en chaîne par polymérisase après transcription inverse d'un acide ribonucléique en ADN complémentaire), qui permettent d'amplifier jusqu'à 386 cibles différentes en parallèle, avec une simplification de la mise 15 en oeuvre et une amélioration de la détection qui sont toutefois pénalisées par l'absence de mesure quantitative pour une réelle comparaison entre les cibles, par la limitation du nombre de cibles à analyser (bien en dessous d'une biopuce de basse complexité) et par un coût élevé de mise en oeuvre ; - les biopuces sur film Nylon , basées sur l'hybridation des 20 cibles dans un grand volume et un marquage en chimiluminescence, qui procurent également une mise en oeuvre simplifiée et une détection améliorée, mais qui sont néanmoins pénalisées par l'absence de mesure quantitative, le grand volume de réaction requis (limitant pour les analyses d'échantillons de faible concentration) et les coûts très élevés de production 25 et de mise en oeuvre ; et - de nouveaux concepts de biopuces sans marquage, qui sont basés sur la détection de la cible par mesure de l'impédance ou par la résonance plasmonique de surface ( SPR ou Surface Plasmon Resonance ), et qui ont été notamment décrits dans David F et al., 30 Bioscience Bioelectron. 2005, dans Li C. M. et al., Front 13iosci. 2005 ou dans Macanovic A. et al., Nucleic Acid Research 2004, mais qui ne permettent pas une quantification du nombre de cibles, posent problème pour réaliser des 10 puces à haute densité et impliquent, tant pour la technique de mesure de l'impédance que pour la technique SPR , des artéfacts de mesure dus aux tailles et aux conformations variables des cibles.
Des procédés de spectrométrie ICP ( Inductively Coupled Plasma , i.e. spectrométrie de masse couplée à un plasma induit) ont également été mis au point, cf. Inchul Yang et al., Analytical Biochemistry (2004), vol.335, 150-161 ou Heinrich F. Arlinghaus et al., Analytical Chemistry (1997), vo1.69, n'18, 3747-3753, procédés qui permettent de doser le phosphore contenu dans un acide nucléique pour estimer par exemple le taux d'hybridation de celui-ci sur une biopuce à PNA ( Peptide Nucleic Acid , i.e. acides nucléiques peptides). Toutefois, il apparaît que l'utilisation de la spectrométrie de masse pour doser le phosphore à partir d'un plasma généré à la surface d'une biopuce est une méthode lente (prenant typiquement plusieurs heures pour 1 cm2 sur la biopuce), et que l'instrumentation nécessaire à sa mise en oeuvre est coûteuse. De plus, il est à noter que cette technique de spectrométrie ICP n'est pas quantitative, car elle ne fournit que la quantité brute de nucléotides hybridés, sans pouvoir différencier entre la taille et le nombre des biomolécules. Le document de Brevet US-A-2006/0105354 présente une méthode de quantification en temps réel d'une multitude de cibles formées d'acides nucléiques marqués et qui se sont liées à la surface d'une biopuce de type à matrice de sondes, comprenant notamment l'émission d'un faisceau laser d'excitation à la surface de la matrice et la mesure de l'émission lumineuse des cibles hybridées en réponse à ce faisceau d'excitation. Un inconvénient majeur de cette méthode est qu'elle n'est pas non plus quantitative au sens indiqué ci-dessus, et qu'elle requiert en outre la présence de molécules marquées liées aux molécules cibles.
Dans le domaine de la protéomique, le problème posé se complique encore. En effet, en plus d'identifier, dans un extrait cellulaire, les protéines présentes ainsi que leurs concentrations, il est nécessaire d'identifier leurs modifications post-traductionnelles. En effet, l'activité d'une protéine est très souvent déterminée par ses modifications posttraductionnelles. Parmi les modifications possibles, les phosphorylations sont sans doute les plus importantes biologiquement.
Les techniques d'électrophorèse à deux dimensions (2D) sont les techniques d'analyses parallèles les plus utilisées pour l'analyse de mélanges de protéines. Ces techniques consistent à faire migrer un mélange de protéines dans un gel, successivement suivant deux directions orthogonales, en fonction de critères physico-chimiques différents (e.g. 1 o chromatographie ou électrophorèse). Les protéines sont alors séparées selon leur affinité à un solvant, leur charge électrique, leur masse, leur forme, leur modification, etc., et après avoir été pigmentées par un pigment fluorescent ou non, les protéines sont identifiées en fonction de leur. position ou tache sur les gels 2D par rapport aux migrations obtenues dans un gel référence. Pour 15 mettre en évidence les modifications post-traductionnelles, notamment les phosphorylations, il est nécessaire de réaliser l'analyse de chaque tache du gel. Différentes méthodes d'analyses sont possibles, telles que la spectrométrie de masse, la RMN, les marquages immunologiques, la technique ICP , par exemple. 20 La mise en évidence des modifications post-traductionnelles est pour l'instant très lourde à réaliser. Depuis quelques années, des biopuces à anticorps sont disponibles sur le marché pour l'analyse d'extraits protéiques. Ces biopuces permettent d'analyser en parallèle l'expression de plusieurs centaines de 25 gènes sous leur forme protéine dès lors qu'il existe des anticorps spécifiques pour les protéines souhaitées. Toutefois, cette technologie est limitée par la nécessité de marquer les protéines. Malheureusement, les chromophores utilisés pour le marquage modifient de manière aléatoire l'affinité des protéines pour leur anticorps. D'autre part, le marquage étant également 30 aléatoire, les résultats sont difficilement interprétables et difficilement comparables entre différentes expériences. Pour évaluer par cette technique, par exemple avec le taux de modifications post-traductionnelles d'une protéine donnée entre deux conditions ou deux types cellulaires, il est nécessaire de disposer de deux anticorps reconnaissant de manière exclusive chacune des formes de la protéine. Ceci, en plus d'être coûteux, est techniquement très difficile à obtenir.
La technique LIBS représente une alternative pour l'analyse sans marquage préalable des biomolécules ségréguées sur tous les types de supports (e.g. membrane, gel, support plastique par exemple en Kapton , support en silicium), ces supports étant les principaux types utilisés dans les analyses biologiques. La méthode d'analyse d'un produit biologique par LIBS consiste à doser un élément chimique constitutif de la biomolécule cible préalablement isolée, ségréguée ou purifiée sur un support de chromatographie, d'électrophorèse, une membrane, ou une biopuce. Comme indiqué précédemment, le principal verrou technologique d'ure analyse par LIBS est la lenteur du procédé, ce qui limite fortement l'utilisation de cette technique en biologie. En effet, les supports d'analyse en biologie font souvent plusieurs centimètres carrés de surface. L'imagerie, à une résolution de 10 microns par exemple, d'un support d'analyse de 1 cm2 nécessite ainsi de réaliser 1 000 000 de tirs laser jointifs, à raison d'un tir par position. Bien entendu, ce nombre est à multiplier par le nombre de tirs à effectuer par position, si la molécule à analyser se trouve dans l'épaisseur du support, tel que cela ce prcduit pour les gels d'électrophorèse par exemple. Pour réaliser cette analyse en 1 seconde, il est nécessaire de disposer d'un laser UV de type méga Hertz avec une énergie suffisante pour induire un plasma sur le support à chaque tir (énergie typiquement supérieure à 60 micro joules par impulsion). Pour réaliser cette analyse en 1 minute, il est nécessaire d'avoir un laser UV avec une fréquence égale à 600 kilo Hertz et une énergie suffisante pour induire un plasma sur le support à chaque tir (également supérieure à 60 micro joules par impulsion). Ce problème peut être minimisé en réalisant des tirs non jointifs en contrepartie d'une dégradation de la résolution. Toutefois la fréquence reste élevée, même pour une image très dégradée.
Il est possible d'utiliser des lasers avec des longueurs d'onde plus grandes par exemple autour de 532 nm, du fait que ces lasers présentent généralement de plus grandes fréquences et de plus grandes énergies. Toutefois, en s'éloignant des UV lointains (266 nm), l'énergie nécessaire pour obtenir un plasma analysable augmente, et par exemple les lasers à 532 nm - d'énergie suffisante - ont des fréquences voisines des lasers UV lointains, ce qui pose alors le même problème que pour le domaine UV lointains.
1 o Un but de la présente invention est de proposer un procédé de mesure quantitative à haute cadence de cibles biomoléculaires, en particulier des protéines, présentes sur ou dans un support d'analyse biologique, qui remédie à l'ensemble des inconvénients précités. A cet effet, le procédé de mesure selon l'invention comprend 15 les étapes suivantes : a) on focalise et l'on superpose sur chaque point de mesure de ce support au rnoins deux faisceaux laser par croisements simultanés de ces faisceaux, pour en extraire un plasma chaud et confiné comprenant au moins un élément chimique à quantifier présent dans lesdites cibles et au 20 moins un autre élément chimique exogène à ces cibles et présent en quantité connue sur ou dans ce support, b) on détecte et l'on analyse, pour chacun de ces points de mesure, des raies lumineuses d'émission de chaque plasma qui correspondent au ou à chaque élément à quantifier et au ou à chaque 25 élément exogène, en mesurant les intensités respectives de ces raies, puis c) on détermine, via un étalonnage préalable des raies du ou de chaque élément à quantifier établissant une corrélation entre les intensités des raies propres à cet élément à quantifier et les concentrations de ce dernier dans des mélanges en proportions connues du ou de chaque élément 30 à quantifier et du ou de chaque élément exogène, la concentration dans chaque point de mesure du ou de chaque élément à quantifier ou d'un groupe l'incorporant au sein de ces cibles.
Le procédé selon l'invention permet ainsi de scanner (i.e. analyser en un balayage) rapidement et efficacement l'ensemble des points de mesure de la biopuce, tout en étant indépendant d'une variation du réglage de la puissance des lasers et de la sensibilité de la détection d'une acquisition à l'autre, grâce à la présence d'une référence interne correspondant à l'élément exogène, et de déduire de l'étape c) précitée le nombre d'atomes de l'élément recherché dans chaque point de mesure, pour en déduire le nombre de cibles à la coordonnée observée, le tout en moins de 1/1000 seconde par point de lecture en moyenne (temps de lecture = nombre de lectures / temps d'acquisition). On notera que cette focalisation en un même point du support de plusieurs faisceaux laser qui est réalisée à l'étape a) permet d'additionner leurs énergies respectives afin de générer un plasma spectralement analysable. On notera également que la corrélation utilisée à l'étape c) entre intensités de raies y et concentration x pour l'élément exogène ou pour l'élément à quantifier, est avantageusement de type linéaire (i.e. une relation de proportionnalité, à une constante affine près, selon l'équation y = ax + b).
Selon une autre caractéristique de l'invention, l'on immobilise préalablement à l'étape a) lesdites cibles biomoléculaires à la surface ou dans l'épaisseur du support d'analyse biologique, lequel est de préférence sensiblement plan et est choisi dans le groupe constitué par les biopuces, les membranes de transfert, les substrats en silicium, en polyimide (e.g. en Kapton ) et en verre, et les gels d'électrophorèse et de chromatographie. Avantageusement, ce support est formé d'une biopuce comprenant à sa surface une matrice de sondes natives, hybridées ou complexées par lesdites cibles, cette matrice comportant une multitude desdits points de mesure comprenant chacun une pluralité de sondes, et le ou chaque élément: chimique à quantifier étant présent dans ces cibles et, optionnellement, en outre dans ces sondes.
On notera que quand l'élément à quantifier se trouve à la fois dans la sonde et dans la cible, ledit élément exogène permet de déduire la quantité de signal qui provient de la sonde et la quantité de signal qui provien.: de la cible. Cet élément exogène fournit une calibration interne qui permet de recaler le signal aux courbes de calibration, quelles que soient les atténuations de signal dues au réglage de l'appareil. Selon une autre caractéristique de l'invention, ce procédé de mesure comprend en outre une étape ultérieure d'obtention d'une ou plusieurs images représentatives de la concentration du ou de chaque élément à quantifier ou du ou de chaque élément exogène, l'intensité de chaque pixel ou bien de chacune des trois couleurs R, G, B de ce dernier au sein de l'image étant représentative de l'intensité de la raie de l'élément correspondant observé. L'image ainsi obtenue permet ainsi de cartographier l'abondance du ou de chaque élément à quantifier ou exogène sur ou dans le support d'analyse. La cartographie de l'épaisseur du support d'analyse est obtenue par des tirs successifs en une même position, les signaux obtenus étant soit accumulés, soit analysés séparément pour réaliser une cartographie en z du support, soit moyennée soit en tranche. Le nombre de tirs successifs dépend notamment de la profondeur d'analyse souhaitée et des propriétés physicochimiques du matériau du support.
Dans le cas précité d'une biopuce à matrice de sondes, l'immobilisation préalablement à l'étape a) de la molécule cible est obtenue, soit directement par une interaction avec le matériau constituant le support ou une rétention dans le maillage moléculaire du support, soit indirectement par une interaction avec un ligand (sonde) fixé sur ou dans le support. A titre de telles interactions sondes / cibles, on peut par exemple citer : - l'hybridation entre une cible et une sonde de type acide 30 nucléique ou assimilé (e.g. PNA, LNA), - les interactions protéine/protéine entre une cible et une sonde de type protéine telle que ligand/récepteur, anticorps/antigène fixé, - des interactions mixtes acide nucléique ou assimilé ,' protéine, - des interactions de type acide nucléique / métal, ion ou toute autre molécule libre, ou - des interactions de type protéine / ion ou toute autre molécule libre.
De préférence, chaque faisceau laser utilisé à l'étape a) est émis dans la gamme infrarouge ù visible - ultraviolet selon une impulsion de 10 durée comprise entre 1 fs et 100 ns, avec une fréquence comprise entre 600 Hz et 1 GHz et une énergie comprise entre 0,05 mW et '1 kW. A titre encore plus préférentiel, chaque faisceau laser est émis dans l'ultraviolet à une longueur d'onde de 266 nm ou 193 nm, en utilisant par exemple les harmoniques d'un laser Nd : YAG (laser à grenat 15 d'yttrium et d'aluminium dopé au néodyme), et selon une impulsion de durée inférieure à 10 ns préférentiellement égale à 5 ns. En variante, les faisceaux laser utilisés dans l'étape a) peuvent être émis à des longueurs d'onde différentes, par exemple dans l'ultraviolet à une longueur d'onde de 266 nm et dans le visible à 532 nm, 20 toujours selon une impulsion de durée inférieure à 10 ns et préférentiellement égale à 5 ns. Selon une autre caractéristique de l'invention, lesdits faisceaux peuvent avantageusement être mis en forme à l'étape a) dans une tête de balayage, de telle manière que : 25 - ces faisceaux se réfléchissent tangentiellement sur une pyramide de renvoi à au moins un étage de réflexion pour donner en sortie de cette pyramide des faisceaux colinéaires, - ces faisceaux colinéaires passent à travers un systèrne optique afocal, tel qu'un télescope réducteur de faisceaux, qui réduit les 30 diamètres respectifs de ces faisceaux et les distances les séparant mutuellement, puis que 2929011 Il - ces faisceaux colinéaires réduits soient ensuite focalisés et croisés sur chaque point de mesure par des miroirs plans, paraboliques ou ellipsoïdaux agencés en sortie de ladite tête de balayage. Avantageusement, lesdits faisceaux colinéaires réduits 5 peuvent être focalisés et croisés sur chaque point de rnesure dudit support par deux disques optiques rotatifs à miroirs les déviant respectivement dans des directions horizontale et verticale et de préférence par un périscope de déviation couplé à ces disques. On notera que la superposition par croisements des faisceaux laser génère à l'étape a) une densité de puissance en chaque point de mesure avantageusement supérieure à 0,5 GW.cm-2, pour l'obtention par vaporisation d'un plasma chaud qui présente une durée cle vie d'environ 2 ps. Avantageusement, un croisement unique de deux faisceaux laser peut être utilisé pour ablater chaque point de mesure, d'une surface comprise entre 1 pm2 et 10 000 pm2. Le balayage de la totalité des points de mesure, selon un pas fixe, peut être ainsi réalisé par des miroirs de préférence ellipsoïdaux qui déplacent, focalisent et croisent les faisceaux sur la surface à analyser. De préférence, on adjoint à chaque plasma confiné au moins 20 un agent d'activation formé d'un gaz plasmogène, tel que de l'argon, de l'hélium, de l'azote ou un mélange de ces gaz. Selon un premier mode préférentiel de réalisation de l'invention, les plasmas extraits sont respectivement confinés optiquement dans des chambres d'intégration de la lumière émise par le plasma 25 correspondant qui présentent chacune une paroi latérale réfléchissante et qui sont chacune munies d'au moins une fibre optique d'acquisition de la lumière accumulée dans cette chambre, de telle sorte que chaque plasma n'interfère pas avec les autres points de mesure à analyser. Conformément à ce premier mode, on soumet lors de l'étape 30 a) le support d'analyse biologique à un mouvement relatif par rapport aux chambres de confinement optique en même temps que l'on fait se croiser lesdits faisceaux laser, et ces chambres sont de préférence alors guidées au- dessus dudit support qui reste fixe. En variante, on peut utiliser un chevauchement rnutuel des ouvertures optiques respectives des fibres optiques d'acquisition en les agençant en quinconce au-dessus dudit support, pour couvrir toute la surface à analyser de ce dernier sans déplacement relatif de ces chambres par rapport audit support. Selon un second mode de réalisation ce l'invention, lesdites chambres de confinement optique des plasmas extraits sont elles-mêmes logées dans une enceinte close qui contient le support, qui est remplie du gaz plasmogène et dont au moins la face supérieure est transparente à la ou chaque longueur d'onde d'excitation des faisceaux laser et aux longueurs d'onde d'acquisition de la lumière générée par ce plasma. Conformément à ce second mode, on notera qu'il est possible de déplacer lesdits faisceaux laser simultanément en mouvement relatif par rapport audit support. Selon une autre caractéristique de l'invention, l'on utilise avantageusement la technique de spectroscopie d'émission optique induite par laser ( LIES en abrégé pour Laser Induced Breakdown Spectroscopy ) pour la mise en oeuvre des étapes a) à c) et, de préférence, on utilise en parallèle la technique de fluorescence induite par laser ( LIF en abrégé pour Laser Induced Fluorescence ) pour ces mêmes étapes.
Avantageusement, lesdites cibles biomoléculaires sont choisies dans le groupe constitué par les acides nucléiques non marqués, les protéines, les peptides, les polypeptides, les polynucléotides tels que de l'ADN et les sucres. On notera que l'on peut d'une manière générale utiliser à titre de cible tout autre composé biologique pouvant être caractérisé par un tel élément intrinsèque à sa structure ou se liant fortement à cette dernière. Dans le cas préférentiel d'un support de type biopuce à matrice de sondes, ces sondes sont choisies dans le groupe constitué par les acides nucléiques les acides nucléiques peptides ( PNA ), les acides nucléiques verrouillés ( LNA ), les éthers ribonucléiques ( ERN ), les anticorps, les hémi-anticorps, les hémi-anticorps couplés avec des acides nucléiques et des récepteurs protéiques. On notera que l'on peut d'une manière générale utiliser à titre de sonde tout autre composé biologique pouvant se lier spécifiquement à une cible et pouvant être immobilisé sur un support d'analyse. Avantageusement, ledit ou chaque élément exogène (i.e. n'existant pas dans la structure des cibles) est déposé en quantité connue sur le support d'analyse, soit de manière homogène, soit spécifiquement avec les sondes. Lorsqu'ils sont déposés avec les sondes, ces éléments exogènes sont soit inclus dans des composés qui seront greffés sur le support conjointement aux sondes dans des proportions connues, soit directement implantés dans la structure de la sonde par substitution atomique or, interaction forte. Dans un mode encore plus avantageux, les éléments exogènes peuvent être inclus dans une matrice moléculaire facilitant la formation du plasma (i.e. substance à forte absorbance optique pour la longueur d'onde d'excitation et à faible énergie d'ablation), cette matrice étant déposée de manière homogène à la surface du support d'analyse biologique. II peut être avantageux d'utiliser des sondes PNA , notamment lorsque les concentrations des cibles sont très faibles. En effet, l'affinité très élevée des PNA pour les acides nucléiques permet de piéger toutes les cibles de type oligonucléotides présentes dans le milieu à analyser.
De plus, comme les PNA sont capables de se fixer spontanément à une surface d'or par leur extrémité COOH ou NH, ces molécules PNA sont particulièrement avantageuses pour des dépôts de sondes sur un support plastique de biopuce (e.g. en polyimide Kapton(D) recouvert d'une couche d'or de quelques microns d'épaisseur.
Le fait que les PNA ne contiennent pas de phosphore, et plus généralement aucun atome ayant une raie d'émission propre à 253 nm, à 194 nm ou 203 nm permet d'augmenter la sensibilité de détection en éliminant totalement le signal de la sonde.
Selon une autre caractéristique de l'invention, ledit ou chaque élément chimique à quantifier peut être choisi dans le groupe constitué par le phosphore, le soufre, l'iode, l'azote, l'oxygène et le carbone.
Avantageusement, l'on utilise à titre de cibles des acides nucléiques ou des protéines phosphorylées, et l'on utilise le phosphore présent dans ces cibles à titre d'élément à quantifier pour la détection dans le plasma, à l'étape b), de raies d'émission atomiques et ioniques du phosphore.
Dans ce cas, l'on détecte à l'étape b) les raies d'émission du phosphore à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 138 3 nm, 148 3 nm, 154 3 nm, 167 3 nm, 177' 3 nm, 190 3 nm, 193 3 nm, 203 _t 3 nm, 213 3 nm et 253 3 nm, et qui est de préférence de 203 3 nm.
Egalement avantageusement, l'on utilise des acides nucléiques ou des protéines à titre de cibles et de sondes, et l'on utilise le soufre et l'iode respectivement dans lesdites cibles et lesdites sondes à titre d'élément à quantifier pour la détection dans le plasma, à l'étape b), de raies d'émission atomiques et ioniques du soufre et de l'iode. Dans ces deux cas, l'on détecte à l'étape b) les raies d'émission du soufre à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 167 3 nm, 181 3 nm, 190 3 nm, 199 3 nm, 415 3 nm, 458 3 nm, 922 3 nm, 942 3 nm, 968 3 nm et qui est de préférence de 415 i_ 3 nm, et les raies d'émission de l'iode à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 150 3 nm, 161 3 nm, 170 3 nm, 178 3 nm, 183 3 nm, 511 3 nm, 661 3 nm, 740 3 nm, 746 3 nm 804 3 nm, 839 3 nm, 902 3 nm, 905 3 nm, 911 3 nm et 973 3 nm et qui est de préférence de 511 3 nm. Egalement dans ces deux dernier cas, l'on utilise avantageusement le chlore ou le brome à titre d'élément exogène auxdites cibles et auxdites sondes, pour la détection dans le plasma à l'étape b) de raies d'émission atomiques et ioniques du soufre et de l'iode, respectivement, pour lever l'indétermination des signaux générés tant par ces sondes que par ces cibles. On alors détecte à l'étape b) : - les raies d'émission du chlore à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 35 3 nm, 386 3 nm, 413 _t 3 nm, 479 3 nm, 490 3 nm, 499 3 nm, 507 3 nm, 521 3 nm, 539 3 nm, 542 3nm, 774 3nm, 725 3nm, 741 -1 3nm, 754 3nm, 822 3 nm, 833 3 nm, 837 3 nm, 842 3 nm, 858 3 nm, 868 3 nm, 894 3 nm, 912 3 nm, 919 3 nm,928 3 nm, 945 3 nm et 959 3 nm ; ou bien - les raies d'émission du brome à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 154 3 nm, 158 3 nm, 163 nm, 614 3 nm, 635 3 nm, 655 3 nm, 663 3 nm, 751 3 nm, 780 nm, 793 3nm, 798 3nm, 813 3nm, 827 3nm, 844 3nm, 889 3 nm, 916 3 nm el: 926 3 nm. l'on utilise pour lesdites cibles de l'ADN et en ce que l'on utilise à titre d'élément à quantifier un cation lié à ces cibles et choisi dans le groupe constitué par le sodium, le magnésium et le potassium pour la détection dans le plasma, à l'étape b), de raies d'émission atomiques et ioniques du phosphore. Dans ce cas, l'on détecte à l'étape b) : - les raies d'émission du sodium à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 268 3 nm, 285 3 nm, 291 3 nm, 292 3 nm, 298 3 nm, 314 3 nm, 321 3 nrn, 325 3 nm, 330 3 nm, 353 3nm, 3631- 3 nm, 449 3 nm, 466 3 nrn, 497 3 nm, 569 3 nm, 589 3 nm, 616 3 nm et 819 3 nm ; ou - les raies d'émission du magnésium à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 285 3 nm, 880 3 nm, 309 3nm,333 3nm,383 3nm,457 3nm,473 3nm,518-1 3nm,5521-3 nm, 571 3 nm, 925 3 nm, 964 3 nm et 941 3 nm ; ou encore - les raies d'émission du potassium à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 404 3 nm, 535 3 nm, 580 3 nm, 693 3 nm, 766 3 nm, 769 3 nm, 825 3 nm, 850 3 nm, 890 3 nm et 959 3 nm. l'invention, Selon une variante de l'on utilise avantageusement l'azote et/ou le carbone et/ou l'oxygène présent(s) dans lesdites cibles et lesdites sondes à titre d'élément(s) à quantifier pour la détection dans le plasma, à l'étape b), des raies d'émission atomiques de l'azote et/ou du carbone et/ou de l'oxygène pour évaluer la quantité de cibles et de sondes sur ledit support, lequel ne contient ni carbone, ni azote, ni oxygène. Dans ce cas, l'on détecte à l'étape b) : - les raies d'émission de l'azote à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 174 3 nm, 575 3 nm, 744 3 nm, 821 3 nm, 859 3 nm, 865 3 nm, 871 3 nm, 938 3 nm et 870 3 nm, et qui est de préférence de 575 3 nm ; -les raies d'émission du carbone à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 156 3 nm, 165 3 nm, 175 3 nm, 193 3 nm, 247 3 nm, 538 3 nm, 600 3 nm, 711 3 nm, 833 3 nm, 908 3 nm, 911 3 nm, 965 3 nm et 940 3 nm, et qui est de préférence de 600 3 nm ; et/ou - les raies d'émission de l'oxygène à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 615 3 nm, 645 3 nm, 700 3 nm, 725 3 nm, 777 3 nm, 822 3 nm, 844 3 nm et926 3 nm, et qui est de préférence de 615 3 nm. On notera que l'azote et/ou le carbone et/ou l'oxygène présent(s) dans toutes les cibles et sondes biologiques à titre d'élément(s) à quantifier pour la détection dans le plasma, à l'étape b), des raies d'émission atomiques de ces éléments, permet(tent) ainsi d'évaluer la quantité de matériel global (i.e. sondes + cibles) présent sur le support, à la condition précitée que ce support ne contienne pas de carbone, d'azote ni d'oxygène.
Afin d'améliorer les limites de détection, on peut 25 avantageusement : (i) mettre en oeuvre la technique LIBS en effectuant une double impulsion laser de type double pulse LIBS , et/ou (ii) utiliser cette technique LIBS en parallèle avec la technique LIF (i.e. une combinaison LIBS-LIF ), et/ou 30 (iii) soumettre le plasma confiné et/ou la surface du matériau à un rayonnement de micro-ondes capable d'échauffer les molécules polaires que sont les biomolécules.
Via ces trois méthodes préférentielles (i), (ii) et (iii), on parvient notamment à induire plus facilement chaque plasma et à augmenter l'intensité et la durée de vie des raies d'émission atomiques des éléments visés, ceci permettant d'obtenir un meilleur rapport signal sur bruit et d'abaisser ainsi d'un facteur au moins égal à dix le seuil de détection dudit élément à quantifier et donc des cibles dont il est issu. Concernant spécifiquement cette méthode (i) de double impulsion laser, elle peut être mise en oeuvre avec deux autres faisceaux croisés pour l'impulsion seconde (puissance, fréquence, longueur d'onde), de même nature que ceux des impulsions premières. En effet, compte tenu de la durée de vie d'environ 2 ps du plasma, ce dernier est optiquement analysable à partir de 100 ns environ après sa formation (fin du rayonnement de type corps noir et émergence des raies atomiques et ioniques recherchées). Cette seconde impulsion laser, peu de temps avant son extinction, permet de prolonger la durée de vie du plasma et d'amplifier l'émission émise. On choisit avantageusement une longueur d'onde caractéristique de l'atome pour laquelle le ou les atome(s) visés ont une forte absorption ou émission. Il est ainsi possible d'augmenter l'émission lumineuse des ions et/ou des atomes ciblés (en l'occurrence le phosphore), en exaltant leur fluorescence propre par cette seconde impulsion laser. Selon une autre caractéristique du procédé selon l'invention, l'ablation de matière à la surface du support d'analyse biologique et la formation du plasma peuvent être découplées. Dans ce cas, une première impulsion laser UV ablate une partie de la surface de la biopuce et l'expuïse au-dessus de celle-ci, puis une seconde impulsion utilisant avantageusement un laser de type femtoseconde à une fréquence de 600 Hz à 1 GHz crée le plasma et génère l'émission caractéristique de ses constituants. Eventuellement, une troisième impulsion peut être ensuite utilisée pour exalter la fluorescence des composés ciblés.
Le procédé selon l'invention permet ainsi de détecter efficacement, rapidement et sans marquage des cibles biomoléculaires, notamment à partir de la fluorescence des atomes constitutifs des molécules d'acides nucléiques après l'émission d'un plasma. Pour disposer d'une mesure véritablement quantitative de ces molécules d'acides nucléiques, on procède nécessairement à la calibration précitée des cibles via une normalisation de leurs tailles respectives.
Un dispositif selon l'invention pour la mise en oeuvre du procédé de mesure quantitative précité comporte : - un support d'analyse biologique de préférence sensiblement plan, tel qu'une biopuce par exemple à matrice de sondes, une membrane de 10 transfert ou un gel d'électrophorèse ou de chromatographie, - une unité de génération de plasma qui comprend des moyens pour focaliser et superposer sur chaque point de mesure au moins deux faisceaux laser par croisement simultané de ces faisceaux sur ce support pour en extraire un plasma chaud contenant au moins un élément 15 chimique à quantifier, tel que le phosphore, qui est présent dans les cibles, - des moyens de confinement optique de chaque plasma extrait par cette unité de génération de plasma, agencés au-dessus de ce support, et -une unité de spectrographie qui est reliée à ces moyens de 20 confinement par des fibres optiques d'acquisition débouchant dans lesdits moyens de confinement, et qui est adaptée pour détecter et analyser des raies lumineuses d'émission du plasma extrait pour chaque point de mesure, de telle sorte que l'on détermine la concentration dans chaque point de mesure dudit ou desdits élément(s) à quantifier à partir de l'une des intensités 25 de ces raies et à partir de courbes de calibration. Selon une autre caractéristique de l'invention, lesdits moyens pour focaliser et superposer les faisceaux peuvent comprendre essentiellement : - une tête de balayage qui est apte à mettre en forme ces 30 faisceaux de manière colinéaire et qui comporte : * une pyramide de renvoi retournée comprenant au moins un étage conçu pour réfléchir tangentiellement des faisceaux incidents émis par plusieurs sources laser de sorte à les rendre colinéaires en sortie de cette pyramide, et * un système optique afocal agencé en dessous du sommet de cette pyramide, de préférence un télescope réducteur de faisceaux, conçu pour recevoir ces faisceaux colinéaires en réduisant leurs diamètres et les distances les séparant mutuellement, et -un système de miroirs plans, paraboliques ou ellipsoïdaux qui est agencé en sortie de ladite tête de balayage et qui coopère avec des disques optiques rotatifs à miroirs les déviant dans des directions horizontale et verticale et, de préférence, qui coopère en outre avec un périscope de déviation couplé à ces disques pour que les faisceaux colinéaires réduits par ce système afocal soient focalisés et croisés sur chaque point de mesure.
Selon le premier mode précité de réalisation de l'invention, lesdits moyens de confinement sont aptes à confiner optiquement chaque plasma extrait et comportent une pluralité de chambres ouvertes qui sont chacune délimitées par une paroi latérale agencée perpendiculairement audit support, la face interne de cette paroi étant apte à réfléchir la lumière accumulée dans cette chambre et en particulier les longueurs d'onde des raies desdits éléments chimiques à quantifier, et au rnoins l'une desdites fibres optiques d'acquisition traversant cette paroi. Selon un premier exemple de ce premier mode de l'invention, lesdits moyens de confinement optique de chaque plasma peuvent comprendre une pluralité d'anneaux adjacents d'intégration de la lumière émise par ce plasma, ladite paroi latérale étant de section sensiblement circulaire, l'extrémité libre de plusieurs desdites fibres d'acquisition débouchant à l'intérieur de la chambre formée par chaque anneau par des orifices ménagés dans ladite paroi. Selon un second exemple de ce premier mode de l'invention, 3C lesdits moyens de confinement optique de chaque plasma peuvent comprendre une pluralité de chambres d'intégration de la lumière émise par ce plasma, ladite paroi latérale de chaque chambre étant de section sensiblement en forme de triangle équilatéral et ces chambres étant deux à deux contiguës par l'un de leurs côtés en étant chacune pourvues desdites fibres d'acquisition en chacun de leurs trois sommets. Conformément à ces premier et second exemples, des moyens de déplacement relatif des chambres par rapport au support, tels que des rails de coulissement desdites chambres équipés d'électroaimants, sont avantageusement: prévus pour couvrir toute la surface à analyser du support. Selon un troisième exemple de ce premier mode de l'invention, lesdits moyens de confinement optique de chaque plasma peuvent comprendre une Dluralité de chambres d'intégration de la lumière émise par ce plasma qui sont équipées d'au moins deux séries de fibres d'acquisition disposées en quinconce, dont les ouvertures optiques respectives sont aptes à couvrir par chevauchement mutuel toute la surface à analyser dudit support. Dans ce troisième exemple, le dispositif selon l'inveritior n'utilise alors pas de déplacement relatif des chambres de confinement optique par rapport au support d'analyse. Selon le second mode précité de réalisation de l'invention, lesdites chambres de confinement optique des plasmas extraits sont elles-mêmes logées dans une enceinte close qui contient le support et qui est remplie d'un gaz plasmogène tel que de l'argon, de l'hélium, de l'azote ou un mélange de ces gaz, au moins la face supérieure de cette enceinte étant transparente à la ou chaque longueur d'onde d'excitation des faisceaux laser et aux longueurs d'onde d'acquisition de la lumière générée par ce plasma, cette enceinte étant équipée d'une valve de remplissage en gaz plasmogène et d'une valve de purge d'air. Comme indiqué précédemment, le support d'analyse biologique utilisé en relation avec le dispositif selon l'invention est de préférence formé d'une biopuce comprenant à sa surface une matrice de sondes natives, hybridées ou complexées par lesdites cibles, cette matrice comportant une multitude desdits points de mesure comprenant chacun une pluralité desdites sondes et ledit ou chaque élément chimique à quantifier étant présent dans ces cibles et, optionnellement, en outre dans ces sondes.
Selon une autre caractéristique de l'invention, ladite unité de spectrographie comprend au moins un spectrographe de type photomultiplicateur, et un filtre optique transparent uniquement à la longueur d'onde souhaitée peut être agencé entre chaque fibre optique d'acquisition et ledit spectrographe. Selon une autre caractéristique préférentielle de l'invention, l'unité de spectrographie comprend au moins un détecteur de type photomultiplicateur. On notera toutefois que l'on pourrait également utiliser pour la détection des raies d'émission du plasma, une caméra de type CCD ou CCD intensifiée ( Charge Coupled Device , i.e. dispositif à couplage de charge) ou bien une galette de micro-canaux. Egalement à titre préférentiel, un filtre optique transparent uniquement à la longueur d'onde souhaitée peut être agencé entre chaque 15 fibre optique d'acquisition et le spectrographe. Dans un mode de réalisation préférentiel, chacune des fibres optiques d'acquisition provenant des moyens de confinement optique (i.e. chaque fibre mère ) se divise en autant de fibres qu'il y a de longueurs d'onde d'éléments à observer. Chaque fibre mère est disposée dans un 20 faisceau en vis-à-vis d'un détecteur qui peut être une cellule photosensible telle qu'un photomultiplicateur ( PM en abrégé), un Channel Tron , une galette de micro-canaux, etc. Un filtre optique ne sélectionnant que la longueur d'onde souhaitée peut être intercalé entre chaque fibre optique d'acquisition et le détecteur, pour injecter la lumière dans ce dernier. De plus, 25 une lentille adéquate peut être collée en sortie de chaque fibre optique. D'une manière générale, on notera que ces filtres peuvent être avantageusement remplacés par des réseaux de diffraction.
Les caractéristiques précitées de la présente invention, ainsi 30 que d'autres, seront mieux comprises à la lecture de la description suivante de plusieurs exemples de réalisation de l'invention, donnés à titre illustratif et non limitatif, ladite description étant réalisée en relation avec les dessins joints, parmi lesquels : la figure 1 est une vue latérale schématique d'une unité de génération de plasma qui est incluse dans un dispositif de mesure quantitative selon l'invention et qui est illustrée en relation avec un support d'analyse biologique incorporant les cibles biomoléculaires à quantifier, la figure 2 est une vue schématique, partiellement en coupe et en perspective, d'une pyramide de renvoi optique incluse dans une tête de balayage laser de l'unité de génération de plasma de la figure 1, la figure 3 est une vue schématique en perspective d'une variante simplifiée de la pyramide de renvoi selon la figure 2, la Igure 4 est une vue schématique partielle de dessus du support d'analyse de la figure 1 qui est surmonté de moyens de confinement optique des plasmas respectivement générés en divers points de mesure, selon un exemple d'un premier mode de réalisation de l'invention, la figure 5 est une vue schématique en section verticale selon le plan de coupe V-V de la figure 4 de l'un de ces moyens de confinement, la figure 6 est une vue schématique en section verticale selon une variante de la figure 5 de l'un de ces moyens de confinement optique agencé au-dessus du support d'analyse, la figure 7 est une vue schématique en section verticale selon une autre variante de la figure 5 d'un tel moyen de confinement optique, la figure 8 est une vue schématique en section vertical-e selon une autre variante de la figure 5 d'un tel moyen de confinement optique, la figure 9 est une vue schématique partielle de dessus du support d'analyse de la figure 1 surmonté de moyens de confinement optique des plasmas selon un autre exemple de ce premier mode de l'invention, la figure 10 est une vue schématique partielle de dessus du support d'analyse de la figure 1 surmonté de moyens de confinement optique des plasmas selon un autre exemple de ce premier mode de l'invention, la figure 11 est une vue schématique partielle de dessus du support d'analyse de la figure 1 surmonté des moyens de confinement optique selon l'exemple de la figure 9, illustrant en outre des organes de commande du déplacement de ces moyens de confinement par rapport à ce support dans une position donnée, la figure 12 est une vue analogue à la figure 11 montrant ces 5 organes de commande du déplacement des moyens de confinement dans une autre position de fonctionnement, et la figure 13 est une vue latérale schématique du support: d'analyse de la figure 1 qui est logé dans des moyens de confinement des plasmas selon un second mode de réalisation de l'invention, laquelle enceinte 10 est illustrée avec une partie de l'unité de génération de plasma adjacente.
Le dispositif de mesure quantitative 1 selon l'invention de cibles biomoléculaires comporte : - un support d'analyse biologique 2 de préférence 15 sensiblement plan, tel qu'une biopuce par exemple à matrice de sondes, une membrane de transfert ou un gel d'électrophorèse ou de chromatographie, - une unité de génération de plasma 3 (voir figure 1) qui comprend des moyens 4 pour focaliser et superposer sur chaque point de mesure au moins deux faisceaux laser par croisement simultané de ces 20 faisceaux sur ce support 2 pour en extraire un plasma chaud P (visible aux figures 5 et 13) contenant au moins un élément chimique à quantifier présent dans ces cibles, - des moyens de confinement 5 de chaque plasma P extrait par cette unité 3, agencés au-dessus du support 2 (voir figures 4 et 25 suivantes), et - une unité de spectrographie (non illustrée) qui est reliée à ces moyens de confinement 5, 5', 5" par des fibres optiques d'acquisition 6, 6', 6" (visibles aux figures 4 et suivantes) débouchant dans ces moyens de confinement 5, 5', 5", et qui est adaptée pour détecter et analyser des raies 30 lumineuses d'émission du plasma P extrait pour chaque point de mesure. de telle sorte que l'on détermine la concentration dans chaque point de mesure de l'élément à quantifier à partir de l'une des intensités de ces raies et à partir de courbes de calibration.
Les moyens de focalisation 4 des faisceaux laser F sur 5 chaque point de mesure comprennent essentiellement, en référence à la figure 1 : - une tête de balayage 7 qui est apte à mettre en forme ces faisceaux F de manière colinéaire et qui comporte : * une pyramide de renvoi 8 retournée comprenant au 1 o moins un étage 8a conçu pour réfléchir tangentiellement des faisceaux F incidents émis par plusieurs sources laser 9 de sorte à les rendre colinéaires en sortie de cette pyramide 8 via des miroirs de haute qualité en aluminium 8b, et * un système optique afocal 10 agencé en dessous du 15 sommet de cette pyramide 8, de préférence un télescope réducteur de faisceaux, qui est conçu pour recevoir ces faisceaux colinéaires F' en réduisant leurs diamètres respectifs et les distances les séparant mutuellement, et - un système de miroirs plans, paraboliques ou ellipsoïdaux 20 11 qui est agencé en sortie de la tête de balayage 7 et qui coopère avec des disques optiques rotatifs 12 et 13 à miroirs 12a et 13a les déviant dans des directions horizontale et verticale et, de préférence, qui coopère en outre avec un périscope de déviation 14 couplé à ces disques 12 et 13 pour que les faisceaux colinéaires F' réduits par ce système afocal 10 soient focalisés et 25 croisés sur chaque point de mesure. On utilise cette tête de balayage 7 comme suit. Les différents faisceaux laser F (au nombre de deux dans l'exemple de la figure 1) se réfléchissent tangentiellement sur les miroirs 8b de haute qualité de la pyramide de renvoi 8 qui assurent leur colinéarité, pour 30 un angle quelconque de la direction d'incidence de ces faisceaux F (préférentiellement, cet angle est égal à 90°).
Comme illustré aux figures 2 et 3, la pyramide de renvoi 8, 8' peut présenter un unique étage 8a (figure 3) en utilisant par exemple quatre sources laser 9 distinctes, ou bien plusieurs étages 8a pouvant aller typiquement jusqu'à cinq (figure 2) en utilisant dans ce cas par exemple un maximum de cent sources laser 9 en parallèle. Il est à noter que l'augmentation du nombre de sources 9 permet en particulier d'augmenter la résolution du balayage, avec une couverture spatiale plus importante des faisceaux sur la zone de balayage. En sortie de la pyramide 8, les faisceaux colinéaires F' passent à travers le télescope 10 réducteur de faisceaux, constitué d'un système de lentilles multiples superposées réduisant le diamètre et l'éloignement mutuel de ces faisceaux colinéaires F'. Par exemple, des faisceaux F' d'un diamètre de 2 mm et espacés de 2,5 mm en sortie de la pyramide 8 sont réduits, en sortie du télescope 10, à un diamètre de 500 prri et un espacement de 500 pm. Ces faisceaux colinéaires F' une fois réduits sont ensuite balayés sur le support d'analyse 2 par les deux disques optiques rotatifs horizontaux 12 et verticaux 13 à miroirs 12a et 13a ( ORD pour optica rotating disc ) assurant respectivement des déviations horizontales e1 verticales des faisceaux, ainsi que le périscope de déviation 14. Ces disques optiques 12 et 13 peuvent être suivant les besoins de type monopiste ou multipistes (i.e. avec une ou plusieurs rangées concentriques de miroirs), en fonction du nombre de sources 9, de l'encombrement, de la résolution, etc. Le dispositif de mesure 1 selon l'invention comprend en outre un système de commande électronique (non illustré) pour piloter et contrôler précisément les vitesses de rotation de ces disques optiques 12 et 13. On notera que la réduction du motif cptique des faisceaux laser F' par le télescope 10 permet de faire se réfléchir tous ces faisceaux F' sur le seul miroir 12a du disque rotatif horizontal 12 et le seul miroir 13a du disque rotatif vertical 13, afin de les faire converger vers un point identique à la surface du support 2. Chaque miroir 12a, 13a est en effet positionné de façon unique sur les disques rotatifs 12 et 13 en termes d'angle d'inclinaison, de manière à faire converger les différents faisceaux F" sur une zone bien localisée du support 2. Pour des raisons d'encombrement, la distance entre les deux disques rotatifs 12 et 13 est de préférence réduite par l'ajout du périscope de déviation 14 qui ajoute deux réflexions supplémentaires sur le parcours des faisceaux. La focalisation des différents faisceaux F" sur le support 2 peut être assurée par le système afocal 10, en jouant notamment sur l'écartement des optiques, par des miroirs paraboliques qui sont positionnés sur le disque optique rotatif vertical 13 situé en sortie de la tête de balayage 7, par un système annexe composé de lentilles et/ou de miroirs de focalisation en sortie de la tête de balayage 7, en jouant sur l'inclinaison des miroirs de la pyramide pour rendre les faisceaux F' destinés à se croiser légèrement non colinéaires.
Dans certains modes de réalisation, avec une configuration utilisant des groupes d'au moins deux faisceaux, seuls les faisceaux de chaque groupe destinés à être croisés sur le support 2 seront colinéaires,de telle manière que seuls les faisceaux colinéaires de chaque groupe convergent en un rnême point du support 2.
A la sortie de cette tête de balayage 7, chaque faisceau laser F" est focalisé sur Pa surface à analyser du support 2 par les miroirs de la tête 7 et les faisceaux sont croisés en au moins un point de mesure de cette surface. Le croisement de chaque faisceau présente une densité de puissance ou irradiance à la surface de chaque point de mesure qui est supérieure à 0,5 G'W.cm-2 qui est suffisante pour l'obtention par vaporisation d'un plasma chaud P à durée de vie d'environ 2 ps, de manière générale à un seuil de puissance par unité de surface supérieur au seuil d'ablation du matériau du support.
A ces très hautes densités d'énergie, une partie du matériau de chaque point de mesure est en effet éjectée de la surface à analyser par vaporisation et ce plasma chaud P, très lumineux et à durée de vie très courte, est ainsi généré. Ce matériau ablaté sous forme de plasma P est dissocié en ses divers constituants atomiques et ioniques et, à la fin de chaque impulsion laser, ce plasma P se refroidit rapiclement. Durant cette période, les atomes et les ions excités émettent des radiations lumineuses qui leur sont caractéristiques, du fait de leur retour à des niveaux d'énergies plus bas.
Les figures 4 à 12 illustrent des exemples de structures utilisables pour les moyens de confinement optique 5, 5', 5" de chaque 1 o plasma P généré, pour qu'il n'interfère pas avec les autres points de mesure à analyser, avant détection simultanée des raies d'émissions du plasma P correspondant à chaque croisement de faisceaux. Comme indiqué précédemment, l'analyse optique du plasma P généré point par point à la surface du support d'analyse biologique 2 permet de reconstituer une image 15 en chaque point de mesure de la quantité d'atomes de l'élément analysé, permettant d'en déduire le nombre de cibles en fonction de l'abondance de l'élément dans la fcrmule brute de la cible. Comme illustré à la figure 4, les raies d'émission du plasma P généré en chaque point de mesure peuvent par exemple être captées par 20 plusieurs fibres optiques d'acquisition 6 (au moins trois fibres optiques 6), dont les extrémités libres respectives sont disposées régulièrement sur un anneau circulaire 5 de 1 à 20 cm de diamètre et de hauteur réduite qui est conçu pour isoler optiquement ce plasma P. La face interne de la paroi latérale 5a, 5b, 5c de cet anneau 5 constitue un miroir pouvant être concave 25 (voir figures 5 et 6), à multiples facettes (voir figure 7), plan (figure 8), ellipsoïdal ou même parabolique, pourvu qu'il soit capable de réfléchir les longueurs d'onde des raies des éléments d'intérêt en formant ainsi un anneau d'intégration de la lumière émise. Les courbures ou inclinaisons des miroirs sont préférentiellement conçues pour faire converger la lumière sur la face 30 intérieure opposée de l'anneau 5. L'anneau 5 est percé à intervalles réguliers d'orifices 5d sur sa paroi latérale 5a, 5b, 5c (e.g. cylindrique dans l'exemple de la figure 5) pour recevoir les fibres optiques d'acquisition 6. En raison de son ouverture numérique, chaque fibre d'acquisition 6 peut être coiffée d'un jeu de lentilles adéquates, tel qu'un collimateur de fibre, pour injecter correctement les rayonnements émis par le plasma P dans l'unité ce spectrographie, les champs respectivement vus par les fibres 6 ainsi coiffées de lentilles correctrices, ou ouvertures optiques, se recouvrant mutuellement pour former une surface assimilable à un cercle (ou à un polygone inscrit dans un cercle), i.e. un cercle optique 16. Chaque plasma P est généré dans ce cercle optique 16, qui est tel que le chemin optique cumulé de la lumière du plasma P vers les fibres 6 est constant quelle que soit la position du plasma P dans ce cercle 16. Dans la variante de la figure 9, les chambres 5' de confinement optique du plasma P ont chacune une forme de triangle équilatéral et présentent chacune le même type de face interne de paroi latérale 5a' que les anneaux 5 précités. Aux trois sommets de chaque triangle 5' sont respectivement disposées trois fibres optiques d'acquisition 6' avec pour chacune une ouverture optique supérieure ou égale à 60°, de manière à capter la lumière directe du plasma P correspondant et celle qui se réfléchit sur les parois du triangle 5'. On peut avantageusement agencer une série de tels triangles équilatéraux 5' de manière à décrire un parallélogramme englobant toute la surface du support 2. Ainsi, les faisceaux laser, croisés, convergés et déplacés par les miroirs précités, balayent avec le pas souhaité l'ensemble de chaque cercle optique 16 selon la figure 4 ou de chaque triangle optique 5' selon le figure 9, générant en chaque point un plasma P dont la lumière est captée par l'ensemble des fibres d'acquisition 6, 6' associées. On notera que la lumière cumulée qui est capturée par les fibres 6 de chaque cercle optique 16 ou celles 6' de chaque triangle optique 5' a une intensité indépendante de la position du plasma P dans ce cercle 16 ou triangle optique 5', respectivement.
Ce procédé permet le balayage de toute la surface à analyser par les faisceaux laser croisés avec, par exemple, un pas de 10 pm qui correspond à la zone ablatée à chaque impulsion laser, les chambres de confinement optique 5, 5' permettant l'acquisition simultanée de plusieurs plasmas P. Pour permettre l'analyse des surfaces à l'aplomb des parois 5a, 5b, 5c ou 5a' de ces chambres de confinement optique 5, 5', il est nécessaire de réaliser un déplacement relatif du support d'analyse biologique 2 par rapport à ces chambres 5, 5' qui, de préférence, est réalisé en déplaçant ces dernières par rapport au support d'analyse 2 qui reste fixe. Comme illustré aux figures 11 et 12 ces chambres de confinement optique 5' (dans cet exemple triangulaires) peuvent coulisser le long de guides ou de rails 17 via des organes de support 17a de ces derniers agencés de chaque côté du support d'analyse 2, sous la commande de deux électroaimants 18 qui sont disposés à l'extérieur et de part et d'autre du support 2 et qui attirent alternativement ces chambres 5, 5', respectivement en association avec deux butées métalliques 17b pour ces électroaimants 18.
Dans la variante de la figure 10, on procède à une analyse de la surface du support 2 sans déplacement relatif des chambres de confinement optique 5" par rapport au support 2, en disposant en quinconce des fibres optiques d'acquisition 6" latéralement de part et d'autre du support 2. De par cette disposition, l'ensemble des ouvertures optiques respectives des fibres d'acquisition 6" englobe la totalité de la surface du support 2. Un léger recouvrement 19 des ouvertures optiques des fibres optiques 6" latéralement de part et d'autre du support 2 permet ainsi l'analyse des surfaces situées à l'aplomb des limites de ces ouvertures optiques. Selon un autre mode de réalisation de l'invention illustré à la figure 13, le support 2 à analyser ainsi que les moyens 5, 5' précités de confinement optique (dans cet exemple constitués des anneaux 5) sont tous disposés dans une enceinte 20 close, dont au moins la face supérieure 21 est prévue transparente aux longueurs d'onde d'excitation des faisceaux laser et aux longueurs d'onde d'acquisition de la lumière générée par ce plasma P.
L'air contenu dans cette chambre 5 est vidé grâce à une valve de purge d'air 22, puis la chambre est emplie d'un gaz plasmogène (e.g. argon/azote, hélium) grâce à une valve de remplissage 23, ces valves 22 et 23 étant montées dans la face inférieure de support 24 de l'enceinte 20.
En conclusion, on notera que l'analyse optique du plasma P généré point par point à la surface du support 2 permet de reconstituer une image de la quantité d'atomes de l'élément recherché en chaque point de mesure. En utilisant plus de deux lasers, il est en outre possible de générer simultanément plusieurs plasmas P sur le support biologique 2 à analyser. Dans ces conditions, une unité de confinement optique est prévue par plasma généré. Les zones du support 2 masquées par cette unité peuvent être analysées après une translation relative de ces zones à l'intérieur de l'unité de confinement optique, telle que le cercle 5 ou le triangle optique 5' précités On notera que les géométries décrites pour la cartographie par LIBS des supports d'analyse biologique, sont également applicables aux cartographies par LIBS de surfaces relativement planes comprenant des supports non biologiques (minéraux ou organiques) à analyser.20
Claims (18)
1) Procédé de mesure quantitative à haute cadence de cibles biomoléculaires, en particulier des protéines, présentes sur ou dans un 5 support d'analyse biologique (2), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on focalise et l'on superpose sur chaque point de mesure de ce support au moins deux faisceaux laser (F") par croisements simultanés de ces faisceaux, pour en extraire un plasma chaud (P) confiné comprenant 10 au moins un élément chimique à quantifier présent dans lesdites cibles et au moins un autre élément chimique exogène à ces cibles et présent en quantité connue sur ou dans ce support, b) on détecte et l'on analyse, pour chacun de ces points de mesure, des raies lumineuses d'émission de chaque plasma qui 15 correspondent au ou à chaque élément à quantifier et au ou à chaque élément exogène, en mesurant les intensités respectives de ces raies, puis c) on détermine, via un étalonnage préalable des raies du ou de chaque élément à quantifier établissant une corrélation entre les intensités des raies propres à cet élément à quantifier et les concentrations de ce 20 dernier dans des mélanges en proportions connues du ou de chaque élément à quantifier et du ou de chaque élément exogène, la concentration dans chaque point de mesure du ou de chaque élément à quantifier ou d'un groupe l'incorporant au sein de ces cibles. 25
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape ultérieure d'obtention d'une image représentative de la concentration dudit ou de chaque élément à quantifier ou dudit ou de chaque élément exogène, l'intensité de chaque pixel ou bien de chacune des trois couleurs de ce dernier au sein de cette image étant 30 représentative de l'intensité de la raie de l'élément correspondant observé.
3) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que chacun desdits faisceaux laser (F) utilisés à l'étape a) est émis dans la gamme infrarouge û visible - ultraviolet selon une impulsion de durée comprise entre 1 fs et 100 ns, avec une fréquence comprise entre 600 Hz et 1 GHz et une énergie comprise entre 0,05 mW et 1 kW.
4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdits faisceaux laser (F) sont émis selon une impulsion de durée inférieure a ns et de préférence égale à 5 ns, par exemple soit dans le domaine 10 ultraviolet à une même longueur d'onde de 266 nm ou de 193 nm, soit dans l'ultraviolet à 266 nm et dans le visible à 532 nm.
5) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits faisceaux (F") sont mis en forme à l'étape a 1 15 dans une tête de balayage (7), de telle manière que : - ces faisceaux se réfléchissent tangentiellement sur une pyramide de renvoi (8) à au moins un étage de réflexion (8a) pour donner en sortie de cette pyramide des faisceaux colinéaires (F'), - ces faisceaux colinéaires passent à travers un système 20 optique afocal (10), tel qu'un télescope réducteur de faisceaux, qui réduit les diamètres respectifs de ces faisceaux et les distances les séparant mutuellement, puis que - ces faisceaux colinéaires réduits soient ensuite focalisés et croisés sur chaque point de mesure par des miroirs plans, paraboliques ou 25 ellipsoïdaux (11) agencés en sortie de ladite tête de balayage.
6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdits faisceaux colinéaires (F') réduits sont focalisés et croisés sur chaque point de mesure dudit support (2) par deux disques optiques rotatifs (12 et 13) 30 à miroirs (12a et 13a) les déviant respectivement dans des directions horizontale et verticale et de préférence par un périscope de déviation (14) couplé à ces disques.
7) Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que la superposition par croisements desdits faisceaux laser (F") mise en oeuvre à l'étape a) génère une densité de puissance en chaque point de mesure qui est supérieure à 0,5 GW.cm-2, pour l'obtention par vaporisation de chaque plasma chaud (P) qui présente une durée de vie d'environ 2 ps.
8) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on adjoint à chaque plasma (P) confiné au moins un agent d'activation formé d'un gaz plasmogène, tel que de l'argon, de l'hélium, de l'azote ou un mélange de ces gaz.
9) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits plasmas (P) extraits sont respectivement confinés optiquement dans des chambres (5, 5', 5") d'intégration de la lumière émise par le plasma correspondant qui présentent chacune une paroi latérale (5a, 5b, 5c, 5a') réfléchissante et qui sont chacune munies d'au moins une fibre optique d'acquisition (6, 6', 6") de la lumière accumulée dans cette chambre, de telle sorte que chaque plasma n'interfère pas avec les autres points de mesure à analyser.
10) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on soumet lors de l'étape a) ledit support d'analyse biologique (2) à un mouvement relatif par rapport aux chambres de confinement optique (5, 5'), lesquelles sont de préférence guidées au-dessus dudit support qui reste fixe, en même temps que l'on fait se croiser lesdits faisceaux laser (F").
11) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on utilise un chevauchement mutuel (19) des ouvertures optiques respectives desdites fibres optiques d'acquisition (6"), en agençant ces dernières en quinconce au-dessus du support (2) pour couvrir toute la surfaceà analyser de ce dernier sans déplacement relatif de ces chambres (5") par rapport audit support.
12) Procédé selon une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que lesdites chambres de confinement optique (5') des plasmas (P) extraits sont elles-mêmes logées dans une enceinte close (20) qui contient ledit support (2), qui est remplie dudit gaz plasmogène et dont au moins la face supérieure (21) est transparente à la ou chaque longueur d'onde d'excitation desdits faisceaux laser et aux longueurs d'onde d'acquisition de la lumière générée par ce plasma.
13) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise la technique de spectroscopie d'émission optique induite par laser ( LIBS ) pour la mise en oeuvre des étapes a) à c), de préférence avec l'utilisation en parallèle de la technique de fluorescence induite par laser ( LIF ).
14) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites cibles biomoléculaires sont choisies dans le groupe constitué par les acides nucléiques non marqués, les protéines, les peptides, les polypeptides, les polynucléotides tels que de l'ADN et les sucres.
15) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on immobilise préalablement à l'étape a) lesdites cibles biomoléculaires à la surface ou dans l'épaisseur dudit support (2), lequel est sensiblement plan et est choisi dans le groupe constitué par les biopuces, les membranes de transfert, les substrats en silicium, en polyimide et en verre, et les gels d'électrophorèse et de chromatographie.
16) Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit support d'analyse biologique (2) est formé d'une biopuce comprenant àsa surface une matrice de sondes natives, hybridées ou complexées par lesdites cibles, cette matrice comportant une multitude desdits points de mesure comprenant chacun une pluralité desdites sondes et ledit ou chaque élément chimique à quantifier étant présent dans lesdites cibles et, optionnellement, en outre dans lesdites sondes.
17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que lesdites sondes sont choisies dans le groupe constitué par les acides nucléiques, les acides nucléiques peptides ( PNA ), les acides nucléiques verrouillés ( LNA ), les éthers ribonucléiques ( ERN ), les anticorps, les hémi-anticorps, les hémi-anticorps couplés avec des acides nucléiques et des récepteurs protéiques.
18) Procédé selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en 15 ce que l'on immobilise préalablement à l'étape a) lesdites cibles biomoléculaires par des interactions sondes / cibles qui sont : - toutes deux à base de protéines, telles que des interactions ligand / récepteur ou anticorps / antigène fixé, ou - des interactions mixtes acide nucléique ou assimilé / 20 protéine, ou bien - des interactions de type acide nucléique / métal, ion ou toute autre molécule libre, ou encore - des interactions de type protéine / ion ou toute autre molécule libre. 22) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on dépose de manière homogène ledit ou chaque élément exogène en quantité connue sur ledit support d'analyse (2). 23) Procédé selon une des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que l'on dépose ledit ou chaque élément exogène en quantité connue sur ledit support d'analyse (2) spécifiquement avec lesdites 25 30sondes, cet élément exogène étant soit inclus dans des composés greffés sur ce support conjointement aux sondes dans des proportions connues, soit directement implantés dans la structure de chaque sonde par substitution atomique ou interaction forte. 21) Procédé selon une des revendications précédentes caractérisé en ce que ledit ou chaque élément chimique à quantifier est chois dans le groupe constitué par le phosphore, le soufre, l'iode, l'azote, l'oxygène et le carbone. 10 22) Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que l'on utilise à titre de cibles des acides nucléiques ou des protéines phosphorylées, et en ce que l'on utilise le phosphore présent dans ces cibles à titre d'élément à quantifier pour la détection dans le plasma, à l'étape b), de 15 raies d'émission atomiques et ioniques du phosphore. 23) Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape b) les raies d'émission du phosphore à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 138 3 nm, 148 20 3 nm, 154 3 nrn, 167 3 nm, 177 3 nm, 190 3 nm, 193 3 nm, 203 3 nm, 213 3 nm et 253 3 nm, et qui est de préférence de 203 3 nm. 24) Procédé selon une des revendications 16 à 18 et selon une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que l'on utilise des acides 25 nucléiques, par exemple marqués au soufre ou à l'iode, ou des protéines à titre de cibles et de sondes, et en ce que l'on utilise le soufre et l'iode respectivement dans lesdites cibles et lesdites sondes à titre d'élément: à quantifier pour la détection dans le plasma (P), à l'étape b), de raies d'émission atomiques et ioniques du soufre et de l'iode. 30 25) Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape b) les raies d'émission du soufre à une longueur d'onde5de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 167 3 nm, 181 3 nm, 190 3 nm, 199 3 nm, 415 3 nm, 458 3 nm, 922 3 nm, 942 3 nm, 968 3 nm et qui est de préférence de 415 3 nm, et les raies d'émission de l'iode à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 150 3 nm, 161 3 nm, 170 3 nm, 178 3 nm, 183 3 nm, 511 3 nm, 661 3 nm, 740 3 nm, 746 3 nm, 804 3 nm, 839 nm, 902 3 nm, 905 3 nm, 911 3 nm et 973 3 nm et qui est de préférence de 511 3 nm. 26) Procédé selon la revendication 24 ou 25, caractérisé en ce que l'on utilise le chlore ou le brome à titre d'élément exogène auxdites cibles et auxdites sondes, pour la détection dans le plasma (P) à l'étape b) de raies d'émission atomiques et ioniques du soufre et de l'iode, respectivement, pour lever l'indétermination des signaux générés tant par ces sondes que par ces cibles. 27) Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape b) : - les raies d'émission du chlore à une longueur d'onde de 20 nm, 912 3 nm, 919 3 nm,928 3 nm, 945 3 nm et 959 3 nm ; ou bien 25 - les raies d'émission du brome à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 154 3 nm, 158 3 nm, 163 3 nm, 614 3 nm, 635 3 nm, 655 3 nm, 663 3 nm, 751 3 nm, 780 3 nm, 793 3 nm, 798 3 nm, 813 3 nm, 827 3 nm, 844 3 nm, 889 3 nm, 916 3 nm et 926 3 nm. 30 28) Procédé selon la revendication 14 et selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce que l'on utilise pour lesdites cibles valeur choisie dans le groupe constitué par 35 3 nm, 386 3 nm, 413 3 nm, 479 3 nm, 490 3 nm, 499 3 nm, 507 3 nm, 521 3 nm, 539 3 nm, 542 3 nm, 774 3 nm, 725 3 nm, 741 3 nm, 754 3 nm, 822 : 3 nm, 833 3 nm, 837 3 nm, 842 3 nm, 858 3 nm, 868 3 nm, 894 : 3de l'ADN et en ce que l'on utilise à titre d'élément à quantifier un cation lié à ces cibles et choisi dans le groupe constitué par le sodium, le magnésium et le potassium pour la détection dans le plasma, à l'étape b), de raies d'émission atomiques et ioniques du phosphore. 29) Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape b) : - les raies d'émission du sodium à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 268 3 nm, 285 3 nm, 29'1 3 nm, 292 3 nm, 298 3 nm, 314 3 nm, 321 3nm, 325 3 nm, 330 3 nm, 353 3 nm, 363 3 nm, 449 3 nm, 466 3 nm, 497 3 nm, 569 3 nm, 589 3 nm, 616 3 nm et 819 3 nm ; ou - les raies d'émission du magnésium à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 285 3 nrn, 880 3 nm, 309 3 nm, 333 3 nm, 383 3 nm, 457 3 nm, 473 3 nm, 518 3 nm, 552 3 nm, 571 3 nm, 925 3 nm, 964 3 nm et 941 3 nm ; ou encore - les raies d'émission du potassium à une longueur d'onde de valeur choisie dans le groupe constitué par 404 3 nm, 535 3 nm, 580 3 nm, 693 3 nm, 766 3 nm, 769 3 nm, 825 3 nm, 850 3 nm, 890 3 2o nm et 959 3nm. 30) Procédé selon une des revendications 16 à 18 et selon une des revendications 21 à 29, caractérisé en ce que l'on utilise l'azote et/ou le carbone et/ou l'oxygène présent(s) dans lesdites cibles et lesdites sondes à 25 titre d'élément(s) à quantifier pour la détection dans le plasma (P), à l'étape b), des raies d'émission atomiques de l'azote et/ou du carbone et/ou de l'oxygène pour évaluer la quantité de cibles et de sondes sur ledit support (2), lequel ne contient ni carbone, ni azote, ni oxygène. 30 31) Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape b) :- les raies d'émission de l'azote à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 174 3 nm, 575 3 nm, 744 3 nm, 821 3 nm, 859 3 nm, 865 3 nm, 871 3 nm, 938 3 nrn et 870 3 nm, et qui est de préférence de 575 3 nm ; - les raies d'émission du carbone à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 156 3 nm, 165 3 nm, 175 3 nm, 193 3 nm, 247 3 nm, 538 3 nm, 600 3 nm, 711 3 nm, 833 3 nm, 908 3 nm, 911 3 nm, 965 3 nm et 940 3 nm, et qui est de préférence de 600 3 nm ; et/ou - les raies d'émission de l'oxygène à une longueur d'onde de valeur qui est choisie dans le groupe constitué par 615 3 nm, 645 3 nm, 700 3nm,725 3nm,777 3nm,822 3nm,844-F3nm et 926 3nm, et qui est de préfé-ence de 615 3 nm. 15 32) Dispositif (1) pour la mise en oeuvre d'un procédé de mesure quantitative selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte : - un support d'analyse biologique (2) de préférence sensiblement plan, tel qu'une biopuce par exemple à matrice de sondes, une 20 membrane de transfert ou un gel d'électrophorèse ou de chromatographie, - une unité de génération de plasma (3) qui comprend des moyens (4) pour focaliser et superposer sur chaque point de mesure au moins deux faisceaux laser (F") par croisement simultané de ces faisceaux sur ce support pour en extraire un plasma chaud (P) contenant au moins un 25 élément chimique à quantifier, tel que le phosphore, qui est présent dans lesdites cibles, - des moyens de confinement optique (5, 5', 5") de chaque plasma extrait par cette unité de génération de plasma, qui sont agencés au-dessus de ce support, et 30 -une unité de spectrographie qui est reliée à ces moyens de confinement par des fibres optiques d'acquisition (6, 6', 6") débouchant dans lesdits moyens de confinement, et qui est adaptée pour détecter et analyser 10des raies lumineuses d'émission du plasma extrait pour chaque point de mesure, de telle sorte que l'on détermine la concentration dans chaque point de mesure dudit ou desdits élément(s) à quantifier à partir de l'une des intensités de ces raies et à partir de courbes de calibration. 33) Dispositif (1) selon la revendication 32, caractérisé en ce que lesdits moyens (4) pour focaliser et superposer par croisement sur ledit support (2) les faisceaux laser (F") sur chaque point de mesure comprennent essentiellement : - une tête de balayage (7) qui est apte à mettre en forme ces faisceaux de manière colinéaire et qui comporte : * une pyramide de renvoi (8) retournée comprenant au moins un étage (8a) conçu pour réfléchir tangentiellement des faisceaux incidents (F) émis par plusieurs sources laser (9) de sorte à les rendre colinéaires en sortie de cette pyramide, et * un système optique afocal (10) agencé en dessous du sommet de cette pyramide, de préférence un télescope réducteur de faisceaux, qui est conçu pour recevoir ces faisceaux colinéaires (F') en réduisant leurs diamètres respectifs et les distances les séparant mutuellement, et - un système de miroirs (11) plans, paraboliques ou ellipsoïdaux qui est agencé en sortie de ladite tête de balayage et qui coopère avec des disques optiques rotatifs (12 et 13) à miroirs (12a et 13a) les déviant dans des directions horizontale et verticale et, de préférence, qui coopère en outre avec un périscope de déviation (14) couplé à ces disques pour que les faisceaux colinéaires réduits par ce système afocal soient focalisés et croisés sur chaque point de mesure. 34) Dispositif (1) selon la revendication 32 ou 33, caractérisé 30 en ce que lesdits moyens de confinement optiques (5, 5', 5") sont aptes à confiner optiquement chaque plasma (P) extrait et comportent une pluralité de chambres ouvertes qui sont chacune délimitées par une paroi latérale (5a, 5b,5c, 5a') agencée perpendiculairement audit support (2), la face interne de cette paroi étant apte à réfléchir la lumière accumulée clans cette chambre et en particulier les longueurs d'onde des raies desdits éléments chimiques à quantifier, et au moins l'une desdites fibres optiques d'acquisition (6, 6', 6") traversant cette paroi. 35) Dispositif (1) selon la revendication 34, caractérisé en ce que lesdits moyens de confinement optique de chaque plasma (P) comprennent une pluralité d'anneaux (5) adjacents d'intégration de la lumière émise par ce plasma, ladite paroi latérale (5a, 5b, 5c) étant de section sensiblement circulaire, l'extrémité libre de plusieurs desdites fibres d'acquisition (6) débouchant à l'intérieur de la chambre formée par chaque anneau par des orifices (5d) ménagés dans ladite paroi, des moyens de déplacement relatif de ces chambres par rapport au support (2), tels que des rails de coulissement (17) des chambres équipés d'électroaimants (18), étant prévus pour couvrir toute la surface à analyser dudit support. 36) Dispositif (1) selon la revendication 34, caractérisé en ce que lesdits moyens de confinement optique de chaque plasma (P) comprennent une pluralité de chambres d'intégration (5') de la lumière émise par ce plasma, ladite paroi latérale (5a') de chaque chambre étant de section sensiblement en forme de triangle équilatéral et ces chambres étant deux à deux contiguës par l'un de leurs côtés en étant chacune pourvues desdites fibres d'acquisition (6') en chacun de leurs trois sommets, des moyens de déplacement relatif des chambres par rapport au support (2), tels que des rails de coulissement (17) desdites chambres équipés d'électroaimants (18), étant prévus pour couvrir toute la surface à analyser dudit support. 37) Dispositif (1) selon la revendication 34, caractérisé en ce que lesdits moyens de confinement optique de chaque plasma (P) comprennent une pluralité de chambres d'intégration (5') de la lumière émise par ce plasma qui sont équipées d'au moins deux séries de fibresd'acquisition (6") disposées en quinconce, dont les ouvertures optiques respectives sont aptes à couvrir par chevauchement mutuel (19) toute la surface à analyser dudit support (2), sans déplacement relatif de ces chambres par rapport à ce dernier. 38) Dispositif (1) selon une des revendications 32 à 36, caractérisé en ce que lesdites chambres de confinement optique (5') des plasmas extraits (P) sont elles-mêmes logées dans une enceinte close (20) qui contient ledit support (2) et qui est remplie d'un gaz plasmogène tel que de l'argon, de l'hélium, de l'azote ou un mélange de ces gaz, au moins la face supérieure (21) de cette enceinte étant transparente à la ou chaque longueur d'onde d'excitation des faisceaux laser et aux longueurs d'onde d'acquisition de la lumière générée par ce plasma, cette enceinte étant équipée d'une valve de remplissage (23) en gaz plasmogène et d'une valve de purge d'air (22). 39) Dispositif (1) selon une des revendications 32 à 38, caractérisé en ce que ladite unité de spectrographie comprend au moins un spectrographe de type cellule photosensible et en ce qu'un réseau de diffraction ou au moins un filtre optique transparent uniquement à la longueur d'onde souhaitée est agencé entre chaque fibre optique d'acquisition (6, 6', 6") et ledit spectrographe. 40) Dispositif (1) selon une des revendications 32 à 39, caractérisé en ce que ledit support d'analyse biologique (2) est formé d'une biopuce comprenant à sa surface une matrice de sondes natives, hybridées ou complexées par lesdites cibles, cette matrice comportant une multitude desdits points de mesure comprenant chacun une pluralité desdites sondes et ledit ou chaque élément chimique à quantifier étant présent dans lesdites cibles et, optionnellement, en outre dans lesdites sondes.
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