FR2927170A1

FR2927170A1 - Dispositifs de puces a molecules et leurs utilisations.

Info

Publication number: FR2927170A1
Application number: FR0850682A
Authority: FR
Inventors: Vehary Sakanyan; Marie Angelini
Original assignee: PROTNETEOMIX SOC PAR ACTIONS S
Current assignee: PROTNETEOMIX SOC PAR ACTIONS S
Priority date: 2008-02-04
Filing date: 2008-02-04
Publication date: 2009-08-07
Anticipated expiration: 2028-02-04
Also published as: FR2927170B1; WO2009098123A1

Abstract

La présente invention concerne des dispositifs de puces à molécules, notamment à petites molécules, de faible masse moléculaire, comprenant un substrat dont au moins une partie d'au moins une surface est revêtue d'une couche comprenant :- de l'agarose et/ou au moins un de ses dérivés ; et- au moins un polyéthylène glycol et/ou au moins un de ses dérivés.L'invention concerne également l'utilisations desdits dispositifs pour la détection d'interactions entre des molécules et des cibles telles que des protéines, des cellules ou encore des organismes.

Description

Dispositifs de puces à molécules et leurs utilisations La présente invention concerne des dispositifs de puces à molécules, notamment à petites molécules, de faible masse moléculaire, et leurs utilisations pour la détection d'interactions entre des molécules et des cibles telles que des protéines, des cellules ou encore des organismes. L'invention comprend également l'utilisation de tels dispositifs pour déterminer la présence d'une cible capable de se lier spécifiquement aux molécules présentes à la surface dudit dispositif. L'invention a également pour objet des méthodes de criblage et de sélection de molécules, présentes à la surface dudit dispositif, capables de se lier spécifiquement à une cible donnée.

Les puces à molécules, notamment à petites molécules (molécules de faible masse moléculaire) permettent de détecter des interactions entre des molécules et différents types de cibles (Uttamchandani et al., Mol Biosyst. 2006, v.2, 58-68 ; Nicholson et al., ACS Chem.

Biol. 2007, v.2, 24-30). Cette technologie, qui est en pleine émergence, possède l'avantage de pouvoir comparer et caractériser simultanément un grand nombre de molécules tout en remplaçant de nombreux tests individuels par un seul et permet d'évaluer plusieurs paramètres en parallèle. De telles puces s'avèrent être un outil puissant pour le criblage à haut débit de bibliothèques ou banques de molécules, notamment de chimiothèques permettant l'identification de molécules capables de se lier spécifiquement à une protéine, une cellule, un organisme ou tout autre cible biologique d'intérêt. Ces puces sont donc particulièrement utiles pour l'identification de candidats médicaments, de molécules valorisables pour certaines applications biotechnologiques, biomédicales ou agronomiques ou encore d'outils pour la recherche mais aussi pour le développement de méthodes diagnostiques. En particulier, ces puces sont un outil particulièrement utile dans le développement de nouveaux agents antibactériens. Les maladies infectieuses restent encore aujourd'hui une des causes de mortalité les plus importantes. En l'absence de la découverte de nouveaux agents antibactériens ou antibiotiques, la progression des germes multi-résistants risque de conduire, dans les années à venir, à des échecs thérapeutiques de plus en plus nombreux. Après plusieurs années d'études exhaustives dans le domaine de la chimie médicale, il devient difficile de modifier la structure des molécules connues pour les rendre plus efficaces. C'est pourquoi la recherche pharmaceutique commence à se focaliser sur la découverte d'autres cibles protéiques pour le développement de nouveaux types d'agents antibactériens et cet axe de recherche est encouragé par le nombre grandissant de génomes séquencés de bactéries pathogènes. De plus, l'avancement dans la résolution tridimensionnelle de la structure des enzymes et des complexes multi-protéiques, déjà exploités comme cibles pour les antibiotiques, donne une forte impulsion pour la création de nouveaux médicaments synthétisés notamment à partir de molécules organiques, de faible masse moléculaire. Durant ces dernières années, plusieurs approches, appelées Small Molecule Microarrays (SMM), ont été développées pour la recherche de molécules d'intérêt dans les chimiothèques ( Winssinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002, v.99, 11139-11144 ; Barnes-Seeman et al., Angew Chem Int Ed Engl 2003, v.42, 2376-2379 ; Bailey et al., Proc Natl Acad Sci USA 2004, v.101, 16144-16149 ; Kurosu and Mowers, Bioorg Med Chem Lett. 2006, v.16, 3392-3395 ; Urbina et al., Chembiochem. 2006, v.7, 1790-1797). Ces méthodes sont toutes basées sur l'attachement covalent des molécules de faible masse moléculaire, sur des surfaces planes préalablement activées par voies chimiques. Ces méthodes nécessitent ainsi des étapes de protection chimique des molécules et/ou des surfaces. En effet, ces méthodes nécessitent la création de linkers ( espaceurs ou bras utilisables pour fixer des molécules à une surface) particuliers pour chaque type de molécule. En outre, en orientant l'immobilisation des molécules sur le support via les linkers , ce type d'approche ne permet pas d'évaluer la capacité d'interaction de la cible, notamment de protéines-cibles, avec tous les groupements chimiques des molécules d'intérêt, ce qui rend le criblage des molécules limité. De plus, cette approche étant dépendante de linkers particuliers pour chaque type de molécule, elle peut ne pas être compatible avec différentes solutions de binding (solution dans laquelle se trouve la cible), ce qui rend le criblage des molécules assez fastidieux et non universel puisque peu ou pas adapté à diverses banques de molécules, notamment à diverses chimiotèques. Enfin, certains dispositifs utilisés à l'heure actuelle pour l'immobilisation de molécules, ne sont pas compatibles avec des solvants organiques (tels que le DMSO et le DMF), utilisés pour améliorer la solubilité des molécules peu ou pas solubles.

Il est donc essentiel de développer des puces à molécules, notamment à petites molécules (de faible masse moléculaire) permettant le criblage à haut débit de divers types de molécules (diverses banques de molécules), avec une sensibilité importante tout en étant peu onéreuses et adaptées aux procédés mis en oeuvre à l'échelle industrielle. Les inventeurs ont maintenant établi des dispositifs de puces à molécules permettant de résoudre en tout ou partie les problèmes évoqués ci-dessus. En effet, les inventeurs ont mis au point un dispositif de puces à molécules, notamment à molécules de faible masse moléculaire, qui ne nécessite pas de fonctionnalisation ni des molécules, ni du dispositif utilisé, qui permet d'éviter les étapes fastidieuses de protection chimique et assure à la cible, notamment à la protéine-cible, l'accessibilité à tous les groupements chimiques des molécules immobilisées sur le dispositif. Un tel dispositif permet notamment de lier les molécules, en particulier les molécules de faible masse moléculaire, de manière non-covalente. De plus, un tel dispositif est compatible avec des solvants organiques (tels que le DMSO et le DMF), utilisées pour améliorer la solubilité de certaines molécules.

En outre, les inventeurs ont maintenant établi une méthode de détection d'interaction entre des molécules, notamment des molécules de faible masse moléculaire, liées audit dispositif et différents types de cibles, notamment des protéines. Cette méthode permet le criblage à haut débit de molécules, notamment de banque de molécules et en particulier de chimiothèques composées d'une pluralité de différentes molécules de faible masse moléculaire, avec une bonne sensibilité de détection tout en étant peu onéreuse, simple, rapide et donc particulièrement adaptée aux procédés mis en oeuvre au niveau industriel. Ainsi, selon un premier aspect, l'invention a pour objet un dispositif de puces à molécules comprenant un substrat dont au moins une partie d'au moins une surface est revêtu d'au moins une couche, en particulier une couche comprenant : - de l'agarose et/ou au moins un de ses dérivés ; et - au moins un polyéthylène glycol et/ou au moins un de ses dérivés. Afin de permettre une meilleure compréhension de la présente invention, certaines définitions sont fournies. Sauf indications particulières, les autres termes techniques employés dans la présente demande doivent être interprétés selon leur sens habituel. On entend par puces à molécules , au sens de la présente invention, tout dispositif sur lequel sont déposées des molécules. Généralement, les molécules sont immobilisées sur le dispositif par liaison non-covalente ou covalente, de manière directe ou par l'intermédiaire d'espaceur (ou linker ). Les puces à molécules peuvent comprendre un nombre faible ou très élevé de molécules et la taille de la surface totale du support occupée par les molécules peut être variable.

Par liaisons non-covalentes , on entend désigner ici les liaisons ioniques, les liaisons hydrogène, les forces de Van der Waals ou encore les liaisons hydrophobes. On entend par molécules au sens de la présente invention les structures chimiques et biologiques existants dans la nature ou créées artificiellement qui peuvent être distinguées entre elles par leurs propriétés. À titre d'exemples de molécules, on peut citer les protéines, les peptides, les polynucléotides tels que les ADN (acide désoxyribonucléique) et les ARN (acide ribonucléique) et les petites molécules d'origine naturelle ou synthétique, organiques dont la masse moléculaire est comprise entre 50 et 150 000 Daltons, de préférence entre 50 et 1000 Daltons et tout préférentiellement entre 100 et 600 Daltons. Selon l'invention, une liaison est considérée comme spécifique, lorsque cette liaison est détectée dans un milieu comprenant un inhibiteur non spécifique, par exemple une molécule se liant de manière faible à une protéine-cible. Selon l'invention, une liaison entre une molécule et une cible est considérée comme spécifique, lorsque cette liaison est effectuée avec un site catalytique d'une cible, notamment d'une protéine-cible, et/ou avec un site fonctionnel d'une cible et/ou avec une structure qui est susceptible d'affecter la fonctionnalité d'une cible.

On entend par cible , au sens de la présente invention, un organisme ou une structure macromoléculaire ou une macromolécule ou un mélange de macromolécules identiques ou différentes, susceptible de se lier à une molécule immobilisée sur le dispositif selon l'invention.

En particulier, la cible est choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes, les acides nucléiques, les aptamères, en particulier les protéines. On entend par agarose , au sens de la présente invention un polymère linéaire purifié à partir de l'agar notamment de certaines algues marines. L'agarose utilisable dans les dispositifs selon l'invention peut être de nature variée et notamment présenter divers degrés de pureté. Les caractéristiques de l'agarose utilisable dans les dispositifs selon l'invention seront aisément déterminées par l'Homme du Métier. En particulier, l'agarose utilisable dans les dispositifs selon l'invention peut former après ébullition une solution transparente qui est retenue ou adsorbée sur un substrat donné de façon à former une surface gélosée transparente et relativement plane. En particulier, une telle agarose peut fondre au-delà de la température de 88°C, peut se transformer en gel en dessous de 39°C, peut posséder une capacité d'électroendosmose comprise entre 0,1 et 0,2, peut contenir moins de 0,1% de sulfate, peut être dépourvue d'activité DNase et RNase et peut se caractériser par un pouvoir gélifiant supérieur à 1500 g/cm2. Par exemple, l'agarose utilisable dans le dispositif selon la présente invention peut être l'agarose disponible chez Eurogentec sous la référence EP-0010-05 (Molecular Biology Grade Agarose). Les dérivés d'agarose utilisables dans la couche revêtant le substrat peuvent être de nature variée. Ainsi, il peut s'agir de tout dérivé d'agarose adapté à lier de manière non-covalente des molécules, notamment dont la masse moléculaire est comprise entre 50 et 150 000 Daltons, de préférence entre 50 et 1000 Daltons et tout préférentiellement entre 100 et 600 Daltons. À titre d'exemples de tels dérivés d'agarose, on peut citer les dérivés d'agarose obtenus par l'addition de radicaux amines, carboxyles, thiols, imidazoles ou phénoles. On entend par polyéthylène glycol au sens de la présente invention tout polymère d'éthylène glycol, de formule HO- (CH2-CH2-0-) n-H . Ce polymère stimule notamment la fusion des structures lipidiques, et est utilisé pour faciliter le transfert des acides nucléiques, protéines et d'autres molécules à travers la membrane lipidique, assurant une absorption facilitée de certaines molécules avec lesquelles il est contact. Ledit au moins un polyéthylène glycol et ledit au moins un de ses dérivés peuvent avoir une masse moléculaire comprise entre 300 et 10 000 000 Daltons, de préférence entre 6000 et 40 000 Daltons et tout préférentiellement entre 15 000 et 20 000 Daltons. Le polyéthylène glycol peut se présenter sous la forme d'une molécule ramifiée ou linéaire, de préférence linéaire. Le polyéthylène glycol peut être préparé par polymérisation de l'oxyde d'éthylène choisi dans le groupe comprenant les dérivés d'oxyde d'éthylène.

Les dérivés de polyéthylène glycol utilisables dans la couche revêtant le substrat peuvent être de nature variée. Ainsi, il peut s'agir de tout dérivé de polyéthylène glycol adapté à lier de manière non-covalente des molécules, notamment dont la masse moléculaire est comprise entre 300 et 10 000 000 Daltons, de préférence entre 6000 et 40 000 Daltons et tout préférentiellement entre 15 000 et 20 000 Daltons. Les dérivés de polyéthylène glycol peuvent être choisis dans le groupe comprenant les copolymères de polyéthylène glycol, de préférence le copolymère de polyéthylène glycol bisphénol A épichlorhydrine (disponible notamment chez Sigma, sous la référence P2263), les dérivés comprenant du méthoxypolyéthylène glycol, et les dérivés activés par différents radicaux tels que les carboxyles, les NHS- esters. La couche revêtant le substrat peut être de nature variée, adaptée à lier de manière non-covalente des molécules, notamment des molécules dont la masse moléculaire est comprise entre 50 et 150 000 Daltons, de préférence entre 50 et 1000 Daltons et tout préférentiellement entre 100 et 600 Daltons.

En particulier, la couche est un mélange, notamment homogène, - d'agarose et/ou d'au moins un de ses dérivés, en particulier de l'agarose ; et -d'au moins un polyéthylène glycol et/ou d'au moins un de ses dérivés, en particulier d'au moins un polyéthylène glycol. On entend par mélange , au sens de la présente invention l'association d'au moins deux substances.

On entend par mélange homogène , au sens de la présente invention, un mélange comprenant une seule phase. Ainsi, par exemple, un mélange d'agarose et de polyéthylène glycol après avoir été chauffé à des températures comprises entre 65°C et 70°C, peut être déposé sur le substrat afin de former une couche revêtant ledit substrat. Ladite couche revêtant le substrat (qui se forme après séchage du mélange déposé) peut avoir une épaisseur comprise entre 1 pm et 200 pm, de préférence entre 1 pm et 50 pm, et tout préférentiellement entre 1 pm et 20 pm. Selon un mode de réalisation particulier du dispositif selon l'invention, la concentration en agarose et/ou ses dérivés dans ladite couche, en particulier dans ledit mélange, peut être comprise entre 0,002 g/mL et 0,04 g/mL, de préférence entre 0,005 g/mL et 0,02 g/mL et tout préférentiellement 0,01 g/mL. La concentration en polyéthylène glycol et/ou ses dérivés dans ladite couche, en particulier dans ledit mélange, peut être comprise entre 0,0005 g/mL et 0,02 g/mL, de préférence entre 0,001 g/mL et 0,015 g/mL et tout préférentiellement entre 0,002 g/mL et 0,01 g/mL. On entend par substrat , au sens de la présente invention, un matériau à la surface duquel est déposée une couche de matière et qui sert de support à celle-ci en la retenant ou en l'adsorbant. Le substrat du dispositif selon l'invention peut être de nature variée. Ainsi il peut s'agir de tout substrat adapté à être revêtu d'une couche d'agarose et/ou ses dérivés et d'au moins un polyéthylène glycol et/ou ses dérivés. En particulier, le substrat peut comporter une surface plane et/ou bombée, et être solide ou semi-solide. Par ailleurs, le substrat peut avoir une forme et des dimensions variables. On peut citer notamment les substrats circulaires, rectangulaires, carrés, etc. La surface du substrat peut être comprise entre 10 mm2 et 400 000 mm2, de préférence entre 100 mm2 et 400 000 mm2 et tout préférentiellement entre 10 000 mm2 et 20 000 mm2. Ledit substrat peut être réalisé à base d'au moins un matériau choisi dans le groupe comprenant les verres, le silicium, le silicone, les polymères tels que les plastiques, le polyacrylamide, le polypyrrole, les polyoses et les métaux tel que l'or, le platine et un mélange de ceux-ci. En particulier, le substrat peut être une lame de verre.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un dispositif selon l'invention comprenant les étapes suivantes : i) le revêtement d'au moins une partie d'au moins une surface d'un substrat par une couche comprenant : - de l'agarose et/ou au moins un de ses dérivés ; et - au moins un polyéthylène glycol et/ou au moins un de ses dérivés ; et éventuellement ii) l'hydratation par au moins une étape d'hydratation de ladite couche obtenue à l'étape i).

Ainsi, selon un mode de réalisation particulier du dispositif selon l'invention, ladite couche peut être hydratée. Ainsi, après que la couche a été déposée sur le substrat du dispositif selon l'étape i), la couche peut subir au moins une étape d'hydratation. Cette étape d'hydratation ii) peut être réalisée par tous moyens adaptés connus de l'Homme du Métier. Par exemple, ledit dispositif peut être plongé dans de l'eau telle que de l'eau distillée et/ou désionisée (notamment MilliQ ), pendant une période de quelques minutes à quelques heures, de préférence 30 minutes à température ambiante. Ledit dispositif peut ensuite être séché, en particulier à 37°C, pendant une période de quelques minutes à quelques heures, de préférence pendant 45 minutes. Un dispositif selon l'invention comprenant une couche hydratée présente l'avantage de réduire l'intensité du bruit de fond et d'optimiser la sensibilité de détection de la liaison entre des molécules immobilisées sur ladite couche par liaison non-covalente et des cibles. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un dispositif selon l'invention pour l'immobilisation, par liaison non-covalente, d'au moins une molécule, notamment d'une pluralité de différentes molécules et tout particulièrement d'une banque de molécules.

On entend par banque de molécules au sens de la présente invention, une bibliothèque de molécules synthétisées par voie chimique ou isolées et d'origine naturelle, qui contient au moins 2 molécules différentes. Les banques de molécules comprennent notamment les chimiothèques obtenues par voie chimique, manuellement ou de façon automatisée et composées de molécules purifiées ou non, en nombre supérieur à deux. Les molécules utilisables pour être immobilisées sur le dispositif selon l'invention peuvent être les molécules utilisables pour la réalisation des puces à molécules selon l'invention.

L'invention a également pour objet une puce à molécules comprenant au moins une molécule, de préférence une pluralité de différentes molécules, liée de manière non-covalente à ladite couche du dispositif selon l'invention, en particulier à des positions définies.

Les puces à molécules selon l'invention présente l'avantage d'immobiliser des molécules sur le dispositif via ladite couche, par liaison non-covalente. Ceci permet notamment d'éviter les étapes fastidieuses de protection chimique et permet l'accessibilité à une cible donnée, à tous les groupements chimiques des molécules immobilisées. En particulier, les puces à molécules selon l'invention permettent l'immobilisation par liaison non-covalente de molécules dont la masse moléculaire est comprise entre 50 et 150 000 Daltons, de préférence entre 50 et 1000 Daltons et tout préférentiellement entre 100 et 600 Daltons. Les molécules utilisables dans les puces à molécules selon l'invention peuvent être de nature variée. Il peut s'agir de molécules identiques ou différentes, en particulier d'une pluralité de différentes molécules. En particulier les molécules peuvent être issues de banques de molécules ou de chimiothèques. À titre d'exemples, de telles chimiothèques, on peut citer la chimiothèque ZINC (Irwin and Shoichet, J Chem Inf Model. 2005; v.45, 177ù182) et d'autres chimiothèques publiques et commerciales. Les molécules utilisables pour les puces à molécules selon l'invention peuvent être notamment choisies dans le groupe comprenant les protéines telles que les anticorps, les peptides, les polynucléotides tels que les ADN (acide désoxyribonucléique) et les ARN (acide ribonucléique), les mélange d'ADN et d'ARN et de préférence les molécules d'origine naturelle ou synthétique, organiques dont la masse moléculaire est comprise entre 50 et 150 000 Daltons, de préférence entre 50 et 1000 Daltons et tout préférentiellement entre 100 et 600 Daltons. Les molécules peuvent être ou non purifiées. Par exemple, les molécules peuvent être mises en contact avec les dispositifs selon l'invention afin d'y être immobilisées, sous la forme d'extrait, tel qu'un extrait brut d'un végétal. Les molécules peuvent être d'origine naturelle ou synthétique, en particulier d'origine synthétique.

On entend par molécule d'origine naturelle , au sens de la présente invention, une molécule synthétisée par un organisme biologique ou présent dans la nature, sur la Terre ou dans l'univers. On entend par molécule d'origine synthétique , au sens de la présente invention, une molécule synthétisée par voie chimique manuellement ou de manière automatisée. Les molécules utilisables dans les puces à molécules selon l'invention peuvent être aussi bien des molécules identifiées dont on connaît la capacité d'interaction avec une cible donnée, que des molécules à tester, dont on veut évaluer la capacité de liaison à une cible donnée.

Les puces selon l'invention peuvent comprendre un nombre faible ou très élevé de molécules, entre 2 et l'infini, et la taille de la surface totale du dispositif occupée par les molécules peut être variable de 100 à 400 000 mm2. On entend par une pluralité de molécules au sens de la présente invention, un nombre de molécules supérieur à 2, en particulier supérieur à 10 et tout particulièrement supérieur à 50. Le nombre de molécules présentes dans un spot (position définie où les molécules sont immobilisées sur le dispositif) peut varier de 2 à 100 000 000 000. Les spots peuvent avoir diverses formes, notamment circulaires ou carrées. Par exemple, le nombre de spots de forme circulaire de diamètre compris entre 50 et 1000 }gym peut varier de 2 à 100 000 sur un dispositif selon l'invention. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une puce selon l'invention comprenant les étapes suivantes : i) la préparation d'un dispositif de puces à molécules selon l'invention, de préférence hydraté ; et ii) la mise en contact d'au moins une molécule, de préférence une pluralité de différentes molécules avec ledit dispositif, selon l'invention obtenu à l'étape i), en particulier à des positions définies, dans un milieu et dans des conditions appropriés afin d'obtenir la liaison non-covalente des molécules audit dispositif, afin d'obtenir un réseau de molécules ; et éventuellement iii) l'élimination par au moins une étape de lavage dans les conditions appropriées, des molécules non liées audit dispositif.

L'étape ii) du procédé de préparation d'une puce selon l'invention peut se faire selon des techniques bien connues de l'Homme du Métier. À titre d'exemples de telles techniques permettant le dépôt d'échantillons comprenant des molécules à la surface de ladite couche du dispositif, on peut citer les techniques manuelles (par exemple avec le Arrayer Replicator de V&P Scientific) ou les techniques à l'aide d'un robot de contact (par exemple le GMS 417 Arrayer de Affymetrix) ou à l'aide d'un robot piezo-électrique (par exemple le Arrayjet Sprint Inkjet Microarray Spotter de Arrayjet). De préférence, l'étape ii) du procédé de préparation d'une puce selon l'invention est réalisée par des moyens de contact tels que l'Arrayer Replicator de V&P Scientific ou le GMS 417 Arrayer de Affymetrix qui permettent d'avoir les empreintes des molécules déposées sur le dispositif selon l'invention. Selon l'invention, les échantillons comprenant les molécules d'intérêt peuvent être déposées sous forme de gouttes avec un volume compris entre 10 picolitres (pL) et 15 nanolitres (nL). La structure gélosée de la couche du dispositif selon l'invention permet une diffusion des molécules immobilisées au fur et à mesure de la conservation des puces selon l'invention, ce qui permet d'augmenter l'efficacité de l'immobilisation non covalente desdites molécules. L'intensité des signaux détectés (détection de la liaison cible-molécule, notamment par fluorescence) après plusieurs jours de conservation des puces à molécules selon l'invention, est ainsi plus élevée par rapport à l'intensité des signaux détectés après un jour de conservation desdites puces à molécules. En outre, le dispositif de puces à molécules selon l'invention est tolérant (compatible) à l'action de différents solvants organiques (tels que le DMSO et le DMF) utilisés pour améliorer la solubilité de certaines molécules, notamment de molécules de faible poids moléculaire, synthétisées chimiquement. Cette propriété du dispositif selon l'invention est un avantage pour la préparation des puces à molécules possèdant une faible solubilité. En outre, le dispositif selon l'invention est compatible avec différentes solutions réactionnelles, telles que des solutions préparées à base du tampon PBS ( Phosphate Buffer Saline ou tampon phosphate salin) ou Tris. De préférence, les solutions (milieux) utilisées dans la présente invention sont préparées à pH 7,4, afin de se placer à un pH physiologique et ainsi dans les conditions physiologiques appropriées, notamment pour l'étude d'interactions entre au moins une protéine-cible et au moins une molécule de faible poids moléculaire, notamment dont la masse moléculaire est comprise entre 50 et 150 000 Daltons, de préférence entre 50 et 1000 Daltons et tout préférentiellement entre 100 et 600 Daltons. L'étape iii) peut être réalisée par des techniques bien connues de l'Homme du Métier (Lam and Renil, Curr Opin Chem Biol. 2002, v.6, 353-358). Par exemple, l'étape iii) peut être mise en oeuvre en incubant au moins une fois, en particulier trois fois, les puces pendant une période de quelques secondes à quelques minutes, de préférence 5 minutes, dans du PBS (Phosphate Buffer Saline)/Tween-20 0,1 % à 4°C, sous agitation. Le procédé de préparation d'une puce selon l'invention peut comprendre en outre une étape iv) de blocage destinée à réduire les interactions non spécifiques qui ont lieu entre la cible et le dispositif selon l'invention ou entre la cible et les solvants (milieux) utilisés.

Cette étape peut être réalisée par des techniques bien connues de l'Homme du Métier (Lam and Renil, Curr Opin Chem Biol. 2002, v.6, 353-358). Cette étape peut être réalisée de préférence, après l'étape ii). Cette étape peut par exemple être réalisée, en incubant les puces avec de l'alcool polyvinylique (PVA), en particulier à 2%, pendant une période de quelques minutes à quelques heures, en particulier 1 heure, de préférence à 4°C et sous agitation.

L'invention a aussi pour objet un kit ou nécessaire pour la détection d'interactions entre au moins une molécule et au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes, les acides nucléiques, les aptamères, en particulier les protéines, ledit kit comprenant : - au moins un dispositif selon l'invention ; et - au moins une molécule, de préférence une pluralité de molécules différentes ; et - au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes, les acides nucléiques, les aptamères, en particulier les protéines ; et - au moins un moyen de détection de l'interaction entre ladite au moins une molécule et ladite au moins une cible. Les molécules utilisables pour les kits selon l'invention peuvent être les molécules utilisables pour les puces selon l'invention.

L'invention a également pour objet un kit ou nécessaire pour la détection d'interactions entre au moins une molécule et au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes, les acides nucléiques, les aptamères, en particulier les protéines, ledit kit comprenant : - une puce selon l'invention; et - au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes, les acides nucléiques, les aptamères, en particulier les protéines ; et - au moins un moyen de détection de l'interaction entre ladite au moins une molécule et ladite au moins une cible. Ledit moyen de détection de l'interaction entre ladite au moins une molécule et ladite au moins une cible peut être tout moyen permettant la détection d'au moins une 20 molécule à laquelle au moins une cible est liée spécifiquement. Notamment, ledit moyen de détection peut être basé sur le marquage de la cible, de la molécule ou d'un agent secondaire (tel qu'un anticorps) qui reconnaît la cible ou la cible liée à une molécule. Par exemple, la 25 cible peut être marquée, directement ou indirectement, par un élément radioactif ou par un fluorophore (colorant fluorescent). À titre d'exemples de tels moyens de détection, on peut citer la fluorescence (notamment la technique FRET Fluorescence Resonance Energy 30 Transfer), la chimioluminescence et la radioactivité. Selon un mode de réalisation particulier des kits selon l'invention, ladite cible est une protéine et ledit moyen 15 de détection est un colorant fluorescent, de préférence dans le proche infrarouge, ledit colorant fluorescent étant lié à la protéine. Selon un autre mode de réalisation particulier des kits selon l'invention, ladite cible est une protéine et ledit moyen de détection est un colorant fluorescent, de préférence dans le proche infrarouge, lié à un anticorps dirigé contre la protéine. Les colorants fluorescents utilisables dans la présente invention et les techniques de liaison d'un colorant fluorescent à une protéine, en particulier à un anticorps sont bien connus de l'Homme du métier. Le colorant fluorescent peut être lié directement à la protéine ou à l'anticorps ou via un espaceur ( linkeur ). L'Homme de l'art saura utiliser les techniques de marquage bien connues, appropriées. À titre d'exemples de colorants fluorescents utilisables dans la présente invention, on peut citer les cyanines, les fluorophores émettant dans le proche infra- rouge (IRDyes), les nanocristaux. À titre d'exemples de coloranst fluorescents dans le proche infra rouge utilisables dans la présente invention, on peut citer les Alexa Fluor (Invitrogen), l'IRDye800 CW (LI-COR Biosciences), DyLight (Pierce).

En particulier, les colorants fluorescents dans le proche infrarouge, utilisables dans la présente invention ont une longueur d'onde comprise entre 700 et 2 500 nm, de préférence entre 700 et 1100 nm et tout préférentiellement entre 720 et 820 nm.

Le système de détection dans le proche infrarouge présente l'avantage d'optimiser la sensibilité de détection de la liaison entre les molécules et les cibles. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un dispositif ou d'une puce ou d'un kit selon l'invention, pour la détection d'interactions, entre au moins une molécule et au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes, les acides nucléiques, les aptamères, en particulier les protéines. Les molécules peuvent être des molécules identifiées dont on connaît la capacité d'interaction à une cible donnée ou des molécules dont on veut tester la capacité à interagir avec une cible donnée.

Ainsi, il peut s'agir de molécules identifiées dont on connaît la capacité d'interaction avec une cible. De telles puces ou kits peuvent être utiles notamment pour déterminer la présence d'une cible et éventuellement sa concentration dans un échantillon mais également caractériser une cible (par exemple déterminer la conformation d'une protéine). En effet, certaines cibles, notamment des protéines, ont la propriété de se lier spécifiquement avec des petites molécules, en fonction de leur conformation. Les petites molécules immobilisées sur le dispositif de la puce peuvent se lier aux cibles, notamment aux protéines dont la présence, la concentration et la caractérisation est alors possible à déterminer. De telles puces peuvent être utiles également pour la séparation de protéines-cibles sous différentes conformations (telle qu'une conformation active ou inactive) présentes dans un échantillon. Les puces à molécules, kits ou dispositifs selon l'invention peuvent également être utiles pour le criblage de molécules dont on veut tester la capacité de liaison à une cible donnée. Il peut notamment s'agir du criblage d'une banque de molécules donnée, notamment d'une chimiothèque. En particulier, de telles puces peuvent être utilisées pour identifier des molécules capables de moduler (activer ou inhiber) l'activité enzymatique de protéines cibles et/ou de se lier au site catalytique de protéines cibles. De telles puces sont particulièrement utiles pour le criblage et la sélection d'agents antibactériens ou d'agents thérapeutiques destinés à prévenir et/ou à traiter des pathologies, notamment les cancers, les maladies cardiovasculaires et neuromusculaires. De telles puces selon l'invention sont ainsi particulièrement utiles pour l'identification de médicaments (tels que des antibiotiques dirigés contre des protéines bactériennes), de molécules valorisables pour certaines applications biotechnologiques, biomédicales, agronomiques ou encore comme outils pour la recherche.

Ainsi, les dispositifs, les puces et les kits selon l'invention trouvent des applications notamment pour : - le criblage de molécules capables d'interagir avec ladite au moins une cible, en particulier le criblage de molécules capables de moduler l'activité enzymatique d'une protéine et/ou de se lier à un site catalytique d'une protéine; ou - le criblage de cibles capables d'interagir avec ladite au moins une molécule, en particulier le criblage de protéines qui sont des ligands de ladite au moins une molécule ; ou - la détermination de la présence et/ou de la concentration et/ou la caractérisation d'au moins 30 une cible présente dans un échantillon, en particulier une protéine, notamment avec une conformation protéique particulière ; ou - la séparation de formes particulières de ladite au moins une cible présente dans un échantillon, en particulier la séparation des formes actives et inactives d'au moins une protéine présente dans un échantillon. Lesdites molécules visées par ces applications peuvent être les molécules utilisables pour les puces à molécules selon l'invention. En particulier, les molécules peuvent avoir une masse moléculaire est comprise entre 50 et 150 000 Daltons, de préférence entre 50 et 1000 Daltons et tout préférentiellement entre 100 et 600 Daltons.

L'invention a également pour objet un procédé de détection d'interactions entre au moins une molécule, de préférence une pluralité de différentes molécules et au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes, les acides nucléiques, les aptamères, en particulier les protéines, comprenant les étapes suivantes : la mise en contact d'au moins une molécule, de préférence une pluralité de différentes molécules, avec ledit dispositif selon l'invention, en particulier à des positions définies, dans un milieu et dans des conditions appropriés pour obtenir la liaison non-covalente de ladite molécule audit dispositif, afin d'obtenir un réseau de molécules ; 30 (ii) la mise en contact dudit réseau obtenu à l'étape (i), avec au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les (i) 25 extraits cellulaires, les cellules, les organismes, les acides nucléiques, les aptamères, en particulier les protéines, dans un milieu et dans des conditions appropriés pour permettre la formation d'une liaison spécifique entre ladite au moins une molécule et ladite au moins une cible ; (iii) la détection sur ledit dispositif de la ou des molécules à laquelle/auxquelles se lient spécifiquement ladite au moins une cible.

L'étape i) du procédé de détection d'interactions selon l'invention peut être réalisée selon l'étape ii) du procédé de préparation d'une puce selon l'invention, à savoir, selon des techniques bien connues de l'Homme du Métier, soit manuellement (par exemple avec le Arrayer Replicator de V&P Scientific) soit à l'aide d'un robot (par exemple le GMS 417 Arrayer de Affymetrix). Les molécules utilisables dans le procédé de détection d'interactions selon l'invention peuvent être les molécules utilisables pour la réalisation des puces à molécules selon l'invention. En particulier, la masse moléculaire de ladite au moins une molécule est comprise entre 50 et 150 000 Daltons, de préférence entre 50 et 1000 Daltons et tout préférentiellement entre 100 et 600 Daltons.L'invention a également pour objet un procédé de détection d'interactions entre au moins une molécule, de préférence une pluralité de différentes molécules et au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes, les acides nucléiques, les aptamères, en particulier les protéines, comprenant les étapes suivantes : (ii) la mise en contact avec une puce selon l'invention d'au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes, les acides nucléiques, les aptamères, en particulier les protéines, dans un milieu et dans des conditions appropriés pour permettre la formation d'une liaison spécifique entre les molécules et ladite cible ; (iii) la détection sur ladite puce de la ou des molécules à laquelle/auxquelles se lient spécifiquement ladite au moins une cible. Le milieu et les conditions appropriés pour permettre la formation d'une liaison spécifique entre ladite au moins une molécule et ladite au moins une cible peut être 15 facilement déterminé par l'Homme du Métier. L'homme du Métier saura utiliser les conditions et les protocoles standards bien connus pour ce type d'interaction spécifique que l'on souhaite mettre en oeuvre (Lam and Renil, Curr Opin Chem Biol. 2002, v.6, 353-358). 20 En particulier, notamment lorsque la cible est une protéine, ledit milieu approprié de l'étape ii) des procédés de détection d'interactions selon l'invention peut être adapté en fonction du point isoélectrique de la cible, notamment de la protéine-cible et de la charge des 25 molécules immobilisées sur le dispositif selon l'invention. En effet, les inventeurs ont montré que la composition dudit milieu de l'étape ii) peut affecter l'interaction d'une cible, notamment une protéine-cible avec les molécules immobilisées en fonction de leur charge 30 et de la charge de la cible, notamment de la protéine-cible. Ainsi, lorsque la cible est une protéine-cible chargée positivement, ledit milieu de l'étape ii) pourra être à base de dérivés de sel tel que le PBS (tampon 10 phosphate salin). Lorsque la cible est une protéine-cible chargée négativement, ledit milieu de l'étape ii) pourra être à base de Tris (tampon de trishydroxyméthylaminométhane ou 2-amino-2-hydroxyméthyl- 1,3-propanediol permettant d'avoir un pH compris dans un intervalle entre 6,5 et 9,7). Le Tris possède des protons labiles, avec un pKa de 8,30 (à 20 °C; le pKa diminue ensuite de 0.03 unités par élévation d'un 1 degré Celsius de température).

L'étape iii) des procédés de détection d'interactions selon l'invention peut être réalisée à l'aide de tout moyen de détection de l'interaction entre ladite au moins une molécule et ladite au moins une cible utilisable dans les kits selon l'invention.

En particulier, la détection peut se faire à l'aide de la fluorescence, dé préférence dans le proche infrarouge. Selon un mode de réalisation particulier des procédés de détection d'interactions selon l'invention, ladite cible est une protéine marquée par un colorant fluorescent, de préférence dans le proche infrarouge, et l'étape (iii) est réalisée à l'aide d'un dispositif d'imagerie à fluorescence, de préférence à infrarouge. Selon un autre mode de réalisation particulier des procédés de détection d'interactions selon l'invention, ladite cible est une protéine et les procédés comprennent en outre, l'étape suivante : - la mise en contact de la protéine avec un anticorps marqué avec un colorant fluorescent, de préférence dans le proche infra rouge, ledit anticorps étant dirigé contre la protéine ; et l'étape iii) est réalisée à l'aide d'un dispositif d'imagerie à fluorescence, de préférence à infrarouge. Ladite étape iii) peut en outre être mise en oeuvre par une méthode assistée par ordinateur, par exemple par le logiciel GenePix Pro 4.0 (Axon Instruments). À titre d'exemples de dispositif d'imagerie à fluorescence, on peut citer le scanner Odyssey Imaging System (LI-COR Biosciences). En particulier, l'étape de mise en contact de la protéine avec un anticorps marqué peut être réalisée simultanément à l'étape ii) des procédés de détection d'interactions selon l'invention. Le système de détection dans le proche infrarouge présente l'avantage d'optimiser la sensibilité de détection de la liaison entre les molécules et les cibles. Lesdits colorants fluorescents peuvent être avantageusement des colorants fluorescents dans le proche infrarouge ayant une longueur d'onde comprise entre 700 et 2 500 nm, de préférence entre 700 et 1100 nm et tout préférentiellement entre 720 et 820 nm. Selon un mode de réalisation particulier des procédés de détection d'interactions selon l'invention, la concentration de ladite protéine dans ledit milieu de l'étape (ii) est comprise entre 0,01 et 100 pull, de préférence entre 0,1 et 10 pM, et tout préférentiellement entre 0,5 et 2 M. Une concentration en protéines comprise entre 0,5 et 2 M, présente l'avantage d'optimiser la sensibilité de détection de la liaison entre les molécules et les cibles.

Ainsi, les procédés de détection d'interactions selon l'invention, possède l'avantage par rapport à d'autres méthodes (telles que la chimioluminescence et la radioactivité) de permettre l'analyse à haut débit des interactions entre des molécules et différentes cibles données, notamment différentes protéines données et/ou différentes conditions (telle que la concentration de la cible), ce qui optimise la probabilité de détection d'interactions spécifiques.

Selon un mode de réalisation particulier des procédés de détection d'interactions selon l'invention, ils comprennent en outre, préalablement à l'étape (i), l'étape suivante : - l'hydratation, par au moins une étape d'hydratation, de ladite couche dudit dispositif. L'hydratation de ladite couche dudit dispositif peut être réalisée selon l'hydratation mise en oeuvre dans le procédé de préparation d'un dispositif selon l'invention. L'hydratation de ladite couche présente l'avantage de réduire l'intensité du bruit de fond et d'optimiser les propriétés de sensibilité de détection de la liaison entre des molécules immobilisées sur ladite couche par liaison non-covalente et des cibles, notamment des protéines. Selon un autre mode de réalisation particulier des procédés de détection d'interactions selon l'invention, l'étape (i) est réalisée au moins 1 jour, de préférence au moins 5 jours et tout préférentiellement au moins 8 jours avant la mise en oeuvre de l'étape (ii). Une durée d'au moins 8 jours permet d'optimiser les propriétés de sensibilité de détection de la liaison entre des molécules immobilisées sur ladite couche par liaison non-covalente et des cibles, notamment des protéines. Ainsi, la conservation prolongée (au moins 1 jour, de préférence au moins 5 jours et tout préférentiellement au moins 8 jours) des puces à molécules selon l'invention améliore la détection de la liaison entre les molécules immobilisées sur ladite couche par liaison non-covalente et des cibles, en particulier des protéines. Selon un autre mode de réalisation particulier des procédés de détection d'interactions selon l'invention, ledit milieu de l'étape (ii) comprend au moins un sel choisi dans le groupe comprenant le chlorure de sodium, le chlorure de magnésium et le chlorure de potassium, de préférence le chlorure de sodium, à une concentration comprise entre 10 mM et 300 mM, de préférence entre 30 mM et 200 mM, et tout préférentiellement entre 100 mM et 160 mM. La présence d'au moins un sel, en particulier du NaCl à une concentration comprise entre 100 mM et 160 mM dans ledit milieu de l'étape (ii), présente l'avantage d'optimiser l'efficacité d'interaction entre les molécules immobilisées sur ladite couche par liaison non-covalente et des cibles, en particulier des protéines. Selon un autre mode de réalisation particulier des procédés de détection d'interactions selon l'invention, ils comprennent en outre, entre l'étape (ii) et l'étape (iii), l'étape suivante : - l'élimination par au moins une étape de lavage, dans des conditions appropriées, des cibles non liées spécifiquement à ladite au moins une molécule.

Cette étape d'élimination peut être réalisée par des techniques bien connues de l'Homme du Métier. En particulier, notamment lorsque la cible est une protéine, l'étape d'élimination peut être réalisée en incubant au moins une fois, en particulier trois fois, les puces pendant une période de quelques secondes à quelques minutes, de préférence 5 minutes, dans du PBS (Phosphate Buffer Saline)/Tween-20 0,1 % à 4°C, sous agitation, puis pendant une période de quelques minutes à quelques heures, de préférence 1 heure, dans de l'isopropanol 20 %/ NaCl 500 mM /Tween-20 0,5 % à 4°C, sous agitation. Cette étape d'élimination présente l'avantage d'optimiser l'efficacité d'interaction entre les molécules immobilisées sur ladite couche par liaison non-covalente et des cibles, en particulier des protéines. Selon un autre mode de réalisation particulier des procédés de détection d'interactions selon l'invention, ils comprennent en outre l'étape suivante, de préférence simultanément à l'étape (ii) : - la mise en contact de ladite cible et du réseau obtenu à l'étape (i) du procédé de détection d'interactions selon l'invention ou d'une puce selon l'invention, avec au moins une molécule capable de se lier spécifiquement à ladite cible.

Cette étape peut être utile pour identifier à haut débit des molécules immobilisées sur ledit dispositif qui entrent en compétition avec des molécules connues capables de se lier spécifiquement à ladite cible. En particulier, notamment dans le cas où la cible est une protéine, cette étape peut permettre la détection de molécules (immobilisées sur le dispositif selon l'invention) qui se lient à un même site ou à un autre site (notamment catalytique) sur la cible, que le site auquel se lie spécifiquement la molécule utilisée dans cette étape (qui est connue pour être capable de se lier spécifiquement à ladite cible). Ainsi cette étape peut également permettre la détection de molécules se liant spécifiquement à une cible donnée et de connaître leur site de liaison sur la cible ou d'identifier de nouveaux sites (notamment catalytique) sur une cible, notamment une protéine. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un procédé de détection d'interactions selon l'invention pour le criblage et la sélection de molécules capables de se lier spécifiquement à une cible, en particulier à une protéine. En particulier, le procédé de détection d'interactions selon l'invention peut être utile pour le criblage et la sélection d'agents antibactériens et/ou d'agents thérapeutiques destinés à prévenir et/ou à traiter des pathologies, notamment les cancers, les maladies cardiovasculaires et neurologiques. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un procédé de détection d'interactions selon l'invention pour la détermination de la présence et/ou de la concentration et/ou la caractérisation d'au moins une cible, en particulier d'au moins une protéine, présente dans un échantillon, ladite cible étant capable de se lier spécifiquement auxdites molécules liées de manière non-covalente audit dispositif.

La caractérisation d'une cible telle qu'une protéine peut par exemple être la détermination de sa conformation protéique particulière (active, inactive...).

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au regard des exemples qui suivent. Il doit être entendu que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. La Figure 1 représente la détection, par fluorescence sur les différentes puces à molécules, des molécules auxquelles se lient spécifiquement la protéine cible R6 PBP 2x marquée à l'IRDye CW (A) et la comparaison de l'intensité des signaux de fluorescence sur les dispositifs de puces à molécules testés (B). La Figure 2 représente, sous la forme d'image fluorescente de puces, l'effet de la concentration des protéines cibles R6 PBP2x (A) et R39 (B) marquées à l'IRDye CW sur l'interaction avec les molécules immobilisées sur les dispositifs de puces à molécules selon l'invention.

La Figure 3 représente l'effet de la durée de conservation des puces à molécules selon l'invention sur la sensibilité de détection des interactions entre la protéine R6 PBP 2x et les antibiotiques immobilisés. La Figure 4 illustre, sous la forme d'image fluorescente de puces, la compétition entre les antibiotiques immobilisés et l'ampicilline compris dans le milieu réactionnel pour l'interaction avec une protéine marquée à l'IRDye 800 CW, R6PBP2x (A) ou R39(B). La Figure 5 représente, sous la forme d'image fluorescente de puces, le criblage de chimiothèques (DF, BA, SRI, AT) pour la détection d'interactions avec les protéines R6 PBP2x (A), 5204 PBP2x S337A (B) et R39 (C) marquées à l'IRDye CW. Chaque puce a aussi été mise en compétition avec l'ampicilline à une concentration de 6 pM ou de 7,5 pM.

La Figure 6 illustre , sous la forme d'histogrammes des intensités des signaux provenant des spots de petites molécules de faible masse moléculaire appartenant aux chimiothèques DF (A), BA (B), SRI (C) et AT (D) qui possèdent un ratio F800/B800 supérieur à 2 avec au moins une des protéines testées. Les expériences ont été réalisées en présence ou en absence d'ampicilline.

EXEMPLES 1. Exemple 1 : Utilisation des dispositifs de puces à molécules selon l'invention pour la détection de l'interaction entre des antibiotiques connus et une protéine cible appartenant à la famille des Penicillin Bindinq Proteins (PBP) Afin de se placer à un pH physiologique et donc dans des conditions physiologiques appropriées pour la détection d'interaction entre des molécules de faible poids moléculaire (antibiotiques) et une protéine (R6 PBP2x), toutes les solutions (milieux) ont été préparées à un pH 7,4.

I.1 préparation de dispositifs de puces à molécules selon l'invention L'agarose (Ref. EP-0010-05, Molecular Biology Grade Agarose, Eurogentec) a été dissout à une concentration de 2% dans de l'eau MilliQ et porté à ébullition. Cette solution a été mise en flacon et incubée à 70°C. Différentes concentrations d'un dérivé de polyéthylène glycol (PEG) ont été préparées en dissolvant le Polyethyleneglycol Bisphenol A Epichlorohydrin Copolymer 15000-20000 (Sigma) (noté Cop PEG ) dans de l'eau MilliQ et en chauffant le mélange jusqu'à 70°C. Des volumes égaux du dérivé de PEG et d'agarose ont été mélangés et préalablement incubés à 70°C pendant 1 heure avant d'être déposés sur une lame de verre nettoyée à l'éthanol 100%.

I.2 Préparation de puces à molécules selon l'invention Une étape d'hydratation de la couche du dispositif réalisé selon l'exemple I.1, a été mise en oeuvre. Ainsi, les dispositifs ont été plongés pendant 30 minutes dans de l'eau MilliQ à température ambiante sans agitation puis séchés à 37°C pendant 45 minutes. Les molécules utilisées pour être immobilisées de manière non-covalente sur le support selon l'invention sont 14 antibiotiques connus pour interagir avec les protéines de la famille des Penicillin Binding Proteins (PBP) : 8 antibiotiques appartenant au groupe des pénicillines, 5 au groupe des céphalosporines et un au groupe des carbapénèmes.

Les abréviations des antibiotiques utilisés sont les suivantes : 6-APA, 6-AminoPenicillinic acid ; Amp, ampicilline ; Pen, pénicilline ; Tem, témocilline ; Mth, méthicilline ; Oxa, oxacilline ; 7-ACA, 7-AminoCephalosporanic acid ; Carb, carbénicilline ; Tic, ticarcilline ; Cpht, céphalothine ; Cphx, céphalexine ; Cftx, céfotaxime ; Imp, imipénème ; Cfx, céfoxitine. La kanamycine (Kan)a été utilisée comme le témoin négatif. Les antibiotiques ont été déposés à partir de solution à 3 mM (dilution dans du PBS) en 4 répliques (spots ou positions définies). Des contrôles négatifs tels que du PBS 1X, du DMSO 55% (diméthyl sulfoxide) ou de la BSA (albumine de sérum bovin) ont également été mis en contact avec les dispositifs selon l'invention. L'anticorps polyclonal anti-PBP2x (0,6 pM) a été immobilisé de manière non-covalente sur les dispositifs selon l'invention et utilisé comme contrôle positif. Les molécules ont été déposées sur les dispositifs par un appareil de contact soit manuellement avec le Arrayer Replicator (V&P Scientific) soit avec le robot GMS 417 Arrayer (Affymetrix). Les puces à molécules ainsi obtenues ont ensuite été bloquées avec du PVA 2% (alcool polyvinylique) (préparé extemporanément dans du PBS) pendant 1 h à 4°C sous agitation puis lavées 3 fois 5 minutes au PBS / Tween-20 0,1% à 4°C sous agitation.

I.3 Mise en contact de puces à molécules selon l'invention avec une protéine-cible :R6 PBP2x Les puces à molécules obtenues selon l'exemple I.2 ont ensuite été incubées 18 h à 4°C sous agitation avec 12,5 log/mL de protéine R6 PBP2x (la protéine recombinante issue de la souche Streptococcus pneumoniae R6) préalablement marquée à l'IRDye800 CW (LI- COR Biosciences) et purifiée sur une colonne SigmaSpin Post-reaction (Sigma). Les puces ont ensuite été lavées 3 fois 5 minutes dans du PBS / Tween-20 0,1% à 4°C sous agitation, puis 1 h à l'isopropanol 20% / NaCl 500 mM / Tween-20 0,5% à 4°C sous agitation I.4 Détection sur la puce à molécules selon l'invention de ou des molécules à laquelle/auxquelles se lient spécifiquement la protéine cible :R6 PBP2x La lecture des puces obtenues à l'exemple 1.3 a été réalisée par le scanner Odyssey Imaging System (LI- COR Biosciences) avec une résolution de 21 }gym grâce à un laser d'excitation à 780 nm et à un filtre capable de détecter la fluorescence à 820 nm. Les images présentées sur la figure lA ont ensuite été analysées par le logiciel GenePix Pro 4.0 (Axon Instruments). Le logiciel génère des données numériques correspondant aux valeurs médianes du signal émis par les pixels de chaque spot (F) (position définie) et du bruit de fond local (B). A partir de ces données, le ratio F800/B800 pour chaque spot (position définie) est calculé, puis la moyenne des ratios pour les 4 répliques. Ce ratio F800/B800 a été utilisé comme la valeur quantitative pour comparer l'interaction d'une molécule immobilisée avec la protéine-cible (Figure 1B).

Il faut noter que, sur la Figure 1B, figurent uniquement les résultats avec 8 antibiotiques sur les 14 testés. Ainsi, l'intensité des signaux fluorescents détectés sur les puces est un indice comparatif de l'affinité de la protéine-cible donnée (présente dans le milieu réactionnel utilisé pour l'obtention de la liaison spécifique entre les molécules et la cible) vis-à-vis de différentes molécules chimiques immobilisées sur le dispositif de puces à molécules selon l'invention, dans un seul essai.

I.5 comparaison du bruit de fond obtenu avec des dispositifs de puces à molécules selon l'invention et du bruit de fond obtenu avec d'autres dispositifs Des puces à molécules ont été obtenues selon les procédés décrits dans les exemples 1.1 à 1.4, ci-dessus.

Ainsi des substrats (lames de verre) ont été revêtus d'un mélange d'agarose 1% et de copolymère de PEG 0,2% (Polyethyleneglycol Bisphenol A Epichlorohydrin Copolymer 15000-20000, noté Cop PEG ) avec ou non une étape d'hydratation dudit mélange. Ces puces à molécules ont été comparées avec des dispositifs dont le substrat (lame de verre) est recouvert d'agarose 1% ou d'un mélange d'agarose 1% et de PVA 2% et de Na2B4O, 0,2%.

Les résultats sont présentés sur la Figure 1 (A et B). Cette comparaison quantitative sous forme d'histogrammes (Figure 1B) montre que l'intensité du signal la plus élevée (excepté pour la céphalexine et l'imipénème) est obtenue sur le dispositif comprenant un mélange d'agarose 1% et de Cop PEG 0,2% qui a été hydraté. Afin d'évaluer de façon quantitative l'intensité des signaux provenant des spots, la moyenne du ratio F800/B800 des 4 spots a été calculée pour chaque antibiotique. Les résultats sont présentés sur le Tableau 1, ci-dessous. Agarose 1% Agarose 1% / Agarose 1% / Agarose 1% / hydratée PVA 2% / PEG 0,2% PEG 0,2% non Na2B4O7 0, 2 hydratée hydratée Moyenne 2961,53 4087,77 2605,37 3604,78 bruit de fond Tableau 1. L'évaluation du bruit de fond sur différents supports d'agarose.

Ainsi, pour la majeure partie des antibiotiques testés, la meilleure sensibilité de détection a été obtenue avec le dispositif selon l'invention revêtu d'un mélange d'agarose 1% et de Cop PEG 0,2% hydraté avant l'étape de mise en contact des molécules avec ledit dispositif.

En outre les dispositifs selon l'invention ont été comparés, (par évaluation du bruit de fond) à d'autres dispositifs de puces à molécules tels que des hydrogels préparé sur la base d'un agar, du polyacrylamide, de l'agarose ou tels que des biofilms composés d'alginate de sodium contenant ou non du cuivre réticulé et estérifié, ou tels que des polymères (nitrocellulose de la société Whatman). Les résultats montrent que les dispositifs selon l'invention permettent de réduire l'intensité du bruit de fond en comparaison avec ces autres dispositifs.

En outre, les dispositifs selon l'invention sont tolérants (compatibles) à l'action d'une solution de solvant organique, notamment de DMSO et de DMF à au moins 50%. Ceci est un avantage pour le criblage de molécules synthétisées chimiquement dans ces solvants, sans affecter l'interaction avec la cible notamment la protéine-cible.

II. Exemple 2 : Effet de la concentration d'un dérivé de PEG sur la performance de la méthode de détection d'interactions selon l'invention. Les 14 antibiotiques de l'exemple 1 ainsi que l'anticorps anti-GST, l'anticorps anti-PBP2x et du PBS ont été immobilisés, selon la technique décrite dans l'exemple 1, sur des dispositifs de puces à molécules selon l'invention comprenant différentes concentrations de Cop PEG . 0,2% ; 0, 5% ; 0,8% ; 1% et 2%. Les puces ainsi obtenues ont été incubées avec 180 pL de la protéine R6 PBP2x à 20 log/mL pendant 18 h à 4°C après avoir été bloquées 1 h avec du PVA 2%. Après lavage pendant 1 h à l'isopropanol 20% / NaCl 500 mM / Tween-20 0,5%, les puces ont été analysées par fluorescence dans l'infra-rouge proche selon la technique décrite dans l'exemple 1. L'intensité des signaux provenant des spots, évaluée comme la moyenne des ratios F800/B800 des 4 spots, a été calculée pour chaque molécule. Les résultats sont présentés sur le tableau 2, ci-dessus.

Type de mélange revêtant la lame de verre 0,2 % 0,5 % 0,8 % 1 % Cop 2 % Cop Cop PEG Cop PEG Cop PEG PEG PEG Antibiotique / Contrôle (mg/mL) Ratio F800 / B800 6-APA 0,2 3,25 6,75 6,78 6,64 2,74 6-APA 0,1 2,67 4,25 3,93 4,71 2,13 6-APA 0,05 1,53 1,62 1,83 1,99 1,37 Amp 0,0125 1,60 1,99 1,87 2,21 1,27 Amp 0,00625 1,52 1,60 1,57 1,90 1,17 Amp 0,00315 1,19 1,24 1,38 1,37 1,11 Amp 0,0125 1,86 1,65 2,07 2,12 1,53 Amp 0,00625 1,53 1,41 1,70 1,97 1,28 Amp 0,00315 1,15 1,14 1,36 1,36 1,12 Pen 1 0,93 0,99 1,03 1,03 1,02 Tem 1 1,09 1,11 1,17 1,19 1,09 Tem 0,5 1,02 1,05 1,07 1,14 1,03 Tem 0,25 1,00 1,01 1,02 1,03 1,01 Mth 1 1,08 0,99 0,99 1,02 1,01 Oxa 1 0,96 1,00 1,04 0,96 0,99 7-ACA 1 1,07 1,20 1,25 1,37 1,12 7-ACA 0,5 1,04 1,13 1,16 1,15 1,07 7-ACA 0,25 0,95 1,05 1,03 0,94 0,99 Tic 1 0,88 1,08 1,09 1,09 1,04 Tic 0,5 0,99 1,03 1,05 1,05 1,02 Tic 0,25 0,96 1,04 1,03 0,99 1,01 Cpht 0,2 1,81 1,76 2,11 1,91 1,22 Cpht 0,1 1,25 1,26 1,44 1,44 1,11 Cpht 0,05 1,12 1,14 1,21 1,19 1,05 Cphx 0,2 1,35 1,24 1,39 1,45 1,27 Cphx 0,1 1,17 1,14 1,18 1,21 1,11 Cphx 0,05 1,09 1,05 1,08 1,08 1,04 Cftx 0,2 2,27 2,03 2,44 2,73 1,64 Cftx 0,1 1,77 1,46 1,95 2,04 1,41 Cftx 0,05 1,27 1,27 1,51 1,47 1,17 Imp 0,1 1,50 1,42 1,55 1,80 1,23 Imp 0,05 1,15 1,13 1,14 1,25 1,09 Imp 0,025 1,05 1,05 1,09 1,12 1,03 Carb 1 2,38 3,72 5,07 5,39 4,11 Carb 0,5 1,82 2,58 3,45 3,58 2,62 Carb 0,25 1,53 1,77 2,44 2,31 1,91 Cfx 1 1,06 1,03 1,03 1,04 1,02 Kan 1 1,00 0,99 0,95 0,97 0,97 Ac anti-GST 0,99 0,96 1,03 1,01 1,00 rabbit Ac anti-PBP2x 1,12 1,64 1,61 1, 96 1,37 rabbit PBS 1,03 0,99 1,02 0,99 1,00 PBS 1,04 0,98 0,97 0,98 0,98 Tableau 2. Interaction des molécules immobilisées avec la protéine R6 PBP2x en fonction de la concentration de Cop PEG.

Pour la plupart des antibiotiques, le meilleur ratio et donc la meilleure interaction entre les antibiotiques et la protéine-cible est obtenu sur le dispositif comprenant entre 0,5 et 1% de Cop PEG mélangé à 1% d'agarose.

Cependant, au-delà de 0,2% de Cop PEG, la polymérisation de l'agarose s'effectue très rapidement rendant la couverture homogène de la surface des lames de verre très délicate.

III. Exemple 3 : Effet de la concentration de la protéine-cible sur la performance de la méthode de détection d'interactions selon l'invention La concentration optimale de protéine-cible a été déterminée sur les puces composées de 14 antibiotiques décrites dans l'exemple 1 (lame de verre revêtu d'un mélange hydraté d'agarose 1 % et de Cop PEG 0,2 %), ainsi que du PBS, de la BSA, des anticorps anti-PBP2x, des anticorps anti-PBP5. Différentes concentrations en protéines marquées ont été ajoutées dans le milieu réactionnel (milieu approprié pour permettre la formation d'une liaison spécifique entre les molécules et la protéine-cible) allant de 0, 3 pM à 1 pM pour la protéine R6 PBP2x et de 0,25 pM à 2 pM pour la protéine R39. La mise en contact des protéines-cibles avec les puces à molécules décrites dans l'exemple 1 a été effectuée à 4°C pendant 18 h sous humidité constante 70% et agitation très douce. Les autres conditions expérimentales décrites dans l'exemple 1 restent identiques.

Les résultats sont présentés sur la Figure 2 (A et B) et dans les tableaux 3 et 4, ci-dessous. Concentration de la protéine R6 PBP2x (pM) 0,30 0,50 0,60 0,80 0,90 1,00 Antibiotique/ Ratio F800 / B800 Contrôle 6-APA 4,54 5,68 7,01 7,48 6,79 7,10 Pen 1,04 1,05 1,05 1,06 1,06 1,06 Amp 15,08 23,62 32,54 30,51 22,90 31,80 Carb 2,22 2,92 3,17 3,13 2,87 3,11 Tic 2,84 3,95 4,65 4,44 3,84 4,20 Tem 1,03 1,06 1,04 1,05 1,04 1,05 Mth 1,02 1,02 1,02 1,00 1,01 1,00 Oxa 1,01 1,04 1,02 1,03 1,04 1,03 7-ACA 1,02 1, 04 1,03 1,03 1,04 1,01 Cpht 1,50 1,40 1,93 2,01 1,49 1,95 Cfx 1,05 1,06 1,06 1,09 1,06 1,10 Cphx 1,54 1,70 1,83 2,03 1,77 2,04 Cftx 2,97 3,03 3,86 4, 22 3,56 4,05 Imp 1,17 1,21 1,18 1,29 1,25 1,30 Kan 1,10 1,13 1,06 1,22 1,24 1,23 DMSO 55% 1,03 1,03 1,04 1,10 1,05 1,08 PBS iX 1,03 1,03 1,01 1,01 1,02 1,02 BSA 1,87 2,72 1,90 2,93 3,37 2,77 Anti-PBP2x 23,12 26,46 25,74 13,46 20,20 16,90 Anti PBP5 3,66 8,10 6,90 11,51 8,47 8,47 Tableau 3. Effet de la concentration de la protéine R6 PBP2x marquée sur l'interaction avec les antibiotiques immobilisés.

10 Selon les résultats obtenus, on peut constater que l'intensité du signal, basée toujours sur le ratio F800/B800, augmente constamment pour tous les antibiotiques testés réagissant avec la protéine R6 PBP2x dans la gamme de concentrations allant de 0,3 à 0,6 pM 15 (Tableau 3). Lorsqu'on augmente sa concentration au-delà de 0,8 pM, la valeur du ratio oscille, montrant qu'un plateau a été atteint. Ainsi, la concentration optimale de5 R6 PBP2x est comprise entre 0,6 et 0,8 pM dans les conditions utilisées. Pour s'assurer que cette concentration en protéine de type sauvage R6 PBP2x ne favorise pas l'apparition de signaux non-spécifiques, l'essai a été aussi réalisé avec 0,6 pM de la protéine mutée 5204 PBP2x S337A (la protéine recombinante issue du mutant Streptococcus pneumoniae 5024 dans la quelle la serine (position 337) dans le site actif dans est remplacée par alanine) qui est incapable d'interagir avec les antibiotiques béta-lactamines. En effet, aucune interaction n'est détectée entre la protéine mutée et les antibiotiques immobilisés, ce qui prouve que les signaux détectés avec la protéine sauvage sont spécifiques.

Une autre protéine PBP, R39 provenant de Actinomadura, a aussi interagi avec les antibiotiques testés, mais les signaux les plus élevés ont été détectés aux concentrations de 0,75-1 pM de cette protéine (Tableau 4). Concentration de la protéine R39 (pM) 0,25 0,50 0,75 1,00 1,50 2,00 Antibiotique/ Ratio F800 / B800 Contrôle 6-APA 1,33 1,52 1,83 1,94 1,67 1,83 Pen 1,01 1,02 1,03 1,05 1,05 1,05 Amp 13,53 19,72 40,58 30,99 26,29 22,28 Carb 1,36 1,62 1,88 2,07 1,88 2,01 Tic 1,54 1,90 2,27 2,45 2,24 2,44 Tem 1,10 1,20 1,27 1,30 1,31 1,34 Mth 1,01 1,01 1,01 1,03 1,01 1,02 Oxa 1,01 1,03 1,05 1,05 1,06 1,06 7-ACA 1,05 1,09 1,12 1,18 1, 14 1,15 Cpht 1,52 1,81 2,07 1,93 1,79 1,85 Cfx 1,71 1,99 2,22 2,25 1,94 1,90 Cphx 10,32 17,87 37,14 30,09 20,25 21,78 Cftx 1,66 2,30 2,68 2,87 2,41 2,82 Imp 1,08 1,15 1,26 1,25 1,24 1,23 Kan 1,07 1,17 1,20 1,28 1,23 1,33 DMSO 55% 1,01 1,06 1,08 1,08 1,10 1,12 PBS iX 1,01 1,02 1,03 1,03 1,03 1,04 BSA 2,01 2,18 8,14 6,37 2,99 4,28 Anti-PBP2x 1,85 2,45 3,02 2,81 1, 57 2,48 Anti PBP5 5,12 7,27 15,19 9,42 14,82 21,50 Tableau 4. Effet de la concentration de la protéine R39 sur l'interaction avec les antibiotiques immobilisés.

Ainsi, la méthode de détection d'interactions entre au moins une molécule et au moins une cible, notamment une protéine-cible, selon l'invention, présente l'avantage par rapport à d'autres approches de permettre l'analyse à haut débit d'interactions entre des molécules immobilisées et différentes cibles, notamment différentes protéines (à différentes conditions, par exemple, différentes concentrations) dans des essais parallèles et ainsi d'augmenter la probabilité de la détection des liaisons spécifiques entre une molécule et une cible. IV. Exemple 4 : Effet de la présence d'un sel sur la performance de la méthode de détection d'interactions selon l'invention Des puces composées de 8 antibiotiques béta-lactames (6-APA, ampicilline, carbénicilline, ticarcilline, témocilline, céphalothine, céfoxitine, céphalexine et céfotaxime), du PBS, du DMSO des anticorps anti-PBP5 et anti-PBP2x, immobilisés, ont été préparées, à partir d'une solution à 3 mM pour chaque molécule, et incubées avec 0,6 pM de R6 PBP2x diluée dans une solution de PBS contenant 12 mM ou 154 mM de chlorure de sodium. les deux solutions ont été complétées avec 0,1% de Tween-20. Le dispositif utilisé est une lame de verre revêtue d'un mélange hydraté comprenant de l'agarose 1% et du Cop PEG 0,2 %, préparé selon l'exemple 1. Les étapes préalables de blocage, de lavage, et les conditions réactionnelles sont celles décrites dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés dans le Tableau 5.35 Concentration en sel 12 mM NaCl 154 mM NaCl Antibiotique/ Ratio F800 / B800 Contrôle 6-APA 43,65 77,45 Amp 55,59 106,06 Carb 25,48 52,64 Tic 28,74 60,58 Tem 2,23 3,16 Cpht 29,33 60,44 Cfx 1,62 2,73 Cphx 4,89 13,47 Cftx 18,11 51,40 Eau 0,99 1,01 PBS iX 0,98 0,91 DMSO 100% 1,00 1,18 DMSO 30% 1,00 1,00 DMF 100% 0,97 0,90 DMF 20% / Eau 0,97 0,96 Ac anti-PBP5 26,83 12,33 Ac anti-PBP2x 18,71 18,20 85,31 Moyenne de bruit de fond 118,58 Tableau 5. Effet des différentes concentrations de NaCl dans le milieu réactionnel sur l'interaction de la protéine R6 PBP2x avec les antibiotiques immobilisés.

L'analyse des résultats montre que la présence d'une concentration plus élevée en sels dans le milieu réactionnel (milieu approprié pour permettre la formation d'une liaison spécifique entre les antibiotiques et la protéine-cible) peut augmenter l'intensité des signaux fluorescents. En effet, lorsque 154 mM de NaCl sont ajoutés dans le milieu réactionnel, le ratio F800/B800 est augmenté de 42 à 184%. Cette augmentation ne peut être attribuée qu'à la diminution du bruit de fond puisqu'il est lui-même légèrement supérieur en présence de 154 mM de NaCl.

Ainsi la présence de sels en concentration élevée dans le milieu réactionnel (milieu approprié pour permettre la formation d'une liaison spécifique entre les antibiotiques et la protéine-cible) peut augmenter l'efficacité de l'interaction entre la protéine-cible et les molécules immobilisées et de cette façon améliorer la performance de la méthode de détection d'interactions selon l'invention.

V. Exemple 5 : Effet de la durée de conservation des puces à molécules selon l'invention sur la performance de la méthode de détection d'interactions selon l'invention Les puces à molécules (à antibiotiques) selon l'invention obtenues selon l'exemple 1 (lame de verre revêtu d'un mélange hydraté d'agarose 1% et de Cop PEG 0,2%) ont été conservées à 4°C pendant 1, 8, 15 et 43 jours avant d'être mises en contact avec une protéine-cible : R6 PBP2x. Les autres conditions expérimentales, notamment de détection d'interactions, sont celles décrites dans l'exemple 1.

Les résultats sont montrés sur la Figure 3. La comparaison des résultats avec la protéine R6 PBP2x montre que, pour l'ensemble des antibiotiques étudiés, une différence importante dans l'intensité des signaux a été détectée sur les puces conservées huit jours par rapport à celles conservées une seule journée. En outre, l'augmentation des signaux a encore été observée après 43 jours de conservation. Les caractéristiques structurales et fonctionnelles des petites molécules peuvent ainsi affecter l'efficacité de leur immobilisation non-covalente sur la couche d'agarose et de Cop PEG. Ainsi, la conservation prolongée des puces à molécules selon l'invention améliore encore la performance de la détection d'interaction entre une molécule et une cible.

VI. Exemple 6 : Comparaison des milieux comprenant du PBS et du Tris sur l'interaction de la protéine R6 PBP2x avec les antibiotiques immobilisés La protéine R6 PBP2x provenant de Streptococcus pneumoniae possède un point isoélectrique de 5,17. Une expérience a été effectuée avec cette protéine présente dans deux milieux (milieu approprié pour permettre la liaison spécifique entre les antibiotiques et la protéine- cible) différents : PBS (avec 154 mM NaCl / Tween-20 0,1%) à pH 7,4 ou Tris 10 mM (avec 154 mM NaCl / Tween-20 0,1%) à pH 7,4 sur une puce à antibiotiques obtenus selon l'exemple 1 (lame de verre revêtu d'un mélange hydraté d'agarose 1% et de Cop PEG 0,2%). Les autres conditions expérimentales, notamment de détection d'interaction, sont celles décrites dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés dans le Tableau 6. Tampon réactionnel PBS Tris Antibiotique / Ratio F800 / B800 Contrôle 6-APA 77, 45 84,80 Amp 106,06 114,48 Carb 52,64 57,12 Tic 60,58 61,16 Tem 3,16 3,01 Cpht 66,50 79,95 Cfx 2,64 2,01 Cphx 13,47 14,93 Cftx 51,40 44,25 Tableau 6. Effet des milieux réactionnels l'interaction de la protéine R6 PBP2x avec antibiotiques immobilisés. sur les Une variation de 31,3% du ratio F800/B800 a été détectée pour la céfoxitine lorsque le milieu réactionnel utilisé est le PBS, tandis que pour les huit autres antibiotiques, la différence n'était pas significative. Ces résultats indiquent que la composition du milieu réactionnel (milieu approprié pour permettre la liaison spécifique entre les antibiotiques et la protéine-cible) peut affecter l'interaction de la protéine-cible avec les molécules immobilisées en fonction de leur charge. VII. Exemple 7 : Etude de la compétition entre les antibiotiques immobilisés et un antibiotique ajouté dans le milieu réactionnel pour l'interaction avec la protéine-cible 15 L'interaction de deux molécules qui se lient au même site sur une protéine-cible peut être évaluée en suivant leur compétition dans le milieu réactionnel (milieu approprié pour permettre la formation d'une liaison spécifique entre les molécules et la protéine-cible). Dans 20 cet objectif, les expériences de compétition sur les puces selon l'invention (selon l'exemple 1, lame de verre revêtu d'un mélange hydraté d'agarose 1% et de Cop PEG 0,2%), entre des antibiotiques immobilisés et dirigés contre le site actif de deux protéines R6 PBP2x et R39 et 25 l'ampicilline qui se lie au même site actif de ces protéines ont été réalisées. Ainsi, l'ampicilline a été ajoutée dans le milieu réactionnel avec la protéine donnée dans le rapport molaire 10 : 1 et ensuite ce mélange (R6 PbP2x ou R39) a été incubé sur des puces composées de 14 30 antibiotiques et de divers contrôles positifs et négatifs. Les autres conditions expérimentales sont celles décrites dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés sur la Figure 4 (A et B) et dans le tableau 7, ci-dessous. 10 Les résultats montrent qu'après l'ajout de l'ampicilline comme compétiteur, une nette diminution des signaux fluorescents a été détectée pour tous les antibiotiques immobilisés (Fig. 4 A et B). Protéine R6 PBP2x Protéine R39 Concentration en ampicilline (pM) 0 6 0 7,5 Antibiotique / Ratio / B800 Contrôle F800 6-APA 21,96 1,02 3,55 1,01 Pen 1,11 1,02 1,04 1,03 Amp 31,80 1,04 33,92 1,02 Carb 7,62 1,01 4,50 1,01 Tic 12,00 1,01 6,11 1,00 Tem 1,15 1,00 1,98 1,00 Mth 1,02 1,00 1,02 1,00 Oxa 1,05 1,02 1,04 1,00 7-ACA 1,08 1,01 1,29 1,01 Cpht 6,30 1,03 7,93 1,02 Cfx 1,23 1, 08 3,69 1,04 Cphx 2,36 1,16 25,99 1,24 Cftx 7,58 1,00 5,29 1,01 Imp 1,34 1, 24 1,32 1,05 DMSO 55% 1,05 1,04 1,04 1,06 PBS iX 1,40 1,24 1,02 1,03 BSA 9, 53 7,90 10,32 11,35 Anti-PBP2x 26,27 24,22 4,73 2,69 Anti PBP5 10,54 12,99 17,61 21,62 Tableau 7. Compétition entre l'ampicilline dans le milieu réactionnel et les antibiotiques immobilisés pour 10 l'interaction avec les protéines R6 PBP2x et R39.

L'analyse quantitative des spots a montré que l'ampicilline dans la solution est aussi bien efficace pour inhiber l'interaction des antibiotiques immobilisés 15 avec la protéine R6 PBP2x qu'avec la protéine R39 (Tableau 7). Cette approche peut être utile pour identifier à haut débit de nouvelles molécules (immobilisées sur ledit5 dispositif) qui entrent en compétition avec des molécules connues capables de se lier spécifiquement à ladite cible. En particulier, cette approche peut être utile pour identifier à haut débit de nouvelles molécules qui entrent en compétition avec les antibiotiques de la famille des beta-lactamines interagissant avec le site catalytique des protéines PBPs. VIII. Exemple 8 : Criblaqe de différentes chimiothèques Différentes chimiothèques (DF, (Université d'Oxford), BA, SRI et AT (IBS de Grenoble)) ont été criblées selon la méthode de détection d'interactions selon l'invention, contre la protéine de type sauvage R6 PBP2x, son mutant résistant aux antibiotiques 5204 PBP2x S337A, la protéine de type sauvage R39 mais également la protéine résistante aux antibiotiques PBP5 issue d'Enterococcus faecium D63r. Les molécules susceptibles de se lier au site catalytique de la protéine PBP2x qui appartiennent à ces chimiothèques ont été sélectionnées après un criblage virtuel. Les molécules appartenant aux différentes chimiothèques ont été dissoutes dans l'eau, ou dans le DMF si elles étaient insolubles dans l'eau. Les concentrations en DMF testées pour la solubilisation des molécules varient entre 20 et 100%, sans affecter ni la qualité du dispositif, notamment de ladite couche ni les interactions avec les cibles protéiques. Il faut noter que la possibilité d'utiliser les molécules dissoutes dans une solution de DMF (amide dérivé de l'acide formique et de la diméthylamine) ou de DMSO à 100% et déposées sur le dispositif selon l'invention est un avantage au vu du criblage des molécules synthétisées chimiquement dans ces solvants, sans affecter l'interaction avec la cible protéique. Ainsi, le dispositif selon l'invention est tolérant à l'action (compatible) de différents solvants, notamment organiques et est ainsi particulièrement utile pour la préparation de puces à molécules, notamment de faible masse moléculaire et qui possèdent une faible solubilité. Les conditions expérimentales sont celles décrites dans l'exemple 1. Une centaine de petites molécules provenant de quatre différentes chimiothèques a été immobilisée en 4 répliques sur un dispositif de puces à molécules selon l'invention, à savoir une lame de verre recouverte d'un mélange hydraté d'agarose 1% et de CopPEG 0,2%. Divers contrôles positifs et négatifs (l'anticorps polyclonal anti-PBP2x, les 14 antibiotiques décrits précédemment) ont été aussi inclus dans ces puces qui ont été conservées pendant 8 jours à 4°C avant l'expérience. Les puces ont ensuite été incubées avec une des protéines marquées dans les différentes conditions décrites précédemment. Des résultats similaires ont été obtenus dans ces expériences sauf que l'intensité des signaux a été variable selon la condition utilisée. Les images obtenues après la réaction d'interaction montrent que chacune des quatre chimiothèques contient des molécules qui réagissent avec les cibles protéiques (Fig. 5 A, B et C). L'analyse quantitative des résultats montre que parmi ces molécules il en existe certaines qui possèdent une forte affinité vis à vis d'au moins une des protéines testées. Un filtre de 2 a été appliqué aux valeurs des ratios obtenus pour discriminer les molécules capables de se lier spécifiquement avec les protéines (molécules dont la valeur du ratio F800 / B800 est supérieure à 2) de celles qui ne se lient pas spécifiquement avec les protéines (molécules dont la valeur du ratio F800 / B800 est inférieure à 2) (Fig. 6A, B, C et D). Les sept molécules DF 26, BA 1, BA 9, SRI 8, SRI 13, AT 2 et AT 39 se lient spécifiquement avec les quatre protéines testées. La molécule SRI 17 se lie spécifiquement avec les protéines de type sauvage R6 PBP2x et R39 mais pas avec les protéines mutées. Il est remarquable que l'intensité des signaux pour les molécules DF 26, BA 9 et AT 39 a été très élevée ce qui pourrait indiquer leur capacité de réagir avec la même efficacité au site catalytique des protéines sauvages et mutée.

L'expérience de compétition effectuée en parallèle a montré que l'ampicilline peut inhiber l'interaction des protéines avec certaines molécules qui possèdent la capacité d'interagir avec ces cibles. En effet, une compétition importante a été détectée entre la molécule AT 2 immobilisée et l'ampicilline dans la solution pour l'interaction avec la protéine R39.

Au total, 19 molécules ont été identifiées après le criblage des quatre chimiothèques en comparant leur capacité d'interagir avec une affinité élevée avec au moins une des trois protéines testées R6 PBP2x, 5204

PBP2x, R39 et PBP5 (Tableau 8). 20 R6 PBP2x 5204 PBP2x R39 PBP5 Molécules Ratio F800 / B800 DF 8 2,08 2,56 1,34 1,09 DF 14 2,15 1,52 2,53 2,43 DF 21 0,80 0,70 1,08 2,02 DF 22 0,89 0,81 1,14 2,07 DF 26 3,59 4,66 6,85 2,50 BA 1 4,18 4,39 3,75 2,80 BA 9 24,56 8,39 35,03 12,90 SRI 8 2,73 2,02 3,11 2,96 SRI 11 1,53 2,42 2,26 1,78 SRI 13 2,61 2,73 3,66 2,00 SRI 17 2,04 1,63 2,17 1,11 SRI-01-050 2,93 3,05 3,71 1,52 AT 2 3,46 3,89 10, 20 4,35 AT 12 2,50 1,83 2,86 4,60 AT 16 1,40 1,28 1,67 2,47 AT 22 1,33 1,18 2,00 1,59 AT 27 0,77 0,76 0,73 2,36 AT 34 2,08 1,93 2,64 2,37 AT 39 8,98 22,21 2,44 46,31 * - L'ampicilline dans l'expérience de compétition a été ajoutée en concentration de 6 pM pour les protéines R6 PBP2x et 5204 PBP2x S337A et de 7,5 pM pour la protéine R39. Tableau 8. Les molécules sélectionnées suite au criblage de quatre chimiothèques contre les protéines R6 PBP2x, 5204 PBP2x S337A, R39 et PBP5.

IX : Exemple 9 : Confirmation de l'activité antibactérienne des molécules sélectionnées à partir de l'exemple 8 L'activité anti-bactérienne des molécules sélectionnées selon l'exemple 8 a été évaluée par la technique d'antibiogramme sur les bactéries gram-positives et gram-négatives. Il a été trouvé que certaines molécules (SRI 11 et AT 12) possèdent une activité importante contre les deux types de bactéries. Ces résultats démontrent l'efficacité des puces à molécules et des méthodes de détection d'interactions selon l'invention, notamment pour le criblage d'agents anti-bactériens potentiels. Cette méthode peut être considérée comme universelle du fait de sa capacité à détecter tous les types d'interaction des molécules avec une cible, notamment une protéine-cible. En particulier, notamment dans le cas où la cible est une protéine, l'étape de compétition avec au moins une molécule capable de se lier spécifiquement à la cible peut permettre la détection de molécules qui, par exemple, se lient à un même ou à un autre site (notamment catalytique) sur la cible que la molécule utilisée dans cette étape (qui est connue pour être capable de se lier spécifiquement à ladite cible).

Ainsi cette étape peut également permettre la détection de molécules se liant spécifiquement à une cible donnée et de connaître leur site de liaison sur la cible ou d'identifier de nouveaux sites (notamment catalytique) sur une cible, notamment une protéine. Ainsi, l'absence de compétition des molécules immobilisées avec l'ampicilline peut être un indice de la présence d'un site(s) différent(s) de la poche catalytique dans les protéines PBP qui peuvent être utilisés pour le développement de nouveaux agents anti-bactériens. Enfin, la méthode élaborée peut être aussi appliquée pour le criblage d'autres agents thérapeutiques notamment contre les cancers, les maladies cardio-vasculaires et neuromusculaires. 15

Claims

REVENDICATIONS

1. Dispositif de puces à molécules comprenant un 5 substrat dont au moins une partie d'au moins une surface est revêtue d'une couche comprenant : -de l'agarose et/ou au moins un de ses dérivés ; et - au moins un polyéthylène glycol et/ou au moins un de ses dérivés.

2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite couche est un mélange, notamment homogène, - de l'agarose et/ou d'au moins un de ses dérivés, en particulier de l'agarose ; et 15 - d'au moins un polyéthylène glycol et/ou d'au moins un de ses dérivés, en particulier d'au moins un polyéthylène glycol ; la concentration en agarose et/ou ses dérivés dans ledit mélange est comprise entre 0,002 g/mL et 0,04 g/mL, 20 de préférence entre 0,005 g/mL et 0,02 g/mL et tout préférentiellement 0,01 g/mL ; et la concentration en polyéthylène glycol et/ou ses dérivés dans ledit mélange est comprise entre 0,001 g/mL et 0, 02 g/mL, de préférence entre 0,0005 g/mL et 0,02 25 g/mL, de préférence entre 0,001 g/mL et 0,015 g/mL et tout préférentiellement entre 0,002 g/mL et 0,01 g/mL. 10

3. Dispositif selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit au moins un polyéthylène glycol et ledit au moins un de ses dérivés ont une masse moléculaire compris entre 300 et 10 000 000 Daltons, de préférence entre 6 000 et 40 000 Daltons et tout préférentiellement entre 15 000 et 20 000 Daltons.

4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit substrat est un support solide ou semi-solide réalisé à base d'au moins un matériau choisi dans le groupe comprenant les verres, le silicium, le silicone, les polymères tel que les plastiques, le polyacrylamide, le polypyrrole, les polyoses et les métaux tel que l'or, le platine et un mélange de ceux-ci.

5. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit substrat est une lame de verre.

6. Puce à molécules comprenant au moins une molécule, de préférence une pluralité de différentes molécules, liée de manière non-covalente à ladite couche du dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, en particulier à des positions définies.

7. Puce selon la revendication 6, caractérisée en ce que la masse moléculaire de ladite au moins une molécule est comprise entre 50 et 150 000 Daltons, de préférence entre 50 et 1000 Daltons et tout préférentiellement entre 100 et 600 Daltons.

8. Puce selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que ladite au moins une molécule est d'origine naturelle ou synthétique, en particulier d'origine synthétique.

9. Kit ou nécessaire pour la détection d'interactions entre au moins une molécule et au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes, les acides nucléiques et les aptamères, en particulier les protéines, ledit kit comprenant : - au moins un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ; et - au moins une molécule, de préférence une pluralité de molécules différentes ; et - au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes les acides nucléiques et les aptamères, en particulier les protéines ; et - au moins un moyen de détection de l'interaction entre ladite au moins une molécule et ladite au moins une cible.

10. Kit ou nécessaire pour la détection d'interactions entre au moins une molécule et au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes les 20 25acides nucléiques et les aptamères, en particulier les protéines, ledit kit comprenant : - une puce selon l'une quelconque des revendications 6 à 8; et - au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes les acides nucléiques et les aptamères, en particulier les protéines ; et - au moins un moyen de détection de l'interaction entre ladite au moins une molécule et ladite au moins une cible.

11. Kit selon l'une quelconque des revendications 9 ou 15 10, caractérisé en ce que ladite cible est une protéine et ledit moyen de détection est un colorant fluorescent, de préférence dans le proche infrarouge, ledit colorant fluorescent étant lié à la protéine. 20

12. Kit selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que ladite cible est une protéine et ledit moyen de détection est un colorant fluorescent, de préférence dans le proche infrarouge, lié à un anticorps dirigé contre la protéine. 25

13. Utilisation d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou d'une puce selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou d'un kit selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, pour la 30 détection d'interactions, entre au moins une molécule et 10au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes les acides nucléiques et les aptamères, en particulier les protéines.

14. Utilisation selon la revendication 13 pour : - le criblage de molécules capables d'interagir avec ladite au moins une cible, en particulier le criblage de molécules capables de moduler l'activité enzymatique d'une protéine et/ou de se lier à un site catalytique d'une protéine; ou - le criblage de cibles capables d'interagir avec ladite au moins une molécule, en particulier le criblage de protéines qui sont des ligands de ladite au moins une molécule ; ou - la détermination de la présence et/ou de la concentration et/ou la caractérisation d'au moins une cible présente dans un échantillon, en particulier une protéine, notamment avec une conformation protéique particulière ; ou - la séparation de formes particulières de ladite au moins une cible présente dans un échantillon, en particulier la séparation des formes actives et inactives d'au moins une protéine présente dans un échantillon.

15. Procédé de détection d'interactions entre au moins une molécule, de préférence une pluralité de différentes molécules et au moins une cible choisie dans le groupe 30 comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits 10 15 20 25cellulaires, les cellules, les organismes les acides nucléiques et les aptamères, en particulier les protéines, comprenant les étapes suivantes : la mise en contact d'au moins une molécule, de préférence une pluralité de différentes molécules, avec ledit dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, en particulier à des positions définies, dans un milieu et dans des conditions appropriés pour obtenir la liaison non-covalente de ladite molécule audit dispositif, afin d'obtenir un réseau de molécules ; (ii) la mise en contact dudit réseau obtenu à l'étape (i), avec au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes les acides nucléiques et les aptamères, en particulier les protéines, dans un milieu et dans des conditions appropriés pour permettre la formation d'une liaison spécifique entre ladite au moins une molécule et ladite au moins une cible ; (iii) la détection sur ledit dispositif de la ou des molécules à laquelle/auxquelles se lient spécifiquement ladite au moins une cible. 25

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la masse moléculaire de ladite au moins une molécule est comprise entre 50 et 150 000 Daltons, de préférence entre 50 et 1000 Daltons et tout préférentiellement entre 100 et 600 Daltons. (i) 5 10 15 20 30

17. Procédé de détection d'interactions entre au moins une molécule, de préférence une pluralité de différentes molécules et au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes les acides nucléiques et les aptamères, en particulier les protéines, comprenant les étapes suivantes : (ii) la mise en contact avec une puce selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 d'au moins une cible choisie dans le groupe comprenant les protéines, les polypeptides, les extraits cellulaires, les cellules, les organismes les acides nucléiques et les aptamères, en particulier les protéines, dans un milieu et dans des conditions appropriés pour permettre la formation d'une liaison spécifique entre les molécules et ladite cible ; (iii) la détection sur ladite puce de la ou des molécules à laquelle/auxquelles se lient spécifiquement ladite au moins une cible. 20

18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que ladite cible est une protéine marquée par un colorant fluorescent, de préférence dans le proche infrarouge, et en ce que l'étape 25 (iii) est réalisée à l'aide d'un dispositif d'imagerie à fluorescence, de préférence à infrarouge.

19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que ladite cible est une 30 protéine et en ce qu'il comprend en outre, l'étape suivante : 15- la mise en contact de la protéine avec un anticorps marqué avec un colorant fluorescent, de préférence dans le proche infra rouge, ledit anticorps étant dirigé contre la protéine ; et en ce que l'étape (iii) est réalisée à l'aide d'un dispositif d'imagerie à fluorescence, de préférence à infrarouge.

20. Procédé selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que lesdits colorants fluorescents sont des colorants fluorescents dans le proche infrarouge ayant une longueur d'onde comprise entre 700 et 2 500 nm, de préférence entre 700 et 1 100 nm et tout préférentiellement entre 720 et 820 nm.

21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisé en ce que la concentration de ladite protéine dans ledit milieu de l'étape (ii) est comprise entre 0,01 et 100 M, de préférence entre 0,1 et 10 M, et tout préférentiellement entre 0,5 et 2 M.

22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 21, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, préalablement à l'étape (ii), l'étape suivante : - l'hydratation, par au moins une étape d'hydratation, de ladite couche dudit dispositif.

23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 et 17 à 22, caractérisé en ce que l'étape (i) estréalisée au moins 1 jour, de préférence au moins 5 jours et tout préférentiellement au moins 8 jours avant la mise en oeuvre de l'étape (ii).

24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 23, caractérisé en ce que ledit milieu de l'étape (ii) comprend au moins un sel choisi dans le groupe comprenant le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de magnésium, de préférence le chlorure de sodium, à une concentration comprise entre 10 mM et 300 mM, de préférence entre 30 mM et 200 mM et tout préférentiellement entre 100 mM et 160 mM.

25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, entre l'étape (ii) et l'étape (iii), l'étape suivante : - l'élimination par au moins une étape de lavage, dans des conditions appropriées, des cibles non liées spécifiquement à ladite au moins une molécule.

26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 25, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante, de préférence simultanément à l'étape (ii) : - la mise en contact de ladite cible et du réseau obtenu à l'étape (i) selon la revendication 15 ou d'une puce selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, avec au moins une molécule capable de se lier spécifiquement à ladite cible. 25

27. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 26 pour le criblage et la sélection de molécules capables de se lier spécifiquement à une cible, en particulier à une protéine.

28. Utilisation selon la revendication 27 pour le criblage et la sélection d'agents antibactériens et/ou d'agents thérapeutiques destinés à prévenir et/ou à traiter des pathologies, notamment les cancers et les maladies cardiovasculaires et neuromusculaires.

29. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 26 pour la détermination de la présence et/ou de la concentration et/ou la caractérisation d'au moins une cible, en particulier d'au moins une protéine, présente dans un échantillon, ladite cible étant capable de se lier spécifiquement auxdites molécules liées de manière non-covalente audit dispositif.