FR2906818A1 - Procede de production de proteines recombinantes a l'aide de plantes carnivores - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de production d'au moins une protéine, comprenant la culture d'une plante carnivore ou insectivore, caractérisé en ce que ladite plante a été génétiquement modifiée pour exprimer la ou les dite(s) protéine(s).

Description

1 La présente invention concerne un procédé de production d'au moins une

protéine, comprenant la culture d'une plante carnivore ou insectivore, caractérisée en ce que ladite plante a été génétiquement modifiée pour exprimer la ou les dite(s) protéine(s).

Les protéines représentent aujourd'hui une catégorie de molécules très utilisée, aussi bien dans le champ thérapeutique que diagnostique ou comme réactif de laboratoire notamment. De nombreux efforts sont donc réalisés pour améliorer les procédés de production de protéines recombinantes existant ou développer de nouveaux systèmes de production plus performants.

Les systèmes usuels de production de protéines recombinantes impliquent différents types d'organismes vivants pouvant être modifiés génétiquement afin de produire des protéines dites "recombinantes" : les micro-organismes (bactéries , levures, champignons), les cellules de mammifères en culture, les cellules d'insectes en culture, les animaux transgéniques, ou les plantes transgéniques.

Le système des plantes transgéniques présente des avantages. Notamment, il conduit à une grande sécurité biologique, puisque aucun agent pathogène connu ne peut infecter à la fois des plantes et des animaux. De plus, la production peut se faire à grande échelle par la culture de ces plantes transgéniques. Elle peut aussi se faire à des coûts plus faibles que dans d'autres systèmes industriels de production. L'utilisation de plantes transgéniques permet également la production de protéines ayant subi un ou plusieurs processus de maturation post-traductionnelle. Enfin, le niveau actuel des biotechnologies végétales permet de cibler de façon spécifique les tissus dans lesquels s'accumulera la protéine d'intérêt, tels que les feuilles ou les graines, facilement accessibles.

Ainsi, l'expression de la protéine recombinante est généralement dirigée vers les feuilles et les graines. Le feuillage offre beaucoup de possibilités de synthèse (1). Ainsi, le tabac génétiquement transformé est utilisé par exemple pour la production 2906818 2 d'hémoglobine humaine. Cependant, le feuillage contient parfois des substances gênantes, difficiles à éliminer (polyphénols présents dans les feuilles de tabac). De plus, les protéines recombinantes doivent être extraites de ces feuilles rapidement car celles-ci sont rapidement périssables. 5 Les graines sont aussi parfois utilisées comme tissu de stockage, du fait de la stabilité plus grande du milieu d'accumulation des protéines, à faible teneur en eau. Ainsi, le maïs transgénique est utilisé par exemple pour la production de lipase gastrique. Les limitations de la graine proviennent principalement d'une capacité plus réduite de synthèse, et de l'obligation d'attendre la floraison avec un risque accru de 10 dispersion du transgène par pollinisation croisée. Dans les deux cas, le principal inconvénient de ces systèmes de production de protéines recombinantes dans le feuillage ou les graines de plantes transgéniques est lié à la nécessité d'étapes lourdes d'extraction-purification de la protéine recombinante à partir du tissu végétal, qu'il s'agisse de feuilles ou de graines. En effet, la protéine 15 recombinante est insérée dans la matrice du tissu végétal, ce qui rend son extraction et sa purification difficile à mettre en oeuvre, alors même que cette étape doit être réalisée le plus rapidement possible du fait de la protéolyse rapide qui survient dès l'homogénéisation (2). Cette dernière étape limite donc les avantages des systèmes actuels de production de protéines recombinantes par des plantes transgéniques. Il existe 20 par conséquent un besoin réel de systèmes de production qui conservent les avantages des systèmes de production actuels utilisant des plantes transgéniques tout en limitant fortement leurs inconvénients, notamment en simplifiant considérablement l'extraction-purification de la protéine recombinante. 25 Les plantes carnivores sont des végétaux capables de capturer des proies et d'en assimiler tout ou partie afin de subvenir partiellement à leurs besoins en azote. Outre leur capacité à fixer le dioxyde de carbone de l'air pour leurs besoins photosynthétiques et à absorber de l'eau et des sels minéraux par leurs racines, ces plantes, qui vivent souvent dans des milieux pauvres en éléments nutritifs, ont développé au niveau de 30 leurs feuilles des pièges de forme et de fonctionnement variés pour capturer des proies leur apportant un supplément azoté. Malgré leurs formes et leurs modes de fonctionnement variés, les pièges des plantes carnivores ont en commun de contenir des 2906818 3 sucs comprenant des enzymes digestives permettant une digestion plus ou moins poussée des proies et leur assimilation. Il existe donc chez les plantes carnivores un système d'expression et de transport d'enzymes digestives dans les pièges, où ces enzymes, présentes dans un liquide, plus 5 ou moins visqueux et collant, sont directement accessibles et faciles à purifier. De plus, la collecte des sucs digestifs des pièges peut être réalisée sans détruire la plante, qui peut donc continuer à produire. Chez certains genres, et sous réserve de quelques précautions, la collecte des sucs digestifs peut donc être réalisée dans des conditions stériles, y compris quand la plante est cultivée dans un environnement non stérile. Enfin, 10 l'excrétion des sucs digestifs au niveau des pièges peut être induite par un stimulus chimique, et éventuellement mécanique, dû à la présence d'un insecte piégé. Le stimulus chimique peut être remplacé par l'application d'une solution contenant de l'azote organique, du phosphate, du chlorure de sodium, de la gélatine, de l'acide salicylique, ou de la chitine (3; 4), permettant ainsi potentiellement d'augmenter 15 facilement la production des protéines purifiées à partir des sucs digestifs. De ce fait, différents documents décrivent la purification de protéines de plantes carnivores. La demande EP0019808 (5) décrit l'utilisation de sucs digestifs de plantes carnivores dans le traitement du cancer. De même, la demande WO9942115 (6) décrit l'utilisation de sucs digestifs de plantes carnivores afin d'inhiber des protéines kinases 20 impliquées dans certaines pathologies. Et la demande de brevet WO02057408 (7) décrit l'utilisation de chitinases, protéines retrouvées à l'état naturel dans les sucs foliaires de plantes carnivores du genre Nepenthes, pour des utilisations pharmaceutiques (antifongiques) ou agronomiques (anti-maladies cryptogamiques). Dans chacun de ces documents toutefois, les protéines produites et purifiées sont des protéines natives, 25 endogènes, de la plante carnivore. Les plantes carnivores n'étant pas génétiquement modifiées, aucune protéine recombinante n'est produite. A aucun moment ces brevets n'évoquent la possibilité de produire d'autres protéines à partir de plantes carnivores que celles déjà présentes à l'état naturel chez ces végétaux. Par ailleurs, un article de Hirsikorpi et al. décrit la transformation de Drosera 30 rotundifolia par le vecteur Agrobacterium avec un gène de luciférase (8). Toutefois, il n'est présenté à aucun moment de résultat montrant une éventuelle sortie de la protéine luciférase dans les sucs se trouvant à la surface des feuilles des plantes. 2906818 4 Or, seules certaines protéines sont transportées vers les sucs digestifs des plantes carnivores. Le processus d'excrétion des protéines par les plantes carnivores a fait l'objet de quelques descriptions anatomiques (9). Sans pour autant que l'on en ait la preuve formelle, il semble bien que la production de sucs foliaires soit due à une 5 production accrue de vésicules golgiennes provenant du réticulum endoplasmique (RE), comme c'est déjà le cas pour d'autres plantes (10). Pour autant, la seule présence d'une protéine à l'intérieur du RE n'apporte aucune garantie qu'elle sera excrétée par la plante. D'une manière générale, les publications récentes décrivent parfois des résultats 10 inattendus en matière de localisation de protéines. Aucun élément ne permet donc de garantir qu'une protéine, sans aucun signal d'adressage ou même possédant un signal d'adressage vers le RE, pourra être excrétée en quantité suffisante pour être détectée dans les sucs digestifs des pièges de plantes carnivores. De ce fait, seules des protéines déjà naturellement présentes dans les sucs digestifs des pièges de plantes carnivores ont 15 été purifiées à ce jour. Aucun document ne décrit ou suggère la possibilité de générer une plante carnivore génétiquement modifiée excrétant au niveau des pièges une protéine recombinante. De plus, les sucs digestifs sécrétés au niveau des pièges des plantes carnivores comprennent des enzymes digestives, telles que des protéases, peroxydases, 20 ribonucléases, lipases, amylases, estérases, phosphatases acide, chitinases, glycosylases. Or cette capacité naturelle à sécréter des enzymes digestives, et notamment des protéases, au niveau des pièges constitue a priori un obstacle à la production de protéines recombinantes par sécrétion au niveau des pièges du fait du risque de dégradation induit par la présence de ces protéases. 25 Pourtant, les inventeurs ont trouvé de façon surprenante qu'il est possible de générer des plantes carnivores génétiquement modifiées exprimant une protéine exogène recombinante, dont une quantité non négligeable est détectable au niveau des sucs digestifs dans les pièges. En outre, les tests réalisés par les inventeurs sur plusieurs protéines recombinantes distinctes montrent qu'il est possible d'isoler des protéines 30 fonctionnelles qui ne sont donc pas dégradées de façon significative par les enzymes digestives. Ainsi, les inventeurs ont montré que, contrairement aux prévisions, il est possible, en modifiant génétiquement une plante carnivore pour qu'elle exprime une 2906818 5 protéine exogène recombinante, de détecter en quantité suffisante cette protéine recombinante dans les sucs digestifs des plantes, et de purifier cette protéine sous une forme fonctionnelle, malgré l'existence des enzymes digestives. Les problèmes du transport de la protéine recombinante dans les pièges et de la dégradation par les 5 enzymes digestives étant surmontés, ce système de production permet de combiner de nombreux avantages liés à la collecte de la protéine recombinante à partir des sucs digestifs des pièges : - la plante n'est pas détruite ni même significativement amoindrie par la collecte et peut donc être conservée en culture pour d'autres collectes 10 ultérieures ; les pièges sont naturellement des organes facilement accessibles, permettant ainsi une collecte aisée des sucs digestifs ; - chez certaines plantes carnivores, notamment celles possédant des pièges à urnes ou à outres, les sucs digestifs sont produits et excrétés en 15 une certaine quantité dans des pièges fermés au milieu extérieur, le piège n'étant ouvert au milieu extérieur qu'une fois prêt pour la digestion de proies. Même si la plante est cultivée dans un environnement non stérile, durant la période de préparation du piège, les sucs digestifs sont excrétés en conditions naturellement stériles. 20 Sous réserve de réaliser la collecte de sucs digestifs avant l'ouverture du piège et de quelques précautions, la collecte des protéines recombinantes peut donc être réalisée dans certains modes de réalisation dans des conditions stériles ; le fait que la protéine recombinante à purifier soit présente dans un 25 milieu liquide extérieur à la plante, et non dans un tissu végétal solide (tel qu'une feuille ou une graine), simplifie énormément l'étape de purification de la protéine recombinante ; enfin, ce système peut être induit dans la mesure où l'excrétion des sucs digestifs peut être augmentée par des signaux mécaniques et/ou 30 chimiques mimant la présence d'une proie. 2906818 6 L'invention concerne donc un procédé de production d'au moins une protéine, comprenant la culture d'une plante carnivore, caractérisé en ce que ladite plante a été génétiquement modifiée pour exprimer la ou les dite(s) protéine(s). 5 Par plante carnivore , on entend tout végétal capable de capturer et digérer des proies animales, tout type de proie du règne animal étant englobé dans cette définition, grâce à un système d'expression et de transport d'enzymes digestives dans les pièges. Le plus souvent, les proies animales sont des insectes (on parle alors plus précisément de plantes insectivores), mais de petits rongeurs ou batraciens, ou encore de 10 petits animaux aquatiques dans le cas des plantes carnivores aquatiques peuvent également être pris dans les pièges de certaines plantes carnivores. Le terme plante carnivore utilisé ici inclut donc tous les types de plantes carnivores possédant un système d'expression et de transport d'enzymes digestives dans les pièges, et en particulier les plantes insectivores, mais sans s'y limiter. En revanche, seules les plantes 15 carnivores possédant un système d'expression et de transport d'enzymes digestives dans les pièges sont inclues au sens de l'invention. Notamment, certains genres de végétaux chez lesquels l'absence de sécrétion d'enzymes digestive est compensée par la présence de microorganismes extérieurs à la plante sécrétant des enzymes digestives, bien que habituellement considérés comme faisant partie des plantes carnivores, ne sont pas 20 considérées comme des plantes carnivores au sens de la présente invention. Ainsi, les genres Brochinia, Catopsis berteroniana, Ibicella lutea, Heliamphora, et Darlingtonia ne sont pas considérés comme des plantes carnivores au sens de l'invention. Comme indiqué précédemment, l'intérêt des plantes carnivores est l'existence de 25 protéines excrétées au niveau des sucs digestifs des pièges, protéines qui sont directement accessibles, faciles à purifier puisque non insérées dans un tissu végétal, et au moins dans certains cas et pendant un certain temps, stockées sous une forme stérile par la plante. Pour tirer profit de ces avantages, il est nécessaire que la protéine recombinante 30 exprimée par la plante soit également excrétée au niveau des pièges de la plante. Ainsi, avantageusement, dans un procédé selon l'invention, la ou les dite(s) protéine(s) est 2906818 7 traduite dans les cellules de plante et excrétée par le système natif d'excrétion des protéines naturelles de ladite plante. Par plante génétiquement modifiée , on entend une plante chez laquelle un 5 gène ou un fragment de gène a été inséré. Cela inclut donc les plantes ayant été transformées avec un vecteur d'expression du gène ou fragment de gène d'intérêt, permettant l'expression de ce gène ou ce fragment de gène chez cette plante. Le gène d'intérêt, qui est inséré en totalité ou en partie chez la plante, peut être aussi bien un gène exogène, no exprimé naturellement par la plante, qu'un gène endogène déjà 10 exprimé naturellement par la plante et dont on souhaiterait augmenter l'expression. En particulier, dans un mode de réalisation avantageux d'un procédé selon l'invention, la plante carnivore qui est cultivée a été génétiquement modifiée par transformation par Agrobactérium, par biolistique, par électroporation, par microinjection ou par l'utilisation de vecteurs viraux. 15 La transformation de plantes par Agrobactérium est une technique bien connue de l'homme du métier. Brièvement, Agrobactérium tumefaciens, un microorganisme pathogène chez la plante, est connu depuis le début du 20ême siècle. Par nature, A. tumefaciens a la capacité exceptionnelle de transférer un segment d'ADN particulier (ADN-T) de son plasmide inducteur de tumeur (Ti) vers le noyau de cellules de plantes 20 infectées où il est ensuite intégré de façon stable dans le génome hôte et transcrit, provoquant la maladie de la galle du collet. Le fragment d'ADN-T est flanqué de répétitions directes de 25 paires de bases (pb) agissant en tant que signal d'élément cisrégulateur pour l'appareil de transfert. Il a été démontré qu'en réalité, tout ADN étranger placé entre ces bordures d'ADN-T peut être transféré aux cellules végétales. Il 25 est donc possible de générer des souches d'Agrobacterium dans lesquelles les gènes provoquant la maladie ont été remplacés par un ADN sélectionné de manière spécifique, permettant ainsi d'intégrer l'ADN sélectionné de manière spécifique de façon stable dans le génome de la plante. La transformation de plantes par biolistique, encore appelé bombardement au 30 moyen de microprojectiles ou microparticules, est une technique utilisée pour libérer l'ADN directement dans le génome hôte également bien connue de l'homme du métier. En résumé, un plasmide ou de l'ADN linéarisé contenant le(s) gènes(s) concerné(s) est 2906818 8 fixé à des particules de tungstène ou d'or (billes micro-porteuses) qui sont libérées dans les cellules de l'hôte à haute vitesse de manière à pénétrer le noyau des cellules végétales. Dans le noyau, l'ADN peut se séparer de la bille micro-porteuse et s'intégrer dans le génome hôte. Le bombardement au moyen de microprojectiles ou biolistique 5 peut être utilisé pour transformer le tissu de la plupart des espèces végétales. La technique d'électroporation des protoplastes, bien connue de l'homme du métier et qui fait appel à des impulsions électriques, peut également être utilisée pour transformer une plante. Brièvement, elle consiste à soumettre un mélange de protoplastes et d'ADN à une série de chocs électriques de courte durée et de tension 10 élevée. Le champ électrique provoque la déstabilisation de la membrane plasmique par polarisation des phospholipides qui la constituent et induit alors la formation de pores au travers desquels les molécules d'ADN peuvent transiter. Si le choc électrique n'a pas été trop violent, le phénomène est réversible et la membrane reprend ensuite son état initial, laissant le protoplaste parfaitement viable. 15 La technique de microinjection consiste à injecter directement, au moyen de micropipettes ou microseringues manipulées sous microscope, l'ADN sélectionné dans le noyau de protoplastes. Des vecteurs viraux peuvent également être utilisés pour la transformation. Cette technique, bien connue de l'homme du métier, consiste à utiliser un virus de plante à 20 ADN double brin, dans le génome duquel les gènes pathogènes ont été inactivés et le gène d'intérêt a été inséré. La plante est alors transformée par infection avec le virus modifié. Avantageusement, la transformation a été réalisée par Agrobactérium tumefaciens, par biolistique, ou par électroporation, techniques les plus couramment 25 utilisées. Par protéine , on entend tout type de polymère comprenant un squelette constitué d'acides aminés. Ainsi, on inclut par ce terme non seulement des protéines entières, mais aussi des peptides ou polypeptides correspondant à des sous-unités ou des 30 fragments de protéines entières, ainsi que tout peptide ou polypeptide d'intérêt, y compris s'il ne correspond pas à un fragment d'une protéine connue, qu'il s'agisse d'un variant d'un tel fragment (possédant des mutations par rapport au fragment de 2906818 9 référence) ou d'un peptide ou polypeptide créé de toutes pièces. En particulier, au sens de l'invention, une protéine peut comprendre des acides aminés modifiés n'existant pas à l'état naturel. De même, les liaisons peptidiques peuvent avoir été modifiées. En outre, on inclut également dans le terme protéine au sens de l'invention la présence facultative 5 de modifications post-traductionnelles de type glycosylation, phosphorylation, ou méthylation. De plus, ladite protéine produite grâce à un procédé selon l'invention peut présenter un intérêt dans tout type de domaine des activités humaines. Notamment, ladite protéine peut être choisie parmi un médicament de médecine vétérinaire ou 10 humaine, un agent cosmétique, un agent phytopharmaceutique, un agent de diagnostic, un agent nutraceutique ou.un réactif de laboratoire Par protéine médicament , on entend toute protéine faisant l'objet d'une autorisation de mise sur le marché (AMM) pour le traitement de maladies humaines ou vétérinaires. De telles protéines médicament comprennent notamment des hormones 15 protéiques (hormones sexuelles, hormone de croissance...), des enzymes, des anticorps (en particulier des anticorps monoclonaux), etc... Par protéine agent cosmétique , on entend toute protéine permettant de nettoyer, entretenir et embellir les parties externes du corps humain, notamment la peau ou les cheveux. Des exemples de protéines agents cosmétiques incluent le collagène, la 20 toxine botulique, ou les protéines de venin de serpent utilisées dans des soins de la peau. Par protéine agent phytopharmaceutique , on entend toute protéine permettant de protéger les végétaux ou les produits végétaux contre tous les organismes nuisibles ou à prévenir leur action, ce qui inclut notamment les pesticides ; exercer une action sur les processus vitaux des végétaux, par exemple en augmentant ou diminuant leur 25 croissance; ou assurer la conservation des produits végétaux. Par protéine agent de diagnostic , on entend toute protéine impliquée dans un test in vitro ou in vivo permettant de déterminer la présence ou l'absence chez un sujet d'une maladie particulière. Notamment, de telles protéines agent de diagnostic comprennent notamment : 30 des anticorps dirigés contre une protéine dont la présence dans un échantillon indique la présence d'une maladie, comme par exemple des anticorps dirigés contre des antigènes de microorganismes pathogènes 2906818 10 ou des antigènes tumoraux, permettant ainsi la détection des microorganismes ou d'un cancer ; - des protéines exprimées spécifiquement en cas de maladie, comme par exemple des protéines de microorganismes pathogènes, permettant ainsi 5 la détection chez un sujet de la présence d'anticorps dirigés contre ces protéines et donc le diagnostic de la maladie. Par protéine réactif de laboratoire , on entend toute protéine utilisée dans un laboratoire d'analyses médicales ou de recherche, tel que notamment un anticorps, une enzyme, un antigène, une hormone, une cytokine, une chemokine, un récepteur 10 cellulaire, etc... Par protéine nutraceutique , on entend toute protéine utilisée pour ses allégations santé, afin d'entretenir le capital santé du consommateur, telle que notamment des protéines ayant une activité sur la régénération ou la prolifération cellulaire, sur le système nerveux central, sur le système cardiovasculaire, les allergies, 15 et la prévention de maladies métaboliques (obésité, diabète). La culture de la plante carnivore utilisée dans un procédé selon l'invention est réalisée de façon classique, en tenant compte des particularités du type de plante carnivore choisi. Les méthodes de cultures des différents types de plantes carnivores 20 sont bien connues de l'homme du métier. D'une manière générale, beaucoup de plantes carnivores poussent sur des sols très riches en matière organique (ex : tourbières), ou même sous forme de lianes poussant sur des arbres porteurs (cas des Nepenthes). Certaines sont aquatiques comme les utriculaires. Des protocoles généraux de culture des plantes carnivores sont décrits dans le livre de Juniper et al (11), qui peuvent ensuite 25 être adaptés facilement par l'homme du métier à chaque plante particulière. Un des avantages évoqués précédemment lié au fait d'utiliser le système natif d'excrétion des protéines de la plante carnivore réside dans le fait que ce système est inductible par des signaux mécaniques et/ou chimiques mimant la présence d'une proie. 30 Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux du procédé selon l'invention, la plante est soumise à des stimuli chimiques, et éventuellement mécaniques, mimant la capture d'une proie et induisant une activation du système de production et d'excrétion des 2906818 11 protéines par ladite plante au niveau des pièges. De tels stimuli chimiques incluent notamment l'application d'une solution contenant de l'azote organique, du phosphate, du chlorure de sodium, de la gélatine, de l'acide salicylique, ou de la chitine (1,2). Toutefois, la plante peut également être cultivée en absence de tout stimulus chimique 5 et/ou mécanique mimant la capture d'une proie et induisant une activation du système de production et d'excrétion des protéines par ladite plante au niveau des pièges. Comme indiqué précédemment, un des problèmes potentiellement lié à l'excrétion de la protéine recombinante d'intérêt dans les sucs digestifs des pièges est lié 10 à la présence dans ces sucs d'enzymes digestives, et notamment de protéases. Outre le fait que les inventeurs ont montré que la présence de ces enzymes digestives n'est en réalité pas un obstacle à la purification de protéines fonctionnelles, il est de plus possible, pour diminuer encore les risques liés à ces enzymes, de prévoir dans le procédé selon l'invention l'inhibition de la synthèse d'une ou plusieurs enzymes 15 digestives, et en particulier d'une ou plusieurs protéases, par ladite plante carnivore. Ainsi, selon un mode de réalisation d'un procédé selon l'invention, ledit procédé comprend en outre l'inhibition de la synthèse d'une ou plusieurs enzymes digestives par ladite plante carnivore. Avantageusement, au moins une de la ou des dite(s) enzyme(s) digestive(s) dont la synthèse est inhibée est une protéase. En effet, ce sont les enzymes 20 les plus susceptibles de détériorer la protéine recombinante excrétée au niveau des pièges. Toutefois, d'autres protéines susceptibles de dégrader la protéine recombinante peuvent également être ciblées. Par exemple, dans le cas d'une protéine glycosylée, il est possible de cibler, seule ou en même temps que des protéases, une ou plusieurs glycosylases. D'autres enzymes susceptibles de dégrader d'autres types de 25 modifications post-traductionnelles peuvent également être ciblées. Une telle inhibition peut être partielle ou totale et peut être induite de différentes manières. Premièrement, elle peut être induite en utilisant des techniques génétiques permettant une telle inhibition. 30 Notamment, il est possible de cibler directement les gènes dont on souhaite inhiber l'expression, notamment par la suppression du génome de la plante du ou des 2906818 12 gènes d'enzyme digestive ou par l'extinction de la transcription de ces gènes appelée gene silencing . La suppression du génome de la plante, encore appelée knock-out ou KO , du ou des gènes d'enzyme(s) digestive(s) ciblé(s) est réalisée par les techniques 5 maintenant bien connues de l'homme du métier. L'extinction de la transcription du ou des gènes d'enzyme(s) digestive(s) ciblé(s) par silencing constitue un ensemble de techniques bien décrites chez les végétaux. Ainsi la technique de Virus Induced Gene silencing (VIGS) nécessite le clonage d'une courte séquence du gène de plante ciblé dans un virus végétal. Dans les quelques 10 semaines qui suivent l'infection virale qui contient le fragment de gène en question, le mécanisme naturel de défense de la plante conduit à la dégradation spécifique des ARNm correspondant au gène endogène de la plante qui est ciblé. Cette technique permet d'obtenir rapidement, en 3 à 4 semaines après l'infection virale, la mise sous silence du gène ciblé, à partir d'une plante normale, sans processus de régénération de 15 transformants in vitro, en utilisant le principe de contamination systémique du virus dans la plante. (12). La technique de co-suppression peut également conduire à l'extinction spécifique de l'expression de gènes ciblés. Cette extinction s'obtient en re-insérant un gène cible, souscontrôle d'un promoteur constitutif ou inductible ou tissu-spécifique, 20 dans une plante donnée. Le transfert de gène peut utiliser une technique quelconque de transformation génétique (infection par agrobacterium, par vecteur viral, par microinjection, par biolistique...). Pour une partie des plantes génétiquement transformées, on observe la disparition du caractère ou de la fonction codée par le gène cible (13). 25 L'inactivation post-transcriptionnelle de gènes peut aussi s'obtenir par toute technique de transformation génétique des végétaux (infection par agrobacterium, par vecteur viral, par microinjection, par biolistique...) en insérant dans la plante cible un fragment du gène dont on cherche à éteindre la transcription, suivant le principe des ARN interférents (RNAi (14)). 30 L'inhibition par voie génétique du ou des gènes d'enzyme(s) digestive(s) ciblé(s) peut également être réalisée indirectement par l'expression ectopique chez la plante carnivore d'au moins un gène d'inhibiteur de protéase, c'est-à-dire d'au moins un 2906818 13 gène dont l'expression conduit à la diminution partielle ou totale de l'expression d'au moins une protéase. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la plante carnivore qui est utilisée est également transformée pour exprimer au moins un gène d'inhibiteur de protéase, la transformation pouvant être réalisée par toute technique connue de 5 l'homme du métier, et notamment par toute technique décrite précédemment. Tout type de gène d'inhibiteur de protéase peut être utilisé. En particulier, la plupart des protéases possèdent une activité enzymatique optimale à pH acide. Par exemple, les deux protéases connues chez les plantes du genre Nepenthes (une endopeptidase et la Nepenthesin) sont des enzymes ayant une activité optimale à pH acide (15). De ce fait, 10 il peut être utile d'utiliser un gène connu pour inhiber l'expression de protéases acides. Notamment, le gène de levure IPA3_YEAST (Swissprot accession number P01094), qui code pour l'inhibiteur de la saccharopepsine, est connu pour coder pour un inhibiteur de protéase acide proche de celles des plantes du genre Nepenthes. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier d'un procédé selon l'invention 15 dans lequel on inhibe l'expression d'au moins une protéase, l'inhibition de la synthèse d'une ou plusieurs protéases par ladite plante carnivore est réalisée par des techniques génétiques choisies parmi la suppression du génome de la plante d'au moins un gène de protéase, l'extinction de la transcription d'au moins un gène de protéase par silencing , ou et l'expression ectopique d'au moins un gène d'inhibiteur de protéase. 20 Alternativement, l'inhibition de la synthèse d'une ou plusieurs enzymes digestives par la plante carnivore peut être induite en utilisant des techniques non génétiques. En particulier, l'inhibition peut également être induite en ajoutant directement dans le liquide digestif des pièges une solution inhibitrice de la ou des enzyme(s) digestive(s) ciblées, ou encore en contrôlant les conditions de pH et/ou de 25 température du liquide digestif, de façon à limiter l'activité de la ou des enzyme(s) digestive(s) ciblées. En effet, des inhibiteurs de la plupart des enzymes sont connus dans l'art, et la plupart des enzymes possèdent des conditions optimales de pH et/ou de température en dehors desquelles leur activité est limitée. En plaçant les sucs digestifs en présence d'inhibiteurs et/ou en dehors des conditions optimales d'activité 30 enzymatique de l'enzyme ciblée, il est donc possible de limiter son activité. En effet, les pièges étant facilement accessibles, il est possible d'ajouter dans le liquide digestif des pièges une solution d'inhibiteurs de la ou des enzyme(s) digestive(s) 2906818 14 ciblées, soit par injection de la solution dans les urnes ou outres des plantes à pièges à urnes (par exemple les Nepenthes) ou à outre (par exemple les Utriculaires), soit par pulvérisation de la solution sur la glu des plantes à pièges à glu (par exemple les plantes du genre Drosera). 5 En ce qui concerne plus particulièrement les protéases, différents types d'inhibiteurs de protéases peuvent être utilisés. Notamment, il a été montré que les activités des protéases de Nepenthes étaient inhibées par un inhibiteur de protéases acides d'animaux et de champignons : le DDE (Dichlorodiphenyldichloroethylene, (16)). Deux autres inhibiteurs de protéases acides, le DAN (Diazoacetyl-DL-norceuline 10 méthyl ester) et la Pepstatine (3S, 4S-4-amino-3-hydroxy-6-methyl-heptanoic acide) isolée de Streptomyces testaceus et d'autres actinomycètes qui forment un complexe avec des protéases à acides aspartiques, inhibent complètement l'activité digestive des urnes de Nepenthes (15, 17). D'autres inhibiteurs de protéases et même des mélanges de plusieurs protéases 15 ayant des cibles de protéines différentes sont commercialisés. Ces mélanges permettent d'inhiber un panel de protéases différentes (par exemple, cystéine protéase, sérine protéase, et métaloprotéases, on y retrouve également la pepstatine), assurant une meilleure protection pour la préservation de notre protéine d'intérêt. Un ou plusieurs de ces inhibiteurs peuvent donc être ajoutés sous forme de 20 solution injectée ou pulvérisée au niveau des pièges. Il est également possible de limiter l'activité des protéases au niveau des pièges en contrôlant la température et/ou le pH des liquides digestifs. En effet, il a notamment été montré que l'activité digestive des protéases extraites du liquide digestif d'urnes de Nepenthes augmentait avec la température, pour atteindre un optimum autour de 25 50 C/60 C (15). Il est donc possible de limiter leur activité en maintenant les plantes à une température plus faible à partir du moment où les urnes sont en développement. Avantageusement, pour limiter l'activité protéasique, la température devrait être comprise entre 5 et 25 C, de préférence entre 5 et 20 C, entre 5 et 15 C, voire entre 5 et 10 C. 30 En outre, il a été montré que l'activité protéasique du liquide digestif des plantes carnivores est optimale à pH bas (15), l'acidification du liquide augmentant l'activité digestive. Il semble que la digestion serait due principalement aux enzymes sécrétées 2906818 15 par les glandes quand l'ascidie est jeune et le pH bas. Mais, avec le vieillissement, le pH augmente et les microorganismes deviennent responsables de la plus grande part de la digestion. Chez Nepenthes villosa, par exemple, le liquide digestif reste actif pendant environ 4 à 5 mois, pendant lesquels le pH est maintenu autour de 2. Passé ce délai, le 5 pH monte rapidement à 6. Il est donc possible de tirer profit de ce fait en contrôlant le pH du liquide digestif, notamment par l'ajout d'une solution basique par injection dans les urnes ou dans les outres ou pulvérisation sur les pièges à glu, ce qui permettrait de limiter l'activité des protéases. L'activité protéasique étant optimale autour de pH 2-3, le pH devrait de préférence être maintenu au-dessus de 4 ; au-dessus de 4,5 ; 10 avantageusement au-dessus de 5 ; au-dessus de 5,5 ; plus avantageusement au-dessus de 6 ; au-dessus de 6,5 ; voire au-dessus de 7 ; ou au-dessus de 7,5 . De préférence, le pH ne devrait pas être trop basique non plus et donc rester en dessous de 9, avantegeusement en dessous de 8,5, voire en dessous de 8. Ainsi, de préférence, pour contrôler l'activité des protéases, le pH devrait être compris entre 4 et 9, 15 avantageusement entre 5 et 8,5, avantageusement entre 6 et 8, voire entre 7 et 8. Une autre amélioration possible du procédé selon l'invention consiste à favoriser l'excrétion de la protéine recombinante dans les pièges soit par la présence dans la protéine d'un peptide signal permettant son transport dans le réticulum endoplasmique 20 (RE) soit en favorisant le transport du RE vers le Golgi, puis du golgi vers la membrane plasmique et les pièges par la voie transmembranaire, en sur-exprimant dans la plante un gène de la famille des SNARE protéines. En ce qui concerne le peptide signal, comme indiqué précédemment, bien que la 25 présence d'un tel peptide ne soit pas nécessairement suffisante pour permettre une exportation vers les sucs digestifs des pièges, il semble que la voie d'excrétion des enzymes digestives présentes dans les pièges passe par le RE, et la présence d'un peptide signal vers le RE endoplasmique peut donc favoriser un meilleur transport vers les pièges de la protéine recombinante. Ainsi, dans un mode de réalisation du procédé 30 selon l'invention, la protéine d'intérêt à produire comprend un peptide signal permettant son transport dans le réticulum endoplasmique. Un tel peptide signal peut être soit 2906818 16 présent naturellement dans la protéine, soit fusionné à une protéine ne possédant pas de peptide signal. L'adressage des protéines dans le compartiment endomembranaire du RE est déterminé par deux mécanismes alternatifs : 5 1/ la présence d'un peptide signal sur la partie N-terminale de la protéine, cette protéine pouvant être soluble ou liée ultérieurement à une membrane. Ce peptide signal comprenant en général un motif hydrophobe assure l'entrée de la protéine à l'intérieur de RE. Consécutivement à l'entrée dans le RE, la protéine peut être prise en charge par des chaperonnes qui auront pour fonction d'assurer une conformation spatiale optimale 10 de la protéine. 2/ la traduction de l'ARNm en protéine peut se faire (en totalité ou en partie) à proximité du RE, avec l'aide de ribosomes liés aux membranes. Ainsi pour certaines protéines, il existe une séquence signal hydrophobe de quelques dizaines d'acides 15 aminés dans la partie N-terminale. Lors du processus de traduction, une protéine cytoplasmique SRP (signal recognition protein) se lie à la surface du ribosome, ce qui stoppe le processus de traduction. La particule SRP fixée sur le ribosome, vient s'attacher sur un récepteur à la surface des membranes du réticulum. La séquence signal hydrophobe de la protéine traverse alors la membrane du RE. La traduction reprend et la 20 protéine est ensuite libérée à l'intérieur du lumen (19). Ainsi, pour une protéine d'intérêt donné, il est possible de favoriser son adressage vers le RE en ajoutant à la séquence primaire un peptide signal en position N-terminale présentant des propriétés hydrophobes. Un exemple de motif N terminal hydrophobe peut être trouvé dans la famille des cytochromes P450 eucaryotes, qui sont 25 des enzymes localisées au niveau des membranes du RE (CYP2C5, CYP73A1). En ce qui concerne l'adressage depuis le RE vers le Golgi, puis du Golgi vers l'extérieur des pièges, il semble que des motifs peptidiques attachés aux vésicules ou aux membranes, connus sous la dénomination de SNARE (soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein attachment protein receptors) soient impliqués dans les 30 processus d'exocytose chez les végétaux, par le biais de mécanismes de fusions membranaires précédées d'interactions moléculaires de type SNARE-SNARE (18). Notamment, de tels motifs peptidiques de type SNARE ciblant le transport de vésicules 2906818 17 chargées en protéines, depuis le RE vers le Golgi, ont été décrits dans des protéines chez Arabidopsis (18) : il s'agit des domaines SNARE des peptides Syntaxin-41, Syntaxin-42, Syntaxin-43 (AtSYP41 à 43, numéros d'accession Genbank respectivement : 065359, Q9SWH4, et Q9SUJ1). D'autres peptides de type SNARE sont également 5 connus chez Arabidopsis. Ils sont présents à la surface de vésicules golgiennes et déterminent le transport depuis le Golgi vers la membrane plasmique (exocytose) ; ils correspondent aux Syntaxin-121 à 125 (AtSYP121 à 125, numéros d'accession Genbank : Q9ZSD4, Q9SVC2, Q9ZQZ8, 064791, et Q9SXBO). Les différents domaines SNARE sont résumés dans le Tableau 1 ci-dessous. 10 Tableau 1. Domaines SNARE connus chez Arabidopsis Gène Numéro d'accession Région correspondant au Genbank domaine SNARE (aa) Syntaxin-41 065359 (GI:28380151) 237-293 Syntaxin-42 Q9SWH4 (GI:28380167) 232-289 Syntaxin-43 Q9SUJ1 (GI:38503420) 246-302 Syntaxin-121 Q9ZSD4 (GI:28380149) 217-276 Syntaxin-122 Q9SVC2 (GI:28380140) 216-275 Syntaxin-123 Q9ZQZ8 (GI:28380148) 209-268 Syntaxin-124 064791 (GI:28380117) 206-265 Syntaxin-125 ' Q9SXBO (GI:28380142) 201-260 Ainsi une plante carnivore génétiquement transformée sur-exprimant au moins une de ces deux familles de protéines SNARE, ou une protéine possédant un ou 15 plusieurs domaines SNARE ou dérivés, devrait conduire à une excrétion majorée de ses protéines présentes au niveau du RE. Dans un mode de réalisation du procédé selon l'invention, la plante carnivore cultivée est en outre génétiquement modifiée pour exprimer au moins un gène comprenant au moins un domaine de type SNARE, conduisant ainsi à une excrétion majorée de la ou des protéines d'intérêt vers les pièges. 20 Par domaine de type SNARE , on entend tout motif peptidique possédant au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99 %, voire 100% d'identité avec au moins un des domaines 2906818 18 SNARE définis dans le Tableau 1. En particulier, les gènes comportant un domaine SNARE décrits dans le Tableau 1 peuvent être surexprimés dans la plante carnivore utilisée. 5 Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre avec tout type de plante carnivore. Les plantes carnivores peuvent être classées en différentes catégories en fonction de leur type de piège, et les modalités pratiques du procédé selon l'invention peuvent donc varier en fonction du type de piège. Différents modes de réalisation particuliers avantageux correspondant à des types de pièges distincts sont décrits ci- 10 dessous. Cependant, d'autres modes de réalisation peuvent être facilement développés par l'homme du métier, et le procédé selon l'invention ne saurait donc se limiter aux modes de réalisations particuliers avantageux décrits ci-dessous. Une première catégorie de plantes carnivores utilisables dans un mode de 15 réalisation avantageux du procédé selon l'invention est celle des plantes carnivores possédant des pièges à glu. Par pièges à glu , on entend des pièges constitués de feuilles adhésives. Ces feuilles sécrètent de petites gouttelettes appelées glu ou mucilage sur lesquelles

les proies se collent. Ces pièges peuvent être passifs (les feuilles sécrétant les gouttelettes 20 de mucilage sont immobiles) ou semi-actifs (les feuilles sécrétant les gouttelettes de mucilage s'enroulent afin d'améliorer la surface de contact, permettant ainsi une meilleure digestion). Plusieurs genres de plantes carnivores possèdent des pièges à glu. Ainsi, dans le procédé selon l'invention utilisant une plante carnivore possédant des pièges à glu, celle-ci est notamment choisie parmi les genres Drosera, Pinguicula, 25 Byblis, Drosophyllum, et Triphyophyllum. Avantageusement, ladite plante carnivore possédant des pièges à glu est du genre Drosera. Chez ces plantes carnivores possédant des pièges à glu, le mucilage est directement accessible à l'air libre, et la protéine d'intérêt peut être obtenue directement par récolte de la glu présente à l'air libre. La récolte de la glu des pièges peut alors être 30 réalisée par trempage, aspersion ou lavage de la plante carnivore possédant des pièges à glu qui est cultivée, par aspiration ou absorption sur tissu (notamment tout type de papier, par exemple du papier buvard) de la glu, ou par prélèvement direct de la glu de 2906818 19 la plante carnivore possédant des pièges à glu qui est cultivée. Notamment, dans un mode de réalisation avantageux, la plante carnivore possédant des pièges à glu est cultivée sur un système rigide permettant la manipulation d'un ensemble de plantes, leur retournement et le trempage de leurs parties aériennes dans une solution.

5 Alternativement, la plante carnivore possédant des pièges à glu peut être cultivée sur un plan incliné recouvert d'un matériau imperméable à l'eau, la glu des pièges étant récoltée par aspersion et/ou lavage des parties aériennes de la plante et la collecte de la solution obtenue au bas du plan incliné.

10 Une deuxième catégorie de plantes carnivores utilisables dans un mode de réalisation avantageux du procédé selon l'invention est celle des plantes carnivores possédant des pièges à urnes, à cornets, ou à outres. Par pièges à urnes , on entend des pièges constitués de feuilles terminées par des urnes ou ascidies, surmontés d'une sorte de couvercle appelé opercule. Les proies, 15 attirées par des glandes à nectar, pénètrent dans le piège et glissent sur les parois internes qui sont surmontées d'un bourrelet infranchissable ; elles finissent par se noyer comme dans le cas précédent. Les plantes carnivores possédant des pièges à urnes incluent notamment les genres Nepenthes et Cephalotus. Par pièges à cornets , on entend des pièges constitués de feuilles transformées 20 en cornets tubulaires. Les insectes attirés par des glandes à nectar pénètrent par l'ouverture qui est située près du sommet du piège. La paroi interne de ce dernier est visqueuse ou garnie de poils dirigés vers le bas, et interdisant toute remontée. Les proies se noient dans le liquide contenu dans le piège. Les plantes carnivores possédant des pièges à cornets incluent notamment le genre Sarracenia.

25 Par pièges à outres , on entend des pièges constitués de petites poches ou utricules plus ou moins transparentes disposées le long des racines, présentant à une extrémité un orifice entouré de poils ramifiés dont certains commandent le déclenchement du piège lorsqu'une proie (souvent microscopique) les effleure. L'utricule s'enfle alors très brutalement (1/500s) aspirant à la fois l'eau et la proie. Puis 30 l'utricule reprend lentement sa forme initiale en 1/2 h tandis que la proie n'a plus aucune chance de s'échapper. De tels pièges se retrouvent principalement chez les espèces du 2906818 20 genre Utricularia. Ainsi, avantageusement, la plante carnivore possédant des pièges à outres utilisée dans le procédé selon l'invention est du genre Utricularia. Avantageusement, la plante carnivore utilisée possède des pièges à urnes et est choisie parmi les genres Nepenthes ou Cephalotus.

5 Dans ce cas, ainsi que dans le cas de plantes à pièges à cornets, les sucs digestifs dans laquelle la protéine d'intérêt est excrétée forment un liquide au fond des urnes ou cornets, liquide qui peut être récolté facilement. Ainsi, lorsque la plante carnivore utilisée dans le procédé selon l'invention possède des pièges à urnes ou à cornets, la protéine d'intérêt est avantageusement obtenue par récolte des fluides excrétés se 10 trouvant à l'intérieur des urnes. L'intérêt des pièges à urnes, c'est-à-dire possédant un opercule, est que l'opercule n'est ouvert par la plante qu'à un certain stade de développement du piège. Avant ce stade, l'opercule est fermé, les sucs digestifs étant excrétés dans le piège étant ainsi en conditions stériles. Ainsi, l'utilisation de telles plantes peut permettre, sous 15 réserve de récolter les sucs digestifs avant l'ouverture de l'opercule et de réaliser la récolte dans des conditions stériles, de collecter la protéine recombinante produite par la plante carnivore et excrétée au niveau des pièges sous forme stérile. Ainsi, avantageusement, la plante carnivore utilisée dans le procédé selon l'invention possède des pièges à urnes, et est avantageusement choisie parmi les genres Népenthes et 20 Cephalotus. Dans ce cas, les fluides se trouvant à l'intérieur des urnes sont alors avantageusement récoltés avant l'ouverture naturelle des urnes de la plante. En particulier, lesdits fluides se trouvant à l'intérieur des urnes peuvent notamment être récoltés par sacrifice des urnes ou par un dispositif permettant la ponction desdits fluides à l'intérieur des urnes en conditions stériles.

25 Qu'il s'agisse de pièges à urnes ou à cornets, les protéases natives produites par la plante s'accumulent petit à petit au fond des urnes ou des cornets. Afin de limiter les risques de dégradation de la protéine d'intérêt par les enzymes digestives, les fluides se trouvant à l'intérieur des urnes sont avantageusement récoltés à un stade de développement de la plante où les protéases natives produites par la plante ne se sont 30 pas encore accumulées de manière massive dans lesdits fluides. Une simple mise au point à la portée de l'homme du métier permet de déterminer pour chaque type de plante 2906818 21 à quel stade la quantité de protéine d'intérêt est maximale tout en restant à un stade où la quantité de protéases natives produites par la plante est encore limitée. Lorsque des plantes carnivores possédant des pièges à outres sont utilisées dans le procédé selon l'invention, la protéine est avantageusement obtenue par récolte des 5 fluides excrétés se trouvant à l'intérieur des outres. En particulier, les fluides se trouvant à l'intérieur des outres peuvent être libérés par application d'un stress mécanique, comme par exemple le passage de peignes, brosses, ou de filaments, ou l'émission d'ultrasons ou encore d'autres ondes sonores, à la surface des outres. DESCRIPTION DES DESSINS 10 Figure 1. Observation au microscope UV de plantes Drosera rotundifolia transformées GFP (A et B) ou de plantes témoins (C). Les flèches indiquent l'emplacement de zones de fluorescence (zones les plus claires) liées à l'expression de la GFP. Figure 2. Observation de poils pédicellés présents sur les feuilles comportant 15 des glandes sécrétrices d'enzymes digestives d'insectes de plantes Drosera rotundifolia témoins (plantes sauvages non transformées, A) ou de plantes transformées GFP (B). Les flèches indiquent l'emplacement de zones de fluorescence (zones les plus claires) liées à l'expression de la GFP. Figure 3. Observations de mucilage de plantes Drosera rotundifolia 20 transformées GFP (A) ou de plantes témoins (plantes sauvages non transformées, B) au microscope UV après absorption sur papier à cigarette. Les flèches indiquent l'emplacement de zones de fluorescence (zones les plus claires) liées à l'expression de la GFP. Figure 4. Observations de feuilles de plantes Drosera rotundifolia_transformées 25 GUS (A) ou de plantes témoins (plantes sauvages non transformées, B) après révélation avec le substrat X-Gluc. Les plages gris foncé correspondent aux plages bleues indiquant que le substrat X-Gluc a été transformé par l'enzyme GUS, démontrant ainsi la présence de l'enzyme GUS dans ces zones. Figure 5. Observations de feuilles et de poils de plantes Drosera rotundifolia 30 transformées GUS (A et B) ou de plantes témoins (plantes sauvages non transformées, C) après révélation avec le substrat X-Gluc à la loupe binoculaire. Les plages gris foncé 2906818 22 correspondent aux plages bleues indiquant que le substrat X-Gluc a été transformé par l'enzyme GUS, démontrant ainsi la présence de l'enzyme GUS dans ces zones. Figure 6. Observations de gouttelettes de glu après révélation avec le substrat XGluc après absorption de la glu sur papier Whatman. A. Comparaison de papiers enduits 5 de gouttelettes de glu de Drosera rotundifolia transformées GUS (en haut), enduit de gouttelettes de glu de Drosera rotundifolia témoin (plante sauvage non transformée, au milieu), ou sans gouttelettes (en bas). B. Aggrandissement de A pour les papiers enduits de gouttelettes de glu de Drosera rotundifolia transformées GUS (en haut), enduit de gouttelettes de glu de Drosera rotundifolia témoin (plante sauvage non transformée, au 10 milieu). C. Papiers enduits de gouttelettes de glu d'autres plantes Drosera rotundifolia transformées GUS. Les plages gris foncé correspondent aux plages bleues indiquant que le substrat X-Gluc a été transformé par l'enzyme GUS, démontrant ainsi la présence de l'enzyme GUS dans ces zones. Figure 7. Analyse par PCR de l'insertion du vecteur d'expression comprenant 15 les gènes GUS et NPT II dans le génome des plantes transformées, par détection du gène NPT II. Mq : marqueurs de taille. 1 et 2 : plantes testées. EXEMPLES EXEMPLE 1. Transformation de plantes Drosera rotundifolia 20 1.1 Matériels et méthodes 1.1.1. Transformation des plantes Drosera rotundifolia avec les gènes GFP ou GUS La transformation des Drosera a été faite à partir des feuilles, après blessure de ces dernières et mise en co-culture avec Agrobactérium tumefaciens afin de réaliser 25 l'étape du transfert de l'ADN-t vers les cellules végétales, comme l'ont décrit Hirsikorpi et al. Dans notre cas, la transformation des plantes a été faite avec deux constructions plasmidiques distinctes, avec des gènes marqueurs différents. L'ADN-t comprenait le gène NPT II codant pour la Neomycin phosphotransférase II conférant la résistance à la kanamycine et : 2906818 23 -Soit le gêne codant pour la protéine GFP, la Green Fluorescent Protein, issue d'une méduse (Aequorea victoria). Cette protéine possède la propriété de fluorescer dans le visible lorsqu'elle est excitée sous UV (395 nm). Soit le gène codant pour l'enzyme GUS, la ,3-Glucuronidase, qui en présence 5 du substrat X-gluc (acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-/3-D-glucuronide) conduit à l'apparition d'un produit de couleur bleue. 1.1.1 Observations de feuilles après révélation avec le substrat X-Gluc La solution mère X-gluc est diluée dans du tampon X-Gluc (l 00mM Tris HC1, NaCl 50 mM, pH7) pour obtenir une concentration finale de 1mM, et est appliqué sur 10 les parties végétales directement. Le tout est placé à 37 C à obscurité pendant 12h. Les feuilles sont ensuite mis à tremper dans un bain d'éthanol afin d'éliminer la chlorophylle, et de mieux voir la coloration bleue due à l'éventuelle présence de l'enzyme GUS. 1.2 Résultats 15 1.2.1 Plantes Drosera rotundifolia transformées GFP 1.2.1.1 Observations de feuilles au microscope UV Des limbes de feuilles de plantes carnivores témoins et transformées GFP ont été observées au microscope UV. Certaines feuilles transformées GFP montrent des plages fluorescentes marquées (Figure 1A et 1 B, voir flèches), alors que les feuilles des plantes 20 témoins n'en présentent pas (Figure 1 C) : Ces observations au microscope montre que les plantes sont bien transformées GFP, et expriment la protéine dans le limbe de la feuille. 1.2.1.2 Observations de poils et de mucilage au microscope UV La recherche de fluorescence a ensuite été axée sur l'observation de poils 25 pédicellés présents sur les feuilles comportant des glandes sécrétrices d'enzymes digestives d'insectes, et sur l'observation de gouttelettes de glu ou mucilage produites par ces glandes. Sur les plantes témoins, les poils observés ne présentent en général pas de fluorescence (Figure 2A). Malgré tout, certaines observations ont révélé la présence de 2906818 24 fluorescence sur des extrémités de poils témoins, mais celle-ci est beaucoup moins marquée que celle observée dans certains poils de plantes GFP où la protéine semble s'exprimer (Figure 2B, voir flèches). 1.2.1.3 Observations de mucilage au microscope UV après absorption sur 5 papier à cigarette Afin d'observer l'éventuelle présence de la protéine GFP dans les gouttelettes de glu, des petits carrés de papier à cigarette ont été découpés, pour balayer les feuilles de plantes témoins et GFP et absorber la glu sur le papier. Le papier ayant absorbé des gouttelettes de mucilage de plantes GFP a été 10 observé sous microscope UV : il présente des spots fluorescents (Figure 3A, voir flèches). Le papier témoin n'en présente aucun (Figure 3B). Cette observation montre que les gouttelettes de glu de plantes transformées GFP expriment et contiennent la protéine. 1.2.2 Plantes Drosera rotundifolia transformées GUS 15 1.2.2.1 Observations de feuilles après révélation avec le substrat X-Gluc Afin de vérifier que les plantessont bien transformées, une révélation avec le substrat X-gluc a été effectuée sur des feuilles de deux plantes supposées transformées et des feuilles témoins. Les feuilles supposées Gus présentent des plages bleues marquées (Figure 4A, 20 voir plages gris foncé) par rapport aux feuilles témoins (Figure 4B). On en déduit donc la présence de l'enzyme Gus et de son activité dans les plantes supposées transformées, étant donné l'apparition de ce produit bleu formé en présence du substrat. A noter que la feuille n'est pas colorée entièrement, certaines plages restent blanches. Les feuilles témoins présentent des zones bleues aux endroits de blessures/sections faites lors de la 25 séparation feuille/plante, mais le limbe ne présente pas de coloration. (Figure 4B). 1.2.2.2 Observations de feuilles et de poils après révélation avec le substrat X-Gluc à la loupe binoculaire Ces feuilles témoins et GUS après révélation ont pu être observées à la loupe binoculaire afin de voir ou se localise exactement la coloration bleue.

2906818 25 Les feuilles de plantes transformées GUS (Figure 5A et 5B) présentent une coloration sur la partie inférieure du poil uniquement (voir coloration gris foncé). L'extrémité du poil, lieu de formation de la glu, n'est pas colorée. Les poils des feuilles des plantes témoins ne présentent aucune coloration (Figure 5C). 5 1.2.2.3 Observations de gouttelettes de glu après révélation avec le substrat X-Gluc après absorption de la glu sur papier Whatman Comme pour les plantes GFP, des gouttelettes de glu de plantes GUS et témoins ont été absorbées avec cette fois du papier Whatman (papier balayé sur les gouttelettes afin d'en absorber le plus possible). Ces morceaux de papier ont ensuite été mis à 10 incuber dans du tampon et du substrat X-Gluc 12h à 37 C. Au bout d'lh d'incubation, la coloration est déjà présente. Des photos ont été prises après 12h d'incubation (Figure 6). Le papier portant des gouttelettes de feuilles GUS (Figure 6A en haut, et Figure 6B à gauche) présente une coloration bleue (voir zones gris foncé) là où la glu a pu être 15 absorbée. Le papier portant des gouttes de glu de feuilles témoins (Figure 6A au milieu, et Figure 6B à droite) ne présente aucune coloration, de même que le papier ne portant pas de gouttes de glu (Figure 6A en bas). L'enzyme GUS est donc exprimée et bien présente dans les gouttelettes de mucilage des feuilles de plantes transformées GUS, et non dans celles des plantes témoins.

20 Cette expérience a été reproduite sur 17 plantes transformées GUS, la transformation étant mise en évidence par la coloration bleue des feuilles après révélation avec le substrat X-Gluc. Sur ces 17 plantes transformées GUS, 14 présentent des gouttelettes contenant l'enzyme GUS (papier tacheté de bleu). Seules 3 plantes apparemment transformées ne semblent pas exprimer la protéine recherchée dans les 25 gouttelettes. Ces résultats indiquent donc, qu'au moins dans la majorité des cas, les plantes transformées GUS expriment l'enzyme GUS et que celle-ci est présente dans les gouttelettes de mucilage des pièges. De plus, différentes intensités et quantités de bleu étaient visibles sur les papiers Whatman, suggérant que certaines plantes transformées expriment et sécrètent plus ou 30 moins l'enzyme GUS dans le mucilage des feuilles. Afin de confirmer ceci, des tests ont été réalisés sur les gouttelettes d'une seule feuille de plantes GUS : 5 feuilles de 5 plantes GUS déjà testées précédemment ont été prélevées, et les gouttelettes de chaque 2906818 26 feuille ont été absorbées séparément sur un papier Whatman. Les résultats obtenus à ce jour confirment le fait que les plantes transformées GUS expriment et sécrètent plus ou moins la protéine GUS dans les gouttelettes de mucilage. 1.2.2.4 Analyse par PCR de l'insertion du vecteur d'expression dans le 5 génome des plantes transformées Les plantes sont transformées à l'aide de 2 gènes, qui se trouvent sur le même fragment d'ADN-t : le gène GUS et un gène de résistance à la Kanamycine (NPT Il), qui permet de sélectionner les plantes en ajoutant l'antibiotique au milieu de culture. En effet, si la plante a intégré le gène de résistance à la Kanamycine, elle survit sur le 10 milieu comportant de la Kanamycine, tandis que les plantes non transformées meurent, ce qui permet de sélectionner les plantes transformées. Les deux gènes, GUS et NPT II, sont intégrés simultanément dans le génome de la plante. Ainsi, la présence dans le génome de la plante du gène NPT II indique la présence dans le génome de la plante du gène GUS, démontrant ainsi la transformation 15 de la plante. Pour des raisons de technique de PCR, la présence du gène NPT II dans le génome de la plante a été recherchée par amplification par PCR d'un fragment du gène NPT II chez 2 plantes chez lesquelles les tests enzymatiques ont déjà indiqué la présence du gène GUSä 20 Les résultats sont présentés sur la Figure 7, et montrent que le fragment du gène NPT II est bien amplifié par PCR chez ces 2 plantes, démontrant ainsi l'insertion dans le génome de la plante du vecteur d'expression comprenant les gènes GUS et NPT II. 1.3 Conclusion Ainsi, les résultats présentés ci-dessus indiquent clairement qu'il est possible de 25 générer une plante carnivore génétiquement modifiée dans laquelle le gène d'une protéine d'intérêt a été inséré, et de récolter facilement la protéine d'intérêt au niveau des sucs digestifs des pièges excrétés par la plante (ici, de la glu). En outre, les tests réalisés sur les deux protéines d'intérêt utilisées (GUS et GFP) indiquent que les protéines obtenues sont fonctionnelles, malgré l'existence d'enzymes 30 digestives.

2906818 27 REFERENCES 1. Ullah, A.H.J., Sethumadhavan, K., Mullaney, E.J., Ziegelhoffer, T., and Austin- Phillips, S. (2003). Fungal phyA gene expressed in potato leaves produces active and stable phytase. Biochemical and Biophysical Research Communications 5 306(2),603-609. 2. Gao, Y., Suo, G.L., Han, J., He, Z.Q., Yao, W., Dai, J.W. (2006). Expression of Human BMP-2 Gene in Different Tissues of Tobacco Plants. Acta Genetica Sinica 33 (1), 56-62. 3. Gallie, D. R., and Chang, S. C. (1997). Signal transduction in the carnivorous 10 plant Sarracenia purpurea - Regulation of secretory hydrolase expression during development and in response to resources. Plant Physiology 115, 1461-1471. 4. Matusikova, I., Salaj, J., Moravcikova, J., Mlynarova, L., Nap, J. P., and Libantova, J. (2005). Tentacles of in vitro-grown round-leaf sundew (Drosera rotundifoliaL.) show induction of chitinase activity upon mimicking the presence 15 of prey. Planta 222, 1020-1027. 5. EP0019808 6. WO 99/42115 7. WO 02/057408 8. Hirsikorpi M., K m iràinen.T., Teeri. T., Hohtola.A. (2002). Agrobacterium- 20 mediated transformation of round leaved sundew (Drosera rotundifolia L.). Plant Science, 162, 537-542. 9. Schweikert, R. J., Beaudoin, S. E., and Owen, T. P. (2006). Induced changes to the ultrastructure of the digestive glands from the carnivorous pitcher plant Nepenthes alata. In "Plant Biology 2006" (A. S. o. P. Biologists, ed.). 25 unpublished, Boston, Massachusetts, USA. 10. Chikwamba, R. K., Scott, M. P., Mejia, L. B., Mason, H. S., and Wang, K. (2003). Localization of a bacterial protein in starch granules of transgenic maize kernels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 11127-11132. 30 11. Juniper, B.E., Robins, R.J., Joel, D. (1989) The Carnivorous Plants. Londres, Academic Press, 353p. 2906818 28 12. Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., and Dinesh-Kumar, S. P. (2004). Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant Journal 39, 734-746. 13. Deblock, M. (1993). The Cell Biology of Plant Transformation - Current State, 5 Problems, Prospects and the Implications for the Plant-Breeding. Euphytica 71, 1-14. 14. Voinnet, O. (2005). Induction and suppression of RNA silencing: Insights from viral infections. Nature Reviews Genetics 6, 206-U1. 15. Frazier,C.K. (2000) The enduring Controversies Concerning the Process of 10 Protein Digestion in Nepenthes (Nepenthaceae). International carnivorous plant Society 29(2), 56-61 16. Lobareva LS, Rudenskaia GN, Stepanov VM. 17. Takahashi, K., Chang, W., Ko, J. (1974). Specific inhibition of acid proteases from brain, kidney, skeletal muscle, and insectivorous plants by diazoacetyl-DL- 15 norleucine methyl ester and by pepstatin. The Journal of Biochemistry 76(4), 897- 900. 18. Pratelli, R., Sutter, J.-U., and Blatt, M. R. (2004). A new catch in the SNARE. Trends in Plant Science 9, 187-195. 19. Nicchitta, C. V. (2002). A platform for compartmentalized protein synthesis: 20 protein translation and translocation in the ER. Current Opinion in Cell Biology 14, 412-416. 15 20 25

Claims (23)

REVENDICATIONS

1. Procédé de production d'au moins une protéine, comprenant la culture d'une plante carnivore, caractérisé en ce que ladite plante a été génétiquement modifiée pour exprimer la ou les dite(s) protéine(s).

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la ou les dite(s) protéine(s) est traduite dans les cellules de la plante et excrétée par le système d'excrétion des protéines naturelles de ladite plante

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite plante a été génétiquement modifiée par transformation par Agrobactérium, par biolistique, par électroporation, par microinjection ou par l'utilisation de vecteurs viraux.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite protéine est choisie parmi un médicament de médecine vétérinaire ou humaine, un agent cosmétique, un agent phytopharmaceutique, un agent de diagnostic, un agent nutraceutique ou un réactif de laboratoire.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite plante est soumise à des stimuli chimiques, et éventuellement mécaniques, mimant la capture d'une proie et induisant une activation du système de production et d'excrétion des protéines par ladite plante au niveau des pièges.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite plante est cultivée en absence de tout stimulus chimique et/ou mécanique mimant la capture d'une proie et induisant une activation du système de production et d'excrétion des protéines par ladite plante au niveau des pièges. 30 2906818 30

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'inhibition de la synthèse d'une ou plusieurs enzymes digestives par ladite plante carnivore. 5

8. Procédé selon l'une la revendication 7, caractérisé en ce que au moins une de la ou des dite(s) enzyme(s) digestive(s) dont la synthèse est inhibée est une protéase.

9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'inhibition de la synthèse d'une ou plusieurs enzyme(s) digestive(s) par ladite plante carnivore est 10 réalisée par des techniques génétiques choisies parmi la suppression du génome de la plante d'au moins un gène d'enzyme digestive, l'extinction de la transcription d'au moins un gène d'enzyme digestive par silencing , ou et l'expression ectopique d'au moins un gène d'inhibiteur d'enzyme digestive.

10. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'inhibition de la synthèse d'une ou plusieurs enzyme(s) digestive(s) par ladite plante carnivore est réalisée en ajoutant directement dans le liquide digestif des pièges une solution inhibitrice de la ou des enzyme(s) digestive(s), ou en contrôlant les conditions de pH et/ou de température du liquide digestif.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ladite protéine comprend un peptide signal permettant son transport dans le réticulum endoplasmique.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ladite plante carnivore est en outre génétiquement modifiée pour exprimer au moins un gène comprenant au moins un domaine de type SNARE.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que 30 ladite plante carnivore possède des pièges à glu. 2906818 31

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite plante carnivore possédant des pièges à glu est choisie parmi les genres Drosera, Pinguicula, Byblis, Drosophyllum, et Triphyophyllum. 5

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que ladite protéine est obtenue par récolte de la glu des pièges par trempage, aspersion ou lavage de ladite plante, par aspiration ou absorption sur tissu de la glu de ladite plante, ou par prélèvement direct de la glu. 10

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ladite plante est cultivée sur un système rigide permettant la manipulation d'un ensemble de plantes, leur retournement et le trempage de leurs parties aériennes dans une solution.

17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ladite plante est cultivée 15 sur un plan incliné recouvert d'un matériau imperméable à l'eau, la glu des pièges étant récoltée par aspersion et/ou lavage des parties aériennes de la plante et la collecte de la solution obtenue au bas du plan incliné.

18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que 20 ladite plante carnivore possède des pièges à urnes, à cornets ou à outres.

19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que ladite protéine est obtenue par récolte des fluides excrétés se trouvant à l'intérieur des urnes, cornets ou outres.

20. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que ladite plante carnivore possède des pièges à urnes et est choisie parmi les genres Nepenthes ou Cephalotus.

21. Procédé selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce que lesdits fluides se trouvant à l'intérieur des urnes sont récoltés avant l'ouverture naturelle des urnes de ladite plante. 25 5 2906818 32

22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que lesdits fluides se trouvant à l'intérieur des urnes sont récoltés par sacrifice des urnes ou par un dispositif permettant la ponction desdits fluides à l'intérieur des urnes en conditions stériles.

23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, caractérisé en ce que lesdits fluides se trouvant à l'intérieur des urnes sont récoltés à un stade de développement de la plante où les protéases natives produites par la plante ne se sont pas encore accumulées de manière massive dans lesdits fluides.