FR2999096A1 - GAS PERMEABLE, LIQUID-SEALED MEMBRANE CAPSULE, PROCESS FOR MANUFACTURING AND USE FOR IN VITRO ARTHROPOD HASTING - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une capsule comportant un cœur semi-solide contenant un matériau d'intérêt à encapsuler, et une membrane polymère de chitosan enveloppant ce cœur, d'épaisseur inférieure à 1 µm, et imprégnée d'au moins un composé hydrophobe, notamment d'un mélange d'alcanes en C20 à C40. Cette capsule trouve une utilité particulière en tant que support pour l'élevage in vitro d'un arthropode, un milieu nutritif pour cet arthropode étant alors encapsulé, sous forme gélifiée, dans la membrane.The invention relates to a capsule comprising a semi-solid core containing a material of interest to be encapsulated, and a polymer membrane of chitosan surrounding this core, of thickness less than 1 μm, and impregnated with at least one hydrophobic compound, in particular a mixture of C20 to C40 alkanes. This capsule finds particular utility as a support for the in vitro culture of an arthropod, a nutritive medium for this arthropod then being encapsulated, in gelled form, in the membrane.
Description
La présente invention s'inscrit dans le domaine des capsules du type à membrane externe étanche aux liquides et perméable aux gaz, pour l'encapsulation d'un matériau d'intérêt. Plus particulièrement, elle concerne une capsule répondant à de telles caractéristiques, ainsi qu'un procédé de fabrication d'une telle capsule. L'invention concerne également l'utilisation de cette capsule pour l'élevage in vitro d'arthropodes, en particulier d'insectes et d'arachnides, notamment des insectes dits piqueurs-suceurs, ainsi qu'un système pour cet élevage, intégrant une telle capsule. La capsule selon l'invention trouve application dans tous les domaines dans lesquels il peut être souhaité d'encapsuler un matériau d'intérêt sous forme liquide ou semi-solide, tel qu'un principe actif ayant un intérêt nutritionnel ou thérapeutique, en interdisant le transfert de liquides dans ou hors de la capsule. Un domaine d'application particulièrement préféré de cette capsule, qui sera plus particulièrement détaillé dans la présente description, bien que nullement limitatif, est celui de l'élevage in vitro d'arthropodes, notamment dits piqueurs-suceurs, entomophages ou parasitoïdes, en particulier en vue de l'utilisation d'insectes dans la lutte contre les insectes ravageurs de cultures et/ou vecteurs de maladies humaines et animales.The present invention is in the field of liquid-tight and gas-permeable outer membrane type capsules for the encapsulation of a material of interest. More particularly, it relates to a capsule with such characteristics, as well as a method of manufacturing such a capsule. The invention also relates to the use of this capsule for the in vitro rearing of arthropods, in particular insects and arachnids, especially so-called biting-sucking insects, as well as a system for this breeding, incorporating a such capsule. The capsule according to the invention finds application in all the fields in which it may be desired to encapsulate a material of interest in liquid or semi-solid form, such as an active ingredient having a nutritional or therapeutic interest, by prohibiting the transfer of liquids into or out of the capsule. A particularly preferred field of application of this capsule, which will be more particularly detailed in the present description, although in no way limiting, is that of in vitro breeding of arthropods, in particular so-called biting-sucking, entomophagous or parasitoids, in particular for the use of insects in the control of insect pests of crops and / or vectors of human and animal diseases.
A l'heure actuelle, le principal instrument de lutte contre les insectes ravageurs des cultures et les vecteurs de maladies humaines et animales est la mise en oeuvre d'insecticides chimiques. Ces composés ont incontestablement participé à l'amélioration des rendements agricoles et au contrôle de plusieurs maladies vectorielles. Pour autant, leur utilisation massive et exclusive dans les champs est à l'origine de problèmes sanitaires et écologiques si préoccupants qu'ils ont conduit plusieurs pays à mener une politique de réduction des quantités d'insecticides utilisés. De même, l'emploi d'insecticide dans la lutte contre les maladies vectorielles montre des limites, en particulier à cause de l'apparition de résistances chez les insectes vecteurs. De telles maladies vectorielles, notamment le paludisme et la dengue, font plusieurs centaines de milliers de victimes chaque année, principalement en Afrique et en Inde. Les agents pathogènes responsables de ces maladies sont véhiculés et transmis à l'homme par des moustiques du genre Aedes, que des décennies de lutte chimique ont rendus résistants à la plupart des familles d'insecticides. Des alternatives aux insecticides ont ainsi été développées, reposant sur l'utilisation d'organismes prédateurs ou entomopathogènes, couramment appelés auxiliaires des cultures. L'utilisation de tels auxiliaires de culture dans les exploitations conduites en agriculture biologique offre plusieurs avantages. Ces auxiliaires de culture ont en effet une bonne capacité de dispersion, de découverte de l'hôte et d'établissement dans un nouvel habitat. De plus, ils sont d'une innocuité totale pour l'homme et ont une grande spécificité d'hôte, donc présentent peu de risques vis-à-vis des organismes non-cibles. Sur un plan sanitaire, des expérimentations ont montré que la lutte biologique à l'aide d'insectes parasitoïdes constituait également un moyen avantageux pour pallier l'apparition de résistances aux insecticides chez les insectes vecteurs de maladies. L'utilisation des insectes parasitoïdes auxiliaires représente donc un potentiel considérable. Cependant, à l'heure actuelle, seules quelques dizaines d'espèces d'insectes parasitoïdes sont réellement utilisées à ces effets, car leur élevage s'avère difficile à réaliser. Dans la plupart des cas, les traitements sont en outre effectués par lâchers inondatifs consistant à disperser massivement (à raison de plusieurs centaines de milliers d'individus par hectare) et régulièrement des auxiliaires à l'état larvaire ou adulte dans la culture à protéger. Les lâchers inondatifs nécessitent par conséquent un grand nombre d'individus, faisant de l'élevage en masse de parasitoïdes un pré- requis indispensable au développement de leur utilisation. Des méthodes d'élevage en masse d'insectes parasitoïdes existent mais leur mise en oeuvre implique des contraintes techniques ne permettant pas de les commercialiser à bas prix. En effet, ces méthodes de production prévoient l'élevage des insectes parasitoïdes en laboratoire sur leur hôte naturel ou sur un hôte de substitution. Or l'obtention et l'élevage des insectes hôtes présentent des difficultés techniques, qui exacerbent les coûts de production. Pour pallier ces difficultés et diminuer les coûts de productions, il a été proposé par l'art antérieur d'élever des insectes parasitoïdes in vitro sur des hôtes synthétiques permettant l'oviposition et/ou le nourrissage des larves. De tels hôtes synthétiques proposés par l'art antérieur consistent principalement en des capsules contenant un milieu nutritif liquide dans une membrane de Parafilm® ou dans des gangues constituées par un mélange hydrophobe incluant divers matériaux tels que de la cire, du Paraplast®, de la vaseline, des alcènes ou du polyéthylène. On peut citer, à titre d'exemple, le système décrit dans le document de brevet WO 03/000047, qui se présente sous forme de billes biopolymères, notamment en chitosan, contenant une solution nutritive. Aucun de ces systèmes synthétiques reproduisant l'hôte naturel ne présente cependant de performance satisfaisante. En effet, aucun ne combine l'ensemble des caractéristiques nécessaires à la mise en place de conditions d'élevage optimales, c'est-à-dire ne permet à la fois : d'isoler de l'environnement extérieur, par une barrière étanche, le milieu nutritif adapté au nourrissage, de sorte à préserver son degré d'hydratation et sa stérilité ; d'autoriser le transfert à travers cette barrière de composés olfactifs, stimulateurs de l'oviposition pour la fondatrice et/ou appétants pour la larve, que doit contenir ce milieu, pour permettre que le système soit reconnu comme hôte potentiel ; d'autoriser la pénétration à travers cette barrière d'un appareil ovipositeur ou piqueur-suceur de faible puissance et de petite longueur, pouvant être aussi faible que 10 iim. Il a en particulier été constaté que des membranes présentant une épaisseur importante ne pouvaient être percées par les chélicères de certains arthropodes. En particulier, les billes biopolymères décrites dans le document de brevet WO 03/000047 ne permettent ni l'intégration de macromolécules olfactives, stimulatrices de l'oviposition et/ou appétantes, dans le milieu nutritif, ni le maintien, lorsqu'elles sont placées à l'air libre, d'un degré d'hydratation du milieu nutritif suffisant pour présenter des performances satisfaisantes, en termes de rendement de ponte des femelles et de nourrissage des larves, nécessaires à l'élevage en masse, et à bas coût, d'insectes parasitoïdes. La présente invention vise à proposer une capsule encapsulant un matériau d'intérêt, notamment un milieu nutritif pour un arthropode, en particulier un insecte ou un arachnide, et qui permette l'élevage de cet arthropode, en remédiant aux inconvénients des systèmes d'hôtes synthétiques proposés par l'art antérieur, notamment à ceux exposés ci-avant. En particulier, la présente invention vise à ce que cette capsule permette l'oviposition et/ou le nourrissage d'arthropodes disposés sur sa surface externe, y compris pour les espèces dont l'appareil ovipositeur et/ou piqueur- suceur est de faible puissance et de petite longueur. Un objectif supplémentaire de l'invention est que cette capsule présente un coût de production faible, en particulier de sorte à permettre que le coût de production d'un système synthétique pour l'élevage in vitro des arthropodes dans lequel elle est mise en oeuvre, soit inférieur à celui d'un hôte naturel ou de substitution. Dans toute la présente description, on entend, par le terme capsule, un volume fermé, également nommé coeur, délimité extérieurement par au moins une membrane jouant le rôle d'enveloppe.At present, the main instrument for the control of crop pests and vectors of human and animal diseases is the use of chemical insecticides. These compounds undoubtedly contributed to the improvement of agricultural yields and the control of several vector-borne diseases. However, their massive and exclusive use in the fields is at the origin of health and ecological problems so worrying that they led several countries to carry out a policy of reduction of the quantities of insecticides used. Similarly, the use of insecticide in the control of vector-borne diseases shows limitations, particularly because of the emergence of resistance in vector insects. Such vector-borne diseases, including malaria and dengue, kill hundreds of thousands of people each year, mostly in Africa and India. The pathogens responsible for these diseases are transmitted and transmitted to humans by mosquitoes of the genus Aedes, which decades of chemical control have made resistant to most families of insecticides. Alternatives to insecticides have been developed, based on the use of predatory or entomopathogenic organisms, commonly called crop aids. The use of such crop auxiliaries in organic farms offers several advantages. These cultivation aids have a good capacity for dispersal, discovery of the host and establishment in a new habitat. In addition, they are of total safety for humans and have a high host specificity, so they pose little risk vis-à-vis the non-target organisms. From a health standpoint, experiments have shown that biological control with parasitoid insects is also an advantageous way to overcome the emergence of insecticide resistance in insect vectors of disease. The use of auxiliary parasitic insects therefore represents a considerable potential. However, at present, only a few dozen species of parasitoid insects are actually used for these purposes because their breeding is difficult to achieve. In most cases, the treatments are also carried out by flood releases consisting of dispersing massively (at the rate of several hundreds of thousands of individuals per hectare) and regularly auxiliaries in the larval or adult state in the culture to be protected. Flood releases therefore require a large number of individuals, making mass rearing of parasitoids an essential prerequisite for the development of their use. Methods for mass rearing of parasitoid insects exist but their implementation involves technical constraints that do not allow them to be marketed at a low price. In fact, these production methods provide for the breeding of parasitoid insects in the laboratory on their natural host or on a surrogate host. However, obtaining and breeding host insects presents technical difficulties that exacerbate production costs. To overcome these difficulties and reduce production costs, it has been proposed by the prior art to rear parasitoid insects in vitro on synthetic hosts for oviposition and / or feeding larvae. Such synthetic hosts proposed by the prior art consist mainly of capsules containing a liquid nutrient medium in a Parafilm® membrane or in gangues constituted by a hydrophobic mixture including various materials such as wax, Paraplast®, Vaseline, alkenes or polyethylene. By way of example, mention may be made of the system described in patent document WO 03/000047, which is in the form of biopolymer beads, in particular chitosan, containing a nutritive solution. None of these synthetic systems reproducing the natural host, however, has satisfactory performance. Indeed, none combines all the characteristics necessary for the establishment of optimal breeding conditions, that is to say, allows both: to isolate the external environment, by a sealed barrier the nutritive medium adapted to feeding, so as to preserve its degree of hydration and sterility; to allow the transfer through this barrier of olfactory compounds, stimulators of oviposition for the founder and / or appetizers for the larva, that must contain this medium, to allow the system to be recognized as a potential host; to allow the penetration through this barrier of an ovipositor or sucking-sucking device of low power and short length, which can be as low as 10 microns. In particular, it has been found that membranes having a large thickness can not be pierced by the chelicera of certain arthropods. In particular, the biopolymer beads described in the patent document WO 03/000047 do not allow the integration of olfactory macromolecules, stimulators of oviposition and / or appetizing, in the nutrient medium, or the maintenance, when they are placed in the open air, a degree of hydration of the nutrient medium sufficient to present satisfactory performance, in terms of female spawning yield and larval feeding, necessary for mass rearing, and at low cost, parasitoids. The present invention aims at providing a capsule encapsulating a material of interest, in particular a nutritive medium for an arthropod, in particular an insect or an arachnid, and which allows the breeding of this arthropod, by overcoming the drawbacks of the host systems. synthetics proposed by the prior art, in particular to those described above. In particular, the present invention aims that this capsule allows oviposition and / or feeding arthropods disposed on its outer surface, including species whose ovipositor apparatus and / or stinger-sucker is of low power and of short length. A further object of the invention is that this capsule has a low production cost, in particular so as to allow the production cost of a synthetic system for the in vitro breeding of arthropods in which it is implemented, less than that of a natural or substitution host. Throughout the present description, the term capsule means a closed volume, also called heart, delimited externally by at least one membrane acting as envelope.
Une capsule selon la présente invention comporte : - un coeur semi-solide contenant un matériau d'intérêt à encapsuler, - et une membrane polymère de chitosan enveloppant ce coeur, d'épaisseur inférieure à 1 i.tm, et imprégnée d'au moins un composé hydrophobe, cette imprégnation étant de préférence sensiblement continue sur 25 toute la surface de la membrane. Une telle membrane est avantageusement étanche aux liquides et perméable aux gaz, si bien que la capsule selon l'invention présente une surface externe sèche et un coeur pouvant être humide, le transfert à travers la membrane de molécules volatiles à l'état gazeux étant tout de même permis.A capsule according to the present invention comprises: a semi-solid core containing a material of interest to be encapsulated, and a polymer membrane of chitosan enveloping this core, of thickness less than 1 μm, and impregnated with at least a hydrophobic compound, this impregnation preferably being substantially continuous over the entire surface of the membrane. Such a membrane is advantageously liquid-tight and gas permeable, so that the capsule according to the invention has a dry outer surface and a core that can be wet, the transfer through the membrane of volatile molecules in the gaseous state being all same permit.
Le taux d'imprégnation de la membrane polymère de chitosan par le ou les composés hydrophobes est de préférence compris entre 5 et 10 pg de composé(s) hydrophobe(s) / mm3 de membrane. Le chitosan, copolymère de N-acétylglucosamine et glucosamine, est un polysaccharide linéaire, dérivé désacétylé de la chitine, un biopolymère présent notamment dans les carapaces de crustacés tels que les crabes ou les crevettes. Ce biopolymère présente notamment les avantages d'être naturel, non-toxique, biodégradable et inoffensif pour l'environnement. Dans le contexte particulier de l'application préférentielle de la capsule selon l'invention pour l'élevage d'arthropodes, il présente en outre l'avantage d'une composition chimique proche de celle de composés entrant dans la constitution des cuticules des insectes. Ainsi, la membrane polymère de chitosan enveloppant le coeur de la capsule constitue avantageusement une cuticule artificielle favorisant sa reconnaissance par les arthropodes à élever.The impregnation rate of the chitosan polymer membrane with the hydrophobic compound (s) is preferably between 5 and 10 μg of hydrophobic compound (s) / mm 3 of membrane. Chitosan, a copolymer of N-acetylglucosamine and glucosamine, is a linear polysaccharide, a deacetylated derivative of chitin, a biopolymer present especially in crustacean shells such as crabs or shrimps. This biopolymer has the advantages of being natural, non-toxic, biodegradable and harmless to the environment. In the particular context of the preferential application of the capsule according to the invention for the breeding of arthropods, it also has the advantage of a chemical composition similar to that of compounds involved in the constitution of cuticles of insects. Thus, the polymer membrane of chitosan enveloping the heart of the capsule advantageously constitutes an artificial cuticle promoting its recognition by arthropods to be raised.
Le terme chitosan est utilisé dans la présente description aussi bien pour désigner le chitosan en lui-même, que ses dérivés tels que des esters, éthers, amines, amides ou tous autres dérivés formés par interaction avec les groupements hydroxyle ou amine du chitosan. Le chitosan mis en oeuvre pour l'obtention de la membrane polymère selon l'invention présente préférentiellement un degré de désacétylation élevé, notamment supérieur ou égal à 70 %. La faible épaisseur de la membrane de chitosan, inférieure à 1 um, de préférence comprise entre 90 et 130 nm, et préférentiellement sensiblement égale à 100 nm, associée à ses propriétés mécaniques, lui permet notamment de pouvoir être facilement transpercée par des chélicères peu puissants et de courte taille, aussi faible que 10 um, sans pour autant être détériorée, notamment déchirée, par la dépose et les déplacements d'un arthropode, en particulier d'un insecte ou d'un arachnide, sur sa surface. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le coeur de la capsule se présente sous forme d'un gel, notamment d'un hydrogel, par exemple à base d'alginate. Dans le contexte de l'application préférée de la capsule selon l'invention à l'élevage d'arthropodes, dans lequel la capsule est mise en oeuvre en tant que support de ponte et/ou de nourrissage pour l'arthropode, il est avantageusement prévu selon l'invention que le coeur présente une résistance mécanique suffisamment élevée pour pouvoir supporter, sans déformation excessive, le poids de l'arthropode posé sur la surface externe de la capsule. Le matériau d'intérêt contenu dans le coeur de la capsule peut être de tout type. Il peut par exemple s'agir d'un composé ou d'un mélange de composés d'intérêt particulier, par exemple d'un milieu nutritif pour un arthropode, le cas échéant additionné d'une ou plusieurs molécules olfactives stimulantes et/ou appétantes, ou encore de tout composé ou mélange de composés à effet thérapeutique, nutritif, cosmétique... Lorsque le(s) composé(s) d'intérêt se présentent sous forme de solution liquide, cette solution est gélifiée, par des moyens classiques en eux-mêmes, pour former le coeur semi-solide de la capsule. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le composé hydrophobe est choisi parmi les polymères styréniques, en particulier le polystyrène, et les alcanes, de préférence les alcanes en C20 à C40.The term chitosan is used in the present description both to designate chitosan itself, and its derivatives such as esters, ethers, amines, amides or any other derivatives formed by interaction with the hydroxyl or amine groups of chitosan. The chitosan used to obtain the polymer membrane according to the invention preferably has a high degree of deacetylation, in particular greater than or equal to 70%. The small thickness of the chitosan membrane, less than 1 μm, preferably between 90 and 130 nm, and preferably substantially equal to 100 nm, associated with its mechanical properties, allows it in particular to be easily pierced by weak chelicères and short, as small as 10 μm, without being damaged, especially torn, by the removal and movement of an arthropod, in particular an insect or an arachnid, on its surface. In particular embodiments of the invention, the core of the capsule is in the form of a gel, in particular a hydrogel, for example alginate-based. In the context of the preferred application of the capsule according to the invention to the breeding of arthropods, in which the capsule is used as a laying and / or feeding support for the arthropod, it is advantageously provided according to the invention that the core has a sufficiently high mechanical strength to be able to withstand, without excessive deformation, the weight of the arthropod placed on the outer surface of the capsule. The material of interest contained in the heart of the capsule can be of any type. It may, for example, be a compound or a mixture of compounds of particular interest, for example a nutritive medium for an arthropod, where appropriate supplemented with one or more stimulating and / or appetizing olfactory molecules. , or any compound or mixture of compounds with a therapeutic, nutritive or cosmetic effect. When the compound (s) of interest are in the form of a liquid solution, this solution is gelled by conventional means. themselves, to form the semi-solid heart of the capsule. In particular embodiments of the invention, the hydrophobic compound is selected from styrenic polymers, in particular polystyrene, and alkanes, preferably C20 to C40 alkanes.
Préférentiellement, la membrane polymère de chitosan est imprégnée d'un mélange d'alcanes en C20 à C40. Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, la membrane polymère de chitosan peut en outre être imprégnée d'un ou plusieurs composés d'intérêt, par exemple stimulant l'oviposition et/ou appétants, tels que des alcanes, des acides gras, des produits du métabolisme des insectes, etc. La capsule selon l'invention peut présenter toute forme, par exemple cylindrique, parallélépipédique, ovoïde, sphérique... Elle présente préférentiellement une forme sensiblement sphérique.Preferably, the polymer membrane of chitosan is impregnated with a mixture of C20 to C40 alkanes. According to an advantageous characteristic of the invention, the polymer membrane of chitosan may, in addition, be impregnated with one or more compounds of interest, for example stimulating oviposition and / or appetizing, such as alkanes, fatty acids, products of insect metabolism, etc. The capsule according to the invention may have any shape, for example cylindrical, parallelepipedal, ovoid, spherical ... It preferably has a substantially spherical shape.
Ses dimensions, notamment son diamètre dans le cas d'une capsule sensiblement sphérique, peuvent par exemple varier de 1 à 20 mm ou même plus. La capsule selon l'invention peut avantageusement être fabriquée à bas coût, et elle présente une bonne stabilité dans le temps.Its dimensions, especially its diameter in the case of a substantially spherical capsule, may for example vary from 1 to 20 mm or even more. The capsule according to the invention can advantageously be manufactured at low cost, and it has good stability over time.
Un objet supplémentaire de l'invention est un procédé de fabrication d'une capsule présentant l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant. Une capsule selon l'invention est susceptible d'être obtenue par un procédé de fabrication comprenant les étapes de : - formation d'une particule semi-solide, notamment d'un gel, de préférence d'un hydrogel, contenant un matériau d'intérêt à encapsuler, - formation d'une membrane polymère de chitosan autour de la particule ainsi formée, à partir d'une solution aqueuse acide de chitosan contenant un agent tensioactif, ou un mélange d'agents tensioactifs, dans une concentration suffisante pour obtenir, après séchage puis traitement en conditions basiques, entraînant la déprotonation des groupements amines du chitosan et conférant ainsi à ce dernier un caractère insoluble dans la solution aqueuse, une membrane polymère de chitosan d'épaisseur inférieure à 1 i.tm, - et imprégnation de la membrane de chitosan ainsi obtenue par une solution contenant ledit/lesdits composé(s) hydrophobe(s).A further object of the invention is a method of manufacturing a capsule having one or more of the above features. A capsule according to the invention can be obtained by a manufacturing method comprising the steps of: - forming a semi-solid particle, in particular a gel, preferably a hydrogel, containing a material of interest to encapsulate, - formation of a polymer membrane of chitosan around the particle thus formed, from an acidic aqueous solution of chitosan containing a surfactant, or a mixture of surfactants, in a concentration sufficient to obtain, after drying and then treatment under basic conditions, resulting in the deprotonation of the amine groups of the chitosan and thus conferring on the latter an insoluble nature in the aqueous solution, a polymer membrane of chitosan with a thickness of less than 1 μm, and impregnation of the chitosan membrane thus obtained by a solution containing said hydrophobic compound (s).
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, la particule destinée à former le coeur de la capsule est formée par gélification d'une solution liquide contenant le matériau d'intérêt à encapsuler, par exemple un milieu nutritif pour un arthropode, et de l'alginate, ou tout autre composé ou mélange de composés d'intérêt, selon un procédé classique en lui-même.In particular embodiments of the invention, the particle intended to form the core of the capsule is formed by gelation of a liquid solution containing the material of interest to be encapsulated, for example a nutritive medium for an arthropod, and alginate, or any other compound or mixture of compounds of interest, according to a conventional method in itself.
Cette particule peut présenter toute forme, par exemple une forme ovoïde ou sensiblement sphérique. La particule ainsi formée est de préférence soumise à une étape de séchage, afin d'éliminer l'excès de liquide à sa surface, préalablement à l'étape de formation de la membrane externe de chitosan.This particle may have any shape, for example an ovoid or substantially spherical shape. The particle thus formed is preferably subjected to a drying step, in order to remove the excess liquid on its surface, prior to the step of forming the outer chitosan membrane.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, la solution aqueuse de chitosan, par exemple une solution d'acide acétique, comprend une concentration comprise entre 2 et 30 mg/ml, de préférence sensiblement égale à 10 mg/ml, de chitosan. Elle présente de préférence une faible viscosité, préférentiellement inférieure à 200 mPa.s. La formation de la membrane de chitosan est préférentiellement réalisée par immersion, pendant quelques secondes, des particules dans la solution aqueuse acide de chitosan et d'agent(s) tensioactif(s), puis séchage et traitement en conditions basiques.In particular embodiments of the invention, the aqueous solution of chitosan, for example a solution of acetic acid, comprises a concentration of between 2 and 30 mg / ml, preferably substantially equal to 10 mg / ml, of chitosan. It preferably has a low viscosity, preferably less than 200 mPa.s. The formation of the chitosan membrane is preferably carried out by immersing, for a few seconds, the particles in the acidic aqueous solution of chitosan and surfactant (s), followed by drying and treatment under basic conditions.
L'agent tensioactif, ou le mélange d'agents tensioactifs, est avantageusement mis en oeuvre dans une concentration apte à permettre une diminution de la tension de surface de la solution aqueuse suffisante pour assurer que la quantité de chitosan se déposant sur la surface de la particule pour former, après séchage, une enveloppe autour de cette dernière, soit suffisamment faible pour que la membrane de chitosan présente la très faible épaisseur conforme à l'invention. Il est du ressort de l'homme du métier de déterminer une telle concentration, de manière théorique ou expérimentale, en fonction de la concentration en chitosan dans la solution aqueuse acide et des caractéristiques particulières du ou des agent(s) tensioactif(s) mis en oeuvre.The surfactant, or the mixture of surfactants, is advantageously used in a concentration capable of allowing a reduction in the surface tension of the aqueous solution sufficient to ensure that the amount of chitosan deposited on the surface of the particle to form, after drying, an envelope around the latter, so small that the chitosan membrane has the very small thickness in accordance with the invention. It is within the competence of a person skilled in the art to determine such a concentration, theoretically or experimentally, as a function of the concentration of chitosan in the acidic aqueous solution and of the particular characteristics of the surfactant (s) put (s) implemented.
Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, l'agent tensioactif est de type non-ionique. Il peut notamment consister en un éthoxylate d'octylphénol, par exemple tel que commercialisé sous le nom Triton X-100®. Cet agent tensioactif abaisse la tension superficielle de l'eau de 33 dynes/cm à une concentration de 1 % à 25 °C. Un tel agent tensioactif est préférentiellement mis en oeuvre dans une concentration comprise entre 0,005 et 0,05 °/0, en volume par rapport au volume total de la solution, de préférence d'environ 0,01 % v/v. Le choix d'un tel agent tensioactif particulier n'est cependant nullement limitatif de l'invention, et d'autres agents tensioactifs ou mélanges d'agents tensioactifs peuvent être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention. Pour l'application préférentielle de la capsule à l'élevage d'arthropodes, le ou les agent(s) tensioactif(s) sont avantageusement choisis pour ne présenter aucune toxicité, à l'état de traces, pour l'insecte à élever. Le traitement en conditions basiques peut notamment être réalisé par une solution d'hydroxyde de sodium. Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, la solution contenant le ou les composé(s) hydrophobes contient une concentration totale en lesdits composés comprise entre 1 et 10 mg/ml. L'imprégnation peut notamment être réalisée par immersion de la capsule dans un bain d'une solution contenant le ou les composé(s) hydrophobe(s), pendant une durée de quelques minutes, par exemple d'environ 2 minutes.In particular embodiments of the invention, the surfactant is of the nonionic type. It may especially consist of an octylphenol ethoxylate, for example as marketed under the name Triton X-100®. This surfactant lowers the surface tension of water by 33 dynes / cm at a concentration of 1% at 25 ° C. Such a surfactant is preferably used in a concentration of between 0.005 and 0.05% by volume relative to the total volume of the solution, preferably about 0.01% v / v. The choice of such a particular surfactant is however not limited to the invention, and other surfactants or mixtures of surfactants can be implemented within the scope of the invention. For the preferential application of the capsule to the breeding of arthropods, the agent (s) surfactant (s) are advantageously chosen to exhibit no toxicity, in trace amounts, for the insect to be raised. The treatment under basic conditions can in particular be carried out with a solution of sodium hydroxide. In particular embodiments of the invention, the solution containing the hydrophobic compound (s) contains a total concentration of said compounds of between 1 and 10 mg / ml. The impregnation can in particular be carried out by immersing the capsule in a bath of a solution containing the hydrophobic compound (s) for a period of a few minutes, for example of about 2 minutes.
La mise en présence de la capsule avec cette solution est préférentiellement précédée d'une étape de déshydratation progressive de la membrane de chitosan, par exemple par trempage de la capsule dans des bains successifs de solutions alcooliques, puis dans un bain d'un solvant organique apolaire, tel que l'hexane.The placing in the presence of the capsule with this solution is preferably preceded by a step of gradual dehydration of the chitosan membrane, for example by soaking the capsule in successive baths of alcoholic solutions, then in a bath of an organic solvent apolar, such as hexane.
Un tel procédé de fabrication, dans lequel la membrane est formée autour de la particule semi-solide destinée à former le coeur de la capsule après formation de cette dernière, permet avantageusement d'intégrer facilement dans le coeur de la capsule tout composé d'intérêt souhaité, par exemple à des fins nutritives et/ou de stimulation de la ponte et/ou du nourrissage, y compris des macromolécules, telles que des protéines complexes, même de taille supérieure à 10 kDa. Dans des modes de réalisation préférés particulièrement avantageux de l'invention, le procédé de fabrication de la capsule comporte une étape intermédiaire de formation, autour de la particule semi-solide, d'un film étanche aux liquides et perméable aux gaz, dit film intercalaire, de préférence d'un film d'un polymère styrénique, préférentiellement de polystyrène, d'épaisseur inférieure à 50 nm, par exemple d'environ 10 nm, ceci préalablement à l'étape de formation de la membrane polymère de chitosan. Une telle caractéristique s'avère tout à fait avantageuse notamment en 30 termes d'uniformité et de résistance mécanique de la membrane de chitosan enrobant la particule, en particulier lorsque cette dernière est formée d'un hydrogel. En effet, la présence d'un tel film intercalaire autour de la particule, d'une part, favorise un recouvrement uniforme de la particule par le chitosan, et, d'autre part, forme une barrière étanche aux liquides entre la particule et la membrane de chitosan, permettant un meilleur séchage, et par voie de conséquence une meilleure densification, de cette dernière. Ainsi, dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la capsule comporte un film étanche aux liquides et perméable aux gaz, dit film intercalaire, de préférence un film d'un polymère styrénique, préférentiellement de polystyrène, d'épaisseur inférieure à 50 nm, par exemple d'environ 10 nm, intercalé entre le coeur semi-solide et la membrane polymère de chitosan. De par sa perméabilité aux gaz, ce film intercalaire ne fait avantageusement pas obstacle au transfert de molécules à l'état gazeux contenues dans le coeur de la capsule. Sa très faible épaisseur lui permet en outre d'être facilement transpercé par l'appareil ovipositeur et/ou piqueur-suceur des arthropodes, quelles que soient la longueur et la puissance de cet appareil. Il a été constaté par les présents inventeurs que dans la pratique, au cours des étapes finales de fabrication de la membrane de la capsule, selon la composition chimique du film intercalaire, il pouvait se produire, à l'interface de ce film et de la membrane de chitosan, une fusion entre le film et la membrane. La formation du film intercalaire autour du coeur de la capsule peut par exemple être réalisée par immersion de la particule semi-solide dans une solution de composition adéquate, par exemple dans une solution contenant du polystyrène. Dans un tel mode de mise en oeuvre particulier de l'invention, la concentration en polystyrène dans la solution est de préférence comprise entre 1 et 50 g/I, par exemple d'environ 10 g/I. L'immersion est préférentiellement réalisée pendant un temps très bref, inférieur à 10 s, de sorte à minimiser au maximum les échanges entre le coeur de la capsule et le ou les solvant(s) contenus dans cette solution, et prévenir ainsi leur pénétration dans le coeur.Such a manufacturing method, in which the membrane is formed around the semi-solid particle intended to form the core of the capsule after formation of the latter, advantageously makes it easy to integrate into the core of the capsule any compound of interest. desired, for example for nutritional purposes and / or spawning and / or feeding stimulation, including macromolecules, such as complex proteins, even larger than 10 kDa. In particularly preferred embodiments of the invention, the method of manufacturing the capsule comprises an intermediate step of forming, around the semi-solid particle, a liquid-tight and gas-permeable film, said interlayer film. preferably a film of a styrenic polymer, preferably polystyrene, having a thickness of less than 50 nm, for example approximately 10 nm, prior to the step of forming the polymer membrane of chitosan. Such a characteristic is quite advantageous especially in terms of uniformity and mechanical strength of the chitosan membrane coating the particle, in particular when the latter is formed of a hydrogel. Indeed, the presence of such an interlayer film around the particle, on the one hand, promotes a uniform coverage of the particle by chitosan, and, on the other hand, forms a liquid-tight barrier between the particle and the chitosan membrane, allowing better drying, and consequently a better densification, of the latter. Thus, in particular embodiments of the invention, the capsule comprises a liquid-tight and gas-permeable film, called interlayer film, preferably a film of a styrenic polymer, preferably polystyrene, with a thickness of less than 50. nm, for example about 10 nm, sandwiched between the semi-solid core and the polymer membrane of chitosan. Due to its gas permeability, this interlayer film does not advantageously prevent the transfer of molecules in the gaseous state contained in the core of the capsule. Its very small thickness also allows it to be easily pierced by the ovipositor device and / or picker-sucker arthropods, regardless of the length and power of this device. It has been found by the present inventors that in practice, during the final stages of manufacture of the capsule membrane, depending on the chemical composition of the interlayer film, it could occur at the interface of this film and the chitosan membrane, a fusion between the film and the membrane. The formation of the interlayer film around the core of the capsule may for example be carried out by immersion of the semi-solid particle in a solution of suitable composition, for example in a solution containing polystyrene. In such a particular embodiment of the invention, the polystyrene concentration in the solution is preferably between 1 and 50 g / l, for example about 10 g / l. The immersion is preferably carried out for a very short time, less than 10 s, so as to minimize the exchanges between the core of the capsule and the solvent (s) contained in this solution, and thus prevent their penetration into the heart.
En étapes finales, le procédé peut comporter une étape de séchage de la capsule, puis de chauffage à une température comprise entre 70 et 75 °C, pendant une durée comprise entre 30 secondes et 20 minutes environ. La capsule selon l'invention ainsi obtenue peut être stockée à basse température, par exemple à environ 4 °C, en chambre humide, à l'abri de la lumière, pendant plusieurs mois. Elle conserve notamment toujours une surface externe sèche. Un tel procédé permet avantageusement de fabriquer une capsule conforme à l'invention facilement, rapidement et avec une bonne reproductibilité. Ses différentes étapes peuvent en outre être mises en oeuvre de manière entièrement automatisée, permettant ainsi une fabrication en masse, et qui plus est à des faibles coûts de revient. La capsule conforme à l'invention présente un large champ d'applications. Ainsi, un objet de la présente invention est l'utilisation d'une capsule répondant à l'une ou plusieurs caractéristiques ci-avant pour l'encapsulation, et le cas échéant le relargage programmé, d'un matériau d'intérêt, par exemple d'un composé ou d'un mélange de composés d'intérêt thérapeutique ou nutritif, à l'état gazeux. Un domaine d'application préféré de la capsule selon l'invention est son utilisation pour l'élevage in vitro d'un arthropode, en particulier d'un insecte ou d'un arachnide. Le matériau d'intérêt contenu dans le coeur de la capsule est alors un milieu nutritif pour l'arthropode, sous forme gélifiée. De préférence, ce milieu nutritif est additionné d'une ou plusieurs molécules stimulant l'oviposition et/ou appétantes pour les larves, par exemple d'un extrait d'hémolymphe de larve d'abeille. La membrane de chitosan peut également, ou alternativement, être imprégnée de telle(s) molécule(s). Cet élevage peut notamment être réalisé en vue de produire une grande quantité d'insectes dits auxiliaires utilisables dans la lutte contre les insectes ravageurs de cultures et/ou vecteurs de maladies humaines et animales. Autrement, cet élevage peut par exemple être réalisé pour l'étude des interactions entre un parasite et son hôte, visant notamment à développer des moyens pour rendre le parasite inoffensif vis-à-vis de son hôte naturel. On entend dans la présente description, par le terme élevage, aussi bien l'obtention de larves à partir d'une fondatrice, que le nourrissage de cette fondatrice et/ou des larves, jusqu'à les amener au stade de développement souhaité, notamment au stade adulte. Les individus ainsi élevés peuvent notamment être utilisés pour la réalisation de lâchers inondatifs sur des zones de culture et/ou dans lesquelles sont susceptibles de se développer des insectes vecteurs de maladies. Ainsi, la présente invention se traduit également dans les termes d'un procédé d'élevage in vitro d'un arthropode, en particulier d'un insecte ou d'un arachnide, mettant en oeuvre une capsule conforme à l'invention, contenant un milieu nutritif pour l'arthropode, en tant que support pour la ponte et/ou le nourrissage des larves. La membrane polymère de chitosan, interposée entre l'arthropode et son milieu nutritif, assure un confinement étanche de ce dernier.In final steps, the process may comprise a step of drying the capsule, and then heating at a temperature between 70 and 75 ° C for a period of between about 30 seconds and 20 minutes. The capsule according to the invention thus obtained can be stored at low temperature, for example at about 4 ° C., in a humid chamber, protected from light, for several months. In particular, it always keeps a dry external surface. Such a method advantageously makes it possible to manufacture a capsule according to the invention easily, quickly and with good reproducibility. Its various steps can also be implemented in a fully automated manner, allowing mass manufacturing, and moreover at low cost. The capsule according to the invention has a wide range of applications. Thus, an object of the present invention is the use of a capsule corresponding to one or more of the above characteristics for the encapsulation, and optionally the programmed release, of a material of interest, for example a compound or a mixture of compounds of therapeutic or nutritional interest, in the gaseous state. A preferred field of application of the capsule according to the invention is its use for the in vitro rearing of an arthropod, in particular an insect or an arachnid. The material of interest contained in the heart of the capsule is then a nutrient medium for the arthropod, in gelled form. Preferably, this nutritive medium is supplemented with one or more molecules stimulating oviposition and / or appetizing for larvae, for example a haemolymph extract of bee larvae. The chitosan membrane can also, or alternatively, be impregnated with such molecule (s). This breeding can be carried out in particular to produce a large quantity of so-called auxiliary insects used in the fight against insect pests of crops and / or vectors of human and animal diseases. Otherwise, this breeding can for example be made for the study of interactions between a parasite and its host, aimed in particular at developing means to make the parasite harmless vis-à-vis its natural host. In the present description, the term "breeding" is intended to mean both the obtaining of larvae from a founder and the feeding of this founder and / or the larvae until they reach the desired stage of development, in particular in the adult stage. The individuals thus raised can in particular be used for carrying out flood releases on cultivation areas and / or in which disease-carrying insects are likely to develop. Thus, the present invention is also expressed in the terms of a process for the in vitro rearing of an arthropod, in particular an insect or an arachnid, using a capsule according to the invention containing a nutrient medium for arthropod, as a support for spawning and / or larval feeding. The polymer membrane of chitosan, interposed between the arthropod and its nutrient medium, ensures a tight confinement of the latter.
Elle joue ainsi un rôle de barrière hydrique et antimicrobienne préservant le degré d'hydratation et la stérilité du milieu nutritif. Elle permet toutefois avantageusement aux molécules volatiles contenues dans ce milieu nutritif, notamment aux molécules olfactives stimulant l'oviposition et/ou appétantes, de parvenir à l'arthropode. Enfin, les caractéristiques mécaniques et la grande finesse du film de chitosan permettent à tout arthropode de le transpercer pour accéder au milieu nutritif. Le milieu nutritif peut avantageusement être complémenté par toute molécule d'intérêt, par exemple en vue d'étudier son action vis-à-vis de l'arthropode.It thus acts as a water barrier and antimicrobial preserving the degree of hydration and sterility of the nutrient medium. However, it advantageously allows the volatile molecules contained in this nutrient medium, particularly olfactory molecules stimulating oviposition and / or appetizing, to reach the arthropod. Finally, the mechanical characteristics and the great fineness of the chitosan film allow any arthropod to pierce it to access the nutritive medium. The nutrient medium may advantageously be complemented by any molecule of interest, for example in order to study its action with respect to the arthropod.
Un objet supplémentaire de l'invention est un système synthétique pour l'élevage d'un arthropode, en particulier d'un insecte ou d'un arachnide, comportant une capsule répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant, en tant que support d'élevage, et des moyens de maintien, dans l'atmosphère environnant cette capsule, d'un taux d'humidité ambiante suffisant pour éviter le desséchement de la capsule, de préférence d'un taux d'humidité relative d'au moins 34 %.A further object of the invention is a synthetic system for the breeding of an arthropod, in particular an insect or an arachnid, comprising a capsule corresponding to one or more of the characteristics described above, in as rearing medium, and means for maintaining, in the atmosphere surrounding this capsule, a sufficient ambient humidity level to prevent drying out of the capsule, preferably a relative humidity level of at least 34%.
Ces moyens de maintien d'un taux d'humidité suffisant peuvent prendre toute forme classique en elle-même. Il peut par exemple s'agir d'un simple récipient contenant de l'eau placé à proximité de la capsule, ou encore d'un humidificateur d'air.These means of maintaining a sufficient moisture content can take any conventional form in itself. It may for example be a simple container containing water placed near the capsule, or an air humidifier.
Ce système peut aussi bien être fabriqué et utilisé à l'échelle du laboratoire, pour l'étude des interactions entre un parasite et son hôte, qu'à grande échelle, par exemple pour la production en masse d'insectes auxiliaires utilisés dans la lutte contre les insectes ravageurs de cultures et/ou vecteurs de maladies humaines et animales, notamment par la technique de lâchers inondatifs. Il peut également être mis en oeuvre pour cette même lutte, en complément des lâchers inondatifs, pour remédier à un des problèmes majeurs liés à la mise en oeuvre de lâchers inondatifs, résidant dans la dynamique proie-prédateur qui s'instaure à la suite de ces lâchers. En effet, dans le cas d'une infestation massive par l'hôte, insecte ravageur de cultures et/ou vecteur de maladies, le parasitoïde lâché va dans un premier temps rencontrer un succès reproducteur très grand. Ce succès va s'accompagner d'une réduction drastique du nombre d'hôtes, ce qui est l'effet recherché. Malheureusement, cette réduction s'accompagne également d'une réduction du nombre de parasitoïdes qui ne trouvent alors plus d'hôtes pour se reproduire. Une fois les parasitoïdes disparus, il n'est donc pas rare d'assister à une ré-explosion démographique de l'hôte, ce qui contraint à effectuer plusieurs nouveaux lâchers inondatifs et augmente donc d'autant le coût du traitement. Le système selon l'invention permet avantageusement de remédier à ces inconvénients.This system can be both manufactured and used at the laboratory scale, for the study of interactions between a parasite and its host, on a large scale, for example for mass production of auxiliary insects used in the fight against insect pests of crops and / or vectors of human and animal diseases, particularly by the technique of flood releases. It can also be implemented for the same fight, in addition to the flood releases, to remedy one of the major problems related to the implementation of flood releases, residing in the prey-predatory dynamic that develops after these releases. Indeed, in the case of a massive infestation by the host, crop pest insect and / or disease vector, the parasitoid released will initially encounter a very large reproductive success. This success will be accompanied by a drastic reduction in the number of hosts, which is the desired effect. Unfortunately, this reduction is also accompanied by a reduction in the number of parasitoids that no longer find hosts to reproduce. Once the parasitoids disappear, it is not uncommon to witness a demographic re-explosion of the host, which forces to perform several new flood releases and therefore increases the cost of treatment. The system according to the invention advantageously makes it possible to remedy these drawbacks.
Placé sur le lieu d'infestation, par exemple sous forme d'un réservoir contenant des milliers de capsules selon l'invention, et des moyens de maintien dans le réservoir d'un taux d'humidité constant et adéquat, il permet tout à fait avantageusement d'attirer le parasitoïde, de provoquer sa ponte et d'assurer le nourrissage des larves, ayant ainsi pour effet de maintenir un nombre minimal de parasitoïdes sur site, et de réduire, par voie de conséquence, la fréquence des lâchers inondatifs nécessaires et les coûts associés.Placed at the place of infestation, for example in the form of a reservoir containing thousands of capsules according to the invention, and means for keeping in the reservoir a constant and adequate humidity level, it makes it perfectly possible to advantageously to attract the parasitoid, to cause its spawning and to ensure the feeding of the larvae, thus having the effect of maintaining a minimum number of parasitoids on site, and consequently of reducing the frequency of the necessary flood releases and the associated costs.
En vue d'une telle application, il est avantageusement prévu selon l'invention que le réservoir soit délimité par des parois périphériques dont au moins une est percée d'orifices de taille suffisamment large pour permettre le passage de l'arthropode femelle, et de préférence suffisamment faible pour interdire le passage d'autres insectes, tels que des fourmis, mouches, etc. La capsule et le système selon l'invention peuvent être mis en oeuvre pour l'élevage d'une grande variété d'arthropodes, par exemple, mais non limitativement, de parasitoïdes de la famille des Trichogrammes (Trichogramma brassicae, Trichogramma cacoeciae, Trichogramma evanescens, Trichogramma voegelei, Trichogramma chilonis,...), du genre des Toxorhynchites (Toxorhynchites rutilus, Toxorhynchites brevipalpis, Toxorhynchites amboinensis), des Psyttalia lounsburyi, Venturia canescens, Lariopha gus distinguendus, Torymus sinensis, Psytta lia fletcheri, Fopus arisanus, ou encore de l'acarien ectoparasite Varroa destructor, principal parasite de l'abeille. Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en oeuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l'invention, avec l'appui des figures 1 à 4, dans lesquelles : - les figures la et lb représentent une particule de gel contenant un milieu nutritif, observée à la loupe binoculaire, avec un grossissement de 1,25 fois pour la figure 1 a, et de 8 fois pour la figure lb ; - les figures 2a et 2b montrent la particule de la figure la recouverte d'un film de polystyrène, observée à la loupe binoculaire, avec un grossissement de 1,25Jois pour la figure 2a, et de 8 fois pour la figure 2b; - les figures 3a et 3b montrent la particule de la figure 2a recouverte d'une membrane polymère de chitosan imprégnée de Paraplast®, observée à la loupe binoculaire, avec un grossissement de 1,25 fois pour la figure 3a, et de 8 fois pour la figure 3b ; - et la figure 4 montre une femelle adulte de l'espèce Varroa destructor en cours de nourrissage à travers la membrane externe de la capsule de la figure 3a, observée à la loupe binoculaire, avec un grossissement de 12 fois. 1/ Préparation des capsules Des capsules conformes à un mode de réalisation particulier de l'invention, contenant un milieu nutritif pour un arthropode, sont formées de la façon suivante. Des particules de solution nutritive gélosée, sous forme de billes de 1 à 20 mm de diamètre, sont formées dans une solution de chlorure de calcium (CaCl2) 1 M stérile, en faisant tomber goutte à goutte dans cette solution, à l'aide d'un embout calibré, de 1 à 5 mm de diamètre, un mélange de : - milieu nutritif de Hunter (Hunter, W.B., 2010. In Vitro Cellular and Developmental Biology Animal, 46, 83-6), contenant 30 % de milieu de Schneider, 30 % de CMRL 1066, 0,06 M d'histidine, 10 % de sérum de veau 15 foetal, 1 % de sels de Hank et 4 % d'insect medium supplement ; - 25 % (v/v) d'extrait d'hémolymphe de larve d'abeille au stade L5, obtenu par filtration centrifuge sur membrane d'une porosité de 3000 Da, la centrifugation étant réalisée pendant 15 min à 12 000 g, et récupération du filtrat ; 20 - et de l'alginate à une concentration de 1 M. Les billes ainsi formées sont ensuite récoltées avec une écumoire stérile et disposées en une seule couche sur un support rigide résistant aux solvants organiques, par exemple une lame de verre. L'ensemble est ensuite brièvement séché sous hôte à flux laminaire afin d'éliminer l'excès de liquide à 25 la surface des billes, et de favoriser leur adhérence au support. Un exemple d'une bille ainsi formée est montré sur les figures la et 1 b. On remarque sur ces figures leur paroi externe parfaitement lisse. L'ensemble billes/support est ensuite immergé dans un bain de chloroforme contenant 10 g/L de polystyrène en solution, et immédiatement retiré du bain. Après 1 min de séchage à température ambiante, le support est incubé à 72°C pendant 45 s, puis refroidi à température ambiante. On obtient ainsi des billes recouvertes d'un film intercalaire de polystyrène dont un exemple est montré sur les figures 2a et 2b. On y observe que la surface externe du film intercalaire est lisse et uniforme. Les billes ainsi enrobées de polystyrène sont plongées, toujours sur le support, dans un bain d'une solution aqueuse acide de chitosan comprenant, en solution dans l'eau ultra-pure : - 10 g/1 d'une solution de chitosan extrait de carapaces de crevettes dans l'acide acétique, de viscosité inférieure à 200 mPa.s (20 °C) (Sigma Aldrich), - 0,1 % (v/v) de Triton X100® (Sigma). Cette solution aqueuse acide a préalablement été dégazée pendant 1 h sous agitation à 200 tr/min.In view of such an application, it is advantageously provided according to the invention that the reservoir is delimited by peripheral walls, at least one of which is pierced with orifices of sufficiently large size to allow the passage of the female arthropod, and preferably low enough to prohibit the passage of other insects, such as ants, flies, etc. The capsule and the system according to the invention can be used for breeding a wide variety of arthropods, for example, but not limited to, parasitoids of the Trichogramma family (Trichogramma brassicae, Trichogramma cacoeciae, Trichogramma evanescens , Trichogramma voegelei, Trichogramma chilonis, ...), of the genus Toxorhynchites (Toxorhynchites rutilus, Toxorhynchites brevipalpis, Toxorhynchites amboinensis), Psyttalia lounsburyi, Venturia canescens, Lariopha gus distinguishedendus, Torymus sinensis, Psytta lia fletcheri, Fopus arisanus, or of the ectoparasite mite Varroa destructor, the main parasite of the bee. The features and advantages of the invention will emerge more clearly in the light of the following examples of implementation, provided for illustrative purposes only and in no way limitative of the invention, with the support of FIGS. 1 to 4, in which: FIGS. 1a and 1b show a gel particle containing a nutrient medium, observed under the binocular microscope, with a magnification of 1.25 times for FIG. 1a, and 8 times for FIG. 1b; FIGS. 2a and 2b show the particle of the figure covered with a polystyrene film, observed under a binocular magnifying glass, with a magnification of 1.25Jois for FIG. 2a, and 8 times for FIG. 2b; FIGS. 3a and 3b show the particle of FIG. 2a covered with a Paraplast®-impregnated chitosan polymer membrane, observed at the binocular magnifying glass, with a magnification of 1.25 times for FIG. 3a, and 8 times for Figure 3b; and FIG. 4 shows an adult female of the Varroa destructor species being fed through the outer membrane of the capsule of FIG. 3a, observed under a binocular magnifying glass, with a magnification of 12 times. 1 / Preparation of capsules Capsules according to a particular embodiment of the invention, containing a nutritive medium for an arthropod, are formed in the following manner. Agar nutrient solution particles, in the form of beads 1 to 20 mm in diameter, are formed in sterile 1 M calcium chloride (CaCl 2) solution, dripping into this solution, using a calibrated tip, 1 to 5 mm in diameter, a mixture of: Hunter's nutrient medium (Hunter, WB, 2010. In Vitro Cellular and Developmental Biology Animal, 46, 83-6), containing 30% Schneider, 30% CMRL 1066, 0.06 M histidine, 10% fetal calf serum, 1% Hank salts and 4% insect medium supplement; - 25% (v / v) haemolymph extract of bee larvae at stage L5, obtained by membrane centrifugal filtration with a porosity of 3000 Da, the centrifugation being carried out for 15 min at 12 000 g, and recovery of the filtrate; And - alginate at a concentration of 1 M. The beads thus formed are then harvested with a sterile skimmer and arranged in a single layer on a rigid support resistant to organic solvents, for example a glass slide. The assembly is then briefly dried under a laminar flow host in order to remove the excess liquid on the surface of the beads, and to promote their adhesion to the support. An example of a ball thus formed is shown in Figures 1a and 1b. We note in these figures their perfectly smooth outer wall. The bead / support assembly is then immersed in a chloroform bath containing 10 g / l of polystyrene in solution, and immediately removed from the bath. After drying for one minute at room temperature, the support is incubated at 72 ° C. for 45 seconds and then cooled to room temperature. Balls coated with an interposed polystyrene film are thus obtained, an example of which is shown in FIGS. 2a and 2b. It is observed that the outer surface of the interlayer film is smooth and uniform. The beads thus coated with polystyrene are immersed, always on the support, in a bath of an acidic aqueous solution of chitosan comprising, in solution in ultra-pure water: - 10 g / 1 of a solution of chitosan extracted from shells shrimp in acetic acid, viscosity less than 200 mPa.s (20 ° C) (Sigma Aldrich), - 0.1% (v / v) Triton X100® (Sigma). This acidic aqueous solution was degassed beforehand for 1 h with stirring at 200 rpm.
L'ensemble billes/support est ensuite immédiatement retiré du bain de solution aqueuse acide, et mis à égoutter et sécher verticalement pendant 20 min sous hotte à flux laminaire. Il est ensuite immergé dans une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) 1 M, et immédiatement rincé dans trois bains successifs d'eau distillée. Il est enfin plongé dans quatre bains successifs, contenant respectivement de l'éthanol à 70 %, puis à 95 %, puis pur, puis de l'hexane, pendant 30 s pour chacun, avant d'être plongé pendant 2 min dans une solution d'hexane contenant 10 g/L de Paraplast® ou de cire d'abeille. L'ensemble billes/support est enfin séché pendant 5 min sous hotte à flux laminaire et incubé à 72°C pendant 45 s.The bead / support assembly is then immediately removed from the bath of acidic aqueous solution, and driped and dried vertically for 20 min in a laminar flow hood. It is then immersed in a solution of sodium hydroxide (NaOH) 1 M, and immediately rinsed in three successive baths of distilled water. It is finally immersed in four successive baths, respectively containing 70% ethanol, then 95%, then pure, then hexane, for 30 s for each, before being immersed for 2 min in a solution. of hexane containing 10 g / L of Paraplast® or beeswax. The bead / support assembly is finally dried for 5 min in a laminar flow hood and incubated at 72 ° C. for 45 s.
Les capsules sensiblement sphériques ainsi formées sont conservées à 4°C en chambre humide. Un exemple en est montré sur les figures 3a et 3b. Sur cette dernière figure, on distingue que la membrane de chitosan entourant le coeur de la capsule est dépourvue de pores et qu'elle présente à sa surface des structures cristallines caractéristiques de sels et d'alcanes. 2/ Nourrissage d'une femelle Varroa destructor adulte Une femelle adulte de l'espèce Varroa destructor est obtenue à partir d'un élevage sur des colonies d'abeilles Apis mellifera, dans des conditions classiques en elles-mêmes. Cette femelle présente un appareil piqueur-suceur d'environ 10 iim de long et de faible puissance. Cette femelle est placée sur une capsule telle que décrite ci-avant, dans laquelle la membrane polymère de chitosan est imprégnée par du Paraplasta On réalise une observation directe et en continu de l'ensemble, à la température ambiante, afin de déterminer le moment où la femelle pique à travers la membrane de la capsule, et la durée de cette piqûre. On observe qu'il ne se produit aucun transfert de liquide du milieu nutritif à travers la membrane. Ceci s'avère d'autant plus avantageux que les individus de l'espèce Varroa destructor présentent un tropisme négatif vis-à-vis des surfaces humides, et se noient en quelques minutes en présence d'un environnement humide. La surface externe de la membrane reste dénuée de tout liquide. A l'observation à la loupe binoculaire, on observe que la femelle se nourrit dans le coeur de la capsule, en piquant à travers la membrane de chitosan, comme montré sur la figure 4. On voit parfaitement sur cette figure que ses pédipalpes sont en position physiologique, perpendiculaire à l'axe de l'appareil piqueur-suceur. Ceci démontre notamment que la membrane de la capsule conforme à l'invention permet le transfert des odeurs stimulant le nourrissage en provenance du milieu nutritif. Après perçage de la membrane de chitosan, la femelle se nourrit pendant 1 à 5 minutes, ce qui est conforme à un nourrissage normal. Cette expérience démontre que la capsule selon l'invention offre une surface qui permet à la femelle Varroa destructor de développer un comportement normal de recherche d'un site de nourrissage, caractérisé par la séquence comportementale classique et aboutissant à un nourrissage efficace.The substantially spherical capsules thus formed are stored at 4 ° C. in a humid chamber. An example is shown in Figures 3a and 3b. In this last figure, it is distinguished that the chitosan membrane surrounding the heart of the capsule is devoid of pores and that it has on its surface crystal structures characteristic of salts and alkanes. 2 / Feeding of an adult female Varroa destructor An adult female of the Varroa destructor species is obtained from a breeding on bee colonies Apis mellifera, under conventional conditions in themselves. This female has a piercing-sucking device about 10 microns long and low power. This female is placed on a capsule as described above, in which the polymer membrane of chitosan is impregnated with Paraplasta. Direct and continuous observation of the whole is carried out, at room temperature, in order to determine the moment when the female stings through the membrane of the capsule, and the duration of this sting. It is observed that no transfer of liquid from the nutrient medium occurs through the membrane. This is all the more advantageous as the individuals of the species Varroa destructor have a negative tropism vis-à-vis wet surfaces, and drown in minutes in the presence of a moist environment. The outer surface of the membrane remains devoid of any liquid. On observation with a binocular magnifying glass, we observe that the female feeds in the heart of the capsule, by pricking through the chitosan membrane, as shown in Figure 4. It is perfectly seen in this figure that its pedipalpes are in physiological position, perpendicular to the axis of the piercing-sucking apparatus. This demonstrates in particular that the membrane of the capsule according to the invention allows the transfer of odors stimulating feeding from the nutrient medium. After piercing the chitosan membrane, the female feeds for 1 to 5 minutes, which is consistent with normal feeding. This experiment demonstrates that the capsule according to the invention provides a surface that allows the female Varroa destructor to develop a normal search behavior of a feeding site, characterized by the classic behavioral sequence and resulting in efficient feeding.
En particulier, cette capsule peut tout à fait avantageusement intégrer dans la membrane et/ou dans son coeur des substances stimulantes, si bien qu'elle reproduit efficacement l'interface parasite/hôte. Cette capsule constitue un support performant, facile et rapide à obtenir et à bas coût, pour l'élevage d'un arthropode, y compris d'un acarien de l'espèce Varroa destructor, très exigeant en terme de spécificité d'hôte et de résistance de la membrane.In particular, this capsule can quite advantageously incorporate stimulating substances in the membrane and / or in its heart, so that it effectively reproduces the parasite / host interface. This capsule is a high-performance, easy and fast to obtain at low cost, for the breeding of an arthropod, including a mite of the species Varroa destructor, very demanding in terms of specificity of host and resistance of the membrane.
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