FR2995082A1 - Methode de determination de l'energie de destabilisation de la conformation d'une proteine - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une méthode de détermination de l'énergie de déstabilisation de la conformation d'une protéine. Ladite méthode étant du type selon laquelle : on fournit, à l'intérieur d'une solution, une protéine comprenant un enchaînement d'acides aminés, ladite protéine présentant une conformation correspondant à une position relative donnée des acides aminés dudit enchaînement ; et, on introduit un composé oxydoréductible dans ladite solution. Ensuite, on fournit successivement des quantités croissantes d'énergie à ladite solution pour pouvoir modifier ladite position relative donnée des acides aminés dudit enchaînement, et de manière à déstabiliser la conformation de ladite protéine, tandis que ledit composé oxydoréductible interagit avec ladite protéine déstabilisée pour provoquer l'apparition d'un signal lorsque l'on applique un champ électrique à ladite solution; et, on enregistre la quantité d'énergie correspondant à l'apparition dudit signal de manière à pouvoir déterminer l'énergie de déstabilisation de ladite conformation.

Description

Méthode de détermination de l'énergie de déstabilisation de la conformation d'une protéine La présente invention se rapporte à une méthode permettant de déterminer les conditions dans lesquelles la conformation d'une protéine se déstabilise. Une protéine est une macromolécule biologique comprenant au moins un enchaînement d'acides aminés déterminant la structure primaire de la protéine. Celle-ci, dans un milieu donné, tend à se replier sur elle-même pour former une structure tridimensionnelle suivant les conditions dudit milieu. Cet état conformationnel résulte des interactions, d'une part des acides aminés entre eux, et d'autre part des acides aminés avec le milieu. Aussi, l'énergie d'interactions des acides aminés entre eux, et celle de leurs interactions avec le milieu est-elle révélatrice de la conformation de la protéine.

La méthode selon l'invention permet de déterminer cette quantité d'énergie, en déstabilisant la conformation de la protéine. Elle vise à rompre au moins une partie des interactions qui s'établissent entre les acides aminés, et entre ceux-ci et le milieu. Il est connu de pouvoir modifier la conformation d'une protéine en la chauffant, et à l'extrême de la déplier entièrement. En effet, en la chauffant, à partir d'un certain seuil propre à chacune d'elles dans un milieu donné, les interactions entre les acides aminés, du type forces de van der Waals, liaisons hydrogènes, ou autres interactions électriques de faible intensité, se relâchent et se rompent.

En outre, il est connu de coupler les effets de l'énergie thermique sur les protéines avec une technique d'analyse fluorescente. On pourra notamment se reporter au document W01997042500, lequel décrit la mise en oeuvre de sondes moléculaires fluorescentes capables de se lier partiellement ou totalement à la protéine elle-même partiellement ou totalement dépliée et d'émettre en conséquence, dans ce seul cas, un signal fluorescent après avoir été excitées par une onde électromagnétique d'une longueur d'onde définie. Ainsi, on fournit une protéine en solution et on y ajoute une sonde moléculaire du type précité formant alors un agent révélateur. Ensuite, on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique à ladite protéine de manière à pouvoir libérer les uns des autres les acides aminés interagissant entre eux, tandis que la sonde moléculaire fluorescente vient elle-même interagir avec les acides aminés ainsi libérés en induisant un signal fluorescent.

De la sorte, en mesurant parallèlement l'intensité du signal fluorescent en fonction de la quantité d'énergie thermique fournie, on détermine une quantité d'énergie correspondant au changement conformation nel de la protéine lorsque le signal fluorescent augmente significativement. Toutefois, de telles méthodes sont délicates à mettre en oeuvre car elles sont basées sur la mesure d'une concentration d'un agent révélateur dans un milieu en appréciant la quantité de photons qu'il émet. De plus, le récepteur optique permettant d'apprécier la quantité de photons est fragile et coûteux. Il est de plus malaisé de conduire des expérimentations simultanément en grand nombre dans un milieu trouble.

Aussi, un problème qui se pose et que vise à résoudre la présente invention est de fournir une méthode permettant non seulement de pouvoir réaliser un grand nombre d'expérimentations simultanées dans tout type de milieu indépendamment de sa turbidité, mais aussi de pouvoir les réaliser à un coût avantageux.

Dans ce but, la présente invention propose une méthode de détermination de l'énergie de déstabilisation de la conformation d'une protéine, ladite méthode étant du type selon laquelle : on fournit, à l'intérieur d'une solution, une protéine comprenant un enchaînement d'acides aminés, ladite protéine présentant une conformation correspondant à une position relative donnée des acides aminés dudit enchaînement ; puis on introduit un agent révélateur dans ladite solution ; et, on fournit successivement des quantités croissantes d'énergie à ladite solution pour pouvoir modifier ladite position relative donnée des acides aminés dudit enchaînement, et de manière à déstabiliser la conformation de ladite protéine, tandis que ledit agent révélateur interagit avec ladite protéine déstabilisée pour provoquer l'apparition d'un signal ; et on enregistre la quantité d'énergie correspondant à l'apparition dudit signal de manière à pouvoir déterminer l'énergie de déstabilisation de ladite conformation. Selon l'invention, on fournit un composé oxydoréductible comme agent révélateur ; et on applique un champ électrique à ladite solution pour pouvoir détecter la variation d'un courant électrique formant ledit signal. Ainsi, une caractéristique de l'invention réside dans la mise en oeuvre d'un composé oxydoréductible comme agent révélateur. Ce composé oxydoréductible est électrochimiquement détectable dans une solution lorsqu'il est libre. La structure primaire d'une protéine correspond à l'enchaînement successif de ses acides aminés. Lorsqu'elle est native, sa conformation, où la position relative de ses acides aminés les uns par rapport aux autres, correspond a priori à la structure thermodynamiquement la plus stable. Cette conformation résulte de facteurs intrinsèques à la protéine et de facteurs extrinsèques. Les premiers sont notamment liés aux interactions électriques de faible intensité entre les acides aminés, et les secondes au solvant. Native, la protéine présente une structure tertiaire, repliée sur elle-même, et biologiquement fonctionnelle. Des sites de complexation possibles ou d'interaction potentiels avec le composé oxydoréductible sont masqués. En revanche, lorsque la conformation de la protéine se modifie, et qu'au moins une partie des acides aminés de l'enchaînement d'acides aminés n'interagissent plus les uns avec les autres ni avec le solvant, les sites de complexation deviennent libres. Le composé oxydoréductible peut alors venir s'y fixer, et conséquemment il devient électrochimiquement indétectable. Partant, à température ambiante, la protéine en solution avec le composé oxydoréductible, ne forment pas ou très peu de complexe avec ce dernier et le signal électrochimique qui en résulte après l'application d'un champ électrique, est dû à la concentration initiale du composé oxydoréductible introduit dans la solution. En revanche, lorsqu'une quantité donnée d'énergie est fournie, et en particulier de l'énergie thermique, les acides aminés sont entraînés en mouvement dans la solution et leurs positions relatives se modifient. Aussi, la conformation de la protéine se déstabilise et à l'extrême, la protéine retrouve sa structure primaire. Le composé oxydoréductible peut alors venir se lier aux sites de complexation laissés vacants lors de la déstabilisation, de telle sorte que la fraction de composé oxydoréductible liée, n'est plus électrochimiquement détectable, et que le signal électrochimique est abaissé.

De la sorte, puisqu'on mesure aisément la concentration du composé oxydoréductible contenu dans la solution, grâce à l'application d'un champ électrique, on détermine alors précisément, l'instant ou la quantité d'énergie thermique fournie provoque la déstabilisation ou le changement de conformation de la protéine. De plus, la mise en oeuvre d'un dispositif permettant d'appliquer un champ électrique à la solution et de mesurer le courant qui en résulte, est bien moins coûteuse que celle d'un détecteur optique. L'appareillage est au surplus robuste en comparaison du détecteur optique.

De préférence, des quantités croissantes d'énergie thermique sont fournies, car c'est la forme d'énergie la plus aisée à mettre en oeuvre et à faire croître progressivement. D'autres formes d'énergie sont envisageables. Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention particulièrement avantageux, on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique de manière à accroître la température de ladite solution d'au moins 0,5°C par minute. On accroît par exemple la température de la solution de 1 °C par minute, de manière à obtenir une vitesse de montée en température qui soit en adéquation avec les constantes de réaction de complexation du composé oxydoréductible et des sites de complexation. En outre, on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique de manière à accroître la température de ladite solution de 25°C à 70°C. La température de la solution peut être portée au-delà de 90 °C. Cependant la déstabilisation de conformation des protéines, ou bien le passage d'une conformation à une autre, intervient généralement à une température inférieure à 70 °C. Cela permet de diminuer les temps d'analyse et d'améliorer la productivité de la méthode. De plus, on applique séquentiellement ledit champ électrique à intervalles de temps réguliers. Ainsi, la température de la solution croît de manière sensiblement linéaire avec le temps, et à intervalles de temps réguliers on applique un champ électrique à la solution et on en mesure le courant électrique qui en résulte. De préférence, on met en oeuvre une technique voltammétrique pour détecter les variations de courant électrique, et par exemple, une technique de voltammétrie cyclique à vagues carrées, laquelle permet d'obtenir une bonne réponse électronique et par conséquent une bonne mesure du signal. Par ailleurs, on dresse, d'une part la courbe de l'intensité dudit courant électrique en fonction des quantités d'énergie thermique croissantes, et d'autre part la courbe dérivée associée, de manière à pouvoir révéler une valeur caractéristique de ladite énergie de déstabilisation de ladite conformation. Cette quantité d'énergie caractéristique correspond à une température de transition de forme Tf, représentative de la protéine étudiée et de sa conformation. Selon une première variante d'exécution de l'invention, que l'on décrira plus en détail dans la suite de la description, on fournit en outre une première solution complémentaire contenant le seul composé oxydoréductible et une seconde solution complémentaire contenant ledit composé oxydoréductible et la protéine sous une autre conformation correspondant à une autre position relative des acides aminés dudit enchaînement, et on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique et on applique un champs électrique, simultanément à ladite solution et auxdites solutions complémentaires. Par exemple, ladite autre conformation correspond à la structure primaire de la protéine où elle est entièrement dépliée. De la sorte, on mesure simultanément l'intensité du courant électrique qui traverse les solutions à mesure que l'on augmente leur température, et on peut déterminer ainsi plus précisément la conformation de la protéine étudiée. En outre, selon une seconde variante d'exécution, on fournit une autre solution contenant ladite protéine et l'un de ses ligands, et on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique et on applique un champ électrique, simultanément à ladite solution et à ladite autre solution. De la sorte, et ainsi qu'on l'expliquera ci-après plus en détail, on vérifie que le ligand est bien un facteur de stabilisation de la protéine, lorsque les deux courbes résultantes sont décalées. À l'inverse, lorsque les deux courbes résultantes sont superposées, cela permet de vérifier que le ligand ne correspond pas à celui de la protéine observée, ou bien qu'il n'est pas un facteur stabilisant. Selon une variante de réalisation de l'invention, ladite une solution comprend un premier solvant et on fournit en outre une autre solution comprenant ladite protéine et ledit composé oxydoréductible dans un deuxième solvant, et on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique et on applique un champ électrique, simultanément auxdites solutions. De la sorte, on mesure l'impact du solvant sur l'énergie de déstabilisation de la conformation d'une protéine.

Par ailleurs, ledit composé oxydoréductible est de préférence un complexe d'un métal de transition et avantageusement, le composé Osmium(2+), bis([2,2'-bipyridine]-4,4'-diamine-KN1,KN1') (dipyrido[3,2-a:2',3'- c]phenazine-KN4,KN5)-, (0C-6-21)- (9CI). Les complexes de l'iridium peuvent également être mis en oeuvre, ou encore les complexes du ruthénium.

D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après d'un mode de réalisation particulier de l'invention, donné à titre indicatif mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - les Figures la et lb illustrent les courbes de mise en oeuvre de la méthode selon l'invention appliquée à des premières solutions ; - les Figures 2a et 2b illustrent les courbes de mise en oeuvre de la méthode selon l'invention appliquées à des deuxièmes solutions ; - les Figures 3a et 3b illustrent les courbes d'une méthode comparative appliquées aux deuxièmes solutions ; - les Figures 4a et 4b, illustrent les courbes de la méthode comparative appliquée à des troisièmes solutions ; et, - les Figures 5a et 5b illustrent les courbes de mise en oeuvre de la méthode selon l'invention appliquée aux troisièmes solutions. La méthode de détermination de la quantité d'énergie apte à provoquer la dénaturation d'une protéine conforme à l'invention nécessite la mise en oeuvre d'un ensemble comportant des moyens de contrôle et de mesure. Ainsi, elle comprend au moins une micro-cuvette, adaptée à recevoir à l'intérieur, une protéine en solution avec un composé oxydoréductible. Cette micro-cuvette déjà connus selon l'art antérieur, présente un fond, sur lequel sont présentes, une électrode, une contre-électrode, et une électrode de référence, obtenues par exemple par sérigraphie et respectivement reliées à un potentiostat. En outre, elle est prise en sandwich entre un module à effet Pelletier qui la supporte et un couvercle chauffant relié à un générateur. Ainsi, le module à effet Pelletier, permet de céder une quantité d'énergie thermique donnée au contenu de la micro-cuvette. Par ailleurs, le générateur et le potentiostat sont contrôlés par un micro-ordinateur, lequel contient un programme d'ordinateur et des moyens d'enregistrement.

Ainsi, la micro-cuvette, constitue un moyen de réception apte à recevoir une solution contenant des protéines et le composé oxydoréductible. Le module à effet Pelletier et le générateur sont aptes à être pilotés par l'intermédiaire du micro-ordinateur. Le composé oxydo-réductible, et en l'espèce le complexe de l'osmium : bis([2,2'-bipyridine]-4,4'-diamine-KN1,KN1') (dipyrido[3,2-a:2',3'-c]phenazine- KN4,KN5)-, (0C-6-21)- (9CI) dont le numéro CAS est 392658-63-8, est de formule I : R = NH2 Formule I D'autres composés oxydoréductibles, et notamment des complexes métalliques, sont envisageables, et en particulier avec le ruthénium à la place de l'osmium. D'autres ligands sont aussi susceptibles d'être mis en oeuvre comme le composé Osmium(2+), bis(4,4'-dimethy1-2,2'-bipyridine- KN1,KN1')(dipyrido[3,2-a:2',3'-c]phenazine-KN4,KN5)-, (0C-6-21)- (9CI) dont le numero CAS est 392658-64-9 et le composé Osmium(2+), bis(2,2'-bipyridineKN1,KN1')(dipyrido[3,2-a:2',3'-c]phenazine-KN4,KN5)-, (0C-6-21)- dont le numero CAS est 355395-37-8. Encore d'autres composés oxydoréductibles sont envisageables comme des dérivés quinoliques, des dérivés flaviniques (FAD, FMN), des viologenes, des anthraquinones, ou encore du bleu de méthylène et ses dérivés.

Exemple 1 Selon un premier exemple, on mettra en oeuvre la Glucose Oxydase, une flavoprotéine, et on visualisera ses changements de conformation, entre un état natif où elle est repliée sur elle-même et où les acides aminés qui la constituent interagissent les uns avec les autres, et un état dénaturé où elle est dépliée et où les acides aminés sont libres les uns par rapport aux autres, en fonction de la quantité d'énergie qu'on lui fournit. La Glucose Oxydase est une protéine d'une masse de 160 kDa (kilodalton). Cette protéine tend à se dénaturer majoritairement suivant les conditions de force ionique et de pH entre 56°C et 64°C. Trois solutions notées A, B et C ont été préparées. Le pH est ajusté à 7,4 avec du tampon phosphate à 0,01 mol.L-1. La première solution A contient uniquement un composé, ou sonde, oxydoréductible comme agent révélateur, à une concentration de 5.10-6 mol.L-1.

La deuxième solution B contient la sonde oxydoréductible à la même concentration que la première solution A et la protéine à l'état natif à une concentration de 10-5 mol.L-1. La troisième solution C contient la sonde oxydoréductible à la même concentration de 5.10-6 mol.L-1 et la protéine préalablement dénaturée. La dénaturation a été réalisée par une incubation à 95°C en solution aqueuse pendant une heure. A chacune de ces solutions A, B et C on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique de 20°C à 95°C selon une rampe de température de 1°C par minute. Aussi, on prévoit trois micros-cuvettes du type précité de manière à respectivement recevoir les trois solutions A, B et C.

On peut de la sorte appliquer une différence de potentiel entre les deux électrodes de chacune des micros-cuvettes et mesurer un courant qui en résulte. Cette mesure de courant permet alors de déterminer la concentration en sonde oxydoréductible libre. Selon ce protocole, on mesure simultanément le courant électrique et la température de la solution.

Dans le présent exemple elle est réalisée tous les 0,7°C, soit toutes les 42 secondes, et une centaine de mesures est ainsi générée pour chaque échantillon A, B et C. Les résultats de cet exemple sont reportés sur les diagrammes des Figures 1a et 1b.

Sur la figure la, sont reportés, en abscisse la température et en ordonnée l'intensité du courant. Ainsi, une courbe supérieure 10, correspond alors à la première solution A, contenant uniquement la sonde oxydoréductible. Une courbe inférieure 12 correspond à la troisième solution C contenant la sonde oxydoréductible et la protéine dénaturée et une courbe intermédiaire 14 correspond à la deuxième solution B contenant la sonde oxydoréductible et la protéine à l'état natif. Ainsi, la courbe supérieure 10 traduit l'augmentation du courant dans la solution lorsque l'énergie thermique fournie augmente, ce qui est naturel puisque la mobilité des molécules est alors accrue. S'agissant de la deuxième solution B, en présence de la protéine non dénaturée, ou à l'état natif, seule une faible fraction de la sonde oxydoréductible se complexe à la protéine, et la courbe intermédiaire 14 montre qu'à 20° C, le courant est alors sensiblement plus faible que pour la première solution B. En outre, en présence de la protéine dénaturée, pour la troisième solution C, une plus grande fraction de la sonde oxydoréductible est complexée à la protéine. Aussi, à 20°C, la courbe inférieure 12 est à une valeur de courant bien inférieur aux deux autres courbes 10, 14. Cet abaissement du courant s'explique par l'augmentation du nombre de sites de complexation sur la protéine entre sa forme native et sa forme dénaturée. La sonde oxydoréductible complexée à la protéine n'est alors plus détectable électrochimiquement. Lorsque l'on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique aux trois solutions A, B et C, on observe différents comportements. S'agissant plus précisément de la deuxième solution B incluant la protéine non dénaturée, et correspondant à la courbe intermédiaire 14 sur la figure 1 a, on observe une augmentation du courant sensiblement parallèle à la courbe supérieure 10 jusqu'à un premier extremum 16 entre 50 et 55°C, puis une décroissance du courant jusqu'à un second extremum 18 au voisinage de 70° C et enfin une nouvelle croissance du courant sensiblement parallèle à la courbe inférieure 12 jusqu'à un point commun des trois courbes 20 à 94°C.

La double inflexion de la courbe intermédiaire 14, entre les deux extremums 16, 18, s'explique par un changement de conformation important de la protéine, conduisant à une dénaturation progressive et aboutissant à une augmentation du nombre de site de complexation pour la sonde oxydoréductible. Ainsi, la protéine commence à se dénaturer lorsque la quantité d'énergie thermique fournit est comprise entre 50 et 55°C, le composé oxydoréductible vient alors se complexer avec les sites de complexation qui se libèrent progressivement, et sa concentration détectable dans la solution diminue alors.

L'expérience réalisée avec la troisième solution C où la protéine est préalablement dénaturée, la courbe inférieure 12 est monotone et de forme exponentielle entre 20° C et 94°C. Elle rejoint la courbe intermédiaire 14 à une valeur de température voisine de 80°C. Elle traduit l'absence de changement de conformation de cette forme de protéine préalablement dénaturée, durant la montée en température. En effet, lorsque la protéine est préalablement dénaturée, tous les sites de complexation sont a priori libres, de sorte que le composé oxydoréductible, vient tous les occuper, et que sa concentration apparente dans la solution révélée par la mesure électrochimique, et minimale. Au fur et à mesure des apports d'énergie thermique, le composé oxydoréductible tend à quitter les sites de complexation, il redevient électrochimiquement détectable. Par conséquent, la mesure du courant électrique augmente. Sur la figure 1 b, sont illustrées les dérivées primaires des courbes illustrées sur la figure 1 a. Ainsi, la dérivée de la courbe supérieure 10 présente la référence 10', la dérivée de la courbe inférieure 12 présente la référence 12' et la dérivée de la courbe intermédiaire 14 présente la référence 14'. Ainsi on définit une température de transition de forme Tf, valant ici pour la courbe dérivée 14' de la courbe intermédiaire 14 et correspondant à la valeur de température où la dérivée est la plus négative. Elle est ici, dans cet exemple, de 60°C. L'expérience de cet exemple 1, a été répétée plusieurs fois permettant à chaque fois de retrouver des courbes similaires. Une augmentation de la vitesse de montée en température décale la température de transition de forme Tf vers une valeur plus élevée et inversement pour une vitesse plus faible vers une valeur Tf plus faible. Ce résultat est en adéquation avec une cinétique lente de dénaturation. La dénaturation thermique de la Glucose Oxydase étant irréversible, cela se traduit lors de l'application d'une rampe descendante en température sur un échantillon contenant initialement une protéine non dénaturée à une évolution du signal similaire se confondant à celui obtenu pour un échantillon contenant initialement la protéine dénaturée, et sur laquelle une rampe montante en température a été appliquée. Exemple 2 Cet exemple vise à comparer la méthode mise en oeuvre conformément à la présente invention et les méthodes classiques de fluorescence. On mettra également en oeuvre la Glucose Oxydase. Méthode électrochimique conforme à l'invention Aussi, quatre solutions D, E, F et G ont été préparées. Le pH est ajusté à 7,4 avec du tampon phosphate à 0,01 mol.L-1. Le volume est ajusté à 4011L avec de l'eau et des adjuvants. La solution D contient la sonde oxydoréductible à une concentration de 3x10-6 mol.L-1 et la protéine Glucose Oxydase native à une concentration de 10-5 mol.L-1. La solution E contient la sonde oxydoréductible à la même concentration et la protéine préalablement dénaturée thermiquement. La dénaturation a été réalisée par une incubation à 95°C en solution aqueuse pendant 1 heure. La solution F ainsi que la solution G contiennent la sonde oxydoréductible à la même concentration et la protéine préalablement dénaturée chimiquement ; respectivement par l'urée et la guanidine hydrochloride, des dénaturants chimiques connus, à fortes concentrations. A chacune de ces quatre solutions, des quantités progressives d'énergie thermique sont fournies selon une rampe de température de 1°C par minute de manière à augmenter la température des solutions de 25°C à 95°C. Une mesure de courant permettant de déterminer la concentration en sonde oxydoréductible libre est réalisée tous les 1,8°C, selon un protocole analogue à l'exemple 1 ci-dessus. Une centaine de points de mesure sont ainsi générés pour chaque expérience. Les résultats sont reportés sur le graphique de la figure 2a, où sont portées quatre courbes 22, 24, 26 et 28 correspondant respectivement aux quatre solutions D, E, F et G.

Ainsi, lorsque la protéine est non dénaturée, s'agissant de la solution D, seule une faible fraction de la sonde oxydoréductible se complexe à la protéine, sur les rares sites de complexation accessibles, ce qui entraîne un faible abaissement de courant, par rapport à une solution qui ne comprendrait que la sonde oxydoréductible. Cette observation est conforme à l'exemple 1 ci- dessus. Dans une première phase de montée en température, la courbe 22 croît jusqu'à un premier extremum 30, traduisant l'agitation thermique subie par les porteurs de charge contenus dans la solution. Ensuite, à partir du premier extremum 30, au fur et à mesure que la température augmente, la protéine change de conformation et tend à se dénaturer en libérant ainsi progressivement les sites de complexation. La sonde oxydoréductible vient alors s'y complexer et sa concentration dans la solution diminue. En conséquence, le courant électrique mesuré diminue également, jusqu'à un second extremum 32. Ensuite, la courbe 22 s'infléchit à nouveau et croît sensiblement parallèlement aux courbes 24, 26, 28 de la protéine dénaturée. En présence de la protéine dénaturée, s'agissant des solutions E, F et G, une plus grande fraction de la sonde oxydoréductible est complexée à la protéine, et partant, la concentration apparente en sonde oxydoréductible est plus faible, et le courant qui en résulte moins élevé.

Cette différence est clairement observée à 25°C entre la courbe 22 correspondant à la solution D et les courbes 24, 26 et 28 correspondant respectivement aux solutions E, F et G. La figure 2b illustre les dérivés primaires des courbes représentées sur la figure 2a. Aussi, la courbe 22' de la dérivée primaire de la courbe 22 représentée sur la figure 2a, présente une valeur minimale 34 permettant de définir une température de transition de forme Tf correspondant à la valeur de température où la dérivée est la plus négative et en l'espèce de 65°C. Méthode par détection de fluorescence La même protéine Glucose Oxydase, est introduite en solution avec une concentration identique à la concentration des solutions précédentes et un fluorophore le SYPRO® Orange (Invitrogen) est ajouté. Il est de couleur orange et est sensible à l'environnement de la protéine et en particulier à l'exposition des acides aminés en surface, et donc à sa structure spatiale en solution aqueuse, ce qui permet de suivre la cinétique de dénaturation de la protéine. Les données de fluorescence sont collectées durant l'augmentation progressive de la température et elles génèrent un profil de fluorescence spécifique de la protéine.

Deux solutions H et I ont été préparées. Un tampon de réaction, la sonde fluorescente et la protéine étudiée sont mis en solution dans de l'eau jusqu'à un volume de 20pL. La première solution H ne contient que la sonde fluorescente à une concentration donnée. La seconde solution I contient la sonde fluorescente à la même concentration et la protéine native à une concentration de 10-5 mol.L-1. De l'énergie thermique est fournit à chacune de ces solutions H, I, selon une rampe de température de l'ordre de 1°C par minute, de 25°C à 99°C. Une mesure de fluorescence tous les 0.4°C permet de sonder en fonction de la montée en température et par conséquent du temps, la concentration apparente de la sonde fluorescente sensible à la structure native ou non de la protéine. Environ 185 points de mesure sont ainsi générés pour chaque expérience. Les résultats sont reportés sur le graphique de la figure 3a. On observe un premier faisceau 40 de courbes sensiblement parallèles et correspondant à quatre expériences identiques réalisées avec la première solution H, et un second faisceau 42 de quatre courbes sensiblement parallèles et correspondant à la seconde solution I. Ainsi, à 25°C, en présence de la protéine native, ou non dénaturée, soit la seconde solution I, la sonde fluorescente est naturellement « quenchée » c'est-à-dire qu'il n'y a pas ou peu de signal en fluorescence, comme l'illustre la courbe 42. Toutefois, on observera que, par rapport à la première solution H, la seconde solution I contenant la protéine native, présente une fluorescence sensiblement supérieure. Dans une première phase d'augmentation de la température, jusqu'à 50°C environ, le signal fluorescent demeure sensiblement constant. Ensuite, lorsque la température croît au-dessus de 50°C, et jusqu'à 70°C environ, la protéine se dénature et le coeur hydrophobe de la protéine tend à être exposé, ce qui libère ses sites actifs. La sonde de fluorescence interagit alors avec ces sites et voit ainsi son environnement changer, et en conséquence un signal fluorescent apparaît et augmente fortement.

Sur la figure 3b apparaît un graphique des courbes dérivées du second faisceau de courbes 42' représentées sur la figure 3a, et il permet de définir à un extremum 44, la température de transition de forme Tf, qui est de 65,5°C. On observe que cette température est très voisine de celle qui avait été déterminée selon la méthode électrochimique objet de l'invention. Exemple 3 La T4 DNA ligase est une enzyme catalysant la reconstitution de la liaison phosphoester entre le carbone 3'-OH et le phosphate-5' de deux nucléotides voisins sur un brin d'ADN. Cette enzyme, ou protéine, peut aussi bien lier les extrémités à bouts francs ou à bouts cohésifs. L'ATP est un cofacteur essentiel au bon déroulement de son fonctionnement. La protéine présente une masse de 55 293 Da (Dalton). Méthode par détection de fluorescence Aussi, quatre solutions J, K, L et M sont préparées. Un tampon de réaction, la sonde fluorescente, ou agent révélateur, est à la même concentration dans tous les essais. La protéine T4 DNA ligase avec ou sans son ligand, l'ATP, sont mis en solution dans un tampon de réaction complété avec de l'eau jusqu'à un volume de 20pL. La première solution J ne contient que la sonde fluorescente. La deuxième solution K contient uniquement le ligand et la sonde fluorescente, mais pas la protéine. La troisième solution L contient la protéine, la T4 DNA ligase, à une concentration donnée et la sonde fluorescente. Et la quatrième solution M contient la protéine à la même concentration, le ligand à savoir l'ATP et la sonde fluorescente. A chacune de ces solutions, sont fournis des quantités d'énergie thermique selon une rampe de température de l'ordre de 1°C par minute de manière à les porter d'une température initiale de 25°C jusqu'à 99°C. Une mesure de la fluorescence tous les 0,4°C permet de sonder en fonction de la montée en température, la concentration apparente de la sonde fluorescente sensible à la structure native ou non de la protéine. Environ 200 points de mesure sont ainsi générés pour chaque expérience. Les résultats sont ainsi reportés sur la figure 4a. Quatre essais ont été conduits pour chacune des solutions J, K, L et M.

Un premier faisceau 50 de quatre courbes sensiblement parallèles et verticales entre 35 et 45 °C, correspond aux quatre essais pour la solution L, laquelle contient uniquement la protéine et la sonde fluorescente. Un deuxième faisceau 52 de quatre courbes sensiblement parallèles et vertical entre 40 et 50°C, et décalé sensiblement de 4 à 5°C correspond aux quatre essais pour la solution M, incluant la protéine, le ligand à savoir l'ATP et la sonde fluorescente. En revanche, deux autres faisceaux confondus et horizontaux 54, 56 de quatre courbes sensiblement parallèles, correspondent aux deux autres solutions J et K, ne contenant pas la protéine. Le premier faisceau 50, correspondant à la solution L incluant la protéine native mais pas le ligand, présente à 30 °C un signal de fluorescence faible car, la sonde fluorescente est naturellement « quenchée ». Il est toutefois sensiblement supérieur à celui des solutions J et K, car une faible fraction de sonde fluorescente est en interaction avec la T4 DNA ligase lui permettant d'exalter un signal fluorescent. Quand la protéine commence à se dénaturer en réponse à une augmentation de la température, vers 30°C pour le premier faisceau 50 et vers 40°C pour le deuxième faisceau 52, le coeur hydrophobe de la protéine tend à être exposé. La sonde de fluorescence interagit alors avec ce dernier et commence à être détectable. La fluorescence croît alors exponentiellement. Les données sont enregistrées en temps réel et l'on peut définir un point où 50% des protéines sont sous une forme dénaturée. La température de transition de forme Tf, pour le premier faisceau 50 correspondant à la protéine sans son ligand, est de 43°C, tandis qu'elle est de 47.5°C pour le deuxième faisceau 52 correspondant à la protéine avec son ligand. Ces valeurs apparaissent plus clairement sur les courbes dérivées 50', 52' correspondantes illustrées sur le diagramme de la figure 4b, et elles correspondent respectivement à leur deux extremum 58, 60. Aussi, un décalage de 4,5°C apparaît entre ces deux extremums. Par conséquent, puisque la quantité d'énergie thermique nécessaire pour modifier la conformation de la protéine lorsqu'elle est en présence de son ligand est supérieure à celle qui est nécessaire en l'absence de son ligand, on en déduit naturellement qu'elle est plus stable en présence de son ligand. Méthode électrochimique conforme à l'invention L'expérience est réalisée de manière analogue par détection électrochimique, selon l'invention. Seules les troisième et quatrième solution L et M sont testées et la sonde fluorescente est remplacée par la sonde oxydoréductible à raison de 30.10-6 mol.L-1. En outre, le volume des solutions est ajusté dans ce cas à 40pL. Ainsi, la troisième solution L comporte la protéine, la T4 DNA ligase, et le composé oxydoréductible, tandis que la quatrième solution M inclut au surplus le ligand ATP. Une mesure de courant permettant de déterminer la concentration en sonde oxydoréductible libre est réalisée tous les 0,7°C, selon un protocole analogue à l'exemple 1. A chacune de ces deux solutions L et M, des quantités progressives d'énergie thermique sont fournies selon une rampe de température de 1°C par minute de manière à augmenter la température des solutions de 25°C à 95°C. Une centaine de points de mesure sont ainsi générés pour chaque expérience. Les résultats sont reportés sur le graphique de la figure 5a. Ainsi, apparaît sur cette figure 5a, un premier faisceau supérieur 60 de deux courbes correspondant à deux essais réalisés sur la quatrième solution M, et un second faisceau inférieur 62 de deux courbes correspondant à deux essais réalisés sur la troisième solution L. L'intensité du courant électrique traversant la quatrième solution M est supérieure à celle traversant la troisième solution L, jusqu'à un point d'intersection des deux faisceaux de courbes 60, 62 où elles sont identiques, lequel pour une intersection est précédé d'une inflexion 66 du premier faisceau supérieur 60. Les faisceaux de courbes 60' et 62' des dérivées primaires des courbes représentées sur la figure 5a, font apparaître deux extremums de 38,2 °C et de 30 43 °C correspondant respectivement à la température de transition de forme Tf, de la protéine sans son ligand et de la protéine avec son ligand. Ce décalage de 4,8 °C est en accord avec celui de 4,5 °C observé avec la méthode par détection de fluorescence, et il montre que l'on peut déterminer dans quelles conditions thermodynamiques, une protéine peut être stabilisée par son ligand.5

Claims (13)

1. REVENDICATIONS1. Méthode de détermination de l'énergie de déstabilisation de la conformation d'une protéine, ladite méthode étant du type selon laquelle : - on fournit, à l'intérieur d'une solution, une protéine comprenant un enchaînement d'acides aminés, ladite protéine présentant une conformation correspondant à une position relative donnée des acides aminés dudit enchaînement ; - on introduit un agent révélateur dans ladite solution; - on fournit successivement des quantités croissantes d'énergie à ladite solution pour pouvoir modifier ladite position relative donnée des acides aminés dudit enchaînement, et de manière à déstabiliser la conformation de ladite protéine, tandis que ledit agent révélateur interagit avec ladite protéine déstabilisée pour provoquer l'apparition d'un signal ; - on enregistre la quantité d'énergie correspondant à l'apparition dudit signal de manière à pouvoir déterminer l'énergie de déstabilisation de ladite conformation ; caractérisée en ce qu'on fournit un composé oxydoréductible comme agent révélateur ; et en ce qu'on applique un champ électrique à ladite solution pour pouvoir détecter la variation d'un courant électrique formant ledit signal.
2. 2. Méthode de détermination selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique.
3. 3. Méthode de détermination selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique de manière à accroître la température de ladite solution d'au moins 0,5°C par minute.
4. 4. Méthode de détermination selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce qu'on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique de manière à accroître la température de ladite solution de 25°C à 70°C.
5. 5. Méthode de détermination selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'on applique séquentiellement ledit champ électrique à intervalles de temps réguliers.
6. 6. Méthode de détermination selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'on met en oeuvre une technique voltammétrique pour détecter les variations de courant électrique.
7. 7. Méthode de détermination selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'on met en oeuvre la voltammétrie cyclique à vagues carrées.
8. 8. Méthode de détermination selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'on dresse, d'une part la courbe de l'intensité dudit courant électrique en fonction des quantités d'énergie thermique croissantes, et d'autre part la courbe dérivée associée, de manière à pouvoir révéler une valeur caractéristique de ladite énergie de déstabilisation de ladite conformation.
9. 9. Méthode de détermination selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'on fournit en outre une première solution complémentaire contenant le seul composé oxydoréductible et une seconde solution complémentaire contenant ledit composé oxydoréductible et la protéine sous une autre conformation correspondant à une autre position relative des acides aminés dudit enchaînement, et en ce qu'on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique et on applique un champs électrique, simultanément à ladite solution et auxdites solutions complémentaires.
10. 10. Méthode de détermination selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'on fournit en outre une autre solution contenant ladite protéine et l'un de ses ligands, et en ce qu'on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique et on applique un champ électrique, simultanément à ladite solution et à ladite autre solution.
11. 11. Méthode de détermination selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ladite une solution comprend un premier solvant et en ce qu'on fournit en outre une autre solution comprenant ladite protéine et ledit composé oxydoréductible dans un deuxième solvant, et en ce qu'on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique et on applique un champ électrique, simultanément auxdites solutions.
12. 12. Méthode de détermination selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ledit composé oxydoréductible est un complexe d'un métal de transition.
13. 13. Méthode de détermination selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que ledit composé oxydoréductible est le Osmium(2+), bis([2,2'-bipyridine]-4,4'-diamine-KN1,KN1') (dipyrido[3,2- a:2',3'-c]phenazine-KN4,KN5)-,(0C-6-21)-(9C1).5