FR2994793A1 - Utilisation d'un recepteur kinase a motifs lysm pour ameliorer la reponse des plantes aux lipochitooligosaccharides. - Google Patents
Utilisation d'un recepteur kinase a motifs lysm pour ameliorer la reponse des plantes aux lipochitooligosaccharides. Download PDFInfo
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Abstract
L'invention est relative à l'amélioration de la réponse d'une plante aux facteurs lipochitooligosaccharidiques Nod et Myc-LCO, par l'expression dans ladite plante d'un récepteur kinase à motifs LysM, homologue de la protéine LYR3 de Medicago truncatula, et capable de se lier avec une affinité élevée aux lipochitooligosaccharides.
Description
UTILISATION D'UN RÉCEPTEUR KINASE À MOTIFS LysM POUR AMÉLIORER LA RÉPONSE DES PLANTES AUX LIPOCHITOOLIGOSACCHARIDES. L'invention est relative à l'amélioration des effets sur les plantes des facteurs lipochitooligosaccharidiques Nod et Myc-LCOs. Un très grand nombre de plantes terrestres sont capable d'établir, par l'intermédiaire de leur système racinaire, une symbiose avec des microorganismes du sol.
Le plus connu de ces systèmes endosymbiotiques est celui qui intervient entre des bactéries du sol, collectivement dénommées Rhizobia ou Rhizobium et les racines de plantes de la famille des légumineuses, et aboutit à la formation de nodules racinaires dans lesquels est fixé l'azote atmosphérique. La symbiose Rhizobium-légumineuse est relativement spécifique : une espèce donnée de Rhizobium ne nodule que certaines espèces de légumineuses, dont le nombre varie selon l'espèce de Rhizobium concernée. Un autre type important d'endosymbiose racinaire est la symbiose endomycorhizienne à arbuscules, qui intervient non seulement chez les légumes, mais chez la plupart des plantes terrestres, et qui implique des champignons appartenant à l'ordre des Glomales.
Le champignon fournit à la plante des composés minéraux, principalement du phosphate et de l'azote, et la plante fournit des composés carbonés issus de la photosynthèse. La symbiose Rhizobium-légumineuse et la symbiose endomycorhizienne à arbuscules ont un certain nombre de points communs. L'un d'entre eux est la nature des signaux symbiotiques produits par les Rhizobia (Facteurs Nod) ou par les champignons (Facteurs Myc-LCOs) ; en effet, dans les deux cas, il s'agit de lipochitooligosaccharides (LC0s), composés d'un squelette d'oligochitine comportant trois à cinq résidus de N-acétyl glucosamine liés en B (1-4), acylé sur la glucosamine terminale non-réductrice par un acide gras (GOUGH & CULLIMORE, Molecular Plant-Microbe Interactions, 24, 867-78, 2012).
Chez les facteurs Nod le squelette oligochitinique porte en outre divers substituants au niveau des extrémités réductrices et non-réductrices (acétylation, sulfatation, méthylation, fucosylation...), et la longueur, le degré d'insaturation, et la position des liaisons insaturées de la chaîne d'acide gras peut varier (DENARIE et al., Annu Rev Biochem, 65, 503-35, 1996; D'HAEZE & HOLSTERS, Glycobiology, 12, 79R-105R, 2002).
Cette diversité de substituants résulte de la présence chez différentes souches de Rhizobia, de gammes différentes de gènes nod impliqués dans ces substitutions, et aboutit à une grande variété de facteurs Nod différents, qui intervient dans la spécificité de l'interaction Rhizobium-légumineuse. Les facteurs Myc-LCOs caractérisés jusqu'à présent ont une variété de substituants beaucoup plus limitée : l'acide gras de l'extrémité non-réductrice est un acide gras courant, principalement un acide oléique (C18:1) ou palmitique (C16:0), et la seule autre substitution ayant été observée est une 0-sulfatation de l'extrémité réductrice (MAILLET et al., Nature, 469, 58-63, 2011). A coté de leurs rôles dans les symbioses Rhizobium-légumineuse et endomycorhizienne, les facteurs Nod et Myc-LCOs ont un effet bénéfique sur la croissance et le développement des plantes. Par exemple, il a été rapporté que des facteurs Nod ainsi que des facteurs Myc-LCOs amélioraient le développement et la structure racinaire (OLAH et al., Plant J, 44, 195-207, 2005 ; MAILLET et al., Nature, 469, 58-63, 2011), et qu'ils favorisaient la germination, la croissance de diverses plantes et le rendement de la photosynthèse (MAJ et al., J Chem Ecol, 35, 479-87, 2009; KIDAJ et al., Microbiol Res, 167, 144-50, 2012; PRITHIVIRAJ et al., Planta, 216, 437-45, 2003 ; SOULEIMANOV et al., J Exp Bot, 53, 1929-34, 2002 ; KHAN et al., J Plant Physiol, 165, 1342-1351, 2008). La N-acétyl glucosamine constitue également un composant de base de molécules de signalisation qui sont importantes dans les interactions parasite-plante, et constituent notamment de puissants éliciteurs des réactions de défense chez les plantes vis-à- vis des bactéries et des champignons pathogènes. Il s'agit des chitooligosaccharides (C0s), qui représentent des fragments de chitine libérés principalement par l'hydrolyse de la paroi fongique, et qui sont constitués d'un enchaînement linéaire de résidus de N-acétyl glucosamine liés en B (1-4) et ne comportant aucune substitution par un acide gras, et des peptidoglycanes bactériens, dont la partie polysaccharidique est un copolymère de N-acétyl glucosamine et d'acide N-acétyl-muramique. Parmi les protéines connues pour être impliquées dans la perception de fragments de chitine ou de peptidoglycanes bactériens figurent des protéines à motifs lysin (LysM), et notamment des protéines appartenant à la famille des récepteurs kinase à motifs 25 LysM (LysM-RLKs pour « LysM Receptor-Like Kinases »). Le motif LysM (Pfam PF01476) est présent dans un très grand nombre de protéines procaryotes ou eucaryotes (BUIST et al., Molecular Microbiology, 68, 838-47, 2008). Chez les procaryotes, il est par exemple retrouvé dans des enzymes pariétales impliquées dans la dégradation des peptidoglycanes; chez les eucaryotes il est présent dans 30 certaines chitinases, ou dans des récepteurs intervenant dans la perception de molécules contenant de la N-acétyl glucosamine. Les récepteurs kinase à motifs LysM, dont l'existence n'a été décrite que chez les plantes (ZHANG et al., Plant Physiology, 144, 623-36, 2007), comprennent un domaine extracellulaire contenant 1 à 3 motifs LysM, associé à un domaine kinase 35 intracellulaire via un domaine transmembranaire. Chez un certain nombre de ces récepteurs, le domaine kinase intracellulaire est inactif, c'est-à-dire n'est pas capable de catalyser une réaction de phosphorylation.
Les analyses effectuées à partir des séquences disponibles sur les bases de données ont montré que les récepteurs kinase à motifs LysM appartiennent à une famille multigénique dont le nombre de représentants dépend de l'espèce concernée. On a ainsi identifié 17 membres de cette famille chez Medicago truncatula (ARRIGHI et al., Plant Physiology, 142, 265-79, 2006) ainsi que chez Lotus japonicus (LOHMANN et al., Mol Plant Microbe Interact, 23, 510-21, 2010), 12 chez le soja, 5 chez Arabidopsis thaliana, et 10 chez le riz (ZHANG, 2007, précité), mais la fonction précise de la plupart d'entre eux n'a pas encore été élucidée. Il a été montré que certains de ces récepteurs sont impliqués dans la perception des COs dérivés de la chitine, et dans l'induction de la réponse de la plante aux infections fongiques ; on citera notamment chez Arabidopsis thaliana LYK1/CERK1 (MIYA et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 19613-18, 2007; WAN et al., Plant Cell 20, 471-81, 2008), et RLK4 (WAN et al., Plant Physiol., prépublication en ligne, 28 juin 2012), et chez le riz, OsCERK1 (SHIMIZU et al., The Plant Journal, 64, 204-14, 2010). Chez le riz et M truncatula, une protéine à motif LysM a également été décrite comme impliquée dans la perception des COs ; cette protéine est toutefois dépourvue de domaine kinase (KAKU et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 103, 11086-91, 2006 ; FLIEGMANN et al., Plant Physiology and Biochemistry 49, 709-720, 2011). D'autres récepteurs kinase à motifs LysM ont été décrits comme impliqués dans la perception des facteurs Nod ; il s'agit de NFP et LYK3 de Medicago truncatula et de NFR1 et NFR5 de Lotus japonicus (LIMPENS et al., Science, 302, 630-3, 2003; MADSEN et al., Nature, 425, 637-40, 2003; RADUTOIU et al., Nature, 425, 585-92, 2003a; ARRIGHI et al., Plant Physiology, 142, 265-79, 2006; SMIT et al., Plant Physiol., 145, 183-91, 2007). Il a aussi été rapporté que NFP de Medicago truncatula et une protéine apparentée de Parasponia andersonii (PaNFP) étaient également impliqués dans la perception des facteurs Myc (MAILLET et al., Nature, 469, 58-63, 2011; OP DEN CAMP et al., Science, 331, 90912, 2011). Récemment, il a été rapporté que NFR1 et NFR5 de Lotus japonicus pouvaient se lier directement à des LCOs avec une affinité élevée (BROGHAMMER et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 109, 13859-64, 2012). En revanche, aucune interaction directe de NFP ou LYK3 de Medicago truncatula avec des LCOs n'a été rapportée à l'heure actuelle. Toutefois, des études biochimiques effectuées avec des facteurs Nod radiomarqués ont montré l'existence de 3 sites de liaison des facteurs Nod (dénommés NFBS, pour "Nod Factor Binding Site") dans des fractions obtenues à partir de racines de Medicago truncatula, ou de cellules en culture de Medicago truncatula ou de Medicago varia (BONO et al., Plant J, 7, 253-60, 1995; GRESSENT et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96, 4704-9, 1999; HOGG et al., Plant Physiol., 140, 365-73, 2006). Ces sites diffèrent entre eux par leur affinité et leur sélectivité vis-à-vis du principal facteur Nod (NodSm-IV(Ac, S, C16:232,9)) produit par Sinorhizobium meliloti, le symbiote de Medicago, mais ils reconnaissent tous également les facteurs Nods sulfatés et non-sulfatés, et sont indépendants de NFP. L'un de ces sites, dénommé NFBS2, qui présente une affinité élevée pour le facteur NodSm est associé à la membrane plasmique des cellules de Medicago varia en culture (GRESSENT et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96, 4704-9, 1999), et un site ayant des propriétés similaires a également été décrit dans la fraction membranaire de cultures de cellules de Medicago truncatula (HOGG et al., Plant Physiol., 140, 365-73, 2006). Cependant, la protéine affine associée à NFBS2 n'avait jusqu'à présent pas pu être identifiée.
Les Inventeurs sont maintenant parvenus à identifier cette protéine comme étant la protéine LYR3, précédemment identifiée in silico par ARRIGHI et al. (2006, précité), parmi les récepteurs kinase à motifs LysM, et également dénommée MtLYK12 (ZHANG, 2007, précité), mais à laquelle aucune fonction particulière n'avait pu être attribuée. Les Inventeurs ont caractérisé en outre ses propriétés de liaison aux LCOs.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'un polynucléotide choisi parmi : - un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM dont le domaine extracellulaire flanqué du peptide signal possède au moins 40%, et par ordre de préférence croissante, au moins 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 98% d'identité de séquence, et au moins 60%, et par ordre de préférence croissante, au moins 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec la région 1-274 de la protéine LYR3 de Medicago truncatula de séquence SEQ ID NO: 1 ; - un polynucléotide codant pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur kinase à motifs LysM; pour améliorer la réponse d'une plante à au moins un LCO choisi parmi les facteurs Nod et les facteurs Myc-LCO. Les valeurs d'identité et de similarité de séquence indiquées ici sont calculées en utilisant le programme Needle de la suite EMBOSS avec les paramètres par défaut, sur une fenêtre de comparaison constituée par les acides aminés 1-274 de la séquence SEQ ID NO: 1 et la région homologue de la protéine ciblée. On désigne ici par facteur Nod ou facteur Myc-LCO, tout LCO dont la structure générique de base comporte une chaîne de résidus de N-acétyl glucosamine liés en 13 (1-4), et qui est N-acylé sur la glucosamine terminale non-réductrice par un acide gras. Ledit LCO peut être d'origine naturelle (fourni par les microorganismes symbiotes ou purifié à partir de ceux-ci), ou être produit par synthèse chimique et/ou par génie génétique. De très nombreux facteurs Nod et facteurs Myc-LCO sont connus en eux-mêmes ; on citera par exemple les facteurs Nod décrits dans les articles de revue de DENARIE et al., (1996, précité) ou de D'HAEZE & HOLSTERS (2002, précité), ainsi que dans les Demandes PCT WO 91/15496, WO 94/00466, ou WO 2005/063784, ou les facteurs Myc décrits dans la Demande PCT WO 2010/049817. L'homme du métier peut aisément identifier des domaines extracellulaires de récepteurs kinase à motifs LysM utilisables dans le cadre de la présente invention, sur la base de leur homologie de séquence avec celui de la protéine LYR3 de Medicago truncatula, et en outre sur la base de leur affinité pour les LCOs et de la sélectivité de leur liaison aux LCOs par rapport aux COs. Quelques exemples de récepteurs kinase à motifs LysM sont mentionnés dans le Tableau I ci-dessous. Ceux dont le domaine extracellulaire possède au moins 40% d'identité et au moins 60% de similarité de séquence avec celui de la protéine LYR3 de Medicago truncatula sont indiqués par un astérisque.
Tableau I Numéro d'accès de la Organisme Nom de la Protéine entière Domaine extracellulaire séquence protéine % identité % similarité °A identité % similarité Medtr5g019040 Medicago MtNFP 30,5 49,7 29,5 48,6 truncatula Medtr8g078300 MtLYR1 27,4 49,0 22,0 47,9 ARRIGHI et al. (2006, précité) MtLYR2 37,6 57,3 41,2 57,0 Medtr5g019050 et MtLYR3* 100 SEQ ID NO: 1 Medtr5g085790 MtLYR4 39,1 57,4 40,0 56,5 Medtr7g079350 MtLYR5 30,3 49,5 34,1 52,7 Medtr7g079320 MtLYR6 30,6 48,1 35,6 53,1 Medtr3g080170 MtLYR7 38,7 57,6 37,5 54,0 Medtr5g086130 MtLYK3 26,4 44,7 17,9 33,1 chr2.CM0545.250.r2.m Lotus LjNFR1a 25,8 43,8 17,9 30,8 j . apon!cus chr2.CM0323.400.r2.d LjNFR5 31,2 49,1 28,0 45,1 chr2.CM0323.420.r2.d LjLYS12* 68,2 79,1 70,6 78,5 G1yma01g38550 Glycine max GmLYR3-1* 66,8 80,9 71,7 84,1 Glyma11g06750 GmLYR3- 66,7 80,4 71,8 84,1 11* Phvulv091008254m Phaseolus PvLYR3* 64,7 78,9 66,7 80,1 vulgaris So1yc02g089900 tycSoc)pi ea rnsuicmum SILYR3* 51,7 67,1 49,6 66,5 At3g21630 Arabidopsis AtCERK1 27,1 40,4 21,9 35,3 thaliana At1g51940 AtLysM- 27,1 43,6 21,6 34,8 RLK2 At2g33580 AtLysM- 38,0 57,3 36,7 51,7 RLK3 At2g23770 AtLysM- 41,2 62,5 40,8 62,8 RLK4* At3g01840 AtLysM- 24,1 43,1 22,8 43,2 RLK5 Sources des références: Medicago truncatula - Genome Sequencing Project Release version : Mt3.5.1 (http://medicagohapmap.ore; Glycine max v1.0 (Soybean) (Phytozome v8.0 - http://www.phytozome.org); Phaseolus vulgaris v0.9 (Common bean) (Phytozome v8 - http://www.phytozome.org); Lotus japonicus genome assembly build 2.5 (http://wvvw.kazusa.or.jp/lotus/), Lohmann et al (2010, précité). Arabidopsis thaliana - The Arabidopsis Information Resource (TAIR) (http://www.arabidopsis.org/); Solanum lympersicum - genome version 3.0.1 (http://solgenomics.net/organism/Solanumlycopersicum/genome) Typiquement, le domaine extracellulaire d'un récepteur kinase à motifs LysM utilisable conformément à l'invention est capable de se lier à au moins un LCO choisi parmi les facteurs Nod et les facteurs Myc-LCO, avec une constante de dissociation (Kd), inférieure ou égale à 100 nM, de préférence inférieure ou égale à 50 nM, et de manière tout à fait préférée inférieure ou égale à 20 nM. Ledit domaine extracellulaire est capable de se lier à au moins un LCO choisi parmi les facteurs Nod et les facteurs Myc-LCO avec une affinité de liaison au moins 50 fois, de préférence au moins 100 fois, avantageusement au moins 200 fois, et de manière tout à fait préférée au moins 500 fois supérieure à son affinité de liaison pour un CO correspondant (c'est-à-dire un CO ayant le même squelette oligochitinique que ledit facteur Nod ou ledit facteur Myc-LCO). Dans le cas d'un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur kinase à motifs LysM, il peut être constitué par le domaine extracellulaire isolé, ou 5 comprendre en outre un ou plusieurs autres domaines, par exemple un domaine transmembranaire (ou une séquence d'ancrage membranaire) et éventuellement un domaine kinase intracellulaire (qui peut soit posséder une activité kinase, soit en être dépourvu). Il peut s'agir le cas échéant d'un polypeptide chimérique, dans lequel le ou les domaine(s) associé(s) au domaine extracellulaire proviennent d'une ou plusieurs autre(s) protéine(s) que 10 le récepteur kinase à motifs LysM dont est issu ledit domaine extracellulaire. Par exemple, le domaine transmembranaire et le cas échéant le domaine kinase intracellulaire, peuvent provenir d'un ou éventuellement de deux récepteur(s) kinase à motifs LysM différent(s) de celui dont provient ledit domaine extracellulaire. Ce ou ces autre(s) récepteur(s) kinase à motifs LysM peuvent être issus d'une plante de la même espèce que celle dont est issu le 15 domaine extracellulaire, ou d'une ou deux plantes d'espèces différentes. La présente invention a pour objet un procédé pour améliorer la réponse d'une plante à au moins un LCO choisi parmi les facteurs Nod et les facteurs Myc-LCO, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite plante par un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM, ou pour un polypeptide comprenant le 20 domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis ci-dessus, et l'expression dudit récepteur ou dudit polypeptide dans ladite plante. L'amélioration de la réponse d'une plante aux facteurs Nod et/ou aux facteurs Myc-LCO peut se traduire notamment par l'amélioration des capacités de nodulation et/ou d'endomycorhization de ladite plante ; elle peut se traduire aussi par une meilleure 25 réponse à un traitement par des facteurs Nod et/ou des facteurs Myc-LCO, permettant d'accroitre un ou plusieurs des effets bénéfiques de ces facteurs, tels que l'amélioration de la germination, du développement racinaire, de la croissance, ou du rendement photosynthétique. Le procédé conforme à l'invention peut être mis en oeuvre par les méthodes 30 usuelles, connues en elles-mêmes, du génie génétique et de la transgénèse végétale. Classiquement, il comprend les étapes suivantes : - la transformation d'une cellule végétale avec un vecteur contenant une cassette d'expression comprenant un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM, ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels 35 que définis ci-dessus, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; - la culture de ladite cellule transformée afin de régénérer une plante ayant dans son génome un transgène contenant ladite cassette d'expression.
Des techniques très nombreuses de transformation de cellules végétales germinales ou somatiques, (isolées, sous forme de cultures de tissus ou d'organe, ou sur la plante entière), et de régénération des plantes sont connues de l'homme du métier. Le choix de la méthode la plus appropriée dépendra généralement de la plante concernée.
La présente invention a également pour objet des constructions d'ADN recombinant permettant l'expression d'un récepteur kinase à motifs LysM ou d'un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis ci-dessus. Il s'agit notamment de cassettes d'expression, comprenant un polynucléotide codant pour ledit récepteur kinase ou ledit polypeptide, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Ledit promoteur peut être le promoteur endogène dudit récepteur kinase à motifs LysM ; dans ce cas, la cassette d'expression peut être avantageusement constituée par la séquence codant pour ledit récepteur kinase, flanquée de 0,5 à 2 kb, de préférence de 1 à 1,5 kb, de séquence génomique en amont.
Alternativement, il peut s'agir d'un promoteur hétérologue. Un large choix de promoteurs appropriés pour l'expression de gènes d'intérêt dans des cellules végétales ou des plantes est disponible dans l'art. Ces promoteurs peuvent être obtenus par exemple à partir de plantes, de virus de plantes, ou de bactéries comme Agrobacterium. Ils incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des tissus et cellules et dans la plupart des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs tissu-spécifiques ou cellule spécifiques, qui sont actifs uniquement ou principalement dans certains tissus ou certains types de cellules, et des promoteurs inductibles qui sont activés par des stimuli physiques ou chimiques.
Des exemples de promoteurs constitutifs qui sont couramment utilisés dans les cellules végétales sont le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit par KAY et al. (Science, 236, 4805, 1987), ou ses dérivés, le promoteur du virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) décrit dans la Demande Internationale WO 97/48819, le promoteur de l'ubiquitine du maïs (CHRISTENSEN & QUAIL, Transgenic Res, 5, 213-8, 1996), du lotier (Ljubql, MAEKAWA et al. Mol Plant Microbe Interact. 21, 375-82, 2008) ou d'Arabidopsis (UBQ10, NORRIS et al. Plant Mol. Biol. 21, 895-906, 1993) ou le promoteur « Actine-Intron-actine » du riz (McELROY et al., Mol. Gen. Genet., 231, 150-160, 1991 ; GenBank numéro d'accès S 44221). Avantageusement, on utilisera un promoteur conférant une expression spécifique ou préférée dans les tissus de la racine ; à titre d'exemples non-limitatifs, on citera le promoteur de l'allothionéine du maïs, (DE FRAMOND et al., FEBS 290, 103-106, 1991; Demande EP 452269), le promoteur de chitinase décrit par SAMAC et al., (Plant Physiol. 93, 907-914, 1990), le promoteur de la glutamine synthétase des racines de soja décrit par HIREL et al. (Plant Mol. Biol. 20, 207-218, 1992), le promoteur RCc3 du riz (Demande PCT WO 2009/016104), le promoteur antiquitine du riz (Demande PCT WO 2007/076115), le promoteur du récepteur kinase LRR décrit dans la Demande PCT WO 02/46439, le promoteur ZRP2 de maïs décrit dans le Brevet US 5,633,363, le promoteur LeExt1 de tomate (BUCHER et al. Plant Physiol. 128, 911-923, 2002), le promoteur pCO2 d'Arabidopsis (HEIDSTRA et al., Genes Dey. 18, 1964-1969, 2004). La présente invention englobe également des vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'une cassette d'expression conforme à l'invention dans un vecteur hôte.
Les cassettes d'expression et vecteurs recombinants conformes à l'invention peuvent, bien entendu, comprendre en outre d'autres séquences, usuellement employées dans ce type de constructions. Le choix de ces séquences sera effectué, de manière classique, par l'homme du métier en fonction notamment de critères tels que les cellules-hôtes choisies, les protocoles de transformation envisagés, etc.
On citera, à titre d'exemples non limitatifs, les terminateurs de transcription, les séquences de tête (leader sequences) et les sites de polyadénylation. Ces séquences n'interviennent pas sur les propriétés spécifiques du promoteur ou du gène auxquelles elles sont associées, mais peuvent améliorer globalement qualitativement ou quantitativement, la transcription, et le cas échéant, la traduction. A titre d'exemples de séquences de ce type fréquemment utilisées chez les plantes, on citera parmi les plus répandues, le terminateur de l'ARN 35S du CaMV, le terminateur du gène de la nopaline synthase, etc. On peut également, dans le but d'augmenter le niveau d'expression, utiliser des séquences amplificatrices (séquences « enhancer » de transcription et de traduction). Parmi les autres séquences couramment employées dans la construction de cassettes d'expression et vecteurs recombinants, on citera également les séquences permettant le suivi de la transformation, et l'identification et/ou la sélection des cellules ou organismes transformés. Il s'agit notamment de gènes rapporteurs, conférant à ces cellules ou organismes un phénotype aisément reconnaissable, ou bien de gènes marqueurs de sélection : seuls les cellules ou organismes exprimant un gène marqueur de sélection déterminé, sont viables dans des conditions données (conditions sélectives). Des gènes rapporteurs fréquemment employés sont par exemple celui de la beta-glucuronidase (GUS), celui de la luciférase, ou celui de la "green or red fluorescent protein" (GFP/RFP) et leurs dérivés. Des gènes marqueurs de sélection sont généralement des gènes de résistance à un antibiotique, ou également, dans le cas des plantes ou des cellules végétales, à un herbicide. Il existe une très grande variété de gènes marqueurs de sélection parmi lesquels l'homme du métier peut effectuer son choix en fonction des critères qu'il aura lui-même déterminés. Le choix du vecteur le plus approprié dépend notamment de l'hôte prévu, et de la méthode envisagée pour la transformation de l'hôte en question. De nombreuses méthodes pour la transformation génétique de cellules végétales ou de plantes sont disponibles dans l'art, pour de nombreuses espèces végétales, dicotylédones ou monocotylédones. A titre d'exemples non-limitatifs, on peut citer la transformation médiée par virus, la transformation par microinjection, par électroporation, la transformation par microprojectiles, la transformation par Agrobacterium, etc. La présente invention englobe également toute cellule-hôte transformée par un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis ci-dessus, ce qui inclut en particulier les cellules hôtes transformées par une cassette d'expression ou un vecteur recombinant conforme à l'invention. On entend par cellule ou organisme transformé par un polynucléotide, toute cellule ou organisme dont le contenu génétique a été modifié par transfert dudit polynucléotide dans ladite cellule ou ledit organisme, quelle que soit la méthode de transfert qui a été utilisée, et que l'information génétique apportée par ledit polynucléotide soit intégrée dans l'ADN chromosomique ou demeure extra-chromosomique. Ladite cellule-hôte peut être une cellule procaryote ou eucaryote. Dans le cas d'une cellule procaryote, il peut notamment s'agir d'une cellule d'Agrobactérie telles qu'Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Dans le cas d'une cellule eucaryote, il peut s'agir notamment d'une cellule végétale, issue d'une plante dicotylédone ou monocotylédone. La construction peut être exprimée transitoirement, elle peut aussi être incorporée dans un réplicon extrachromosomique stable, ou intégrée dans le chromosome. La présente invention a également pour objet une plante transgénique comprenant dans son génome au moins une copie d'un transgène contenant un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis ci-dessus. On définit ici comme plante transgénique une plante transformée chez laquelle l'information génétique exogène apportée par un polynucléotide transformant est intégrée de manière stable dans l'ADN chromosomique, sous forme de transgène, et peut ainsi être transmise aux descendants de ladite plante. Cette définition englobe donc également les descendants des plantes résultant de la transgénèse initiale, dès lors qu'ils contiennent dans leur génome au moins une copie du transgène. Le matériel végétal (protoplastes, cals, boutures, graines, etc...) obtenu à partir des cellules transformées ou des plantes transgéniques conformes à l'invention fait également partie de l'objet de la présente invention. L'invention englobe également les produits obtenus à partir des plantes transgéniques conformes à l'invention, notamment le fourrage, le bois, les feuilles, les tiges, les racines, les fleurs et les fruits. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la caractérisation de la protéine LYR3, et la mise en évidence de son rôle dans la perception des LCOs. EXEMPLE 1: CARACTÉRISATION D'UN SITE DE LIAISON D'AFFINITÉ ÉLEVÉE POUR LES LIPOCHITOOLIGOSACCHARIDES CHEZ MEDICAGO 5 TRUNCATULA. Chez Medicago varia et Phaseolus vulgaris, des sites de liaison présentant une affinité élevée pour les facteurs Nod produits par les symbiotes respectifs de ces 2 plantes, ont été précédemment décrits à partir de la fraction membranaire des cellules en culture, et respectivement dénommés MvNFBS2 et PvNFBS2 (GRESSENT et al., Proc Natl 10 Acad Sci USA, 96, 4704-9, 1999; GRESSENT et al., Mol Plant Microbe Interact, 15, 834-9, 2002). MvNFBS2 et PvNFBS2 sont enrichis dans la membrane plasmique. Toutefois, les protéines correspondant à ces sites NFBS2 n'avaient pas été identifiées. Plus récemment, un site de liaison possédant des propriétés comparables, à savoir une affinité élevée pour le facteur Nod de S. meliloti, NodSm-IV(Ac,S,C16:2A2,9), a été mis en évidence dans la 15 fraction membranaire de cellules en culture de Medicago truncatula (HOGG et al., Plant Physiol., 140, 365-73, 2006). Afin de poursuivre la caractérisation de ce site, des expériences de liaison à l'équilibre de différents chitooligosaccharides (CO) ou lipochitoologosaccharides (LCO) en présence du ligand radioactif LCO-IV (35S, C16:242,9), représentatif d'un facteur Nod de S. 20 mellloti, ont été effectuées. Les composés testés présentent des variations au niveau du squelette chitinique (nombre de résidus saccharidiques) et de ses substitutions (présence ou absence du groupement sulfate) ainsi qu'au niveau de la chaîne d'acide gras (longueur de la chaine et nombre et type d'insaturations) N-acylant le sucre terminal non-réducteur des LCOs. La nomenclature utilisée ici pour désigner ces composés est la suivante : pour les 25 facteurs Nod naturels, l'indication Nod est suivie du nom abrégé de l'espèce bactérienne produisant le facteur Nod concerné; pour les molécules synthétiques, CO désigne un chitooligosaccharide, LCO un lipochitooligosaccharide. Le nombre d'unités saccharidiques est indiqué par un chiffre romain. La nature de la chaîne d'acide gras des LCO, et les éventuelles substitutions sur le squelette oligochitinique (Ac pour 0-acétyl, S pour 30 groupement sulfate) sont précisées entre parenthèses. Ces expériences ont été réalisées avec les fractions membranaires obtenues à partir de cellules en culture du mutant dmi3 de Medicago truncatula (qui n'est capable d'établir ni la symbiose rhizobienne, ni la symbiose endomycorhizienne à arbuscules), car il a été observé qu'elles étaient plus riches en sites de liaison MtNFBS2 que celles des plantes 35 sauvages (HOGG et al., Plant Physiol., 140, 365-73, 2006). Les cellules en culture ont été obtenues à partir de cals de racines de plantes, produites et récoltées comme décrit par GRESSENT et al. (Proc Natl Acad Sci USA, 96, 4704-9, 1999).
Les cellules ont été homogénéisées 6 fois 5 secondes à 4°C dans un broyeur à hélices, dans du tampon d'extraction (Tris-HCI 25 mM pH 8,5, 0,47 M saccharose, 10 mM EDTA, 10 mM dithiothréitol) additionné d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases (0,1 mM (Amino-2-éthyl)-4-benzènesulfonyle fluorure chlorohydrate (AEBSF), antipaine, leupeptine, aprotinine, pepstatine, chymostatine), puis l'homogénat a été traité comme précédemment décrit par GRESSENT et al. (1999, précité). La fraction membranaire qui sédimente à 45000 x g, a été resuspendue dans du tampon de liaison (tampon Na-cacodylate 25 mM pH 6,0, 0,25 M saccharose, 1 mM MgC12, 1 mM CaC12, cocktail d'inhibiteurs de protéases) ajusté à 50% de glycérol et conservé à -80°C.
Pour les expériences de liaison à l'équilibre, 10 à 50 ltg de protéines de fraction membranaire ont été incubées en présence de 0,4, 0,7 ou 2 nM de facteur Nod marqué au 35S, (LCO-IV(35S, C16:2A2,9)) dans du tampon de liaison (volume final 200 La composante de liaison non-spécifique a été déterminée en présence de 2 iM de LCOIV(S, C16:2A2,9).
Les expériences de compétition ont été effectuées en présence de concentrations variables en compétiteurs afin de déterminer leurs affinités (Kd, K,) pour le site de liaison. Toutes les expérimentations ont été effectuées en triplicata. Les mélanges réactionnels ont été incubés pendant 1 heure à 0°C dans des plaques de microtitration à 96 puits (Nunc), filtrés pour séparer le ligand radioactif libre de celui lié, les filtres lavés et leur radioactivité mesurée comme décrit précédemment par GRESSENT et al. (1999, précité). Les données ont été analysées à l'aide du logiciel RADLIG, version 4 (Biosoft, Cambridge, UK). Les résultats de ces expérimentations sont présentés dans le Tableau II ci- dessous. Tableau II Composé Affinité (nM) LCO-IV(S, C16:242,9) 15 LCO-IV(C16:242,9) 15 Myc-LCO: LCO-IV(S, 016:0) 6 Myc-LCO: LCO-IV(S, C18:1,49) 10 Myc-LCO: LCO-IV(C18:14.9) 11 LCO-II(C16:1A9) > 5000 CO-IV > 5000 Le facteur Nod LCO-IV(S, C16:2A2,9), a une affinité élevée (Kd 15 nM) pour le site de liaison, ainsi que son homologue non sulfaté, le LCO-IV(C16:242,9) (K, 15 nM). Les LCOs correspondant à des facteurs Myc-LCOs : LCO-IV(S, C18:1A9) et son homologue non-sulfaté, ainsi que LCO-IV(S, C16:0) sont également reconnus avec une 30 affinité très élevée (K, de 6 à 11 nM). En revanche, le LCO-II(C16:149) et le chitotétraose (CO-IV) ont une affinité très faible (K, de 5 1.iM et K, > 21.1M, respectivement).25 Le site de liaison présent chez Medicago truncatula possède donc des caractéristiques d'affinité et de sélectivité de liaison similaires à celles précédemment observées pour le site MvNFBS2. Il sera dénommé ci-après MtNFBS2. EXEMPLE 2: IDENTIFICATION D'UN POLYPEPTIDE DE 100 KDA 5 CORRESPONDANT À MTNFBS2 Afin d'évaluer la masse moléculaire de la protéine affine des facteurs Nod responsable des propriétés de liaison de MtNFBS2, un photomarquage à l'aide d'analogues de facteurs Nod, contenant un groupement photoactivable, qui après irradiation à une longueur d'onde donnée forme une espèce réactive pouvant établir une liaison covalente avec 10 les molécules environnantes, a été effectué. La structure chimique des analogues choisis est représentée sur la Figure 1. Ils contiennent un groupement photoactivable azoture (Figure 1 A) ou benzophénone (Figure 1B), activés respectivement à 254 et 380 nm, et il a été vérifié que leur affinité pour MtNFBS2 était comparable à celle de LCO-IV(S, C16:2A2,9). Des homologues non-sulfatés de ces molécules ont été synthétisés et marqués au 35S pour 15 permettre de détecter le complexe stable ligand/protéine affine. Pour le photomarquage, 5 nM de ligand radioactif et photoactivable, seul ou en présence d'un excès (2 itM) de différents compétiteurs, ont été incubées dans du tampon de liaison, dans les mêmes conditions que celles décrites à l'Exemple 1 ci-dessus pour les expériences de liaison à l'équilibre, avec 300 ttg de protéines de fraction membranaire 20 obtenues à partir de cellules en culture de Medicago truncatula de type sauvage (A17), ou du mutant dmi3 de Medicago truncatula. Après 1 heure d'incubation, les échantillons ont été irradiés pendant 5 min. à 254 nm ou 10 min. à 365 nm avec un tube fluorescent à une distance de 4 cm. Le ligand libre a été éliminé par centrifugation, et le culot membranaire a été lavé 2 fois dans le tampon de liaison. 25 Les protéines du culot membranaire ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% en présence de SDS, et transférées sur membrane de nitrocellulose, et la détection a été effectuée par autoradiographie. L'autoradiographie obtenue avec le ligand contenant le groupement azoture est représentée sur la Figure 2. Une protéine de poids moléculaire apparent proche de 100 kDa est 30 détectable dans la fraction membranaire obtenue à partir des cellules du mutant dmi3. la liaison du ligand radiomarqué à ce polypeptide est complètement abolie quand l'incubation est effectuée en présence d'un excès de LCO-IV(S, C16:2A2,9). La liaison est également inhibée en présence d'un excès de facteurs Myc-LCOs sulfatés ou non (LCO-IV(S, C18:149 et LCO-IV(C18:149), mais pas en présence d'un excès du chitooligosaccharide 35 correspondant (CO-IV). L'absence de marquage spécifique dans la fraction membranaire obtenue à partir des cellules de la plante sauvage suggère que le polypeptide de 100 kDa y est présent en quantité inférieure au seuil de détection.
Les mêmes résultats (non montrés) ont été obtenus avec le ligand radioactif contenant le groupement benzophénone. Le fait que le polypeptide de 100 kDa soit détecté dans la fraction membranaire de cellules en culture de dm13 mais pas dans celle des plantes de type sauvage, qu'il se lie sélectivement aux LCOs par rapport aux COs, et qu'il reconnaisse de la même manière les LCOs sulfatés ou non, suggère qu'il correspond à la protéine impliquée dans le site MtNFBS2. EXEMPLE 3: IDENTIFICATION ET CARACTÉRISATION D'UN RÉCEPTEUR KINASE À MOTIFS LysM CORRESPONDANT À MTNFBS2 Dans le but d'identifier des protéines candidates pouvant correspondre au polypeptide de 100 kDa, des approches protéomiques et transcriptomiques ont été effectuées. Plusieurs protéines candidates ont été identifiées sur la base de leur poids moléculaire apparent et d'un niveau d'expression plus important chez les cellules en culture de dm13 que chez celles issues de plantes de type sauvage.
Parmi ces protéines figuraient des récepteurs kinase à motifs LysM : LYR3, LYK9, et LYR6. Comme il est connu que les protéines de cette famille sont impliquées dans la perception de molécules contenant un squelette chitinique, ces récepteurs ont été choisis pour la suite des expérimentations. Les gènes LYR3, LYK9, et LYR6 ont été insérés dans un vecteur binaire, en fusion C-terminale avec une protéine fluorescente (Yellow Fluorescent Protein :YFP) et introduits dans des feuilles de Nicotiana benthamiana par agroinfiltration à l'aide d' Agrobacterium tumefaciens. Parallèlement, les gènes NEF et LYK3 qui codent pour des récepteurs putatifs de facteurs Nod et LYR4 ont été insérés dans les mêmes vecteurs et exprimés dans les mêmes conditions.
Pour la construction des vecteurs binaires, la technologie GATEWAY (Invitrogen) a été utilisée. Pour chacun des gènes choisis, la séquence codante complète a été amplifiée par PCR à l'aide d'amorces spécifiques de cette séquence et contenant les sites de recombinaison attB1 et attB2 puis introduite par recombinaison BP dans le vecteur d'entrée pDONR 207 (INVITROGEN). Le clone pENTR recombinant ainsi obtenu a ensuite été recombiné avec le vecteur pBin19-35S-GW-YFP (FROIDURE et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107, 15281-86, 2010; CANONNE et al., Plant Cell, 23, 3498-511, 2011) pour générer le vecteur binaire utilisé pour transformer les plantes. Ce vecteur a été introduit par électroporation dans la souche LBA4404 d' Agrobacterium tumefaciens qui porte le plasmide ternaire pBBRv1rGN54D (VAN DER FITS et al., Plant Molecular Biology, 43, 495-502, 2000). Les bactéries transformées ont été cultivées pendant une nuit à 28°C en milieu YEB (5 g/1 Bacto peptone, 5 g/1 extrait de boeuf, 5 g/1 saccharose, 1 g/1 extrait de levure, 2 mM MgSO4) complémenté avec 10 tg/ml de rifampicine, 40 14/m1 de gentamycine, et 50 tg/ml de kanamycine. Elles ont ensuite été récoltées, lavées 3 fois avec une solution 10 mM Acide 2-morpholino éthanesulfonique (MES)/10 mM MgC12 (pH 5.6), et incubées dans la même solution additionnée de 1 ltg/ml d'acétosyringone, à une densité optique (600 nm) finale de 0,25, pendant au moins une heure avant l'infiltration dans les feuilles 2, 3, et 4 de plantes de N benthamiana âgés de 4 semaines. Les feuilles ont été observées 72 h après l'agroinfiltration. Dans le cas des protéines recombinantes LYR3/YFP, NFP/YFP, and LYK3/YFP une fluorescence jaune est observée à la périphérie des cellules épidermiques, ce qui suggère une localisation au niveau de la membrane plasmique. Dans le cas de LYK9/YFP, LYR4/YFP, et LYR6/YFP des lésions nécrotiques des feuilles sont observées, ce qui suggère une réaction de type réponse hypersensible, probablement médiée par le domaine kinase de ces proteines, comme déjà observé dans le cas d'autres récepteurs kinase à domaine LysM (MADSEN et al., The Plant Journal, 65, 404-17, 2011). En conséquence, des constructions chimériques, dans lesquelles le domaine 15 transmembranaire et le domaine kinase sont remplacés par le domaine transmembranaire et le domaine kinase inactif de NFP, ont été réalisées pour les protéines LYR3, LYR4, LYK9, et LYR6. Pour ces constructions, la méthode de clonage « Golden Gate » a été utilisée (ENGLER et al., PLOS One, 3(11): e3647, 2008) et le gène chimérique construit a été inséré dans un vecteur binaire pCAMBIA2200 (http://www.cambia.org; GenBank: AF234313.1) 20 modifié, sous contrôle du promoteur 35S. L'introduction du vecteur binaire dans la souche LBA4404 d' Agrobacterium tumefaciens, et l'agroinfiltration des feuilles de N benthamiana ont été effectuées comme décrit ci-dessus, à la seule différence que 25 1.tg/m1 de kanamycine (au lieu de 50) ont été utilisés dans le milieu de culture des bactéries transformées. Les protéines chimériques exprimées par ces constructions contiennent, 25 dans leur portion C-terminale, le domaine transmembranaire et le domaine kinase intracellulaire de NFP, et dans leur portion N-terminale, le domaine extra-cellulaire de LYR3, LYR4, LYK9, ou LYR6. Leur expression dans les feuilles N benthamiana n'a pas engendré de réponse hypersensible. 3 jours après l'agro-infiltration, les feuilles de N benthamiana exprimant 30 les différentes constructions ont été récoltées, et broyées dans l'azote liquide. Des fractions membranaires ont été préparées à partir des broyats, en utilisant le même protocole que celui décrit ci-dessus pour la préparation des fractions microsomales, à ceci près que 0,6 % (p/v) de polyvinyl-polypyrrolidone ont été ajoutés au tampon d'extraction. Après centrifugation à 3000 x g, le surnageant a été collecté et centrifugé à 45000 x g. Le culot résultant (fraction 35 membranaire) a été resuspendu dans du tampon de liaison, et conservé à -80°C en présence de 10% ou 50% de glycérol, jusqu'à utilisation. Les protéines membranaires ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% en présence de SDS, et transférées sur membrane de nitrocellulose, et la détection des protéines recombinantes effectuée à l'aide d'anticorps anti-GFP. Parallèlement, les propriétés de liaison spécifique aux LCOs ont été évaluées par liaison à l'équilibre, comme décrit à l'Exemple 1, en utilisant de 0,8 à 2,4 nM de LCO-IV(35S, C16:242,9) +/- 2 !AM LCO-IV(S, C16:242,9) non marqué, et de 25 .tg à 80 tg de protéines membranaires, selon le niveau d'expression de la protéine marquée avec la YFP. Les résultats sont illustrés par la Figure 3. 1. LYR3, 2. NFP, 3. LYK3, 4. LYR3-NFP, 5. LYR4-NFP, 6. LYR6-NFP, 7. LYK9-NFP. C: extrait des feuilles non transformées. Ces résultats confirment que toutes les protéines recombinantes sont exprimées (Figure 3A), mais que seules celles qui contiennent le domaine extracellulaire de LYR3 se lient au ligand LCO (Figure 3B). La liaison directe de LYR3 aux LCOs a été étudiée par photomarquage. 300 pg de protéines de la fraction membranaire de feuilles de N benthamiana soit transformées par le vecteur exprimant la protéine LYR3-YFP, soit non-transformées (C) ont été incubés en présence du ligand radioactif et photoactivable contenant le groupement azoture, en présence ou en l'absence de compétiteurs, en utilisant le protocole décrit à l'Exemple 2 ci-dessus. Les résultats sont illustrés par la Figure 4. Ces résultats montrent le marquage sélectif d'une protéine de masse moléculaire apparente de 130 kDa, correspondant à la masse moléculaire attendue de la protéine LYR3-YFP. Les expériences de compétition effectuées en présence du facteur Nod LCO-IV(S, C16:242,9), de Myc-LCO sulfaté ou non, (LCO-IV(S, C18:149), ou LCOIV(C18:149) et de chitotétraose (CO-IV), montrent que, comme pour le site MtNFBS2, la liaison est spécifique des LCOs par rapport aux COs. Pour mieux caractériser les propriétés de liaison de la protéine LYR3, des expérimentations de liaison à saturation de LCO-IV(35S, C16:242,9) et de liaison compétitive en présence de différents COs ou LCOs ont été effectuées. Les résultats sont illustrés sur la Figure 5, ainsi que dans le Tableau III ci-dessous, qui à titre de comparaison, reprend également les résultats observés dans les mêmes expérimentations avec le site MtNFBS2.
Tableau III Composés Affinité (nM) pour LYR3 Affinité (nM) pour MtNFBS2 LCO-IV(S,C16 :242,9) 25 +/- 3 15 +/- 2.5 correspondant à l'homologue radioactif LCO-IV(S,C18 :242,9) 7+/-1.5 2 Myc-LCO: LCO-IV(S,C16 :0) 26 +/-5 6 Myc-LCO : LCO-IV(S,C18 :149) 13,5 +/- 3 10 LCO-IV(S,C16 :1A9) 21 +/- 2 Myc-LCO : LCO-IV(C16 :0) 15 +1-2 Myc-LCO : LCO-IV(C18 :1A9)) 22 +/- 6 11 LCO-IV(C16 :242,9) 30+/- 6 15 +/- 3 LCO-II(C16 :149) >5000 >5000 LCO-III(C16 :149) 79 LCO-IV(S,C16 :149) 21 LCO-V(C16 :149) 4,3 CO-IV > 5000 > 5000 CO-V 12 000 CO-VI 1200 La Figure 5 montre les résultats de diverses expérimentations effectuées avec la protéine LYR3-YFP exprimée dans les feuilles de N. benthamiana : 5a) : courbe de Scatchard d'une expérience de liaison à saturation avec LCO-IV(35S, C16:2A2,9) ; 5 b)-e) : expériences de liaison à l'équilibre avec 0,9 nM LCO-IV(35S, C16:2A2,9) comme ligand marqué, et des concentrations variables de divers LCOs et COs compétiteurs ; b) MycLCOs; c) LCOs avec un nombre variable de résidus GlcNAc ; d) COs avec un nombre variable de résidus GlcNAc ; e) LCOs différant par la longueur de la chaine d'acide gras, et sulfatés ou non sur le sucre terminal non réducteur.
L'analyse de Scatchard montre la présence d'une seule classe de sites de liaison, avec une affinité Kd = 25 nM pour le facteur Nod LCO-IV(S, C16:2A2,9), similaire à celle de MtNFBS2 (Kd = 15 nM). Tous les Myc-LCOs testés présentent une affinité similaire (Fig 5b, Tableau II). La longueur de la chaine oligosaccharidique a une influence sur les propriétés de liaison à la protéine LYR3: le LCO-V a une affinité légèrement plus élevée que le LCO-IV, et la liaison du LCO-II est très faible (Fig 5c, Tableau III). Tous les COs testés présentent également une affinité très faible (Fig 5d, Tableau III). L'augmentation de la longueur de la chaîne d'acide gras de C16:2 à C18:2 induit une augmentation d'environ 3 fois de l'affinité (Fig. 5e). En revanche, LYR3 ne montre pas de sélectivité importante vis-à-vis de la structure de la chaîne d'acide gras, car des LCOs avec des chaines en C16 contenant 0, 1 ou 2 insaturations ont des affinités similaires (Tableau III), et les différences d'affinité entre les Myc-LCOs (C16:0 ou C18:1A9) et les facteurs Nod (C16:2,A2,9), qui portent des chaînes d'acide gras différentes, sont peu importantes (inférieures à 2 fois). De même, la sulfatation sur le sucre terminal non-réducteur n'affecte pas non plus significativement les propriétés de liaison (Fig. 5e, Tableau III). Le peptidoglycane, qui constitue un ligand pour certaines protéines à domaine LysM (WILLMANN et al., Proc Natl Acad Sei U S A, 108, 19824-9) a également été testé dans des expérimentations de liaison à l'équilibre; aucune compétition avec le LCO radioactif pour la liaison à LYR3 n'a été observée (résultats non montrés).
Claims (3)
- REVENDICATIONS1) Utilisation d'un polynucléotide choisi parmi : - un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM dont le domaine extracellulaire flanqué du peptide signal possède au moins 40%, et par ordre de préférence croissante, au moins 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 98% d'identité de séquence, et au moins 60%, et par ordre de préférence croissante, au moins 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec la région 1-274 de la protéine LYR3 de Medicago truncatula de séquence SEQ ID NO: 1 ; - un polynucléotide codant pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur kinase à motifs LysM; pour améliorer la réponse d'une plante à au moins un LCO choisi parmi les facteurs Nod et les facteurs Myc-LCO.
- 2) Procédé pour améliorer la réponse d'une plante à au moins un LCO choisi parmi les facteurs Nod et les facteurs Myc-LCO, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite plante par un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM, ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis dans la revendication 1, et l'expression dudit récepteur ou dudit polypeptide dans ladite plante. ) Cassette d'expression, comprenant un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM, ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis dans la revendication 1, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. 4) Vecteur recombinant contenant une cassette d'expression selon la revendication
- 3. 5) Cellule-hôte transformée par un polynucléotide codant pour un récepteur 25 kinase à motifs LysM, ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que définis dans la revendication 1. 6) Plante transgénique, comprenant dans son génome au moins une copie d'un transgène contenant un polynucléotide codant pour un récepteur kinase à motifs LysM, ou pour un polypeptide comprenant le domaine extracellulaire dudit récepteur, tels que 30 définis dans la revendication 1.
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