FR2984076A1 - Surproduction de jasmonates dans des plantes transgeniques - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique permettant la synthèse de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc chez une plante pour induire, chez cette plante, une accumulation d'acide jasmonique et/ou d'OPDA. L'accumulation d'acide jasmonique et/ou d'OPDA confère, en particulier, à la plante transformée, une résistance améliorée aux bioagresseurs. Les acides nucléiques et méthodes de transformation selon l'invention peuvent être utilisés pour augmenter la production, par les plantes, de métabolites secondaires présentant un intérêt pharmaceutique et dont la synthèse est induite par les jasmonates.

Description

Surproduction de Jasmonates dans des Plantes Transgéniques Domaine de l'Invention La présente invention concerne l'amélioration des plantes, et notamment l'amélioration de la résistance des plantes aux bioagresseurs, par augmentation de la production d'acide jasmonique et/ou d'OPDA dans ces plantes. Contexte de l'Invention La lutte contre les maladies de plantes est une préoccupation majeure de l'agriculture. On estime qu'au niveau mondial environ un tiers des récoltes est détruit au champ ou lors du stockage par des agents pathogènes (insectes, virus, bactéries, oomycètes ou champignons). Cela se traduit par des pertes économiques considérables et, peut, dans certaines régions du globe, conduire à des problèmes de sous-alimentation ou de malnutrition des populations. Au fil du temps, plusieurs approches ont été développées pour lutter contre les maladies de plantes, la plus ancienne étant l'approche chimique qui fait appel aux pesticides, tels que les fongicides, bactéricides, nématocides, virucides et insecticides. Bien qu'efficace, l'utilisation de molécules issues de l'industrie chimique est généralement associée à des problèmes de pollution et à des risques potentiels pour la santé humaine et animale. De plus, de nombreux phytopathogènes d'origine virale ou bactérienne ne sont pas sensibles aux produits chimiques actuellement disponibles sur le marché, et certains champignons pathogènes, acariens, nématodes et insectes peuvent supporter sans dommage de fortes doses de pesticides. Des alternatives aux traitements chimiques ont, depuis, été mises au point et sont couramment utilisées au champ ou arrivent peu à peu sur le marché. Il faut citer, en particulier, la lutte biologique qui emploie des organismes prédateurs naturels contre les agents pathogènes de plantes; l'amélioration génétique des plantes qui demeure l'une des méthodes de choix lorsqu'on a identifié des gènes de résistance ou de tolérance stables qui peuvent être introduits dans le matériel héréditaire des plantes; et les méthodes fondées sur la résistance naturelle des plantes aux maladies provoquées par les ravageurs. La résistance naturelle des plantes aux maladies provoquées par les ravageurs est souvent initiée par la reconnaissance spécifique d'un pathogène donné, et particulièrement par la reconnaissance de molécules appelées "éliciteurs" ou "effecteurs" présentes à la surface des pathogènes ou excrétées par ceux-ci. Cette reconnaissance conduit à une - 1 - induction rapide des mécanismes de défense de la plante qui limitent la multiplication et la propagation du pathogène dans les différents tissus végétaux. Des travaux ont montré que l'application d' éliciteurs sur une plante augmente la résistance de celle-ci aux bioagresseurs en activant préventivement ses réactions de défense. Cette stimulation des défenses naturelles a ouvert la voie à de nouvelles approches en matière de lutte contre les maladies des plantes et suscite de plus en plus d'intérêt. Cependant, les éliciteurs présentent le désavantage d'avoir un spectre d'action limité et un coût encore trop élevé. La reconnaissance des éliciteurs résulte généralement en la biosynthèse d'une ou de plusieurs molécules secondaires de signalisation cellulaire, les plus importantes étant: l'acide jasmonique (Memelink et al., Trends Plant Sci., 2001, 6 : 212-219; Turner et al., Plant Cell, 2002, 14 (suppl.): S153-S164), l'éthylène (Wang et al., Plant Cell, 2002, 14 (suppl.): S131-S151; Guo et al., Curr. Opin. Plant Biol., 2004, 7: 40-49) et l'acide salicylique (Shah, Curr. Opin. Plant Biol., 2003, 6: 365-371). La production de ces composés génère un réseau de signalisation conduisant à une cascade d'évènements responsables de l'adaptation physiologique des plantes aux stress externes. Les recherches actuelles visent à identifier des signaux activant tout ou une partie de ces éléments de défense naturelle dans le but de développer de nouvelles stratégies phytosanitaires plus respectueuses de l'environnement que les méthodes chimiques. Un certain nombre de ces recherches concerne l'acide jasmonique qui joue un rôle essentiel dans les interactions plantes-insectes, plantes-bactéries et plantes-champignons en augmentant la défense de plantes (McConn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 5473-5477; Dong, Curr. Opin. Plant Biol., 1998, 1: 316-323; Penninckx et al., Plant Cell, 1998, 10: 2103-2113; Thomma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95: 1510715111; Vijayan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95: 7209-7214). L'acide jasmonique et ses précurseurs et dérivés, collectivement dénommés "jasmonates", constituent une famille de composés synthétisés à partir d'acide linoléique membranaire via la voie métabolique des octadécanoïdes (Turner et al., Plant Cell, 2002, 14 (suppl.): S153-S164; Atallah et al., In Encyclopedia of Plant and Crop Science, 2004, R.M. Goodman (Ed), New York: Marcel Dekker Inc, pp. 1006-1009). Le développement, chez Arabidopsis, de mutants présentant des déficiences dans certains mécanismes jasmonatedépendants a révélé la complexité de la voie de signalisation de l'acide jasmonique. Cette voie se distingue en particulier par son autorégulation: les gènes de la voie de biosynthèse de l'acide jasmonique pouvant être eux-mêmes activés par les jasmonates (Bonaventure et - 2 - al., Plant J., 2007, 49: 889-898). Plus d'une dizaine de gènes, appelés gènes ORA, qui codent pour des facteurs de transcription du domaine AP2/ERF d'Arabidopsis et dont l'expression est jasmonate-dépendante ont été identifiés (Atallah, PhD thesis, « Jasmonate-responsive AP2-domain transcription factors in Arabidopsis », 2005, Pays- Bas). Les présents demandeurs ont démontré que, contrairement à ce qui est observé chez Arabidopsis thaliana, la surexpression hétérologue du facteur de transcription ORA47 chez le cotonnier induit non seulement une forte accumulation d'OPDA (acide 12-oxophytodiénoïque), un précurseur de l'acide jasmonique, mais également une forte accumulation d'acide jasmonique.

Malgré les progrès réalisés permettant une meilleure compréhension de la fonction de l'acide jasmonique dans la résistance naturelle des plantes, la connaissance des bases moléculaires des mécanismes de régulation contrôlant la voie de signalisation de l'acide jasmonique demeure encore fragmentaire et reste insuffisante pour un développement logique et informé de nouvelles stratégies de lutte contre les maladies des plantes.

Résumé de l'Invention D'une façon générale, la présente invention repose sur l'utilisation de mécanismes de défenses naturelles des plantes impliquant les jasmonates pour améliorer la résistance de ces plantes aux bioagresseurs, et/ou pour augmenter leur production de métabolites secondaires.

En se basant sur une homologie de séquence, les présents demandeurs ont identifié, chez le cotonnier, trois orthologues fonctionnels du gène ORA47 d'Arabidopsis, qu'ils ont nommé GhERF-IIa, GhERF-IIb et GhERF-IIc. Ils ont également montré que la surexpression d'un de ces facteurs chez le cotonnier et chez le tabac induisait une forte accumulation d'acide jasmonique et de son précurseur, OPDA. Comme dans le cas d'ORA47, la surexpression de GhERF-IIc, chez le cotonnier et chez le tabac, s'est révélée résulter en une production d'acide jasmonique plus élevée que la production d'OPDA. Au contraire, la surexpression de GhERF-IIa ou de GhERF-IIb est associée à une production d'OPDA supérieure à la production d'acide j asmonique. Etant donné le rôle important de l'acide jasmonique dans les mécanismes de défense végétale contre les bioagresseurs, la surexpression d'un (ou de plusieurs) de ces facteurs de transcription peut être utilisée pour augmenter la teneur en acide jasmonique et/ou en OPDA dans les plantes et produire ainsi des plantes présentant une résistance améliorée - 3 - aux agents pathogènes. Cette approche a plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes: (1) elle est universelle, (2) elle permet une accumulation in planta de jasmonates, et (3) elle consiste à exploiter des mécanismes de défenses naturelles de plantes dans l'objectif d'une gestion durable des résistances, et de ce fait représente une stratégie plus respectueuse de l'environnement que les méthodes chimiques de lutte contre les maladies des plantes. En conséquence, dans un premier aspect, la présente invention concerne une plante transgénique contenant une séquence nucléotidique exogène permettant l'expression d'un facteur de transcription choisi parmi GhERF-IIa, GhERF-IIb et GhERF-IIc, caractérisée en ce que l'expression du facteur de transcription induit, dans la plante, une surproduction d'acide jasmonique et/ou d'OPDA. Préférablement, la séquence nucléotidique permettant l'expression de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc est intégrée dans le génome de la plante transgénique. Dans certains modes de réalisation, la plante transgénique contient une séquence nucléotidique exogène permettant l'expression du facteur de transcription GhERF-IIa ou GhERF-IIb et est caractérisée par une teneur en OPDA supérieure à la teneur en acide jasmonique. Dans d'autres modes de réalisation, la plante transgénique contient une séquence nucléotidique exogène permettant l'expression du facteur de transcription GhERF-IIc et est caractérisée par une teneur en acide jasmonique supérieure à la teneur en OPDA. Dans encore d'autres modes de réalisation, la plante transgénique contient une séquence nucléotidique exogène permettant l'expression d'une combinaison quelconque des facteurs de transcription GhERF-IIa, GhERF-IIb et GhERF-IIc (ex. GhERF-IIb et GhERF-IIc ou GhERF-IIa et GhERF-IIc). Une plante transgénique selon l'invention est en outre caractérisée en ce qu'elle présente une résistance améliorée à au moins un agent pathogène sélectionné parmi les bactéries, les virus, les champignons, les insectes et les oomycètes, où les bactéries, les virus, les champignons, les insectes et les oomycètes sont capables d'induire une maladie chez une plante. Dans certains modes de réalisation, la plante transgénique appartient à la famille des Malvacées (ex. cotonnier, cacao, okra, etc...), à la famile des Solanacées (ex. tabac, tomate, pomme de terre, aubergines, etc...), à la famille des Rubiacées (ex. café, etc...), à la famille des Poacées ou Graminées (ex. riz, maïs, blé, orge, avoine, seigle, mil, canne à - 4 - sucre, etc...) ou à la famille des Vitacées (ex. vigne, etc...). Dans certains modes de réalisation préférés, la plante transgénique appartient aux genres Gossypium ou Cotoneaster (coton), au genre Nicotiona (tabac), au genre Oryza (riz), au genre Solanum (tomate), au genre Coffra (café), ou au genre Vitis (vigne).

Dans un autre aspect, la présente invention concerne du matériel végétal obtenu ou extrait d'une plante transgénique de l'invention. Le matériel végétal peut être une cellule, une culture de cellules, un protoplaste, un organe, un cal, une graine, une feuille, une tige, une racine, une fleur, un fruit, un tubercule, du pollen, ou une bouture de la plante transgénique. Dans certains modes de réalisation, le matériel végétal est capable de régénérer une plante entière, en particulier une plante transgénique de l'invention. Dans un autre aspect, la présente invention concerne des procédés d'obtention d'une plante transgénique selon l'invention. Dans certains modes de réalisation, le procédé comprend les étapes suivantes: (a) une étape de transformation d'une cellule de plante avec une cassette d'expression ou 15 un vecteur comprenant une séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc, de manière à obtenir une cellule de plante transformée de façon stable; et (b) une étape de culture de la cellule de plante transformée de façon stable de manière à régénérer une plante entière contenant, intégrée dans son génome, une séquence nucléotidique permettant l'expression de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc. Cette 20 étape de culture peut comprendre: la culture de plusieurs cellules transformées de façon stable de manière à régénérer plusieurs plantes; et la sélection, parmi les plantes régénérées de celles qui contiennent, intégrée dans leur génome, une séquence nucléotidique permettant l'expression de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc. Dans d'autres modes de réalisation, le procédé comprend les étapes suivantes: 25 (a) une étape de transformation d'une cellule hôte d' Agrobacterium de manière à obtenir une cellule hôte recombinante; et une étape de transformation d'une plante ou d'une cellule de plante par infection avec la cellule hôte recombinante de manière à obtenir une plante entière contenant, intégrée dans son génome, une séquence nucléotidique permettant l'expression de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc. Cette étape de 30 transformation peut comprendre: l'infection de plusieurs plantes ou de plusieurs cellules de plante avec des cellules hôtes recombinantes, éventuellement la culture de plusieurs cellules de plantes infectées de manière à régénérer plusieurs plantes; et la sélection, - 5 - parmi les plantes infectées ou parmi les plantes régénérées, de celles qui contiennent, intégrée dans leur génome, une séquence nucléotidique permettant l'expression de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc. Pour produire une plante transgénique contenant une séquence nucléotidique exogène permettant l'expression d'une combinaison des facteurs de transcription GhERF- IIa, GhERF-IIb et GhERF-IIc, les procédés de l'invention peuvent comprendre deux ou trois étapes de transformation utilisant chacune une cassette d'expression ou un vecteur comprenant une séquence nucléotidique codant pour l'un des facteurs de transcription de l'invention. Alternativement, les procédés de l'invention peuvent comprendre une seule étape de transformation utilisant une casette d'expression ou un vecteur comprenant une séquence nucléotidique codant pour deux ou trois des facteurs de transcription de l'invention. Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une cassette d'expression ou d'un vecteur comprenant une séquence nucléotidique permettant la synthèse de GhERF-IIa, GhERF-IIb, GhERF-IIc ou d'une de leurs combinaisons chez une plante pour induire, chez cette plante, une surproduction d'acide jasmonique et/ou une surproduction d' OPDA. Dans certains modes de réalisation, la plante surproduisant l'acide jasmonique et/ou OPDA présente une résistance améliorée à au moins un agent pathogène. L'agent pathogène peut être choisi parmi les bactéries, les virus, les champignons, les insectes ou les oomycètes, où les bactéries, les virus, les champignons, les insectes et les oomycètes sont capables d'induire une maladie chez une plante. Il est connu dans l'art que l'acide jasmonique induit, dans différentes espèces de plantes, l'expression de gènes intervenant dans la biosynthèse de métabolites secondaires présentant un intérêt économique en tant que produits pharmaceutiques ou en tant que colorants ou arômes alimentaires. Plusieurs de ces métabolites secondaires appartiennent aux familles des taxoïdes, des phénylpropanoïdes, des flavonoïdes, des anthocyanines, des guaianolides, des anthraquinones, des sesquiterpénoïdes, et des alcaloïdes. En conséquence, dans un autre aspect, la présente invention concerne des plantes transgéniques selon l'invention caractérisées en ce qu'elles surproduisent au moins un métabolite secondaire dont la biosynthèse est induite par l'acide jasmonique. Elle concerne également l'utilisation des méthodes décrites ici pour générer de telles plantes - 6 - transgéniques. Dans certains modes de réalisation préférés, le métabolite secondaire est la nicotine. Une description plus détaillée de certains modes de réalisation préférés de l'invention est donnée ci-dessous.

Description Détaillée de l'Invention Comme mentionné ci-dessus, la présente invention concerne la transformation d'une plante pour induire, chez cette plante, une surproduction ou accumulation d'acide jasmonique et/ou d' OPDA. La transformation inclut l'utilisation d'une cassette d'expression ou d'un vecteur permettant, chez la plante transformée, la synthèse d'un facteur d'expression de transcription du cotonnier, ce facteur de transcription étant GhERF-IIa, GhERF-IIb, GhERF-IIc, ou une combinaison de ces facteurs de transcription. I - Cassettes d'Expression et Vecteurs permettant la Surproduction de Jasmonates chez une Plante Une cassette d'expression (ou un vecteur) selon l'invention comprend une séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc (ou une de leurs combinaisons). Comme mentionné plus haut, GhERF-IIa, GhERF-IIb et GhERF-IIc ont été identifiés comme des orthologues fonctionnels du gène AtORA47 d' Arabidopsis thaliana, qui code pour ORA47, un facteur de transcription (c'est-à-dire une protéine capable de moduler l'expression des gènes) appartenant à la famille AP2/ERF et dont l'expression entraîne l'induction coordonnée de plusieurs gènes codant pour des enzymes de la voie de biosynthèse des jasmonates. Séquence Nucléotidique Codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc Dans la mise en oeuvre de l'invention, la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc peut être n'importe quelle séquence nucléotidique dont la transcription résulte en la protéine GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 3, respectivement) ou un polypeptide homologue. Préférablement, la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERFIIb ou GhERF-IIc comprend, ou consiste en, la séquence SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 6, respectivement, ou une de leurs séquences homologues résultant de la dégénérescence du code génétique. Alternativement, la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc comprend, ou consiste en, une séquence - 7 - homologue de la séquence SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, respectivement et codant pour un polypeptide homologue à GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc. Alternativement encore, la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc comprend, ou consiste en, une séquence nucléotidique complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, respectivement ou d'une de leurs séquences homologues; une séquence nucléotidique modifiée de la séquence SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 ou d'une de leurs séquences homologues; ou un fragment représentatif d'une des séquences nucléiques précédentes (par exemple, un cadre ouvert de lecture).

Les termes "séquence nucléotidique", "acide nucléique", "séquence nucléique", "polynucléotide" et "oligonucléotide" sont ici employés indifféremment. Par ces termes, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir une région d'un acide nucléique, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin ou un ADN simple brin qu'à des produits de transcription de ces ADNs.

Par "séquence nucléotidique homologue" d'une séquence particulière (par exemple, de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 6), on entend toute séquence nucléotidique qui diffère de la séquence particulière par substitution, délétion, et/ou insertion d'un nucléotide ou d'un nombre réduit de nucléotides, à des positions telles que ces séquences nucléotidiques homologues codent pour des polypeptides homologues à GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc et en particulier à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3. De préférence, une telle séquence nucléotidique homologue a un pourcentage d'identité tel qu'elle est identique à au moins 75% de la séquence SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, préférablement au moins 85%, plus préférablement encore au moins 95%.

Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences nucléotidiques ou deux séquences peptidiques, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après alignement optimal. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties au hasard et sur toute la longueur de la séquence. Les termes "alignement optimal" et "meilleur alignement", qui sont utilisés de façon interchangeable ici, désignent l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme décrit ci-dessous est le plus élevé. L'alignement optimal des séquences, nécessaire à la comparaison, peut être réalisé manuellement ou au moyen de logiciels informatiques - 8 - (GAP, BESTFIT, BLASTP, BLASTN, FASTA, et TFASTA, qui sont disponibles soit sur le site NCBI, soit dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI). Le pourcentage d'identité entre deux séquences nucléotidiques ou deux séquences peptidiques est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100. Préférablement, dans le contexte de la présente invention, une séquence nucléotidique homologue d'une séquence particulière (par exemple, de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 6) s'hybride spécifiquement à la séquence complémentaire de cette séquence particulière, dans des conditions stringentes (Sambrook et al., "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Par "séquence nucléotidique modifiée" d'une séquence particulière (par exemple, de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 6), on entend, au sens de l'invention, toute séquence nucléotidique obtenue par mutagénèse selon les techniques bien connues de l'homme du métier, et comportant des modifications par rapport à cette séquence particulière, par exemple des mutations dans les séquences régulatrices et/ou promotrices de l'expression du polypeptide, notamment conduisant à une modification du taux d'expression ou d'activité de ce polypeptide. Par séquence nucléotidique modifiée, on entend également toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide (GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc) modifié. Le terme "fragment représentatif' d'une séquence nucléotidique particulière (par exemple, de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 6) désigne tout fragment de cette séquence particulière, qui code pour un polypeptide présentant une activité identique ou similaire à celle de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc. Dans certains modes de réalisation, un fragment représentatif d'une séquence particulière est un cadre ouvert de lecture de cette séquence. L'homme du métier sait identifier un cadre ouvert de lecture. Les techniques pour isoler ou cloner un gène ou une séquence nucléotidique codant 30 pour un facteur de transcription (tel que GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc) sont connues dans l'art et incluent l'isolation à partir d'ADN génomique, la préparation à partir d'ADN complémentaire, ou une combinaison de ces méthodes. Le clonage d'un gène, ou - 9 - d'une séquence nucléotidique codant pour un facteur de transcription, à partir d'un ADN génomique peut être effectué par exemple en utilisant une réaction en chaîne par polymérase (PCR) ou par criblage de librairies d'expression pour détecter les fragments d'ADN clonés avec des caractéristiques structurelles identiques (Innis et al., "PCR: A Guide to Method and Application", 1990, Academic Press: New York). D'autres méthodes d'amplification d'acides nucléiques connues de l'homme du métier peuvent être utilisées, comme par exemple, une réaction en chaîne par ligase (LCR), une transcription activée par ligation (LAT) et la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification).

Cassettes d'expression Dans une cassette d'expression selon la présente invention, la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc est insérée en orientation sens et est préférablement liée à un ou plusieurs éléments permettant son expression et éventuellement sa régulation dans une cellule de plante. Ainsi, préférablement, une cassette d'expression selon l'invention inclut des séquences régulatrices 5' et 3' liées opérationnellement à la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc. Les termes "lié opérationnellement" et "lié de façon opérationnelle" sont utilisés indifféremment et font référence à un lien fonctionnel entre les séquences régulatrices 5' et 3' et la séquence d'acide nucléique qu'elles contrôlent. Une cassette d'expression selon l'invention comprend, dans la direction 5' ->3' de transcription, une région d'initiation de la transcription, la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc, et une région de terminaison de la transcription, qui sont fonctionnelles dans une cellule de plante ou dans une plante. Une telle combinaison est désignée ici par le terme "séquence nucléotidique permettant la synthèse de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc". Promoteurs. La région d'initiation de la transcription est également appelée promoteur. Par "promoteur", on entend tout polynucléotide capable de réguler l'expression, dans une cellule, d'une séquence nucléotidique à laquelle il est lié de façon opérationnelle. Dans le contexte de l'invention, un promoteur est capable d'exercer son action régulatrice dans une cellule de plante (on parle d'un "promoteur végétal"). Ainsi, dans le contexte de l'invention, une séquence régulatrice de type promoteur est une région régulatrice reconnue par une ARN polymérase dans une cellule et capable d'initier la transcription de la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou - 10 - GhERF-IIc dans une cellule de plante. Le promoteur peut être homologue à la cellule de plante hôte ou, alternativement, peut être hétérologue à la cellule de plante hôte. De plus, le promoteur peut être une séquence naturelle (c'est-à-dire une séquence existant dans la nature) ou une séquence synthétique (c'est-à-dire une séquence n'existant pas en tant que telle dans la nature). Dans la mise en oeuvre de l'invention, les promoteurs appropriés incluent, en particulier, les promoteurs constitutifs et les promoteurs tissu-spécifiques. Promoteurs Constitutifs. Dans certains modes de réalisation, une cassette selon l'invention comprend un promoteur constitutif de plante lié de façon opérationnelle à la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc. Par "promoteur constitutif', on entend un promoteur capable d'exprimer des séquences nucléotidiques liées de manière opérationnelle au promoteur, dans tous ou pratiquement tous les tissus de l'organisme hôte et pendant tout le développement de cet organisme. Les promoteurs constitutifs de plantes incluent, sans limitation, le promoteur du virus mosaïque de chou-fleur 35S (CaMV), le promoteur constitutif double 25S (pd35S) du CaMV, le promoteur de synthase nopaline, le promoteur de synthase octopine, le promoteur 19S, le promoteur actine de riz suivi de l'intron actine de riz (PAR-LAR) contenu dans le plasmide pAct-1-F4, le promoteur du gène de l'actine 1 du riz, le promoteur du gène AdH du maïs, le promoteur de l'ubiquitine du maïs, et le promoteur pUbil du gène codant pour l'ubiquitine 1 du maïs. De tels promoteurs peuvent être obtenus à partir d'ADN génomique par PCR, puis ils peuvent être clonés dans une cassette d'expression selon l'invention. Promoteurs Tissu-Spécifiques. Dans d'autres modes de réalisation, l'expression de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc est ciblée à certains tissus de la plante transgénique. Par "promoteur tissu-spécifique" ou "promoteur tissulaire spécifique", on entend un promoteur capable d'exprimer, de manière sélective, des séquences nucléotidiques liées à lui de manière opérationnelle, dans certains tissus spécifiques de l'organisme hôte. Par exemple, l'expression spécifique des tissus peut être accomplie pour une expression préférentielle de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc dans les feuilles et/ou les tiges et/ou la racine de la plante plutôt que dans les graines ou les fruits de la plante (ce qui peut réduire les inquiétudes liées à la consommation humaine d'organismes génétiquement modifiés). L'expression spécifique des tissus peut également être utile dans le cas où le pathogène auquel la plante est naturellement sensible attaque spécifiquement seulement certains tissus de la plante.

Ainsi, dans certains modes de réalisation, une cassette selon l'invention comprend un promoteur tissu-spécifique de plante lié de façon opérationnelle à la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-Ilb ou GhERF-IIc. Plusieurs gènes régulateurs spécifiques de tissus et des promoteurs de tissus utilisables dans les plantes sont connus dans l'art. De tels gènes incluent, sans limitation, les gènes codant pour des protéines de stockage ou de réserve des graines (telles que napine, cruciférine, 13- conglycinine et phaséoline) de type zéine, des gènes impliqués dans la biosynthèse d'acide gras (y compris la protéine ACP - acyl carrier protein, stéaroyle ACP-désaturase, et les désaturases d'acides gras (fad 2-1)), et d'autres gènes exprimés pendant le développement embryonnaire tel que Bce4 (Kridl et al., Seed Science Res., 1991, 1: 209). Les promoteurs spécifiques de tissus qui ont été décrits incluent, sans limitation, la lectine (Vodkin, Prog. Clin. Biol. Res., 1983, 138: 87; Lindstrom et al., Der. Genet., 1990, 11: 160), l'alcool déshydrogénase-1 du maïs (Dennis et al., Nucleic Acids Res., 1984, 12: 983), l'antenne collectrice de lumière du maïs (Bansal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 3654), la protéine de choc thermique du maïs, la petite sous-unité de la ribulose- 1,5-bisphosphate carboxylase du pois, la mannopine synthase du plasmide Ti, la nopaline synthase du plasmide Ti, la chalcone isomérase de pétunia (van Tunen et al., EMBO J., 1988, 7:125), la protéine I riche en glycine du haricot (Keller et al., Genes Dev., 1989, 3: 1639), le CaMV 25S tronqué (Odell et al., Nature, 1985, 313: 810), la patatine de pomme de terre (Wenzler et al., Plant Mol. Biol., 1989, 13: 347), la zéine de maïs (Reina et al., Nucleic Acids Res., 1990, 18: 6425; Kriz et al., Mol. Gen. Genet., 1987, 207: 90; Wandelt et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17 2354), le promoteur PEPC du gène de la phosphoénolpyruvate carboxylase de sorgho (Crétin et al., Gène, 1991, 99: 87-94), le promoteur HMGW du blé (Blechl and Anderson, Nat. Biotech., 1996, 14: 875-879) ou de l'orge et les promoteurs de la chalcone synthase (Franken et al., EMBO J., 1991, 10: 2605). Région de Terminaison de Transcription. Dans la mise en oeuvre de la présente invention, la région de terminaison de transcription présente dans la cassette d'expression peut être de la même origine que (c'est-à-dire homologue à) la région d'initiation de transcription ou la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc, ou bien d'origine différente (c'est-à-dire hétérologue). Des régions de terminaison de transcription sont par exemple disponibles à partir du plasmide T1 d' Agrobacterium tumefaciens, telles que les régions de terminaison de la synthase - 12 - octopine et de la synthase nopaline (An et al., Plant Cell, 1989, 1: 115-122; Guerineau et al., Mol. Gen. Genet., 1991, 262: 141-144; Proudfoot, Cell, 64, 671-674; Sanfacon et al., Genes Dev., 1991, 5: 141-149; Mogen et al., Plant Cell, 1990, 2: 1261-1272; Munroe et al., Gene, 1990, 91: 151-158; Ballas et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17: 7891-7903; and Joshi et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15: 9627-9639). D'autres exemples de régions de terminaison de transcription incluent, sans limitation, le polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (Franck et al., Cell, 1980, 21: 285-294) et le terminateur du gène histone (EP 0 633 317). Autres Séquences Régulatrices. D'autres séquences qui peuvent être présentes dans 10 une cassette d'expression selon l'invention sont des séquences qui augmentent l'expression génique comme les introns, les séquences "enhancer" et les séquences "leader". Les introns dont on sait qu'ils augmentent l'expression génique dans les plantes sont, par exemple, les introns du gène Adhl du maïs, les introns du gène bronzel du maïs 15 (J. Callis et al., Genes Develop., 1987, 1 : 1183-1200), l'intron DSV de la mosaïque jaune du tabac (Morris et al., Virology, 1992, 187: 633), et l'intron actine-1 du riz (McElroy et al., Plant Cell, 1990, 2: 163-171). Les séquences enhancer appropriées incluent, sans limitation, l'activateur de transcription du virus de la mosaïque du tabac TEV (Carrington et al., J. Virol., 1990, 64: 1590-1597). Les séquences leader non-traduites dont on sait 20 qu'elles augmentent l'expression génique dans les plantes sont, par exemple, les séquences leader du virus mosaïque de tabac (TMV), du virus de la marbrure chlorotique du maïs (MCMV), et du virus mosaïque d'alfalfa (AIMV) (Gallie et al., Nucl. Acids Res., 1987, 15: 8693-8711; Skuzeski et al., Plant Mol. Biol., 1990, 15: 65-79). D'autres séquences leader appropriées incluent, sans limitation, le leader EMCV 25 (Encephalomyocarditis 5'noncoding region (Elroy-Stein et al., PNAS USA, 1989, 86: 6126-3130), le leader BiP-protéine de liaison humaine (Macejack et al., Nature, 1991, 353 : 90-94), et le leader AMV RNA 4 provenant de l'ARNm de la protéine de virus de la mosaïque de la luzerne (Jobling et al., Nature, 1987, 325 : 622-625). Si nécessaire ou désiré, la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF- 30 IIb ou GhERF-IIc peut être modifiée pour inclure des codons qui sont optimisés pour l'expression dans la plante transformée (Campbell et al., Plant Physiol., 1990, 92: 1-11; Muray et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17: 477-498; Wada et al., Nucl. Acids Res., 1990, 19: 2367; and brevets U.S. 5,096,825; 5,380,831; 5,436,391; 5,625,136, 5,670,356 et - 13 - ,874,304). Les séquences codon optimisées sont généralement des séquences synthétiques. Séquences Supplémentaires. Dans certains modes de réalisation, une cassette d'expression selon l'invention comprend en outre un ou plusieurs gènes marqueurs. Les gènes marqueurs sont des gènes qui confèrent un phénotype distinctif aux cellules exprimant le gène marqueur, ce qui permet de distinguer les cellules transformées des cellules non-transformées. Ces gènes marqueurs codent pour un marqueur de sélection. Le phénotype distinctif permet l'identification de cellules, de groupes de cellules, de tissus, d'organes, de parties de plantes ou de plantes entières contenant dans leur génome la cassette d'expression. De nombreux exemples de gènes marqueurs sont connus dans l'art. Certains marqueurs confèrent un bénéfice supplémentaire à la plante transgénique, comme par exemple une résistance à un herbicide, à des maladies, à des ravageurs ou au stress environnemental. Des exemples de marqueurs qui confèrent une résistance aux herbicides et qui peuvent être utilisés dans la mise en oeuvre de la présente invention incluent, sans limitation, le gène bar du Streptomyces hygroscopicus qui code pour l'acétylase phosphinothricine (PAT) procurant une résistance au glufosinate; les gènes mutants qui confèrent une résistance à l'imidazalinone ou au sulfonylurée tels que les gènes codant pour la forme mutante des enzymes ALS et AHAS (Lee et al., EMBO J., 1988, 7: 1241; Miki et al., Theor. Appl. Genet., 1990, 80: 449; et brevet U.S. 5,773,702); les gènes qui confèrent une résistance au glycophosphate comme les formes mutantes de la synthase EPSP et aroA, une résistance au L-phosphinothricine comme les gènes de la synthase glytamine, une résistance à la kanamycine comme les gènes nptl et nptll de la phosphotransférase omycine, ou une résistance aux acides phénoxypropioniques et aux cyclohexones comme les gènes codant pour l'inhibiteur ACCAse (Marshall et al., Theor. Appl. Genet., 1992, 83: 435). Les gènes marqueurs qui confèrent une résistance aux maladies et aux ravageurs et qui peuvent être utilisés dans la mise en oeuvre de la présente invention incluent, sans limitation, les gènes codant pour une protéine de Bacillus thuringiensis telle que l'endotoxine-delta (brevet U.S. 6,100,456); des gènes qui codent pour les lectines (Van Damme et al., Plant Mol. Biol., 1994, 24 : 825); des gènes qui codent pour des protéines se liant aux vitamines telles que l'avidine et les homologues de l'avidine qui sont utilisés comme larvicides contre les insectes ravageurs; des gènes codant pour des inhibiteurs de - 14 - protéase ou d'amylase comme l'inhibiteur de la protéinase cystéine du riz (Abe et al., J. Biol. Chem., 1987, 262: 16793) et l'inhibiteur I de la protéinase du tabac (Hubb et al., Plant Mol. Biol., 1993, 21: 985); des gènes codant pour des hormones spécifiques d'insectes ou des phéromones telles que l'hormone ecdystéroïde et l'hormone juvénile et leurs équivalents; des gènes codant pour des peptides ou neuropeptides spécifiques d'insectes qui, en s'exprimant perturbent la physiologie du ravageur; des gènes codant pour du venin spécifique d'insectes; des gènes codant pour des enzymes responsables de l'accumulation de monoterpènes, sesquiterpènes, astéroïde, acide hydroxamique, dérivé de phénylpropanoide ou d'autres molécules non-protéiniques présentant une activité insecticide; des gènes codant pour des enzymes impliqués dans la modification de l'activité biologique d'une molécule (brevet U.S. 5,539,095); des gènes codant pour des peptides hydrophobiques tels que des dérivés de Tachyplesine qui inhibent des pathogènes fungiques; des gènes codant pour une protéine invasive virale ou une toxine dérivée (Beachy et al., Ann. Rev. Phytopathol., 1990, 28 : 451); et des gènes codant pour un anticorps ou une antitoxine spécifique d'insectes ou un anticorps spécifique de virus (Tavladoraki et al., Nature, 1993, 366 : 469). Les gènes marqueurs qui confèrent une résistance au stress environnemental et qui peuvent être utilisés dans la mise en oeuvre de l'invention incluent, sans limitation, mtld et HVAI ; rd29A et rd19B qui sont des gènes d' Arabidopsis thaliana codant pour des protéines hydrophiles qui sont induites en réponse à la déshydratation, les basses températures, le stress dû à la salinité, ou une exposition à l'acide abscissique (Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Cell, 1994, 6: 251-26). D'autres exemples de tels gènes sont décrits dans les brevets U.S. 5,296,462 et U.S. 6,356,816. Alternativement, un gène marqueur peut provoquer, chez les cellules de plante ou chez les plantes transformées une réponse visible (par exemple une apparence distinctive telle qu'une couleur ou une croissance différente, par rapport aux cellules de plante ou aux plantes qui n'expriment pas le gène marqueur). Ces gènes marqueurs codent pour un rapporteur. Il est connu dans l'art que les activateurs de transcription de la biosynthèse d'anthocyanine, liés opérationnellement à un promoteur approprié dans une cassette d'expression, sont de grande utilité en tant que marqueurs non-phytotoxiques pour la transformation de cellules de plante. La localisation d'une protéine peut être altérée en modifiant la séquence nucléotidique codant pour la protéine par addition d'une région codant pour un peptide - 15 - signal. Pour l'addition de séquences codant pour de tels peptides signal, l'homme du métier peut se référer, par exemple, aux documents suivants (Dai et al., Trans. Res., 2005, 14: 627; Keegstra et al., Physiol. Plant., 1995, 93: 157-162; Zoubenko et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22: 3819-3824; Jones et al., Plant. Physiol., 1993, 101: 595-606; Nhakamura et al., Plant. Physiol., 1993, 101: 1-5; Hemon et al., Plant Molecular Biology, 1990, 15: 895-904; Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 4144-4184; Thoma et al., Plant. Physiol., 1994, 105: 35-45; ou WO 88/02402). Une cassette d'expression selon l'invention peut également comprendre toute autre séquence nucléotidique qui, après transcription, confère à la plante transformée obtenue une propriété désirable supplémentaire. Les exemples de propriétés désirables supplémentaires des plantes transformées selon l'invention incluent, sans limitation, la capacité d'adaptation de croissance dans différentes conditions de climats et/ou de sols; l'incorporation de caractéristiques de bio-confinement comme par exemple des fleurs stériles (males uniquement ou bien males et femelles); l'incorporation de caractéristiques de phytoremédiation; et une biomasse augmentée. Vecteurs Dans certains modes de réalisation de l'invention, la cassette d'expression est insérée dans un vecteur approprié. On entend ici par "vecteur" une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou de double brin. Un vecteur recombinant selon l'invention est de préférence un vecteur d'expression ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation ou un vecteur d'intégration. Le vecteur peut être d'origine bactérienne ou virale. Dans tous les cas, dans un vecteur selon l'invention, la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc est placée sous le contrôle d'une ou de plusieurs séquences contenant des signaux de régulation de son expression dans la plante considérée, comme mentionné ci-dessus. Dans certains modes de réalisation, les signaux de régulation sont tous contenus dans la cassette d'expression insérée dans le vecteur. Dans d'autres modes de réalisation, un ou plusieurs signaux de régulation sont contenus dans la casette d'expression et un ou plusieurs autres signaux sont contenus dans le vecteur. Dans encore d'autres modes de réalisation, tous les signaux de régulation sont contenus dans le vecteur. - 16 - Un vecteur recombinant selon l'invention comprend avantageusement des séquences appropriées d'initiation et d'arrêt de la transcription. En outre, un vecteur recombinant selon l'invention peut inclure une ou plusieurs origines de réplication fonctionnelle chez les plantes dans lesquelles leur expression est désirée, ainsi que, le cas échéant, des séquences nucléotidiques marqueurs de sélection. Les vecteurs recombinants selon l'invention peuvent aussi inclure un ou plusieurs signaux de régulation de l'expression tels que définis ci-dessus. Dans certains modes de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est un vecteur intégratif permettant l'insertion de multiples copies fonctionnelles de la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc dans le génome de la plante. De préférence, un vecteur selon l'invention sera choisi parmi ceux spécialement adaptés à l'expression de séquences d'intérêt dans des cellules de plante, tels que le vecteur pCAMBIA 1302 (Hajdukiiewicz et al., Plant Mol. Biol., 1994, 25: 989-994) et les vecteurs commercialisés par Clontech; le vecteur pBIN19 (Bevan et al., Nucleic Acids Res., 1984, 12: 8711-8721), le vecteur pBI 101 (Jefferson, Plant Mol. Biol. Report., 1987, 5: 387-405), le vecteur pBI 121 (Jefferson, Plant Mol. Biol. Report., 1987, 5: 387-405) et le vecteur pEGFP (Yang et al., Nat. Biotechnol., 1996, 14 : 1246-1251, Yang et al., Nucleic Acids Res., 1996, 24: 4592-4593). Le plus souvent, les vecteurs utilisés pour la transformation génétique existent sous forme de plasmides. Dans ce cas, le "plasmide" est une molécule d'ADN circulaire autonome capable de réplication dans une cellule. Si un micro-organisme ou une culture cellulaire recombinante est décrit comme hôte d'un plasmide d'expression, celui-ci comprend à la fois des molécules d'ADN circulaires extrachromosomiques et de l'ADN ayant été intégré au(x) chromosome(s) hôte(s). Si le plasmide est maintenu dans une cellule hôte, le plasmide est soit répliqué de manière stable par les cellules pendant la mitose en tant que structure autonome, soit intégré au génome de l'hôte. Les plasmides qui peuvent être utilisés dans la mise en oeuvre de la présente invention incluent, sans limitation, les plasmides Ti d'Agrobacterium tumefaciens (Darnell, Lodish, Baltimore, "Molecular Cell Biology", 2nd Ed., 1990, Scientific American Books: New York), un plasmide comprenant un gène de P-glucuronidase et un promoteur du virus mosaïque de chou-fleur (CaMV) avec une séquence leader du virus mosaïque d' alfalfa (Sanford et al., Plant Mol. Biol., 1993, 22: 751-765) et un plasmide comprenant un gène bar cloné downstream d'un promoteur CaMV 35S avec une séquence leader du virus mosaïque de - 17 - tabac (TMV). Certains plasmides peuvent contenir des introns, tels que ceux dérivés de l'alcool déhydrogénase (Adh 1), et d'autres séquences ADN. La taille du vecteur n'est pas un facteur limitant. Pour les cassettes d'expression ou les vecteurs destinés à être utilisés dans des transformations par l'intermédiaire d' Agrobacterium tumefaciens, le plasmide peut comprendre une origine de réplication qui permet une réplication dans Agrobacterium et un nombre élevé d'origines de réplication fonctionnelles dans E. Coli. Cela permet une production et un test faciles de transgènes dans E. Coli avant le transfert à l'Agrobacterium pour une introduction subséquence dans les plantes.

Comme le reconnaîtra l'homme du métier, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention peut comprendre une séquence nucléotidique codant pour un seul des facteurs de transcription GhERF-IIa, GhERF-IIb et GhERF-IIc, ou peut comprendre des séquences nucléotidiques codant pour deux des facteurs de transcription ou pour les trois. Préparation de Cassettes d'Expression et de Vecteurs Une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention peut être préparé par n'importe quelle méthode appropriée, la méthode d'obtention de la cassette ou du vecteur n'étant pas un élément critique ou limitant de l'invention. Des méthodes de préparation de telles constructions d'acide nucléique sont connues dans l'art et ont, par exemple, été décrites dans plusieurs ouvrages de référence comme Sambrook, Fritsch et Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manuaf', 1989, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, et Silhavy, Berman, et Enquist, "Experiments with Gene Fusions", 1984, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor; F.M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", 1989, John Wiley & Sons: New York.

II - Méthodes de Préparation de Plantes Présentant une Surproduction de Jasmonates Les cassettes d'expression ou les vecteurs décrits ci-dessus peuvent être utilisés pour obtenir des plantes transgéniques présentant une surproduction ou une accumulation d'acide jasmonique et/ou d'OPDA. En conséquence, un aspect de la présente invention concerne des méthodes de préparation de telles plantes transgéniques. On entend par "plante transgénique" une plante ayant été obtenue par des techniques de manipulation génétique. Plus spécifiquement, une plante transgénique est une plante dont au moins une - 18 - cellule contient des séquences nucléotidiques exogènes introduites par l'intermédiaire d'une intervention humaine. Typiquement, les plantes transgéniques expriment des séquences ADN qui confèrent à ces plantes un ou plusieurs caractères différents de ceux de plantes non-transgéniques de la même espèce.

D'une façon générale, la présente invention fournit une méthode pour obtenir une plante transgénique surproduisant de l'acide jasmonique et/ou de l'OPDA. Cette méthode comprend la transformation d'une plante en utilisant une cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERFIIc, ou un vecteur contenant ladite cassette d'expression. Les termes "surproduction d'acide jasmonique" et "accumulation d'acide jasmonique" sont ici utilisés de façon interchangeable et désignent une production ou une accumulation d'acide jasmonique dans la plante transformée qui est supérieure à la production ou à l'accumulation d'acide jasmonique dans une plante non-transformée de la même espèce et au même stade de développement. Dans certains modes de réalisation, la production d'acide jasmonique dans la plante transformée est au moins 2 fois supérieure à celle dans la plante non- transformée, préférablement au moins 5 fois, au moins 10 fois, au moins 25 fois, au moins 50 fois, au moins 75 fois, au moins 100 fois, ou plus de 100 fois supérieure à la production ou l'accumulation d'acide jasmonique dans la plante non-transformée. De même, le terme "surproduction d'OPDA", "accumulation d'OPDA" et les termes apparentés désignent une production ou une accumulation d'OPDA dans la plante transformée qui est supérieure à la production ou à l'accumulation d'OPDA dans une plante non-transformée de la même espèce et au même stade de développement. Dans certains modes de réalisation, la production d'OPDA dans la plante transformée est au moins 2 fois supérieure à celle dans la plante non-transformée, préférablement au moins 5 fois, au moins 10 fois, au moins 15 fois, au moins 25 fois, au moins 30 fois, au moins 40 fois, au moins 50 fois, au moins 75 fois, au moins 100 fois ou plus de 100 fois supérieure à la production ou l'accumulation d'OPDA dans la plante non-transformée. La transformation d'une plante en utilisant une cassette d'expression ou un vecteur de l'invention peut être réalisée par n'importe quelle méthode appropriée, la méthode de transformation utilisée n'étant pas critique pour la présente invention. Les techniques possibles incluent, sans limitation, les méthodes non-biologiques (ex. la micro-injection, le bombardement de micro-projectiles, l'électroporation, l'infiltration sous vide, ou la précipitation directe) et les méthodes biologiques (ex. l'infection par une souche - 19 - bactérienne transformée notamment une souche d'Agrobacterium). Toute combinaison de ces méthodes qui permet une transformation efficace de cellules de plantes ou de plantes peut également être utilisée dans la mise en oeuvre de la présente invention. Méthodes Générales de Transformation Ainsi, dans certains modes de réalisation, une méthode pour obtenir une plante transgénique surproduisant l'acide jasmonique, et éventuellement l'OPDA, comprend: (a) une étape de transformation d'une cellule de plante avec une cassette d'expression ou un vecteur de l'invention pour obtenir une cellule de plante transformée de façon stable; et (b) une étape de culture de la cellule de plante transformée de manière à régénérer une plante entière contenant, intégrée dans son génome, une séquence nucléotidique permettant l'expression de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc dans la plante. L'étape de culture peut comprendre la régénération de plusieurs plantes et la sélection, parmi ces plantes régénérées, de celles qui ont intégré, dans leur génome, une séquence nucléotidique permettant l'expression de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc dans la plante. Dans d'autres modes de réalisation, une méthode pour obtenir une plante transgénique surproduisant l'acide jasmonique, et éventuellement l'OPDA, comprend: (a) une étape de transformation d'une cellule hôte d'Agrobacterium tumefaciens ou d'Agrobacterium rhizogenes pour obtenir une cellule hôte recombinante; et (b) une étape de transformation d'une plante ou de cellules de plante par infection avec une cellule hôte recombinante pour obtenir une plante contenant, intégrée dans son génome, une séquence nucléotidique permettant l'expression de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc dans la plante. L'étape de transformation de la plante peut comprendre l'infection de plusieurs plantes avec des cellules hôte recombinantes et la sélection, parmi ces plantes infectées, de celles qui ont intégré, dans leur génome, une séquence nucléotidique permettant l'expression de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc dans la plante. Dans certains modes de réalisation particuliers, ces méthodes peuvent en outre comprendre les étapes additionnelles suivantes: (c) croisement entre elles de deux plantes transformées pour obtenir des plantes croisées; et (d) sélection, parmi ces plantes croisées ou hybrides, des plantes homozygotes pour le transgène. Alternativement, ces méthodes peuvent comprendre les étapes additionnelles suivantes: (c) croisement d'une plante transformée avec une plante de la même espèce pour obtenir des plantes croisées; et (d) sélection, parmi ces plantes croisées ou hybrides, des plantes ayant conservé le transgène. - 20 - Transformation de Cellules de Plantes et de Cellules Hôtes Tel qu'utilisé ici, le terme "cellule de plante" inclut les protoplastes (cellules végétales sans paroi), les cellules végétales germinales ou somatiques, et plus généralement toute cellule ou groupement de cellules capable de régénérer une plante entière. Ainsi, une graine comprenant une multitude de cellules de plante capable de régénérer une plante entière est inclut dans le terme "cellule de plante". La cellule de plante utilisée dans une méthode de l'invention peut être isolée de la plante de laquelle elle provient (ex lignée cellulaire) ou sous forme de culture de tissus ou d'organes de plante. Les cellules de plantes utilisées dans une méthode de l'invention peuvent provenir de toute plante quelle que soit son espèce (voir ci-dessous). Des cellules de plantes peuvent être obtenues d'un grand nombre de sources commerciales différentes telles que l'American Type Culture Collection (Rockland, MD), ou les producteurs et revendeurs de graines comme par exemple A. Atlee Burpee Seed Co. (Warminster, PA), Park Seed Co. (Greenwood, SC), Johnny Seed Co. (Albion, ME), or Northrup King Seeds (Hartsville, SC), Vilmorin, France, Thompson & Morgan, Graines Baumaux: Clause vegetale seeds. On trouve également des descriptions de cellules hôtes utiles à la transformation de plantes dans I.K. Vasil, "Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants", Vol. I, II and II; 1984, Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press: New York; R.A.

Dixon et al., "Plant Cell Culture - A Practical Approach", 1985, IRL Press: Oxford University; and Green et al., "Plant Tissue and Cell Culture", 1987, Academic Press: New York. Dans une méthode selon l'invention, la transformation de cellules de plantes (ou de cellules hôtes) peut être réalisée par n'importe quelle technique connue de l'homme du métier. Des méthodes d'introduction de cassettes d'expression dans des cellules de plantes ont été décrites. Voir, par exemple, "Methods for Plant Molecular Biology", Weissbach and Weissbach (Eds.), 1989, Academic Press, Inc; "Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods", 1995, Springer-Verlag: Berlin, Germany; et les brevets U.S. 4,945,050; 5,036,006; 5,100,792; 5,240,855; 5,302,523; 5,322,783; 5,324,646; 5,384,253; 5,464,765; 5,538,877; 5,538,880; 5,550,318; 5,563,055; et 5,591,616). On peut citer notamment les méthodes de transfert direct de gènes telles que la microinjection directe dans les embryoïdes de plante (Neuhaus et al., Theoretical and Applied Genet., 1987, 75: 30-36), l'infiltration sous vide (Bechtold et al., Comptes - 21 - Rendus Acad. Sci. Série III - Sciences de la Vie, 1993, 316(10) : 1194-1199), l'électroporation (Chupeau et al., Biotechn., 1989, 7: 503-508) ou encore la précipitation directe au moyen de PEG (Schocher et al., Biotechn., 1986, 4 : 1093-1096) ou le bombardement par canon de particules recouvertes de l'ADN d'intérêt (Fromm et al., Biotechn., 1990, 8 : 833-839). En particulier, l'électroporation a fréquemment été utilisée pour transformer des cellules de plantes (brevet US 5,384,253). Cette méthode est généralement effectuée sur des tissus friables (comme par exemple une culture de cellules en suspension ou un cal embryogénique) ou cible des cellules d'embryons ou d'autres tissus organisés qui ont été rendus plus susceptibles à l'électroporation par exposition à des enzymes qui dégradent la pectine ou par traitement mécanique. Des cellules intactes de maïs, de blé, de tomate, de soja, et de tabac ont, par exemple, été transformées par électroporation (D'Halluin et al., Plant cell, 1992, 4: 1495-1505; Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 1995, 55: 121-131; et brevet US 5,384,253). L'électroporation peut également être utilisée pour transformer des protoplastes (Bates, Methods Mol. Biol. 1999, 111: 359-366). Les techniques de bombardement par canon de particules peuvent être utilisées pour transformer pratiquement n'importe quelle espèce de plantes monocotylédones ou dicotylédones (brevets US 5,036,006; 5,302,523; 5,322,783 et 5,563,055; WO 95/06128; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 1994, 24: 317-325; Hengens et al., Plant Mol. Biol. 1993, 23: 643-669; Hengens et al., Plant Mol. Biol. 1993, 22: 1101-1127; Buising et al., Mol. Gen. Genet. 1994, 243: 71-81; Singsit et al., Transgenic Res. 1997, 6: 169-176). La transformation de protoplastes de plantes peut être effectuée par des méthodes basées sur la précipitation par du phosphate de calcium, traitement au polyéthylène glycol, électroporation et des combinaisons de ces méthodes (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 1985, 199: 169-177; Fromm et al., Nature, 1986, 31: 791-793; Callis et al., Genes Dev. 1987, 1: 1183-1200; Omirulleh et al., Plant Mol. Biol. 1993, 21: 415-428). D'autres méthodes de transformation de cellules de plantes, qui ont par exemple été décrites dans l'art antérieur (par exemple Rakoczy-Trojanowska, Cell Mol. Biol. Lett. 2002, 7: 849-858), peuvent également être utilisées dans la mise en oeuvre de l'invention.

La transformation de cellules de plantes via Agrobacterium est également bien connue dans l'art (brevet US 5,563,055). Cette méthode peut être utilisée pour la transformation de plantes dicotylédones ou monocotylédones. Pour les espèces de plantes - 22 - pour lesquelles la transformation via Agrobacterium est efficace, c'est souvent la méthode de choix. La transformation via Agrobacterium s'effectue en plusieurs étapes: tout d'abord le clonage et les modifications d'ADN sont réalisés dans E. Coli, puis le plasmide contenant les séquences nucléotidiques d'intérêt est transféré par conjugaison ou par électroporation dans une souche bactérienne d'Agrobacterium (généralement Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes), et les cellules d'Agrobacterium recombinantes obtenues sont utilisées pour infecter les plantes ou les cellules de plantes. A titre d'exemple, les cellules de plantes qui peuvent être transformées par cette méthode sont typiquement des cellules de cal, d'embryons, de tissue méristématique, ou de cultures cellulaires en suspension. Préférablement, dans une méthode de transformation de l'invention, les cellules de plantes sont transformées de façon stable. Le terme "transformé de façon stable", tel qu'utilisé ici, désigne une cellule, un cal ou un protoplaste dans lequel un acide nucléique exogène qui a été introduit par une méthode de transformation, est capable de réplication.

La stabilité de la transformation est démontrée par la capacité de la cellule transformée à établir des lignées cellulaires ou des clones comprenant une population de cellules filles qui contiennent elles aussi l'acide nucléique exogène. Le succès de la transformation d'une cellule de plante peut être évalué de façon préliminaire visuellement lorsque la cassette d'expression ou le vecteur utilisé contient un gène marqueur (voir ci-dessus). Alternativement, les cellules de plantes comprenant la séquence nucléotidique codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc (ou une de leurs combinaisons) et qui expriment GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc (ou une de leurs combinaisons) peuvent être identifiées et sélectionnées par une variété de procédures appropriées telles que par hybridations ADN-ADN ou ADN-ARN, par des essais protéiniques ou immunologiques connus pour détecter et quantifier les acides nucléiques et les protéines. Les cellules de plantes (y compris les protoplastes, les cals, etc... ) transformées de façon stable par une méthode de l'invention font également partie de l'invention. Régénération de Plantes Il est connu dans l'art que la régénération à partir de cellules transformées individuelles pour obtenir des plantes entières transgéniques est possible pour un grand nombre de plantes. La régénération a été démontrée aussi bien pour les plantes - 23 - dicotylédones que pour les plantes monocotylédones. Dans la mise en oeuvre de l'invention, les cellules de plante transformées de façon stable peuvent être cultivées pour obtenir des plantes transgéniques par n'importe quelle méthode standard connue de l'homme du métier (voir, par exemple, McCormick et al., Plant Cell Reports, 1986, 5: 81- 84). La régénération des plantes à partir de protoplastes a également été décrite, par exemple, par Evans et al., "Handbook of Plant Cell Cultures", Vol. 1, 1983, MacMilan Publishing Co: New York; and I.R. Vasil (Ed.), "Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants", Vol. I (1984) and Vol. II (1986), Acad. Press: Orlando. Tel qu'utilisé ici, le terme "régénération" désigne le procédé consistant à faire pousser une plante à partir d'une cellule de plante. Les moyens de régénération peuvent varier d'une espèce de plante à une autre, mais généralement, une suspension de cellules végétales transformées ou des explants transformés contenus dans un boite de Pétri sont utilisés. Un cal se forme, d'où sont induits des germes et par la suite, une racine. Alternativement, une technique d'embryogenèse somatique peut être utilisée. Cette technique permet d'obtenir, à partir d'une seule graine ou d'un seul cal, un nombre illimité de copies de cette graine ou de ce cal, chacune des copies étant morphologiquement et génétiquement semblable à la graine ou au cal de départ. Les plantes transgéniques primaires peuvent être cultivées en utilisant des méthodes conventionnelles. De nombreuses techniques de culture de plantes sont bien connues dans l'art. Ainsi, les plantes peuvent être cultivées dans le sol, ou alternativement hors-sol (culture hydroponique - voir, par exemple, les brevets US 5,364,451; 5,393,426; et 5,785,735). Sélection de Plantes Transformées La sélection de plantes qui ont été transformées peut être effectuée par n'importe quelle méthode appropriée, par exemple par Northern Blot, Southern Blot, détection de résistance à un herbicide ou à un antibiotique, ou par toute combinaison de ces méthodes ou d'autres méthodes connues de l'homme du métier. Les techniques de Southern Blot et de Northern Blot, qui testent respectivement la présence d'une séquence polynucléotidique d'intérêt (ex. séquence codant pour GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc) et de son ARN correspondant, sont des méthodes standard connues (voir, par exemple, Sambrook & Russell, "Molecular Cloning", 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor). Alternativement ou additionnellement, la - 24 - sélection des plantes peut se faire par détection de la surproduction d'acide jasmonique et/ou d'ODPA (voir Exemples). Les plantes transgéniques primaires transformées (et éventuellement sélectionnées) peuvent être soit croisées entre elles, soit croisées avec des plantes de la même espèce, et parmi les plantes croisées ou hybrides obtenues, on peut sélectionner celles qui présentent les caractéristiques phénotypiques désirées. Plusieurs générations de plantes peuvent être générées pour s'assurer que les caractéristiques phénotypiques désirées sont bien héritées et maintenues de façon stable, et des graines de ces plantes peuvent être récoltées. Par exemple, une plante transformée selon l'invention peut être croisée avec une plante d'une lignée à valeur agronomique de la même espèce et les plantes hybrides obtenues ayant conservé le transgène, peuvent être soumises à une procédure de rétrocroisement avec la plante de la lignée à valeur agronomique pour obtenir des plantes qui ont conservé le transgène et qui possèdent un fond génétique proche ou identique au fond génétique de la plante de la lignée à valeur agronomique.

III - Plantes Transgéniques Présentant une Surproduction de Jasmonates La présente invention concerne également les plantes transgéniques obtenues par les méthodes décrites ici, c'est-à-dire les plantes transgéniques contenant, intégrée dans leur génome, une séquence nucléotidique exogène permettant l'expression de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc (ou une de leurs combinaisons). En particulier, les plantes transgéniques de l'invention sont caractérisées en ce que l'expression de GhERF-IIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc induit une surproduction d'acide jasmonique et/ou d'OPDA. Comme mentionné plus haut, une surproduction d'acide jasmonique dans une plante transgénique est une production ou une accumulation d'acide jasmonique dans la plante transformée qui est supérieure à la production ou à l'accumulation d'acide jasmonique dans une plante non-transformée de la même espèce et au même stade de développement. Dans certains modes de réalisation, la surproduction d'acide jasmonique dans la plante transformée est au moins 2 fois, au moins 5 fois, au moins 10 fois, au moins 25 fois, au moins 50 fois, au moins 75 fois, au moins 100 fois, ou plus de 100 fois supérieure à la production ou l'accumulation d'acide jasmonique dans la plante non-transformée. De même, comme mentionné plus haut, une surproduction d'OPDA dans une plante transgénique est une production ou une accumulation d'OPDA dans la plante transformée qui est supérieure à la production ou à l'accumulation d'OPDA dans une plante non- - 25 - transformée de la même espèce et au même stade de développement. Dans certains modes de réalisation, la surproduction d'OPDA dans la plante transformée est au moins 2 fois, au moins 5 fois, au moins 10 fois, au moins 20 fois, au moins 25 fois, au moins 30 fois, au moins 40 fois, au moins 50 fois, au moins 75 fois, au moins 100 fois, ou plus de 100 fois supérieure à la production ou l'accumulation d'OPDA dans la plante non- transformée. Dans certains modes de réalisation, la surexpression de GhERF-IIc dans une plante transgénique selon l'invention résulte en une surproduction d'acide jasmonique et d'ODPA, telle que la teneur en acide jasmonique dans la plante est supérieure à la teneur en OPDA. Dans d'autres modes de réalisation, la surexpression de GhERF-IIa ou de GhERF-IIb dans une plante transgénique selon l'invention résulte en une surproduction d'acide jasmonique et d'OPDA, telle que la teneur en OPDA est supérieure à la teneur en acide jasmonique. Tel qu'utilisé ici le terme "supérieure" fait référence à la teneur en un jasmonate (ou quantité d'un j asmonate) qui est au moins 1,1 plus élevée que la teneur en l'autre jasmonate (ou quantité de l'autre jasmonate), préférablement au 1,25 fois plus élevée, plus préférablement encore au moins 1,5 fois plus élevée et encore plus préférablement au moins 1,75 fois plus élevée, par exemple 2 fois, 2,25 fois, 2,5 fois, 2,75 fois, 3 fois ou plus de 3 fois plus élevée. Les plantes transgéniques de l'invention peuvent appartenir à n'importe quel genre ou espèce de plantes pour lesquelles une transformation par introduction d'une cassette d'expression ou d'un vecteur contenant une séquence nucléotidique codant pour GhERFIIa, GhERF-IIb ou GhERF-IIc résulte en une surproduction d'acide jasmonique et/ou d'OPDA. Ainsi, les plantes transgéniques de l'invention peuvent être des plantes de grandes cultures, des plantes potagères, des fleurs ou des arbres. Les plantes transgéniques de l'invention peuvent être des dicotylédones, telles que notamment les malvacées (ex. cotonnier, etc...), les solanacées (ex. tabac, tomate, pomme de terre, aubergines, etc...), les cucurbitacées (ex. melon, concombre, pastèque, courges, etc...), les crucifères (ex. colza, moutarde, etc...), les composées (ex. chicorée, etc...), les ombellifères (ex. carotte, cumin, etc...), ou les rosacées (en particulier arbres et arbustes dont les fruits ont une importance économique), ou des monocotylédones, telles que par exemple notamment les céréales (ex. blé, orge, avoine, riz, maïs, etc...) ou les liliacées (ex. oignon, ail, etc...). - 26 - Dans certains modes de réalisation, une plante transgénique de l'invention appartient à la famille des Malvacées (ex. cotonnier, cacao, okra, etc...), à la famile des Solanacées (ex. tabac, tomate, pomme de terre, aubergines, etc...), à la famille des Rubiacées (ex. café, etc...), à la famille des Poacées ou Graminées (ex. riz, maïs, blé, orge, avoine, seigle, mil, canne à sucre, etc...) ou à la famille des Vitacées (ex. vigne, etc...). Dans certains modes de réalisation préférés, une plante transgénique de l'invention appartient aux genres Gossypium ou Cotoneaster (coton), au genre Nicotiona (tabac), au genre Oryza (riz), au genre Solanum (tomate), au genre Coffra (café), ou au genre Vitis (vigne).

L'invention englobe les plantes transgéniques entières, leur progéniture (ou descendants) croisée ou non, ainsi que le matériel végétal obtenu à partir de ces plantes. Le terme "matériel végétal", tel qu'utilisé ici, inclut les cellules de plantes, les organes de plantes, les protoplastes, les cals, les cultures de cellules et toutes autres cellules de plantes organisées en tant qu'unité fonctionnelle et/ou structurelle, les graines, les feuilles, les tiges, les racines, les fleurs, les fruits, les tubercules, le pollen, les boutures, etc. IV - Utilisation des Plantes Transgéniques Surproduisant des Jasmonates Résistance Améliorée aux Agents Pathogènes Etant donné le rôle important mentionné ci-dessus des jasmonates dans les mécanismes de défense végétale, en particulier contre les insectes et les bactéries mais également contre les champignons, les méthodes de l'invention peuvent être utilisées pour produire des plantes présentant une résistance améliorée aux agents pathogènes. Tel qu'utilisé ici, le terme "résistance améliorée aux agents pathogènes" désigne une résistance d'une plante transformée (c'est-à-dire une capacité à se défendre) contre au moins un agent pathogène, qui est supérieure à la résistance d'une plante non-transformée de la même espèce. Un agent pathogène dans le contexte de l'invention peut être n'importe quel microorganisme (bactéries, champignons, mycoplasmes, virus), insecte ou autre ravageur qui est capable d'induire une pathologie dans une plante. Production de Métabolites Secondaires Beaucoup de métabolites secondaires de plantes ont une valeur économique en tant que produits pharmaceutiques (ex. taxol, digoxine, colchicine, codéine, morphine, quinine, quinidine, shikonine, ajmaline, ajmalicine, vinblastine, vincristine, réserpine, rescinnamine, camptothécine, ellipticine, nicotine, etc...), colorants ou arômes - 27 - alimentaires (ex. anthocyanines, vanilline, etc...), ou parfums. Cependant, l'utilisation industrielle de ces métabolites secondaires est limitée par le fait que les plantes ne produisent qu'une faible quantité de ces métabolites. La biosynthèse de nombreuses classes de métabolites secondaires est stimulée par les jasmonates et certains de leurs précurseurs (Memelink, Curr. Opin. Plant Biol., 2005, 8: 23-235). En particulier, dans certaines plantes, l'acide jasmonique induit l'expression de gènes intervenant dans la biosynthèse de métabolites secondaires (Menke et al., EMBO J., 1999, 18: 4455-4463). Une liste non-exhaustive de classes de métabolites secondaires dont la biosynthèse est induite par les jasmonates comprend les taxoïdes, les phénylpropanoïdes, les flavonoïdes, les anthocyanines, les guaianolides, les anthraquinones, les sesquiterpénoïdes, et plusieurs types d'alcaloïdes comme les alcaloïdes indol-terpénoïdes. Par conséquent, les plantes transgéniques de l'invention, qui surproduisent l'acide jasmonique, peuvent être utilisées pour la production de métabolites secondaires. De même, les méthodes de l'invention peuvent être utilisées pour produire des plantes surproduisant au moins un métabolite secondaire. Toute plante connue pour produire un métabolite secondaire dont la biosynthèse est induite par les jasmonates, et en particulier par l'acide jasmonique et/ou l'OPDA, peut être transformée par une méthode de l'invention en vue d'obtenir une plante transgénique surproduisant ce métabolite secondaire. Des exemples de plantes connues pour produire de tels métabolites secondaires incluent, sans limitation, la pervenche de Madagascar (Catharanthus roseus) dont les feuilles synthétisent la vinblastine et la vincristine - des composés utilisés dans le traitement du cancer - et dont les racines synthétisent l'ajmalicine, qui est utilisée pour l'amélioration de la circulation sanguine cérébrale; le pavot à opium (Papaver somniferum), dont le latex contient des alcaloïdes narcotiques tels que la morphine et la codéine; la Rauwolfia serpentina qui produit un certain nombre de composés bioactifs comme la réserpine qui est utilisée comme agent hypotenseur; les plantes du genre Cinchona qui produisent la quinine, utilisée contre la malaria et la quinidine, un agent antiarythmique; les jusquiames telles que la jusquiame blanche (Hyoscyamus albus L.) et la jusquiame noire (Hyoscyamus niger L.) ou les plantes du genre Datura qui contiennent divers alcaloïdes tels que l'atropine - un antagoniste cholinergique utilisé par exemple pour réduire les tremblements chez les patients atteints de la maladie de Parkinson - l'hyoscyamine qui est utilisée dans le traitement de - 28 - nombreuses maladies gastrointestinales, et la scopolamine, un sédatif central; et le tabac (Nicotiana) qui produit la nicotine, connue pour avoir des effets thérapeutiques utiles dans le traitement de conditions neurologiques et psychiatriques. A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés dans la description ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevet, tous les brevets et toutes autres références mentionnés ici sont incorporés par référence. Exemples Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, il est entendu que les exemples ne sont présentés qu'à titre illustratif seulement et ne limitent en aucun cas la portée de l'invention. Exemple 1: Induction des Facteurs de Transcription GhERF-IIa et GhERF-IIc Matériels et Méthodes Le cultivar de cotonnier Gossypium hirsutum cv. Reba B50, qui porte les gènes B2B3 de résistance à la rouille, a été utilisé. Ce cultivar est résistant à la race 18 de la bactérie Xanthomonas campestris pv. Malvacearum (Xcm18) mais développe des symptômes de maladie en réponse à la race 20 de cette même bactérie (Xcm20) (Innes et al., Biol. Rev., 1983, 58 : 157e176; Hillocks et al., Cotton Diseases, 1992, Redwood Press CAB, International Melksham). Les bactéries Xcm18 et Xcm20 ont été maintenues à 28°C dans un agar LPG dans de l'eau distillée (0,5% d'extrait de levures, 0,5% de peptone bactériologique, 0,5% de glucose comme source de carbone, solidifié avec 1,5% d'agar, les pourcentages étant exprimés en poids par volume, Difco, Etats-Unis). Avant inoculation, les bactéries ont été cultivées à 29°C dans 20 mL de milieu LPG dans un incubateur sous agitation à 150 rpm/minute. Après environ 18 heures dans ces conditions, les cultures ont été centrifugées à 4°C à 4000 min-1 pendant 20 minutes et lavées deux fois avec de l'eau par centrifugation à 4°C à 4000 min-1 pendant 10 minutes pour éliminer le milieu de culture et les exopolysaccharides. Les bactéries ainsi obtenues ont ensuite été resuspendues dans de l'eau et ajustées à 108 cfu/mL (ce qui correspond à une absorbance de 0,2 à 600 nm). - 29 - Les cotonniers utilisés ont été cultivés dans une serre avec un cycle lumière naturelle/nuit de 29°C/24°C et une humidité relative moyenne de 80%, ce qui représente les conditions optimales pour les interactions cotonnier/Xcm. Les suspensions de bactéries (108 cfu/ml), ou l'eau stérile utilisée comme contrôle, ont été injectées dans les domaines intercellulaires de cotylédons de cotonnier âgés de 10 jours en utilisant une seringue sans aiguille. Résultats Une étude bioinformatique a été réalisée dans le but de rechercher chez le cotonnier des orthologues fonctionnels du gène AtORA47, qui appartient à la famille des facteurs de transcription dénommée AP2/ERF, en se basant sur l'homologie de séquences avec AtORA47 d'Arabidopsis thaliana. L'équipe des présents demandeurs (Champion et al., Mol. Plant Pathol., 2009, 10: 471-485) a déjà effectué une recherche systématique des membres de la famille AP2/ERF dans la base d'unigène du cotonnier. En utilisant les résultats de cette étude et par comparaison avec la séquence du gène AtORA47 d'Arabidopsis, trois séquences phylogéniquement proches d'AtORA47 ont été identifiées. Ces séquences ont été clonées à partir d'ADNc de Gossypium hirsutum cv. Réba B50, et ont été nommées GhERF-IIa (SEQ ID NO: 4), GhERF-IIb (SEQ ID NO: 5) et GhERF-IIc (SEQ ID NO: 6). Les séquences protéiques déduites de ces séquences génomiques (respectivement SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 3) possèdent avec la séquence d'ORA47 (SEQ ID NO: 7) un domaine commun de liaison à l'ADN, nommé AP2-domaine et les domaines CMII-1 et CMII-3 caractéristiques du groupe II de la famille ERF (voir Figure 1). Pour étudier les effets de la bactérie Xcm (Xanthomonas campestris pv. malvacearum) sur l'expression des gènes GhERF-IIa et GhERF-IIc, des cotonniers ont été inoculés avec Xcm. Une analyse par PCR quantitative a ensuite été effectuée sur les ADNc issus de la rétro-transcription des ARN totaux extraits de 10 cotylédons pour chaque traitement. Deux races différentes de bactérie ont été utilisées: Xcm18 qui induit l'apparition de la réaction hypersensible, une réponse de défense rapide spécifique permettant à la plante de résister et Xcm20 qui est responsable de la bactériose du cotonnier. La cinétique d'infection par chacune de ces deux races a été suivie pendant les 16 heures qui ont suivi l'inoculation. Une cinétique témoin contrôle a également été générée sur des cotonniers inoculés avec de l'eau (le solvant utilisé pour diluer les cultures de bactéries Xcm). -30- Les résultats obtenus montrent que l'expression des gènes GhERF-IIa (Figure 2(A)) et GhERF-IIc (Figure 2(B)) est induite en réponse à Xcm18, et ce de manière significative par rapport au TO. On observe que l'expression de GhERF-IIa est induite rapidement et spécifiquement en réponse à la race Xcm18 avec un facteur d'augmentation d'expression de 6 à T=lh. L'expression décroît ensuite pour atteindre un facteur 4 à T=4h. Un second pic d'induction de l'expression est également observé à T=8h (facteur 9), avant une diminution progressive de l'expression jusqu'à T=16h. En revanche, l'expression de GhERF-IIa est réprimée par Xcm20 au cours des 8 premières heures post inoculation, puis augmente très faiblement par la suite pour atteindre un facteur 3 à T=16h. Le traitement contrôle (eau) modifie peu ou pas l'expression du gène GhERF-IIa. Comme pour GhERF-IIa, on observe que GhERF-IIc est induit spécifiquement en réponse à la race Xcm18 mais de manière plus importante que GhERF-IIa. Un premier pic d'induction est visible à T=lh (facteur 55), suivi d'une décroissance très rapide entre T=lh et T=4h (facteur 20 à T=2h; facteur 1 à T=4h). Comme pour GhERF-IIa, l'expression de GhERF-IIc ré-augmente à partir de T=8h (facteur 20) et s'amplifie à T=10h (facteur 35). Ces résultats indiquent que l'expression des gènes GhERF-IIa et GhERF-IIc est spécifiquement et rapidement induite dans un contexte de défense du cotonnier en réponse à Xcm.

Exemple 2: Transactivation du Promoteur AtAOC2 par GhERF-IIa, GhERF-IIb et GhERF-IIc dans des Protoplastes de Cotonnier Matériels et Méthodes Des protoplastes de cotonnier ont été transformés avec du polyéthylène glycol par une méthode connue dans l'art (Schirawski et al., J. Virol. Methods, 2000, 86: 85-94) avec 3 constructions dans un rapport 2:2:6 (1..tg GUS:LUC:plasmide). Les protoplastes de cotylédons de cotonnier ont été produits et transformés en utilisant un protocole adapté de la méthode décrite par Sheen et al. (Sheen J, 2002, A transient expression assay using Arabidopsis mesophyll protoplasts. http//genetics.mgh.harvard.edu/sheeweb/). Les protoplastes ont été recueillis 18 heures après la transformation et congelés dans de l'azote liquide. Des tests d'activité de GUS et LUC ont été réalisés comme décrit précédemment (Zarei et al., Plant Mol. Biol., 2011, 75: 321-331). Dans chaque échantillon, l'activité de GUS et l'activité de LUC ont été prises en compte pour corriger -31- les différences d'efficacité de transformation et d'extraction de protéines. Les rapports moyens GUS/LUC déterminés pour 3 expériences indépendantes ont été exprimés relativement aux vecteurs de contrôle respectifs. Des protoplastes de feuilles d'Arabidopsis ont été préparés et transformés comme décrit précédemment (Sheen et al., 2002 A transient expression assay using Arabidopsis mesophyll protoplasts. httpfigenetics.mgh.harvard.edu/sheeweb/). Les protoplastes ont été co-transformés avec 10 lig de GFP-fusion et le plasmide d'ADN NtKIS1a-DsRFP (Jasinski et al., Plant Physiol., 2002, 130 : 1871-1882) et incubés dans le noir pendant au moins 16 heures. La localisation nucléaire a été étudiée par expression, dans les protoplastes, de GhERF-IIa, GhERF-IIb et GhERF-IIc fusionnés à la région C-terminale de la protéine fluorescente verte 6 (GFP6) et par microscopie de fluorescence. Résultats La biosynthèse de l'acide jasmonique s'effectue par la voie métabolique des octadécanoïdes (Turner et al., Plant Cell, 2002, 14 (suppl.): S153-S164) qui comprend plusieurs étapes enzymatiques bien caractérisées. Une de ces étapes inclut l'action d'un enzyme de plastide, l'allène oxide cyclase (AOC). Zarei et al. (Plant Mol. Biol., 2011, 75: 321-331) ont montré que AtOR47 se lie au promoteur AOC2 in vitro. L'objectif de la présence étude était de déterminer si GhERF-IIa, GhERF-IIb et GhERF-IIc sont capables d'activer l'expression du gène AOC2 par liaison avec le promoteur de ce gène. La capacité de ces facteurs de transcription de transactiver le promoteur de AOC2 a donc été testée dans un essai transitoire. Les constructions qui ont été utilisées dans les expériences sur les protoplastes de cotylédons de cotonnier sont présentées sur la Figure 3(A). Les constructions 'effector' consistent en un vecteur d'expression comprenant le promoteur CaMV 35S (flèche) avec ou sans les ADNc de GhERF-IIa, GhERF-IIb, GhERF-IIc ou GhERF-IXa5. Le gène LUC (Firefly luciferase) est fusionné au promoteur CaMV 35S et sert de gène de référence pour corriger les différences dans les efficacités de transformation et d'extraction de protéines entre échantillons. Les protoplastes de Gossypium hirsutum ont été co-transformés avec la construction 'reporter', un des plasmides 'effector' et le plasmide de référence. Les résultats obtenus sont présentés sur le graphe de la Figure 3(B). Dans ce graphe, les barres d'erreur -32- représentent les rapports GUS/LUC déterminés dans trois expériences indépendantes ± SE (l'erreur type) et exprimés relativement au vecteur contrôle. Comme le montrent les résultats, GhERF-IIa, GhERF-IIb et GhERF-IIc activent le gène AOC2 2,5, 6,5 et 5 fois, respectivement. Au contraire, GhERF-IXa5 et le vecteur vide n'ont aucun effet sur AOC2. Ces résultats démontrent que GhERF-IIa, GhERF-IIb et GhERF-IIc sont capables de transactiver, dans un protoplaste de cotonnier, un promoteur de la biosynthèse des jasmonates d' Aradidopsis, ce qui suggère une conservation au niveau moléculaire de l'expression du gène de la biosynthèse des jasmonates entre Arabidopsis et le cotonnier.

La Figure 4 montre des images obtenues par microscopie de protoplastes d' Arabidopsis transformés simultanément par le marqueur nucléaire NtKIS 1 a-DsRFP et un plasmide d'expression de GhERF-IIa-GFP6, de GhERF-IIb-GFP6 ou de GhERF-IIcGFP6. Un recouvrement total des localisations est observé indiquant que les facteurs de transcription, GhERF-IIa, de GhERF-IIb et de GhERF-IIc sont exprimés dans le noyau des protoplastes. Exemple 3: La Surexpression des Facteurs de Transcription GhERF-II augmente les Taux Endogènes d'OPDA et d'Acide Jasmonique chez le Cotonnier Matériels et Méthodes Constructions et Transformation Transitoire des Cotonniers: Pour transformer transitoirement le cotonnier, une souche d' Agrobactérium tumefaciens LBA1119 a été utilisée. Le système de transformation utilisé est nommé « ternaire ». Ce système a permis, pour de nombreuses espèces végétales, d'augmenter la fréquence du transfert de l'ADN-T (Van der fits et al., Plant Mol. Biol., 2000, 43: 495-502). Schématiquement, après contact entre les agrobactéries et les cellules végétales blessées, les composés phénoliques, les oses et un pH acide créent un environnement favorable à l'induction des gènes vir. Le facteur de transcription VirG activé par phosphorylation peut induire l'expression des gènes vir qui est nécessaire au transfert de l'ADN-T. Le système ternaire utilise une forme mutée de la protéine virG (virGN54D) mimant la forme active. Ce système a été introduit dans la souche d' agrobactérie LBA1119. Cette souche 30 possède également l'un des vecteurs binaires suivants: pCAMBIA1300-GUS-intron, pCAMBIA1300-GhERF-11a, pCAMBIA1300-GhERF-11b, pCAMBIA1300-GhERF-11c ou pCAMBIA1300-GhERF-IXa5. Les souches ont été étalées et mises en culture sur milieu - 33 - LB contenant trois antibiotiques (Gentamicine (Gen), Rifampicine (Rif) et Kanamycine (Kan)) pendant 48 heures à 29°C. Quelques colonies ont été prélevées et mises en culture liquide (milieu contenant 20 mL de LB, 20 µL de Gen, 20 µL de Rif et 20 µL de Kan). Puis, la culture a été mise sous agitation à 200 rpm et 29°C durant environ 18 heures. Les agrobactéries ont ensuite été mesurées par un spectrophotomètre à 600 nm. Lorsque l'absorbance mesurée est comprise entre 0,6 et 1 (sans dilution), une centrifugation est effectuée à 4°C à 3000 rpm pendant 20 minutes, et au culot formé récupéré on ajoute un milieu d'infiltration (contenant MgSO4 (10 mM), Acétosyringone (200 iiM) et MES pH 5,5 (20mM)) pour obtenir une absorbance égale à 0,5.

L'agrofiltration a été réalisée sur de cotylédons (cotonnier) âgés de 10 jours. Chaque cotylédon a été inoculé à l'aide d'une seringue sans aiguille sur la face inférieure. L'infiltration a été effectuée de bas en haut et entre 2 nervures principales, pour que l'inoculum se répartisse sur toute la surface du demi-cotylédon. Pour chaque construction, 6 demi-cotylédons ont été agroinfiltrés. Deux jours (48 heures) plus tard, les demi-cotylédons ont été prélevés et placés rapidement dans l'azote liquide. La conservation a été réalisée à -80°C. L'expérience a été répétée trois fois. Aucun effet visible n'a été observé sur les cotylédons inoculés 48 heures après transformation par les deux constructions. Extraction d'OPDA et de l'Acide Jasmonique: Dans un premier temps, le matériel végétal obtenu d'un cotonnier transformé a été finement broyé au mortier dans l'azote liquide, et 250 mg de cette poudre ont été placés dans un tube Eppendorf de 1,5 mL. Cette poudre a été reprise par 1 mL de méthanol auquel ont été ajoutés 100 ng de jasmonate deutéré (d6Ja) et 100 ng d'OPDA deutéré (d5OPDA) qui servent de calibrateurs internes. L'extrait méthanolique a été centrifugé à 5000 g pendant 10 minutes à 4°C et le surnageant a été récupéré dans des tubes en verre. Cette étape d'extraction a été réalisée trois fois en combinant les extraits méthanoliques. Le méthanol a ensuite été éliminé par évaporation sous flux d'azote (40°C pendant 1 à 1h30 environ). Les résidus secs obtenus ont été repris par 5 mL de tampon phosphate (phosphate de sodium 100 nM, pH 7,8; NaC1 5 %). Une extraction par partage de phase a été réalisée sur l'extrait aqueux par 2,5 mL d'hexane, et la phase contenant l'hexane (phase supérieure) a été éliminée. Cette extraction par partage de phase a été réalisée trois fois. La phase aqueuse purifiée a été acidifiée à pH 1, 4 par une solution de HC1 5 N. -34- Une seconde purification par partage de phase a été réalisée avec 2,5 mL de chloroforme et la phase chloroformique a été récupérée (phase inférieure) à l'aide d'une pipette pasteur dans une autre série de tubes en verre. Cette étape de purification par partage de phase a été répétée trois fois en combinant les extraits chloroformiques.

Finalement, le chloroforme a été éliminé par évaporation sous flux d'azote (40°C pendant à 30 minutes environ) et les tubes ont été stockés à -80°C. Dosage de l'Acide Jasmonique et de l'OPDA extraits par LC-MS: Les analyses ont été réalisés sur une LC de type Waters 1515 couplée à un spectromètre de masse de type Waters ZQ contrôlé par le logiciel MassLynk V5.0 5(MicroMass, Cray, USA). La 10 colonne utilisée était une XTerra MS C18, 3,5 [lm, 100 x 2,1 mm (Waters, milford, MA, USA). L'extrait végétal a été repris avec 100 p.L de méthanol, dont 20 p.L ont été injectés sur la colonne. La séparation a été réalisée avec un gradient acide formique 15 mM: méthanol (0-2 min, 40/60 % (v/v); 2-14 min, de 40/60% à 60/40%; avec un débit de 0,25 pL/min. Dans ces conditions, le temps de rétention de l'acide jasmonique et de sa forme deutérée est de 9.3 minutes, alors que celui de l'OPDA et de sa forme deutérée est de 16.50 minutes. L'acide jasmonique et l'OPDA ont été détectés et dosés en mode ESI (Electron Spray Ionisation) négative. Les conditions d'analyse pour la spectrométrie de masse étaient les suivantes: Température vaporisation 120°C, Température source 450°C, Capilary voltage 2.5 KV, Cone voltage 20 V. La quantification a été réalisée en mode «selected ion monitoring» avec l'ion 209 pour l'acide jasmonique, l'ion 215 pour l'acide jasmonique deutéré, l'ion 291 pour l'OPDA et 295 pour OPDA deutéré, et a été faite grâce au rapport des surfaces des pics acide jasmonique/acide jasmonique deutéré et OPDA/OPDA deutéré où la surface du pic acide jasmonique deutéré représente 100 ng.

Extraction d'ARNt: Les transcriptions inverses et les PCR quantitatives en temps réel noté qPCR ont été réalisées sur les échantillons ayant servis au dosage de l'OPDA et de l'acide jasmonique. La qPCR utilisée est basée sur la détection et la quantification d'un reporteur fluorescent dont l'émission est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons générés pendant la réaction. Le thermocycleur MX 3500P (Stratagene, Etats-Unis) a été utilisé pour les réactions de qPCR. Le système de détection utilisé repose sur un agent qui se lie à l'ADN double brin, il s'agit du SYBR Green. La quantification des transcrits se -35- base sur la valeur du Ct (THRESHOLD CYCLE), ce point est défini comme étant le cycle seuil et apparait toujours au cours de la phase exponentielle. Plus il y a de matrices à amplifier au départ, moins élevé sera le Ct. Les amorces utilisées ont été désignées à l'aide du logiciel Beacon Designer (Premier Biosoft International, Etats-Unis); leur efficacité et concentration optimale ont été vérifiées. La réaction de qPCR a été réalisée avec le Mesa Green qPCR Master Mix Plus for SYBER Assay (Eurogentec, Belgique) dans un volume total de 20 !IL (4 !IL d'ADNc dilués au 10ème ; 0,6 !IL de chaque amorce qPCR sens et anti-sens à 10 p.M; !IL de Master Mix (Taq polymérase, les nucléotides et le Syber Green) et 4,8 !IL d'eau 10 stérile. Le programme utilisé au cours de la réaction qPCR était le suivant: un cycle à 50°C/2 min suivi d'un cycle à 95°C/10 min (phase de dénaturation), puis 40 cycles à 95°C/15 s, 58°C/20 s, 72°C/40 s et un cycle de dissociation à 95°C/1 min, 60°C/30 s, 95°C/30 s. Lorsque la réaction qPCR est terminée, la quantification des transcrits a été effectuée à partir du logiciel MXPro, et normalisée par rapport au calibrateur (TO, temps avant l'infection), et au normalisateur (l'actine; GhACT2, Champion et al, Mol. Plant Pathology, 2009, 10: 471-485). L'analyse de l'expression de quatre gènes codant potentiellement pour des enzymes de la voie de biosynthèse de l'acide jasmonique ont été analysées. Ces gènes notés GhAOS, GhA0C2 et GhACXIa codent respectivement pour les enzymes Allene Oxyde 20 Synthase, Allene Oxyde Cyclase 2 et Acyl-CoA Oxydase. Résultats Les résultats présentés sur la Figure 5 correspondent à la moyenne de trois expériences indépendantes. Pour chacune des expériences, cinq plantes ont été transformées par agroinfiltration à l'aide des quatre constructions testées. 25 Les Figures 5(A)-(C) montrent que l'expression des trois gènes associés à la biosynthèse de l'acide jasmonique sont induits en réponse à la surexpression de chacun des gènes GhERF-IIa, GhERF-IIb, et GhERF-IIc. En revanche, la surexpression du contrôle négatif GFP ne modifie l'expression d'aucun des gènes GhA0C2, GhAOS et GhACXIa. 30 Les deux gènes, nommés GhLOXJ et GhERF-Ixa2, sont associés à la résistance du cotonnier à Xcm. GhLOXI est inductible d'une part par Xcm18 (race avirulante) et d'autre part par la surexpression d'AtORA47 (voir demande internationale -36- PCT/EP2011/060026 des présents demandeurs). GhERF-IXa2 est un gène dont l'expression est régulée spécifiquement par la race avirulente Xcm18 chez le cotonnier. Les résultats obtenus en PCR quantitative indiquent que l'expression des gènes GHLOX1 et GhERF-IXa2 est induite dans les plantes surexprimant GhERF-IIa, GhERF-IIb, ou GhERF-IIc (voir Figure 5(D) et (E)). Les résultats de dosage de l'OPDA et de l'acide jasmonique dans les cotonniers transformés avec les trois facteurs de transcription sont présentés sur la Figure 5(E). Ces résultats montrent que la surexpression de chacun des gènes GhERF-IIa, GhERF-IIb et GhERF-IIc entraîne une accumulation importante d'OPDA et d'acide jasmonique. Ainsi, par rapport à une transformation contrôle (GFP), les taux d'accumulation de l'OPDA et de l'acide jasmonique sont multipliés respectivement par un facteur 4 et 8 chez le cotonnier transformé par le gène GhERF-IIa, 32 et 56 chez le cotonnier transformé par le gène GhERF-IIb, et 10 et 60 chez le cotonnier transformé par le gène GhERF-IIc. Ainsi, cette étude démontre que les gènes GhERF-IIa, GhERF-IIb et GhERF-IIc sont des orthologues fonctionnels, chez le cotonnier, d'A tORA47 issu d' Arabidopsis. Ces gènes codent donc pour des éléments de signalisation essentiels au contrôle de la production de l'acide jasmonique. Exemple 4: Rôle de GhERGF-IIc dans la Résistance contre Xcm Matériels et Méthodes Souches bactériennes, Culture des Cotonniers, et Agro-infiltration. Voir Exemple 1. Extraction et Quantification de Xcm20 . Les isolations ont été réalisées sur des tissus de cotylédons 1, 6 et 12 jours après inoculation avec Xcm20. Les densités de populations bactériennes ont été calculées par comptage de dilutions en série sur des plaques. Trois séries indépendantes de dilutions en série ont été effectuées pour chaque demi-cotylédon.

Trois disques (de 12 mm de diamètre) de tissus inoculés ont été découpés de trois régions inoculées de chaque cotylédon. Les disques obtenus ont été désinfectés avec de l'éthanol à 70% pendant 2 minutes et rincés dans deux bains d'eau stérilisée. Ils ont ensuite été broyés par homogénéisation dans 5 mL d'eau filtrée (Ultraturax). La suspension ainsi obtenue a été diluée en série dans de l'eau filtrée, et trois aliquotes ont été préparés à partir de chaque échantillon. Cent (100) iaL de chacune des trois dilutions ont été placés sur une plaque d'agar 3 LPG et incubés à 28°C jusqu'au comptage des colonies. -37- Résultats Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 6. Ces résultats montrent que, comme AtORA47, GhERF-IIc accroît la résistance du cotonnier à la race virulente Xcm20 Exemple 5: La Surexpression de GhERGF-IIc, chez le Tabac augmente les Taux Endogènes d'OPDA et d'Acide Jasmonique, et induit l'Expression des Enzymes de la Biosynthèse de la Nicotine Matériels et Méthodes Extraction et Quantification d'OPDA et de l'Acide Jasmonique: Voir Exemple 3, la seule différence étant que le tabac (Nicotiana Benthamiana) a été utilisé à la place du 10 cotonnier. Culture du Tabac, et Transformation Transitoire du Tabac: Le tabac, Nicotiana Benthamiana, a été cultivé en pot contenant du terreau de type azoté, en chambre de culture sous des conditions climatiques de 24°C la journée, 22°C la nuit et 50% d'humidité relative avec un éclairage de type jour long (16h/24h). Les tabacs utilisés sont 15 âgés de 25 jours au moment de leur transformation génétique. Le procédé de transformation des feuilles de tabac par agro-infiltration est le même que celui utilisé pour la transformation des cotylédons de cotonnier (voir Exemple 3). La seule différence réside dans la concentration d'agro-bactérie utilisée pour la transformation des feuilles de tabac, elle est deux fois et demie plus faible. 20 Extraction d'ARNt: La méthode utilisée est similaire à celle décrite dans l'Exemple 2 à l'exception du fait que les gènes Nubiquitine, NbAOX, NbODC, NbPMT et NbMPO ont été testés et amplifiés à l'aide des amorces publiées par Todd et al. (Plant J., 2010, 62: 589-600). Pour le tabac, c'est l'expression du gène Nubiquitine qui a été utilisée pour normaliser les données d'expression. NbAOX, NbODC, NbPMT et NbMPO codent 25 respectivement pour les enzymes aspartate oxidase, ornithine décarboxylase, putrescine N-méthyltransférase, et méthylputrescine oxidase, qui sont tous impliqués dans la biosynthèse de la nicotine. Résultats La Figure 7(A) montre la localisation intracellulaire de la protéine de fusion 30 GhERF-IIc-GFP chez le tabac. Cette protéine est localisée dans les noyaux des cellules épidermiques des feuilles de tabac, comme c'est le cas dans les protoplastes produits à -38- partir des feuilles d' Arabidopsis. Par contraste, la GFP seule est localisée dans le cytoplasme des cellules. Les résultats présentés sur la Figure 7(B) indiquent une forte production de novo des métabolites OPDA et acide jasmonique en réponse à la surexpression du gène GhERF-IIc chez le tabac. Deux jours après transformations, les feuilles de tabac présentent des teneurs proches de 1000 pMole/FW d'OPDA et plus de 2000 pMole/FW d'acide jasmonique. Vingt-quatre heures après transformation du tabac par le gène GhERF-IIc, les taux d'accumulation de l' OPDA et de l'acide jasmonique sont multipliés respectivement par un facteur de 14 et 9 par rapport à une transformation contrôle (GUS).

Quarante huit heures après transformation, ces taux d'accumulation sont multipliés respectivement par un facteur 28 et 53. Comme le montrent les Figures 8(A)-(D), l'expression des 4 gènes associés à la synthèse de nicotine (NbAOX, NbODC, NbPMT, et NbMPO) est induite par la surexpression de GhERF-IIc. Dans tous les cas testés, on constate une forte induction de l'expression de ces gènes 24 heures et 48 heures après transformation. En revanche, l'expression transcriptionelle de ces 4 gènes est peu ou pas induite par la surexpression de la GFP. -39-

Claims (9)

1. REVENDICATIONS1. Une plante transgénique présentant une surproduction d'acide jasmonique, et éventuellement une surproduction d'OPDA, et contenant une séquence nucléotidique exogène codant pour un facteur de transcription choisi parmi GhERF-IIa, GhERF-IIb, GhERF-IIc et leurs combinaisons, la séquence nucléotidique étant préférablement intégrée dans le génome de la plante transgénique.
2. 2. Plante transgénique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente une résistance améliorée à au moins un agent pathogène, l'agent pathogène étant une bactérie, un virus, un champignon, un insecte ou un oomycète, où la bactérie, le virus, le champignon, l'insecte ou le oomycète est capable d'induire une maladie chez une plante.
3. 3. Plante transgénique selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que la plante appartient à la famille des Malvacées, à la famille des Solanacées, à la famille des Rubiacées, à la famille des Poacées ou Graminées ou à la famille des Vitacées, et préférablement appartient aux genres Gossypium ou Cotoneaster (coton), au genre Nicotiona (tabac), au genre Oryza (riz), au genre Solanum (tomate), au genre Coffra (café), ou au genre Vitis (vigne).
4. 4. Un matériel végétal obtenu ou extrait d'une plante transgénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, le matériel végétal appartenant au groupe constitué des cellules, cultures de cellules, protoplastes, organes, cals, graines, feuilles, tiges, racines, fleurs, fruits, tubercules, pollen, et boutures de plantes.
5. 5. Matériel végétal selon la revendication 4, caractérisé en ce que le matériel végétal est capable de régénérer une plante entière. -40-
6. 6. Un procédé d'obtention d'une plante transgénique présentant une surproduction d'acide jasmonique, et éventuellement une surproduction d'OPDA, le procédé comprenant les étapes suivantes : (a) une étape de transformation d'une cellule de plante avec une cassette d'expression ou un vecteur comprenant une séquence nucléotidique codant pour un facteur de transcription choisi parmi GhERF-IIa, GhERF-IIb, GhERF-IIc et leurs combinaisons, de manière à obtenir une cellule de plante transformée de façon stable ; et (b) une étape de culture de la cellule de plante transformée de façon stable de manière à régénérer une plante entière contenant, intégrée dans son génome, une séquence nucléotidique permettant l'expression du facteur de transcription.
7. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape de culture comprend : la culture de plusieurs cellules transformées de façon stable de manière à régénérer plusieurs plantes ; et la sélection, parmi les plantes régénérées, de celles qui contiennent, intégrée dans leur génome, une séquence nucléotidique permettant l'expression du facteur de transcription.
8. 8. Un procédé d'obtention d'une plante transgénique présentant une surproduction d'acide jasmonique, et éventuellement une surproduction d'OPDA, le procédé comprenant les étapes suivantes : (a) une étape de transformation d'une cellule hôte d' Agrobacterium de manière à obtenir une cellule hôte recombinante ; et (b) une étape de transformation d'une plante ou d'une cellule de plante par infection avec la cellule hôte recombinante de manière à obtenir une plante entière contenant, intégrée dans son génome, une séquence nucléotidique permettant l'expression d'un facteur de transcription, le facteur de transcription étant GhERF-IIa, GhERF-IIb, GhERF-IIc ou une de leurs combinaisons.
9. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'étape de transformation comprend : l'infection de plusieurs plantes ou de plusieurs -41-cellules de plante avec des cellules hôtes recombinantes, éventuellement la culture de plusieurs cellules de plantes infectées de manière à régénérer plusieurs plantes ; et la sélection, parmi les plantes infectées ou parmi les plantes régénérées, de celles qui contiennent, intégrée dans leur génome, une séquence nucléotidique permettant l'expression d'un facteur de transcription, le facteur de transcription étant GhERF-IIa, GhERF-IIb, GhERF-IIc ou une de leurs combinaisons. -42-